CN103843879A - 用于诱导果实抗性控制病害的制剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂，为浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液。当果实为梨时，γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml；当果实为枇杷时，γ-氨基丁酸的浓度为1000μg/ml；当果实为柑橘时，γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml。病害为青霉病、炭疽病或绿霉病。上述制剂的使用方法为以下任一方式：方式A：将浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液于果实采摘前24～72小时喷洒在果实表面，直至果实表面润湿；方式B：将采摘后24小时内的果实浸泡在浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液中，浸泡时间为1～30分钟。

Description

用于诱导果实抗性控制病害的制剂及其使用方法

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过γ-氨基丁酸诱导果实抗性的生物保鲜技术。

背景技术

水果在采后由于腐烂而导致的损失非常巨大，据资料显示，我国每年果蔬腐烂超过8000万吨，造成的经济损失达750亿元，占整个产值的30%以上。病原菌侵染是影响果实采后生理、代谢的重要因素，每年由病害导致的采后损失数目可观。例如：多数水果（梨、苹果、柑橘、枣等）都会被Penicillium expansum侵染造成果实腐烂，这种病害会导致储藏果实50%损失，另一方面P.expansum会产生棒曲霉素（4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2[6H]one），这种毒素可以对人体产生多种严重的慢性影响；因此探讨病害控制方法，一直是人们关注的研究方向。

化学杀菌剂通常被认为是最便宜且能有效控制果蔬采后病害的方法。中国发明专利（申请号200910028802.2，一种柑橘保鲜剂）提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括甲基托布津，多菌灵。中国发明专利（申请号200910028804.1）提供了可控制柑橘病害的化学杀菌剂，包括2,4-D钠盐，托布津。中国发明专利（申请号201110209305.X）提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括醚菌酯、唑菌胺脂、肟菌酯、烯肟菌酯等。但是，有许多研究报道，化学杀菌剂具有一定的毒副作用。美国国家科学院（NAS）的报道指出，杀菌剂的应用造成了人类健康的危害性，全美9种致瘤化合物的销售量占所有杀菌剂90%左右，在用于食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致癌危险。更为严重的是，化学杀菌剂的残留水平在不断升高，同时导致了耐药性病原菌的产生。近年来由于大量使用杀菌剂而引起指状青霉和意大利青霉的获得性抗性已经成为采后病害防治的一大难题而引起人们的重视。因此，寻找低毒性、高效、环保和残留量低的杀菌剂的替代品非常迫切。

无论植物的抗病品种还是感病品种，都具有潜在的抗病机制，经过外源因子诱导后可以表现出来，从而使植物获得对病原物的抗性，这一现象称之为诱导抗病性。将植物诱导抗病理论和技术引入到果蔬采后病害防治中是对传统的果蔬产品病害防治观念的一次革新，具有良好的应用前景。

许多研究报道外源因子如一些生物、物理和化学激发子都能诱导果实采后的抗性。经大量的研究证明果实抗性的化学激发子诱导已成为一种非常成熟和简易的操作，其对果实抗性诱导及防御各种逆境因子对果实的危害方面是有效的。化学激发子能够诱导果实产生抗病性，较生物诱导因子具有容易生产、运输的特点，而且储藏成本低，防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，其使用更为广泛，因此开发化学诱抗剂对于商业化应用有广阔的发展前景。中国发明专利（申请号200580006760.2，在植物中诱导抗性的混合物和方法）提供了一种使用了两种或者多种化合物，包括水杨酸、促进性化合物、调节性化合物，通过刺激植物天然防御系统，增强植物诱导抗性抑制病原菌的侵染的方法；中国发明专利（申请号201010118266.8，利用提高植物免疫力防治植物病毒害的方法及其用途）提供了一种使用了多种化合物诱导植物免疫系统使植物产生对植物病毒抗性用于植物保护的方法。中国发明专利（申请号200810140359.3，一种果蔬保鲜剂及其制备与应用）提供了一种通过以牛蒡低聚糖为主要成分的混合物诱导果蔬系统获得抗性的方法。

