CN103820488A

CN103820488A - 一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

Info

Publication number: CN103820488A
Application number: CN201410077200.7A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 吴东海
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明公开了一种多基因共转化毕赤酵母的新方法。利用本方法，可以实现多个需要表达的外源基因连接到同一毕赤酵母表达载体，在该表达载体中，每个基因都位于彼此独立的表达框内；用构建的共表达载体转化毕赤酵母，可以实现多个基因高效且同时稳定整合到毕赤酵母基因组中。该方法为实现多个基因同时在同一毕赤酵母细胞中独立表达提供了有效的新方法。

Description

一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

技术领域

本发明涉及一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，具体来说涉及两个及以上基因共转化酵母并获得多基因整合到同一毕赤酵母基因组中的方法，该酵母转化子中各外源基因在相同且又彼此独立的基因表达调控元件控制下具有独立表达的能力。

背景技术

甲醇酵母表达系统是目前应用非常广泛的酵母表达系统。以Pichia pastoris（P. pastoris，毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具有以下几个优点：①具有特有强力醇氧化酶基因AOX1启动子，用甲醇可以严格调控外源蛋白的表达；②作为真核表达系统，表达的蛋白可以进行翻译后加工和修饰；③易于利用发酵罐进行高密度连续培养，大量表达目的产物；④营养要求低，生长快，可以在廉价的非选择性培养基中生长；⑤表达量高，许多蛋白可达到克/升及以上水平；⑥在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于胞内又可分泌至胞外；⑦糖基化程度低。利用启动子AOX1，已在毕赤酵母中高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段和基因工程抗体等多种外源基因。该系统是一种以提高表达量并保持生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，非常适宜扩大为工业规模。该系统表达的Cephelon制剂等早已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。

到目前为止，虽然有数千个外源基因实现了在毕赤酵母中的表达，但这些都是单一的外源基因在毕赤酵母中表达。为实现两上或以上基因在同一毕赤酵母中表达，目前主要方法有：（1）将多个需要表达的外源基因融合再转化酵母进行表达；（2）将外源基因串联于一个读码框架内，利用IRES实现两个基因的各自表达；（3）分别构建外源基因的表达载体，先将其中的一个转化毕赤酵母，得到酵母转化子，然后将另一个基因再次转化已转入一个基因的酵母中，以实现两个基因同时整合到酵母基因组中。然而，以上3种方法都存在明显的不足：首先，将不同的通过PCR连接，进行融合再构建表达载体。这种方法所得到的转化子的表达产物只能是两个基因融合的产物，并且将基因进行融合表达的毕赤酵母转化子的分泌表达量很低，其低水平分泌表达的主要原因之一可能是两亚基的基因片段融合所得到的融合基因片段明显变大，这可能影响到基因的转录、翻译及蛋白质的分泌；其次，将两个亚基串联于一个读码框架内，利用IRES实现两个或多个基因的各自翻译，从而获得目标蛋白。但是，利用该方法得到的产物的表达量往往非常低。其原因主要在于，两个或多个基因串联于同一个读码框内，再加上IRES序列，基因片段比融合表达的基因片段更大，在仅有共同的表达调控元件调空下，尤其是在唯一的启动子控制下，会影响基因的转录和翻译，从而很难获得高水平分泌表达的毕赤酵母转化子；最后，分别构建外源基因的表达载体，先将其中的一个转化毕赤酵母，得到酵母转化子，然后将另一个基因再次转化已转入一个基因的酵母中，以实现两个基因同时整合到酵母基因组中的方法往往较难筛选到两个基因同时插入的酵母转化子，因为当转化第二种基因时，第一个基因很可能被从染色体中重组而去除掉；若要得到3个及个以上基因共表达的酵母转化子概率更低，很难筛选到所有基因都整合的酵母转化子。因此，建立一种快速、简便的多基因共转化毕赤酵母的方法将有助于实现多个基因在酵母中共表达，为重组蛋白尤其是包含两个以上不同亚基的外源蛋白在毕赤酵母中共表达提供一种新的方法。

发明内容

基于此，本发明提供一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，利用本方法，可以实现将需要表达的多个外源基因克隆到同一毕赤酵母表达载体中，在该表达载体中，每个基因都位于彼此独立的表达框内；同时，用构建的该表达载体电转化毕赤酵母，其生长出的酵母转化子经PCR分析，可以得到同时含有全部多个基因的酵母转化子，实现多个基因同时整合到酵母基因组中，每个基因都在相同且独立的表达调控元件控制下，可以实现独立且共同表达。该方法为实现多个基因同时在酵母中彼此独立表达提供了一种新的有效方法。

解决上述问题的技术方案如下（以共转2个基因为例）：

1）PCR分别扩增2个目标基因（命名为A基因和B基因，本发明中A、B基因分别以常用的绿色荧光蛋白基因eGFP和红色荧光蛋白基因Cherry为代表），分别构建目标基因的酵母表达载体（以酵母分泌表达载体pPICZα为例）pPICZα-A和pPICZα-B；

