CN103813709A

CN103813709A - 具有增加的油含量的经修饰植物

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Publication number: CN103813709A
Application number: CN201280041569.1A
Authority: CN
Inventors: J·尚克林; C·安德烈
Original assignee: Brookhaven Science Associates LLC
Current assignee: Brookhaven Science Associates LLC
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2014-05-21
Also published as: EP2725895A1; WO2013003608A1; CA2840525A1; EA201490174A1; AU2012275348A1; US20140230091A1; JP2014531194A

Abstract

本发明提供用以增加植物（尤其产油植物）的油含量的方法和手段，其是通过以各种方式防止这些植物的细胞中的乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制来实现。

Description

具有增加的油含量的经修饰植物

本发明是在美国能源部（U.S.Department of Energy）所授予的合同号DE-AC02-98CH10886下通过政府支持而完成。政府对本发明具有某些权利。

相关申请的交叉引用和序列表的并入

本申请要求2011年6月28日提交的美国临时专利申请61/502,163的优先权权益，这个申请以全文引用的方式并入本文中。在名为“58764000510PCT”的文件中所含的序列表与此一同提交并且以引用的方式并入本文中，这个文件为276kb（在MS-Windows操作系统中测得）并且在2012年6月15日创建。

技术领域

本发明关于农学领域。更具体地说，本发明提供用以增加植物、尤其产油植物的油含量的方法和手段，其是通过以各种方式防止这些植物的细胞中的乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制来实现，包括通过提供对反馈不敏感或敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶，通过过度表达FATA基因或乙酰基CoA结合蛋白。

背景技术

植物油在经济上日益重要，因为其被广泛用于人类和动物膳食中以及许多工业应用中，包括作为用以生产生物燃料或生物柴油的再生源。最广泛使用的植物油来源于棕榈（在2008年全球消耗量为4131万吨）或大豆（4128万吨），其次是菜籽油（1824万吨）、向日葵油（991万吨）、花生油（482万吨）棉籽油（499万吨）棕榈仁油（485万吨）椰子油（348万吨）和橄榄油（284万吨）。其他重要的甘油三酸酯油包括玉米油、葡萄籽油、榛子油、亚麻籽油、米糠油、红花油和芝麻油。

增加每株植物的油产量似乎是一种提供更多油用于这些不同目的的有前景的方法，并且避免了一方面用于食物和饲料与另一方面用于工业的油之间的土地竞争。植物中的油合成似乎受脂肪酸的产生所限制，并且脂肪酸生物合成中的第一关键步骤，即，由乙酰基-CoA羧化酶使乙酰基-CoA羧化产生丙二酰基-CoA，已表明是限速的。

Roesler等人1997（Plant Physiol.113,75-81）描述了拟南芥同质型乙酰基-CoA羧化酶的表达以及使蛋白质靶向油菜籽的质体使得种子油增加5%。

Madoka等人2002（Plant Cell Physiol.43,1518-1525）报导了通过质体转化而过度表达质体编码的乙酰基CoA羧化酶羧基转移酶β-亚单元（accD）诱导烟草植物中的叶子油含量增加5-10%。

US5,962,767描述了编码251kD细胞溶质乙酰基CoA羧化酶的拟南芥乙酰基coA羧化酶基因的分离。

WO94/17188披露了具有植物乙酰基-CoA羧化酶的密码的另一个DNA序列以及所述DNA序列的等位基因和衍生物。

WO95/13039关于植物硫酯酶，特别是对棕榈酰基-ACP底物具有实质活性的植物酰基-ACP硫酯酶。描述了适用于在植物种子细胞中表达植物棕榈酰基-ACP硫酯酶的DNA构筑体。这些构筑体将含有在调控元件控制下编码所关注的植物棕榈酰基-ACP硫酯酶的DNA序列，当这类构筑体在转基因植物中表达时，这些调控元件能够相较于其他植物组织优先引导种子组织中植物棕榈酰基-ACP硫酯酶的表达。这个文献还描述了使用编码植物棕榈酰基-ACP硫酯酶的DNA序列来修饰植物种子细胞中所产生的游离脂肪酸部分的方法。在此所例示的植物棕榈酰基-ACP硫酯酶序列包括Cuphea、leek、mango和elm。还提供了由于这些棕榈酰基-ACP硫酯酶序列的表达而使种子中C16:0脂肪酸的水平提高的转基因植物。

