CN103830239B

CN103830239B - 红曲色素组份及其衍生物在抗阿尔兹海默症中的应用

Info

Publication number: CN103830239B
Application number: CN201410099998.5A
Authority: CN
Inventors: 郑允权; 潘启胜; 郭养浩; 石贤爱
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: CN103830239A

Abstract

本发明公开了一种红曲色素组份及其衍生物作为制备抗阿尔兹海默症药物和保健品的应用，红曲色素组份为红曲霉菌的发酵产物或发酵产物的提取纯化产物，包括红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素、红斑胺、红曲红胺、莫娜斯佛瑞尔A和莫娜斯佛瑞尔B，红曲色素组份的衍生物是由红曲色素组份经生物转化或化学修饰合成。该类化合物可作为防治阿尔兹海默症的药物和保健品添加剂，且其对人体正常细胞毒副作用很小，具有较好的发展前景。

Description

红曲色素组份及其衍生物在抗阿尔兹海默症中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和药物开发领域，具体涉及一种红曲色素组份及其衍生物作为制备抗阿尔兹海默症药物的用途。

背景技术

在我国红曲生产及应用已有1000多年历史。红曲产品是传统发酵产品，常用于食品着色、酿酒以及药用。红曲色素是红曲霉菌生长过程中产生的次级代谢产物，广泛作为天然食品色素，同时具有一定的防腐、消炎和抗氧化的生物活性作用。目前国内外对红曲色素产品的需求增长很快。

红曲色素属于Azaphilone化合物，由真菌聚酮合成酶（PolyketideSynthases，PKS）代谢途径合成，主要有六种，分别为红曲素两种（红斑胺、红曲红胺）、黄色素两种（红曲素、红曲黄素）和橙色素两种（红斑素、红曲红素）。另有一些新的红曲霉菌Azaphilone代谢产物被发现，如xanthomonasinA和B具有抑制NorI活性的作用；MonascopyridineA和B能抑制永生化人肾上皮细胞生长，EC₅₀介于11-31μmol/L；还有一些结构的作用还未被进一步揭示，如MonasfluoreA和B。现代药理学研究表明Azaphilone类化合物对鞘氨醇激酶、脂肪酸合成酶、端粒酶、gp120-CD4、Grb2-SH2和p53-MDM2等三大疾病(癌症、爱滋病和心血管疾病)相关的关键酶蛋白具有重要的生物活性作用。而红曲色素组份的生物活性，如黄色素的治疗代谢综合症和抑癌作用已引起国内外学者的广泛重视。

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种多发于老年期的神经系统退行性疾病，其临床特征主要表现在记忆力减退和认知功能障碍。β-淀粉样蛋白(βamyloidprotein，Aβ)聚集所形成的老年斑(senileplaques，SP)、过度磷酸化的tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)和神经元细胞的丢失是AD最主要的病理特征。迄今为止，阿尔茨海默病的发病原因尚不明确，现有的药物只能在一定程度上缓解症状却并不能逆转疾病的进程。我国流行病学资料显示，2011年我国阿尔茨海默病患者增至800万人，人数位居世界各国之首，60岁以上老人患阿尔茨海默病的几率约为4.8%，65岁以上阿尔茨海默病的发病率高达7.2%。美国早老性痴呆症协会最新发布的报告《2012年早老性痴呆症事实和数据》显示，美国目前共有约540万早老性痴呆症患者。美国65岁以上老人中，13%患有早老性痴呆症；85岁以上老人中的该病患者比例高达45%。伴随全球人口老龄化趋势，阿尔茨海默病将成为医疗领域和公共卫生领域面临的巨大挑战，严重危害人类生活和生命质量，因此，寻找和开发具有治疗或预防阿尔茨海默病的新药刻不容缓。

AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种病理过程。其主要的组织病理学改变包括：神经元纤维缠结（neurofibrillarytanglesNFTs），神经炎斑（neuriticplaquesNP或老年斑senileplaquesSP），神经元丢失，淀粉样血管改变（amyloidangiopathy）。而神经炎斑的核心成分为β淀粉样蛋白（amyloidbeta－proteinAβ）。β淀粉样蛋白是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤、死亡，在AD的发病中起着相当重要的作用。