γ-氨基丁酸(GABA)又称4-氨基丁酸，是一个四碳非蛋白氨基酸，它广泛存在于动物、植物和微生物中。长久以来，GABA被认为是植物或微生物的代谢产物。在安全方面，美国环境保护署（EPA）已经确认这种物质在植物或果实上使用时对环境和人健康无任何毒害作用。GABA成本低廉，容易生产、运输，而且防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，并具有镇静神经、抗焦虑、降低血压、增进脑活力、抗衰老等生理功能，开发GABA作为化学保鲜剂，非常具有市场潜力。中国发明授权专利《γ-氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力的新用途》，专利号200810239320.7，公开了γ-氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用和γ-氨基丁酸在促进植物生长，提高植物产量，提高植物品质中的应用。试验证明，用一定浓度的γ-氨基丁酸通过种子处理、叶面喷施等方式，可提高农作物忍耐能力，减少高温、低温等温度胁迫带来的危害，减少产量损失。中国发明授权专利《一种通过γ-氨基丁酸诱导提高植物抗盐性的方法》，专利号200710098727.8，公开了一种提高植物抗盐性的方法。该方法是对植物用浓度为0.1-10mmol·L^-1的γ-氨基丁酸进行处理，植物的抗盐性获得提高；所述处理方式选自叶面喷施、浸种、浸根和根际注射中的一种或几种配合使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂及其使用方法；本发明在不使用化学杀菌剂的条件下，实现了采用化学激发子抑制果实采后病害的保鲜。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂：为浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸(GABA)水溶液。

作为本发明的用于诱导果实抗性控制病害的制剂的改进：病害（果实病害）为青霉病、炭疽病或绿霉病。

作为本发明的用于诱导果实抗性控制病害的制剂的进一步改进：

当果实为梨时，γ-氨基丁酸(GABA)的浓度为100μg/ml；

当果实为枇杷时，γ-氨基丁酸(GABA)的浓度为1000μg/ml；

当果实为柑橘时，γ-氨基丁酸(GABA)的浓度为100μg/ml。

本发明还同时提供了上述制剂的使用方法（从而实现降低果实病害的发病率），为以下任一方式：

方式A：将浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液于果实采摘前24～72小时喷洒在果实表面，直至果实表面润湿；

方式B：将采摘后6～36小时（优选时间为24小时）的果实浸泡（果实被浸没即可）在浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液中，浸泡时间为1～30分钟（较佳为10分钟）。

作为本发明的使用方法的改进：将方式B所得的果实于4～25℃的恒温、相对湿度90%的恒湿条件下诱导12～36小时，较佳为诱导24小时。

本发明利用γ-氨基丁酸作为化学激发子，从而诱导获得对果实病害控制更有效的方法。本发明使用γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml～1000μg/ml作为制剂，果实利用本发明的制剂按照上述使用方法处理后，可有效防治青霉病、绿霉病、炭疽病。本发明所述的果实包括梨、柑橘和枇杷等。

本发明的优点是：

（1）本发明中的γ-氨基丁酸为化学制剂，产品成本低廉，容易生产、运输，而且防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，其可以广泛用于柑橘、梨、苹果、水蜜桃等多种水果种类与品种，可以减少果实的腐烂，延长水果保鲜期，减少资源浪费和经济损失；

（2）诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；

（3）本发明中的γ-氨基丁酸对环境和人健康无任何毒害作用，大幅度降低化学杀菌剂的使用，保证食品安全并减少环境污染，从而促进农业生态环境的健康发展，具有良好的社会效益和生态效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是γ-氨基丁酸不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响；

其中图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

图2是γ-氨基丁酸不同诱导时间对梨果实青霉病抗性的影响；

其中图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

图3是冷藏条件下γ-氨基丁酸对梨果实青霉病抗性的影响；

其中图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

具体实施方式

下述案例中，除了采摘前，其余整果处理的果实均为采摘后24小时内的果实。

实验1γ-氨基丁酸对梨果实抗性的影响

实验1.1γ-氨基丁酸不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口5个。每个伤口处分别对应加入等量（30μl）1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/mlγ-氨基丁酸溶液，在25℃恒温、恒湿条件（相对湿度90%）下诱导24小时，以加入等量的无菌水作为对照。

（3）诱导结束后，在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度γ_-氨基丁酸的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取9个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响如图1所示（检测时间为第5天）。

3、结果：

如图1所示，γ-氨基丁酸在低浓度1μg/ml时，完全不能抑制梨果实的青霉病害，但是当浓度提高到10μg/ml～1000μg/ml时，可以明显降低病害的发生率（44.4%、11.1%、5.6%），γ-氨基丁酸100μg/ml相比对照处理，发病率降低了69.4%，有效的抑制了青霉病害，与1000μg/ml无明显差异。

实验1.2γ-氨基丁酸不同诱导时间对梨果实青霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口2个。每个伤口处加入等量（30μl）100μg/mlγ-氨基丁酸，在25℃恒温、恒湿条件（相对湿度90%）下诱导0、6、12、24、36小时，以加入等量的无菌水作为对照。

（3）诱导结束后在原伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对γ-氨基丁酸不同诱导时间的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取9个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸不同诱导时间对梨果实青霉病抗性的影响如图2所示（检测时间为第6天）。