WO00/09721关于一种增加作为大豆种子中所存在的总甘油三酸酯的组分的硬脂酸酯的方法。这种方法一般包含种植具有整合到基因组中的DNA构筑体的大豆植物，这种DNA构筑体在转录的5'到3'方向上包含：在大豆植物种子细胞中发挥功能的启动子、编码对C18:0酰基-ACP底物具有实质活性的酰基-ACP硫酯酶蛋白的DNA序列，以及在植物细胞中发挥功能的转录终止区。这个文献还提供了一种大豆种子，其具有约33重量%或更多的硬脂酸酯作为种子甘油三酸酯中所存在的总脂肪酸的组分。

US2010/033329描述了使用酰基-CoA结合蛋白来增强经过遗传修饰的植物的低温耐受性的方法。

US2009/0291479描述了操纵酰基-CoA结合蛋白用于改变微生物宿主中的脂质产生。

US7,880,053描述了在植物修复中使用表达来源于植物的酰基-辅酶A结合蛋白的转化植物的方法。

US2008/0229451描述了在植物中表达微生物蛋白以产生具有改善特性的植物。

生物合成路径的反馈调控通过将对代谢物的需求传达给供应其的酶来优化细胞经济。典型地，当下游代谢物积累并且使得用于其自身产生的限速酶受抑制，从而限制通过整个路径的通量时，反馈发生。不幸的是，这些机制当未知或了解不足时，可能成为成功代谢工程的阻碍。植物脂肪酸生物合成为靶向显示反馈抑制的操纵的此类路径之一（Ramli等人2002,Biochem J,364,385-391；Shintani和Ohlrogge1995,Plant J,7,577-587；Terzaghi1986Plant Physiol,82,780-786）。然而，尚未确定反馈的机制和目标。对这个基本过程的更充分理解将有助于在增加植物中的脂肪酸产生方面的未来工程尝试的设计和分析。

动物、真菌和细菌具有关于脂肪酸生物合成的反馈调控的已知机制。其中的共同特征为乙酰基-CoA羧化酶（ACCase，EC6.4.1.2）的抑制，其单独产生用于脂肪酸合成的丙二酰基-CoA并且被视为脂肪酸合成的限速步骤（Cronan和Waldrop2002Prog Lipid Res,41,407-435；Ohlrogge和Jaworski1997Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,48,109-136；Wakil等人1983Annu Rev Biochem,52,537-579）。在大鼠和酵母中，脂肪酸合成的最终产物棕榈酰基-CoA结合到ACCase上并抑制ACCase（Ogiwara等人1978Eur J Biochem,89,33-41）。另外，酵母ACCase和脂肪酸合酶（FAS）基因表达通过以酰基-CoA依赖性方式整夜暴露于长链脂肪酸而降低（Feddersen等人2007Biochem J,407,219-230）。细菌具有类似反应。大肠杆菌ACCase和β-酮基酰基-酰基载体蛋白合酶（KAS）两者都受脂肪酸合成中间物长链（C16-C18）酰基-酰基载体蛋白（酰基-ACP）抑制（Davis和Cronan2001J Bacteriol,183,1499-1503；Heath和Rock1995J Bioi Chem,270,15531-15538）。在外源脂肪酸存在下生长通过长链酰基-ACP或酰基-CoA与转录因子的相互作用也使细菌脂肪酸生物合成基因（包括ACCase）受抑制（Zhang和Rock2009J.Lipid Res,50增刊,Sl15-119）。基于这些研究，已浮现出一幅画面，其中对从头脂肪酸的较低需求是通过酰基-ACP和/或酰基-CoA的积累而发信号。这些代谢物变构抑制ACCase并且因此可以快速限制用于脂肪酸合成的丙二酰基-CoA的产生。在抑制ACCase之后酰基-ACP和酰基-CoA的水平并未降低的情况下，整个脂肪酸生物合成路径的基因表达受抑制。组合起来，这些反应在细胞需求短期和长期减少的时段内防止脂肪酸不必要的产生。