虽然，台湾大学的潘子明教授课题组已经发现红曲霉发酵产物具有抗阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）的药用价值，可延缓病程恶化，并有改善记忆学习的功效[Chun-LinLee,Tzong-FuKuo,Jyh-JyeWangetal.RedMoldRiceAmelioratesImpairmentofMemoryandLearningAbilityinIntracerebroventricularAmyloidβ-InfusedRatbyRepressingAmyloidβAccumulation.JournalofNeuroscienceResearch,2007,85:3171-3182.]。此文中，潘子明教授课题组分别采用红曲粗提物和洛伐他汀作为药物成分研究其抗AD活性，结果认为红曲之所以具有抗AD活性，起主要作用的是一种红曲霉发酵产物—洛伐他汀，而对于其他的红曲霉发酵产物（例如红曲色素组份）所具有的活性并未公布。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红曲色素组份及其衍生物在抗阿尔兹海默症中应用，红曲色素组份及其衍生物对人体正常细胞毒副作用很小，可作为防治阿尔兹海默症的药物和保健品添加剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种红曲色素组份及其衍生物在抗阿尔兹海默症中应用，主要用于制备抗阿尔兹海默症药物和保健品；

所述红曲色素组份为红曲霉菌的发酵产物或发酵产物的提取纯化产物，包括红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素、红斑胺、红曲红胺、莫娜斯佛瑞尔A和莫娜斯佛瑞尔B，具体分子结构如下：

；

所述红曲色素组份的衍生物是由红曲色素组份经生物转化或化学修饰合成。

主要生物转化或化学修饰的位置为分子结构中的2-3位、4位或6位。

2-3位修饰是由内脂结构转为开环结构，反应式如下：

其中M为铵离子、钾离子、钠离子、镁离子、锌离子、铁离子中的任一种。

4位修饰为羰基转化为羟基，反应式如下：

。

6位的修饰为氧杂环转变为氮杂环化合物，反应式如下：

。

所述含氮杂环化合物的氮来源于氨基酸的氨基；

所述的氨基酸为碱性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸中的任一种。

本发明的显著优点在于：本发明提供了一种红曲色素组份及其衍生物作为制备防治阿尔兹海默症药物和保健品的新用途，拓展了红曲色素组份及其衍生物的利用领域。通过实验得知，红曲色素组份及其衍生物对Aβ1-42诱导的脑神经瘤细胞（Neuro-2a）均具有抑制凋亡活性，且其对人体正常细胞毒副作用很小，具有较好的发展前景。

具体实施方式

一种红曲色素组份及其衍生物用于制备抗阿尔兹海默症药物和保健品的应用；

；

其中，红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素、红斑胺和红曲红胺见文献（Blanc,Loretetal.1994），莫娜斯佛瑞尔A和B见文献（Huang,Xuetal.2008）。

红曲色素组分的提取方式可以采用水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂、乙酸丁脂等一种或多种混合溶液进行萃取，纯化方式可以采用硅胶柱、C18柱、大孔吸附树脂、高速逆流萃取色谱等一种或多种方法联合纯化。

所述红曲色素组分的衍生物是由红曲色素组份生物转化或化学修饰合成，主要修饰位置为2-3位、4位或6位。

2-3位修饰为内脂转为开环结构，具体反应如下：

；

M是医学上可以接受的铵离子、钾离子、钠离子、镁离子、锌离子或铁离子中的一种，优选钾离子、钠离子、铵离子中的任一种。

4位修饰为羰基还原为羟基，具体反应如下：

。

6位修饰为氧杂环转变为氮杂环化合物，氮来源于氨基酸的氨基，具体反应如下：

；

红曲色素组份及其衍生物的存在形式是晶体，晶型为晶体或无定型；或者为离子状态，或者以盐存在于液相、固相以及固液混合物中。

通过下面给出的本发明的几个具体实施例，进一步描述本发明，但是它们不是对本发明的限定：

实施例1

（1）红曲素、红曲红素、红斑胺、莫娜斯佛瑞尔A纯化组分的制备：按照CN101862324B专利文件中所提到的提取、纯化方法制得。

（2）对上述红曲色素组份的活性作用进行测定：

细胞培养和药物处理：冻存的Neuro-2a细胞（即脑神经瘤细胞）经复苏传至培养瓶中，用含有40U/mL庆大霉素和10%胎牛血清的MEM-EBSS培养基于37℃，5%CO₂培养箱中培养。当细胞单层生长达80%时，用不含EDTA（乙二胺四乙酸)的0.25%胰蛋白酶消化，弃去胰酶，用MEM培养基终止消化并反复吹打细胞至细胞分布均匀，待细胞计数后，将细胞按1×10⁴个/孔接种于96孔板或按5×10⁵个/孔接种于6孔板，过夜贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时弃去培养基进行药物干预实验。

MTT细胞存活率测定：药物处理后孵育24h，吸弃培养基，每孔加入100μLMTT溶液（溶于无血清无酚红培养基中，终浓度为0.5mg/mL），37℃反应4h。吸弃含MTT的培养基，加入150μLDMSO（二甲基亚砜），室温轻微震荡10min，置酶标仪于570nm测吸光度OD值。重复3次测定并计算细胞抑制率，计算方法如下：