3、结果：100μg/mlγ-氨基丁酸诱导抗性随诱导时间的增加而增加，诱导6小时，由于作用时间较短，没有明显的抑制效果，但从12小时开始发病率显著下降。诱导24、36小时，发病率仅为22.2%和11.1%，与对照处理比较，分别下降了54.5%和66.6%，病斑直径也随着诱导时间的延长而呈下降趋势，由于诱导24小时与36小时之间差异不大。因此说明，选取24小时作为诱导果实抗性的最佳时间在本发明中是最为合理的。

实验1.3冷藏条件下γ-氨基丁酸对梨果实青霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口3个。伤口处加入（30μl）100μg/mlγ-氨基丁酸，在25℃恒温、恒湿条件（相对湿度90%）下诱导24小时，以加入等量的无菌水作为阴性对照，以加入等量的水杨酸（SA100μg/ml）作为阳性对照。

（3）诱导结束后在原伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在低温下（4℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，从接入病原菌的第16天开始，每隔4天定时后观察并记录结果，对γ-氨基丁酸在低温下诱导效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取9个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

冷藏条件下γ-氨基丁酸对梨果实青霉病抗性的影响如图3所示。

3、结果：在低温条件下贮藏，对照组与处理组果实青霉病的发病情况均明显减弱。在低温贮藏的早期（接入病原菌后的第16天），100μg/mlγ-氨基丁酸可以完全抑制梨果实青霉病害的发生。到第20天时，对照组发病速度较快，分别达到了50%和38.0%，而γ-氨基丁酸诱导处理的发病率仅为3.70%，相比阴性对照降低了46.3%，比阳性对照降低了34.3%，有效减缓了果实青霉病的发生率。到第24天和第28天时，γ-氨基丁酸处理组发病率虽略有升高，但仍显著低于对照组。在病斑直径上也体现相同的结果。

因此，本发明提供的γ-氨基丁酸诱导方法在低温贮藏下也具有十分明显的效果。

实验2γ-氨基丁酸不同诱导浓度对枇杷果实炭疽病抗性的影响

1、实验材料：

果实为枇杷，品种为红沙枇杷。

病原菌：炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioiles），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口5个。每个伤口处分别加入等量（30μl）1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/mlγ-氨基丁酸，在25℃恒温、恒湿（相对湿度90%）条件下诱导24小时，以加入等量的无菌水作为对照；

（3）、诱导结束后在伤口处接入1×10⁴spores/ml炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioiles悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度γ-氨基丁酸的效力进行比较，结果以平均病斑直径（mm）表示。选取10个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸不同诱导浓度对枇杷果实炭疽病抗性的影响如表1所示。

表1、γ-氨基丁酸不同诱导浓度对枇杷果实炭疽病抗性的影响（检测时间为第6天）

3、结果：如表1所示，不同浓度的γ-氨基丁酸伤口处理均能一定程度上抑制枇杷果实采后炭疽病害。其中伤口处理在接种病原菌后的3-5天，处理组的病斑直径相比对照明显下降，但γ-氨基丁酸不同浓度之间没有差异。但在第6天时，对照组和1μg/ml～100μg/ml处理组的果实也快速发病，而只有1000μg/mlγ-氨基丁酸的浓度可以明显抑制病害后期的发生和发展，其病斑直径仅为11.3mm。因此本发明提供的1000μg/mlγ-氨基丁酸伤口处理对于枇杷果实炭疽病的抑制均有明显效果。

实施例1、

将实验1.1的处理步骤的（2）改成以下内容：

梨果实分别在10μg/ml、100μg/ml、1000μg/mlγ-氨基丁酸中浸泡10分钟自然晾干，以无菌水作为对照，然后在25℃恒温、恒湿条件（相对湿度90%）下诱导24小时后，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。

其余内容等同于实验1.1。

γ-氨基丁酸整果处理对梨果实青霉病抗性的影响如下表2所示。

表2、γ-氨基丁酸整果处理对梨果实抗性的影响（检测时间为第5天）

处理号	处理	发病率（%）
			1	空白对照	94.4±5.6
2	10μg/mlγ-氨基丁酸	90.5±5.6
			3	100μg/mlγ-氨基丁酸	72.2±5.6
4	1000μg/mlγ-氨基丁酸	70.8±5.6

如表2所示，γ-氨基丁酸100μg/ml整果处理后病害发生率相比对照也降低了22%左右。因此，说明本发明100μg/mlγ-氨基丁酸是诱导梨果实抗性的最适处理浓度。