关于植物中脂肪酸合成的反馈调控的机制尚未确定。吐温-脂肪酸酯有效补给脂肪酸（Terzaghi1986Plant Physiol,82,771-779），并且已显示在以下植物中引起反馈抑制：烟草（Shintani和Ohlrogge1995,Plant J.7,577-587)和大豆（Terzaghi1986Plant Physiol,82,780-786）细胞培养物，以及油棕榈和橄榄愈伤组织（Ramli等人2002BiochemJ,364,385-391）。基于烟草中酰基-ACP的合成速率和ACCase蛋白水平，Shintani和Ohlrogge假定反馈通过ACCase和可能存在的FAS的生物化学或翻译后修饰而发生。经过纯化的玉米和硅藻ACCase受棕榈酰基-CoA抑制（Nikolau和Hawke1984Arch Biochem Biophys,228,86-96；Roessler1990Planta,198,517-525），但长链酰基-ACP未能抑制来自蓖麻和豌豆的部分纯化的ACCase（Roesler等人1996Planta,198,517-525）。然而，中链酰基-ACP抑制芥花和菠菜的粗提取物中的KAS活性（Bruck等人1996Planta,198,271-278）。这些结果与反馈抑制的关联尚不明朗，因为尚未测量在反馈期间酰基-CoA或酰基-ACP的稳态库的变化。由于在质体中和细胞溶质中存在分别负责脂肪酸合成和伸长的结构上不同的ACCase和FAS系统，因此这种情况进一步牵涉到植物中。细胞溶质伸长路径是否对反馈有反应是未知的。先前研究使用营养组织或发芽幼苗来建立细胞培养物，并且因此也不知晓反馈是否在需要高速脂肪酸合成的组织（诸如油籽）中发生。

因此，现有技术缺乏乙酰基-CoA羧化酶的哪个同种型在植物中受到反馈抑制以及哪些分子负责反馈抑制的教示。如下文所描述，这个问题已得到解决，从而防止或避免植物细胞、植物部分、植物组织、种子和植物中乙酰基-CoA羧化酶的反馈抑制，以达到增加脂肪酸合成和油合成的目的，如从不同实施方案和权利要求书中显而易见。

发明概要

在一个实施方案中，本发明关于一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止植物细胞中的质体乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤。这种防止反馈抑制可以通过提供具有乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元的植物细胞（包括提供植物细胞的质体）来实现，这种乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对反馈抑制的敏感性较小。敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元可以由植物细胞中的变体等位基因编码或可以由引入到植物细胞中的转基因编码。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止植物细胞中的质体乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤，其中植物细胞具有来自使用3-羟基丙酸循环进行碳固定的生物体的乙酰基CoA-羧化酶或其一个或多个亚单元，例如来自从以下组中选出的生物体的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元：硫化叶菌目（Sulfolobales）、餐古菌目（Cenarchaeles）、古生球菌目（Archeaoglobales）、除硫球菌目（Desulfurococcales）、热变形菌目（Thermoproteales）、热球菌目（Thermococcales）或盐杆菌目（Halobacterales）。乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元可以来源于从以下组中选出的生物体：勤奋金属球菌（Metallosphaera sedula）、布氏酸菌（Acidianus brierleyi）、硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldaricus）、Cenarcheum symbiosum、闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）、丁酸栖高温菌（Hyperthermusbutylicus）、海生葡萄状嗜热菌（Staphylotthermus marinus）、依赖热丝菌（Thermofilum pendens）、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculumaerophilum、冰岛热棒菌（Pyrobaculum islandicum）、坎地热棒菌（Pyrobaculum calidifontis）、激烈热棒菌（Pyrobaculum furisous）、深海热棒菌（Pyrobaculum abyssi）、掘越氏热棒菌（Pyrobaculumhorykoshii）、死海盐盒菌（Haloarcula marismortui）、盐杆菌属（Halobacterium sp.）NRC-1、Haloquatratum walsbyi、湖渊盐红菌（Halorubrum lacusprofundi）或法老盐碱单孢菌（Natromonaspharaonis）。植物细胞还可以具有来自橙色绿屈挠菌（Chloroflexusauranticus）的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含提供植物细胞的步骤，这种植物细胞具有包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子：