2）Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-A，得到A基因酵母的独立表达框“Box-A”；BamH I单酶切pPICZα-B，将“Box-A”和酶切后的pPICZα-B进行连接，得到同时含有A基因及B基因的酵母表达载体载体pPICZαA/B；

3）电转化毕赤酵母，涂布YPDZ抗性平板，转化子长出后，利用A基因及B基因的引物PCR法对转化子进行验证，检测A和B基因插入到酵母基因组中的情况，挑选出既能扩增出A基因又能扩增出Ｂ基因的转化子即为共表达A、B基因的酵母转化子。

附图说明

图1是 eGFP和Cherry基因的PCR结果；图2是共表达载体的构建示意图；图3是共表达毕赤酵母转化子的PCR验证图。

具体实施方式

本发明选用毕赤酵母X-33菌株，整合性表达质粒pPICZαA载体均购自美国Invritrogen公司。所用培养基配方如下：

1）YPDZ平板：完全溶解1 g 酵母提取物，2g蛋白胨，1.8 g琼脂粉，定容到80 mL，121 ℃蒸气高压灭菌15-20 min，当培养基冷却至60℃加入经灭菌的10%葡萄糖溶液20 mL、100 μL 1 mg/mL的Zeicin，倒10 cm平板，每个平板倒15 mL，室温避光冷却1-2小时后于4℃冰箱中保存备用。 2）LBZ平板：NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，酵母提取物 0.5 g，1.8 g琼脂粉，蒸馏水定容到100 L，高压灭菌，当培养基冷却至60℃加入25 μL 1 mg/mL的Zeicin，倒10 cm平板，每个平板倒15mL，室温避光冷却1-2小时后于4℃冰箱中保存备用。

一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，主要包括以下步骤：

1、克隆eGFP基因：

设计一对引物，以含有eGFP成熟基因的质粒为模板（DNA序列为：ATGGTG AGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAACGGCGG），用特异引物扩增出完整eGFP基因片段，PCR条件为：94℃预变性，45min，一个热循环；94 ℃热变性30 s，55 ℃褪火30 s，72 ℃延伸45 s，30个热循环；72 ℃复性10 min，PCR结果如图1所示。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体（购自于广州TAKARA公司），核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的eGFP的序列一致。PCR扩增引物为：eGFP-for: 5’-GCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；eGFP -rev: 5’-CCGCGGTTGTACAGCTCGTCCATG -3’。其中，GGATCC为EcoR 位点，CCGCGG为Sac

位点；

2、构建毕赤酵母分表达载体pPICZαA/eGFP

1）用EcoR

和Sac

双酶切重组质粒eGFP /pMD20-T，获得目的片断eGFP，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：质粒eGFP /pMD20-T 15 μL；10× 缓冲液 5 μL；EcoR

5 U；Sac

5 U；加无菌水至50 μL；2）用EcoR

和Sac

双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：质粒pPICZαA 15 μL；10× 缓冲液 5 μL；EcoR

5 U；Sac

5 U；加无菌水至50 μL；3）由1）及2）步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；4）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：质粒pPICZαA 片段 1 μL；目的片段落强 3 μL；10×缓冲液 1 μL；T4连接酶 0.5 μL；加无菌水至10 μL。经连接得重组载体pPICZαA/eGFP；

3、克隆Cherry基因：

设计一对引物，以含有Cherry成熟基因的质粒为模板（DNA序列为：ATGGA TTCGGACCGGCCATTACGGCCGCGTATCACGGCCAGGGCGGCCATGCTGTGCTGCATCAGAAGAACTAAACCGGTTGAGAAGAATGAAGAGGCCGATCAGGAGCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGACCCACCGGTAGCATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA），用特异引物扩增出Cherry基因片段，PCR条件为：94℃预变性，45min，一个热循环；94 ℃热变性30 s，55 ℃褪火30 s，72 ℃延伸55 s，32个热循环；72 ℃复性10 min，PCR结果如图1所示。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体（购自于广州TAKARA公司），测定序列与Genebank公布的Cherry的序列一致。PCR扩增引物为：Cherry-for: 5’-GCGGATCCATGGA TTCGGACCGGCCATTAC-3’；Cherry-rev: GCTCTAGATTGTACAGCTCGTCCATG-3’；其中，GGATCC为EcoR

位点，CCGCGG为Xba

位点；

4、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/Cherry

1）用EcoR

和Xba

双酶切重组质粒Cherry /pMD20-T，获得目的片断Cherry，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：质粒Cherry/pMD20-T 15 μL；10×缓冲液 5μL；EcoR

5 U；Xba

5 U；加无菌水至50μL；2）用EcoR

和Xba 双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：质粒pPICZαA 15 μL；10×缓冲液5μL；Xba