对比例1、将实施例1中的100μg/mlγ-氨基丁酸分别改成改成100μg/ml的2-氨基丁酸、3-氨基丁酸。其余内容等同于实施例1。

按照上述方法进行检测，所得的发病率为90.6±5.6%、81.4±6.7%。

实施例2、

将实验2的处理步骤的（2）改成以下内容：

枇杷分别在1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/mlγ-氨基丁酸溶液中浸泡10分钟自然晾干，以无菌水作为对照，在25℃恒温、恒湿条件（相对湿度90%）下诱导24小时后，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。

γ-氨基丁酸整果处理对枇杷果实炭疽病抗性的影响如表3所示。

表3、γ-氨基丁酸不同诱导浓度对枇杷果实炭疽病抗性的影响（检测时间为第6天）

结果：如表3所示，不同浓度的γ-氨基丁酸整果处理均能一定程度上抑制枇杷果实采后炭疽病害。从整果处理的结果也可以看出，第6天时，只有1000μg/ml的浓度控制病害的效力较为突出，对照组病斑直径第6天已达到13.2mm，1000μg/ml仅为10.2mm。

因此本发明提供的1000μg/mlγ-氨基丁酸伤口和整果处理对于枇杷果实炭疽病的抑制均有明显效果。

对比例2、将1000μg/mlγ-氨基丁酸分别改成1000μg/ml的2-氨基丁酸、3-氨基丁酸。其余内容等同于实施例2。

按照上述方法检测，第6天的病斑直径分别为12.8mm、12.1mm。

实施例3、γ-氨基丁酸对柑橘果实绿霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为柑橘，品种为中晚熟宫川蜜橘，产地为浙江省淳安县塔山乡里商村。

病原菌：指状青霉（Penicillium digitatum），25℃活化7天备用。

2、处理：

2.1采前处理：

采前试验设置以下3个处理：

1）空白对照，即水处理对照。

2）、γ-氨基丁酸处理：每升制剂中γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml。于果实采摘前48小时，将制剂液均匀喷洒至果实表面，直至果实表面润湿。两天后采收，用保鲜膜单果包装备用。

2.2采后整果处理：

柑橘果实在100μg/mlγ-氨基丁酸中浸泡10分钟自然晾干，以无菌水作为对照，然后于25℃恒温、恒湿条件下诱导24小时。

2.3采后接种病原菌观察对抗性的影响

采前处理的果实采收后当天运回实验室。将上述采前处理和整果处理的果实分别用无菌打孔器在果实赤道处制造大小统一的伤口（直径约5mm，深度约3mm），每个果实4个伤口，每个伤口处等量加入20μl的指状青霉孢子悬浮液，浓度为1×10⁴spores/ml。每处理重复3组，每组15个果实。3天后观察发病率和病斑直径。

γ-氨基丁酸对柑橘果实绿霉病抗性的影响如表4所示。

3、结果：如表4所示，100μg/mlγ-氨基丁酸采前处理和整果处理均能显著增强柑橘果实对绿霉病的抗性，其降低平均病害发病率分别达17.0%和36.6%，病斑直径的降低率达47.8%和47.7%。因此，本发明提供的γ-氨基丁酸诱导柑橘果实抗性的技术效果非常显著，具有良好的实用价值和应用前景。

表4、γ-氨基丁酸对柑橘果实绿霉病的控制

对比例3、将100μg/mlγ-氨基丁酸改成100μg/ml的2-氨基丁酸或3-氨基丁酸。其余内容等同于实施例3。

按照上述方法检测，2-氨基丁酸整果处理时的发病率为79.4±7.8%，3-氨基丁酸整果处理时的发病率为66.6±5.4%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.用于诱导果实抗性控制病害的制剂，其特征是：为浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的用于诱导果实抗性控制病害的制剂，其特征是：病害为青霉病、炭疽病或绿霉病。

3.根据权利要求1或2所述的用于诱导果实抗性控制病害的制剂，其特征是：

当果实为梨时，γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml；

当果实为枇杷时，γ-氨基丁酸的浓度为1000μg/ml；

当果实为柑橘时，γ-氨基丁酸的浓度为100μg/ml。

4.如权利要求1～3任一所述制剂的使用方法，其特征是：为以下任一方式：

方式A：将浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液于果实采摘前24～72小时喷洒在果实表面，直至果实表面润湿；

方式B：将采摘后24小时内的果实浸泡在浓度为100～1000μg/ml的γ-氨基丁酸水溶液中，浸泡时间为1～30分钟。

5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征是：将方式B所得的果实于4～25℃的恒温、相对湿度90%的恒湿条件下诱导12～36小时。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征是：所述诱导时间为24小时。

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