a）植物可表达启动子；

b）编码一个或多个乙酰基CoA-羧化酶亚单元的一个或多个编码区，其具有从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列，优选地为异源编码区；或与从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的编码区；以及任选地

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

DNA分子可以进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区。编码区可以从以下核苷酸序列中选出：从位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID No.1、从位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No6、SEQ ID No8、SEQ IDNo10、SEQ ID No12、SEQ ID No14、SEQ ID No16或SEQ ID No18，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的编码区。在一个特定实施方案中，植物可表达启动子为在质体中表达的启动子并且其中终止和/或聚腺苷酸化区为在质体中发挥功能的转录终止区。DNA分子可以被整合于植物细胞的核基因组中，或者，DNA分子可以被整合于植物细胞的质体的基因组中。植物细胞还可以含有多于一个DNA分子，其各自表达乙酰基-CoA羧化酶的一个亚单元。

本发明还提供一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止植物细胞中的质体乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤，其中防止反馈抑制是通过降低植物细胞的质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平来实现。一个降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平的替代实施方案是通过增加细胞质体中FATA酶的水平。为此，可以将包含以下各项的DNA分子引入到植物细胞中：植物可表达启动子，可操作地连接到编码FATA酶的DNA区，这种FATA酶为例如具有从以下各项中选出的氨基酸序列的FATA酶：氨基酸序列SEQ ID21，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列；以及任选地，在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。此外，DNA分子可以进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区，或植物可表达启动子为在质体中表达的启动子并且其中终止和/或聚腺苷酸化区为转录终止区

在本发明的另一个实施方案中，提供一种用于增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止植物细胞中的质体乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤，其中降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平是通过提高植物细胞中酰基-CoA结合蛋白的水平来实现。为此，可以将DNA分子引入到植物细胞中，其中DNA分子包含可操作地连接到编码酰基-CoA结合蛋白的DNA区的植物可表达启动子；以及任选地，在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。酰基-CoA结合蛋白可以包含从以下各项中选出的氨基酸序列：SEQ ID No23或SEQ ID No25中任一项的氨基酸序列，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列。

在所提及的任一种方法中，植物细胞可以再生到植物中。因此，本发明还提供了如上文所描述的方法，其中植物细胞是在植物中；并且其中油含量是在植物的储油部分（如种子）中得到增加。

这些方法可以应用于任何植物，但尤其适用于产油植物，如油菜，包括欧洲油菜（Brassica napus）、芸苔（Brassica campestris（rapa））、芥菜（Brassica juncea）或埃塞俄比亚芥（Brassica carinata），向日葵、红花、大豆、棕榈、麻风树、亚麻、海甘蓝、亚麻荠、玉米、芝麻、蓖麻子。