细胞抑制率%=（空白组OD值－实验组OD值/空白组OD值）×100%；

其中，空白组为未经Aβ1-42（β淀粉样蛋白1-42）处理的一组；。

测定结果表明：以1、5、10、15μmol/L的Aβ1-42处理后对应Neuro-2a细胞的抑制率分别为:4.2±1.586%、24.2±3.289%、34.5±3.006%（Abeta处理组）、48.8±2.046%。由于采用10μmol/L的Aβ1-42能显著降低Neuro-2a细胞的存活(P<0.05)，因此，此浓度可以建立AD的细胞凋亡模型用于抗AD药物的筛选。

在添加10μMAβ1-42的条件下，加入不同浓度的红斑胺药物（10、50、100μM），细胞抑制率由原来的34.5%分别降低至30%、22.5%、20%；按照上述的试验步骤，将红斑胺替换为红曲素，抑制率由原来由原来34.5%分别降低至32.3%、27.7%、24.2%；将红斑胺替换为红曲红素，抑制率由原来34.5%分别降低至30.7%、26.4%、22.3%；将红斑胺替换为莫娜斯佛瑞尔A，抑制率由原来34.5%分别降低至32.3%、28.5%、25.9%。与Abeta处理组相比，红斑胺、红曲素、红曲红素、莫娜斯佛瑞尔A均能够显著提高Aβ1-42损伤的Neuro-2a细胞的存活率，表明其均具有抗AD活性。

实施例2

红曲红素6位修饰衍生物N-戊二酰基红曲红胺的制备：按照CN101862324B专利文件中所提到的N-戊二酰基红曲红胺制备方法来制备。

在添加10μMAβ1-42的条件下，加入不同浓度的N-戊二酰基红曲红胺（10、50、100μM），抑制率由原来的34.5%分别降低至31.4%，23.9%，18.3%，即N-戊二酰基红曲红胺能够显著提高Aβ1-42损伤的Neuro-2a细胞的存活率，表明其具有抗AD活性。

实施例3

红斑胺4位修饰衍生物4-羟基红斑胺的制备：按照CN101862324B专利文件中所提到的4-羟基红斑胺制备方法来制备。

在添加10μMAβ1-42的条件下，加入不同浓度的4-羟基红斑胺（10、50、100μM），抑制率由原来的34.5%分别降低至29.3%，24.7%，20.4%，即4-羟基红斑胺能够显著提高Aβ1-42损伤的Neuro-2a细胞的存活率，表明其具有抗AD活性。

实施例4

红曲素2-3位修饰制备红曲素羧酸钠的方法：取红曲素1g溶解于100mL70%的乙醇溶液中，70℃条件下加入1gNaOH，反应1小时后采用硅胶柱纯化，无水甲醇洗脱，收集红曲素羧酸钠组分洗脱样品，真空浓缩至原体积1/2即析出晶体，红曲素羧酸钠晶体采用HPLC-MS测定，其分子量398，纯度为98.6%。

在添加10μMAβ1-42的条件下，加入不同浓度的红曲素羧酸钠（10、50、100μM）：抑制率由原来34.5%分别降低至28.2%，23.4%，19.1%，即红曲素羧酸钠能够显著提高Aβ1-42损伤的Neuro-2a细胞的存活率，表明其具有抗AD活性。

实施例5

莫娜斯佛瑞尔A4位修饰制备4-羟基莫娜斯佛瑞尔A的方法：取莫娜斯佛瑞尔A1g溶解于100mL70%的乙醇溶液中，30℃条件下加入5mL1mol/L硼氢化钠，反应1小时后采用硅胶柱纯化，无水甲醇洗脱，收集4-羟基莫娜斯佛瑞尔A组分洗脱样品，真空浓缩至原体积1/2即析出晶体，4-羟基莫娜斯佛瑞尔A晶体采用HPLC-MS测定，其分子量358，纯度为98.6%。

添加10μMAβ1-42的条件下，加入不同浓度的4-羟基莫娜斯佛瑞尔A（10，50，100μM）：抑制率由原来34.5%分别降低至31.3%，26.6%，23.1%，即4-羟基莫娜斯佛瑞尔A能够显著提高Aβ1-42损伤的Neuro-2a细胞的存活率，表明其具有抗AD活性。

Claims

1.一种红曲色素组份及其衍生物在抗阿尔兹海默症中的应用，其特征在于：所述红曲色素组份及其衍生物用于制备抗阿尔兹海默症药物和保健品；

所述红曲色素组份为莫娜斯佛瑞尔A或莫娜斯佛瑞尔B；

所述红曲色素组份的衍生物为莫娜斯佛瑞尔A经生物转化或化学修饰得到的4-羟基莫娜斯佛瑞尔A。