5 U；EcoR

5 U；加无菌水至50μL；3）由1）及2）步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；4）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：质粒pPICZαA 1μL；目的片段 3μL；10×缓冲液1μL；T4连接酶 0.5μL；加无菌水至10μL。经连接得重组载体pPICZαA/Cherry；

5、共表达载体pPICZαA-eGFP/cherry的构建

Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα/eGFP，得到eGFP基因酵母的独立表达框“Box-eGFP”；BamH I单酶切pPICZα/Cherry，将“Box-eGFP”和酶切后的pPICZα/Cherry进行连接，LBZ平板筛选转化子，得到同时含有eGFP基因及Cherry基因的酵母表达载体载体pPICZα eGFP/Cherry，表达载体的构建示意图如图2所示。所得的共表达载体pPICZαA-eGFP/cherry经测序结果正确；

6、酵母共表达载体pPICZαeGFP/Cherry电转化毕赤酵母及转化子的验证

提取共表达载体pPICZαeGFP/Cherry，采用电转化法转化毕赤酵母表达菌株X-33，并涂布YPDZ抗性平板，于28℃培养2-3天，待转化子长出后，长出的转化子再次涂布于YPDZ高抗性平板（Zeocin浓度为5 mg/L），待转化子长出后，利用eGFP基因及Cherry基因的引物PCR法对转化子进行验证，检测两个基因插入到酵母基因组中的情况。经PCR检测，随机挑取的8个转化子中，得到了5株能同时扩增出eGFP基因和Cherry基因的酵母转化子，共转化效率达62.5%；随机挑取PCR验证的共转化毕赤酵母转化子划线于YPDZ平板，于28℃培养2-3天，长出的转化子再次划线于YPDZ平板，于28℃培养2-3天，如此传代10次，随机挑选酵母转化子，利用eGFP基因和Cherry基因的特异引物，PCR结果表明，以eGFP基因的特异引物可以扩增出eGFP基因，以Cherry基因的特异引物可以扩增出Cherry基因，同时利用eGFP基因和Cherry基因的特异引物既能扩增出eGFP基因，又能扩增出Cherry基因，PCR验证结果如图3所示。PCR结果说明，利用本方法筛选得到的酵母转化子为同时含有eGFP基因和Cherry基因的稳定酵母转化子，该酵母转化子的eGFP基因和Cherry基因处于相同且彼此独立的Aox1启动子等元件的调控下，可实现独立表达。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化学院

<120> 一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

<130> 2014

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaacggc 720

gg 722

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcggatccat ggtgagcaag ggcgag 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcggttgt acagctcgtc catg 24

<210> 4

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggattcgg accggccatt acggccgcgt atcacggcca gggcggccat gctgtgctgc 60

atcagaagaa ctaaaccggt tgagaagaat gaagaggccg atcaggagct gcagtcgacg 120

gtaccgcggg cccgggaccc accggtagca tccgccacca tggtgagcaa gggcgaggag 180

gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg 240

aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag 300

accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc 360

cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac 420

ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc 480

ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg 540

aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc 600

tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag 660

cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag 720

gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc 780

tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc 840

accggcggca tggacgagct gtacaagtaa 870

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggatccat ggattcggac cggccattac 30

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagatt gtacagctcg tccatg 26

Claims

1.一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，其特征在于，利用该方法可以实现2个及以上基因共转化毕赤酵母（以共转2个基因为例），主要包括以下步骤：

PCR分别扩增多个需要在转化到毕赤酵母中的目标基因（命名为A基因、B基因、C基因、D基因……，等等），分别构建目标基因的酵母表达载体（以酵母分泌表达载体pPICZα为例）pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C pPICZα-D……，等等；本发明以共表达两个基因（A基因和B基因，本发明中A、B基因分别以常用的绿色荧光蛋白基因eGFP和红色荧光蛋白基因Cherry为代表）为例进行说明；

Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-A，得到A基因酵母的独立表达框“Box-A”；BamH I单酶切pPICZα-B，将“Box-A”和酶切后的pPICZα-B进行连接，得到同时含有A基因及B基因的酵母表达载体载体pPICZαA/B；以此类推，若要实现A、B、C三个基因的表达，可将pPICZαA/B BamH I单酶切与利用Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-C所得独立表达框“Box-C”进行连接，得到可独立表达的共表达载体pPICZαA/B/C，以此类推，可以构建更多基因独立表达的多基因共表达载体（本发明以共表达两个基因A、B为例进行说明）；酵母共表达载体载体pPICZαA/B电转化毕赤酵母，涂布YPDZ抗性平板，转化子长出后，利用A基因及B基因的引物PCR法对转化子进行验证，检测A和B基因插入到酵母基因组中的情况，挑选出既能扩增出A基因又能扩增出Ｂ基因的转化子即为共表达A、B基因的酵母转化子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的共表达宿主菌为毕赤酵母，表达载体为毕赤酵母表达载体。

3.根据权利要求1所述的应用，外源基因为任意两种（或两种以上）需要在酵母中独立且共表达的外源基因。