本发明进一步提供一种植物，其包含一个或多个质体ACCase变体酶或其亚单元，这种质体ACCase变体酶或其亚单元与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小，例如来自使用3-羟基丙酸循环进行碳固定的生物体的CoA-羧化酶或其亚单元，特别是，其中乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元来自从以下组中选出的生物体：硫化叶菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、热变形菌目、热球菌目或盐杆菌目，例如勤奋金属球菌、布氏酸菌、硫磺矿硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热硫化叶菌、Cenarcheum symbiosum、闪烁古生球菌、丁酸栖高温菌、海生葡萄状嗜热菌、依赖热丝菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculumaerophilum、冰岛热棒菌、坎地热棒菌、激烈热棒菌、深海热棒菌、掘越氏热棒菌、死海盐盒菌、盐杆菌属NRC-1、Haloquatratum walsbyi、湖渊盐红菌或法老盐碱单孢菌。乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元还可以来自橙色绿屈挠菌。

在另一个替代实施方案中，本发明提供一种植物，其包含有包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子：

a.植物可表达启动子；

b.编码一个或多个乙酰基CoA-羧化酶亚单元的一个或多个编码区，其具有从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列，优选地为异源编码区；或与从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的编码区，例如包含以下核苷酸序列的编码区：从位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID No.1、从位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No6、SEQ ID No8、SEQ ID No10、SEQ ID No12、SEQ ID No14、SEQ ID No16或SEQ ID No18，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的编码区；以及任选地

c.在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

DNA分子可以进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区，或植物可表达启动子可以为在质体中表达的启动子并且终止和/或聚腺苷酸化区可以为在质体中发挥功能的转录终止区。植物细胞还可以含有多于一个DNA分子，其各自表达乙酰基-CoA羧化酶的一个亚单元。

本发明进一步提供如本文所描述的植物的细胞、组织、储油组织或种子，以及从这种植物产生的油。

本发明的另一个目的为提供一种嵌合DNA，其包含以下可操作地连接的DNA片段：

a.植物可表达启动子；

b.编码一个或多个乙酰基CoA-羧化酶亚单元的一个或多个编码区，其具有从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列，优选地为异源编码区；或与从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的编码区；以及任选地

c.在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

因此，本发明关于与植物细胞的质体中的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元的用途，其用于增加植物细胞中的油含量。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种用以分离与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的质体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体的方法，其包含以下步骤：

a.产生一大批来源于优选来自植物的反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元；

b.在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温存在下鉴别变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元中每一种的酶促活性；

c.分离在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温存在下与反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有较大酶促活性的那些酶变体或其亚单元。

本发明还提供一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含以下步骤：分离与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体；以及将乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体引入到植物细胞中，优选地通过从编码乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的DNA构筑体转录。

本发明的另一个目的为一种用以分离包含编码乙酰基CoA-羧化酶变体酶（如质体乙酰基CoA-羧化酶变体酶）或其亚单元的变体等位基因的植物细胞或植物的方法，这种乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小，这种方法包含以下步骤：

a.提供植物细胞或植物的群体，其包含一大批变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元；

c.分离包含在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白存在下与反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有较大酶促活性的酶变体或其亚单元的那些植物细胞或植物；

以及通过这种方法获得的植物细胞或植物。

本发明进一步关于一种生产食物、饲料或工业产品的方法，其包含获得如本文所描述的植物以及从这种植物或其部分制备食物、饲料或工业产品的步骤。食物或饲料可以为油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白质；或工业产品可以为生物燃料、纤维、工业化学品、医药品或营养保健品。

附图简述

图1-（a）生长，（b）蛋白质组成，以及（c）在多种浓度的吐温-80下生长的细胞的脂质概况。

图2-在多种浓度的吐温-80下生长8天之后欧洲油菜（B.napus）细胞中的脂肪酸含量。（a）极性脂质中的脂肪酸。（b）三酰甘油（TAG）中的脂肪酸。（c）总脂肪酸含量。所有数据都是平均值±SD（n=3）。FW，鲜重。

图3-欧洲油菜细胞从¹³C-油酰基-吐温中吸收脂肪酸的定量。当向细胞补给10mM13C-油酰基-吐温时13C-脂肪酸出现在（a）极性脂质和（b）三酰甘油（TAG）中的时程。暗区为未标记的内源脂肪酸并且亮区为来自吐温的13C-脂肪酸。个别脂肪酸种类列在每个图的左上角。所有数据都是平均值±SD（n=3）。FW，鲜重。

图4-在吐温-80存在下欧洲油菜细胞对脂质的14C-乙酸盐标记的抑制。（a）显示在10mM吐温-80存在下14C-乙酸盐并入到总脂质中的时程。（b）暴露于多种浓度的吐温-80达3小时之后总脂质的¹⁴C-乙酸盐标记。（c）暴露于10mM吐温-80达3小时之后在去除吐温-80之后总脂质的¹⁴C-乙酸盐标记的时程。所有数据都是平均值±SD（n=3）。

图5-在存在或不存在吐温-80的情况下¹⁴C-乙酸盐并入到（a）甾醇和（b）游离脂肪酸中的情况。

图6-在吐温-80补给3小时之后欧洲油菜细胞中质体ACCase的特异性抑制。（a）在10mM吐温-80补给3小时之后相对¹⁴C-乙酸盐并入到个别脂肪酸中的情况。（b）在10mM吐温-80补给3小时之后由多种浓度的氟吡甲禾灵（haloxyfop）补给的细胞将¹⁴C-乙酸盐并入到总脂质中的情况。（c）在10mM吐温-80补给3小时之后来自¹⁴C-丙二酸盐和¹⁴C-乙酸盐的标记并入到16和18碳脂肪酸中的情况。所有数据都是平均值±SD（n=3）。

图7-（a）氟吡甲禾灵、（b）磷酸酶处理和2-氧化戊二酸以及（c）吐温-80对来自粗细胞提取物的ACCase酶活性的影响。

图8-丙二酸盐对（a）极性脂质和（b）TAG中的脂肪酸含量以及对（c）脂质的¹⁴C-乙酸盐标记的影响。

图9-在吐温-80补给3小时之后欧洲油菜细胞中的脂质中间物的定量。在10mM吐温-80补给3小时之后细胞中的（a）游离脂肪酸（FFA）、（b）酰基-ACP以及（c）酰基-CoA含量。当存在时，数字代表在10mM¹³C-油酰基-吐温补给3小时之后¹³C标记的18:1的百分比。所有数据都是平均值±SD（n=3）。

图10-脂质中间物对粗欧洲油菜细胞提取物中的ACCase活性的影响。（a）10μΜ游离脂肪酸对粗提取物中的ACCase活性的影响。（b）欧洲油菜16:0-ACP和18:1-ACP对粗提取物中的ACCase活性的影响。（c）多种长链酰基-CoA对粗提取物中的ACCase活性的影响。所有数据都是平均值±SD（n=3）。

图11-脂肪酸合成的反馈抑制的建议机制的模型。质体ACCase受18:1-ACP和18:1-CoA抑制。这些代谢物为在质体内从头脂肪酸合成的产物，或从吐温-18:1所提供的外源脂肪酸合成。可以产生或消耗18:1-ACP或18:1-CoA并且因此参与调控18:1-ACP或18:1-CoA的反应以箭头指示。

图12-与不存在ACCase亚单元的情况下（EVL：空载体系列）经过骨架T-DNA载体转化的拟南芥（Arabidopsis thaliana）系列的种子油含量相比，过度表达Cenarcheum symbiosum的ACCase亚单元（ACCase系列）的拟南芥系列的种子油含量。基于对每个系列3个种子样品的分析来确定脂肪酸甲酯（FAME）浓度。所分析的种子为T2-种子。

发明的各种实施方案描述

本发明是基于鉴别在脂肪酸生物合成中实现初始步骤的反馈抑制的目标和分子。如下文所展示，特别是在实施例中，本发明者已鉴别，在植物中，其特定地为受到反馈抑制的质体异质型乙酰基-CoA羧化酶，并且效应分子特定地为油酰基-ACP和油酰基-CoA。

因此，本发明提供一种用于增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止这种植物的这些细胞中的质体乙酰基CoA-羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤。

在本发明的第一实施方案中，通过提供具有乙酰基CoA羧化酶变体酶或其亚单元的植物细胞、尤其植物细胞的质体来防止反馈抑制，这种乙酰基CoA羧化酶变体酶或其亚单元与植物的相应野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对这种反馈抑制的敏感性较小。

如本文所用的“乙酰基-CoA羧化酶”（ACC）E.C.编号6.4.1.2为催化脂肪酸生物合成中的第一关键酶促步骤的生物素依赖性酶，即，通过其两种催化活性的生物素羧化酶（BC）和羧基转移酶（CT）使乙酰基-CoA不可逆地羧化产生丙二酰基-CoA。初始部分反应是由生物素羧化酶催化并且使用碳酸氢盐和ATP经由羧基磷酸盐中间物来羧化经赖氨酸残基连接到生物素羧基载体蛋白（BCCP）上的生物素辅基。

HCO₃ ^-+ATP+BCCP=>ADP+Pi+BCCP-COO^-

羧基然后被转移到受体乙酰基-辅酶A上以产生丙二酰基-辅酶A，这是由羧基转移酶催化的反应。

BCCP-COO^-+乙酰基-CoA=>丙二酰基-CoA+BCCP

ACC已在大多数活的生物体中发现，包括古细菌、细菌、酵母、真菌、植物、动物和人类。在大多数真核生物中，ACC为多域酶（同质型），其中BC、BCCP和CT活性位于大的多肽（>200kDa）上。原核生物具有由若干多肽组成的多亚单元ACC，这些多肽由不同基因编码。生物素羧化酶（BC）活性、生物素羧基载体蛋白（BCCP）各自含于不同亚单元上，其编码基因通常分别被称为accC和accB。羧基转移酶（CT）活性分裂为两种肽，α-羧基转移酶（由accA编码）和β-羧基转移酶（由accD编码）。在古细菌中，α和β亚单元是由一个基因编码。除禾本科以外的大多数植物含有“原核”异质型和“真核”同质型两者。异质型位于质体中并且用于脂肪酸的从头合成。三个编码基因（用于生物素羧化酶、生物素羧基载体蛋白和α-羧基转移酶亚单元）是核编码的，而编码β-羧基转移酶的基因位于质体基因组中。同质型位于质体外的细胞溶质中。禾本科不含有ACC的“原核”形式，但在质体和细胞溶质两者中都含有同质型。

用于测量ACC活性的试验在本领域中众所周知，并且包括例如Howard和Ridley,1990（FEBS Letters261,2,261-2641990年2月）所描述的利用磷酸盐的测量结果来估算酶促活性的试验或Kroeger等人,2011（Analytical Biochemistry411,100-105）所描述的分光光度试验。

编码来自植物的ACC多域蛋白或ACC亚单元的众多基因已经被分离出，并且ACC多域蛋白或ACC亚单元的蛋白序列可以在资料库中找到。拟南芥同质型ACC蛋白的氨基酸序列可以例如在编录号NP_174850（乙酰基-CoA羧化酶2）或NP_174849（乙酰基-CoA羧化酶2）下找到。NP_197143（ACC1的生物素羧基载体蛋白）、NP_001031968（生物素羧化酶）、NP_850291（羧基转移酶亚单元α）和ACCD_ARATH（羧基转移酶亚单元β）代表拟南芥异质型ACC的不同亚单元的氨基酸序列。

欧洲油菜、甘蓝（Brassica oleracea）、芸苔和芥菜的同质型ACC蛋白的氨基酸序列或异质型蛋白的不同亚单元的氨基酸序列的编录号可以在下表1到5中找到。所有氨基酸序列特此以引用的方式并入。

表1：来自芸苔属的同质型乙酰基CoA羧化酶

欧洲油菜	长度（AA）	甘蓝	长度（AA）	芸苔	长度（AA）	芥菜	长度（AA）
								CBU86998	2321	ABA1005	1065
CBV09123	2304			ABA1006	1063
								CBV09287	2321	ABA1007	1065
CAA54683	2304
								CAC19875	2321
CAA02452	2273
								CBU86834	2304
CBU93391	2321
								CBU93227	2304
CBU89179	2321
								CBU89015	2304
CBU86094	2321
								CBU85930	2304
CBU85485	2321
								CBU85321	2304
CBF95767	2321
								CBF95603	2304
CBF68517	2321
								CBF68353	2304
CBF62122	2321
								CBF61958	2304
CBF61066	2321
								CBF60793	2304
CBF60241	2321
								CBF60077	2304
CAC19876	1789
								ABA01004	1064
CAC16410	796

表2：来自芸苔属的异质型乙酰基CoA羧化酶-生物素羧化酶亚单元

表3：来自芸苔属的异质型乙酰基CoA羧化酶-生物素羧化酶载体蛋白

表4：来自芸苔属的异质型乙酰基CoA羧化酶-羧基转移酶α亚单元

表5：来自芸苔属的异质型乙酰基CoA羧化酶-羧基转移酶β亚单元

一种获得对18:1-ACP或18:1-CoA作出的反馈抑制的敏感性较小的乙酰基-coA羧化酶变体酶或其变体亚单元的方式为从植物中分离由编码生物素羧化酶、生物素羧化酶载体蛋白和/或羧基转移酶亚单元的氨基酸序列，例如那些所提及的或以引用的方式并入本文中的氨基酸序列，或其编码核苷酸序列开始的这些变体。

为此，可以使用蛋白质工程领域中惯用的方法产生一大批来源于优选来自植物的反馈抑制敏感性CoA-羧化酶或其亚单元的变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。举例来说，可以在易错条件下对编码ACCase或其亚单元的核苷酸序列进行PCR以产生其变体。然后，甚至可以使用PCR加强变异以重组装并改组这些类似但不同的DNA序列。变体ACCase或其亚单元可以在宿主细胞中表达，例如大肠杆菌或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、植物细胞等。接下来，如本文所描述，在不存在和存在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温的情况下鉴别这些变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的酶促活性，并且分离出与所述反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白存在下具有较大酶促活性的那些酶变体（或其亚单元）并任选地用于引入到植物细胞的质体中。

还可以在植物细胞中由变体等位基因产生变体质体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。为此，可以例如通过使用诱变来产生包含一大批变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的植物细胞或植物的群体。此外，如本文所描述确定在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温存在下变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元中每一种的酶促活性，并且鉴别包含与反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白存在下具有较大酶促活性的酶变体的那些植物细胞或植物。植物细胞可以用于再生包含变体等位基因的植物。这些植物可以用于进一步杂交以在所选植物品种中组合所需的变体等位基因。

如本文所用的“诱变”是指以下过程：对植物细胞（例如多个植物种子或其他部分，如花粉等）进行诱导细胞DNA发生突变的技术，例如与诱变剂接触，这种诱变剂如化学物质（如甲磺酸乙酯（EMS）、乙基亚硝基脲（ENU）等）或电离辐射（中子（如快中子诱变等）、α射线、γ射线（如由钴60源提供的γ射线）、X射线、UV辐射等），或这些诱变剂中的两种或更多种的组合。因此，一个或多个ACCase编码等位基因的所需诱变可以如下实现：通过使用化学手段，例如通过使一个或多个植物组织与甲磺酸乙酯（EMS）、乙基亚硝基脲等接触；通过使用物理手段，如x射线等；或通过γ辐射，如由钴60源提供的γ辐射。由照射产生的突变常常为大缺失或其他大体损害，如易位或复杂重排，而由化学致变物产生的突变常常为更离散的损害，如点突变。举例来说，EMS使鸟嘌呤碱基烷基化，其引起碱基失配：烷基化鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，主要导致G/C到A/T的转变。在诱变之后，可以使用已知技术从经过处理的细胞再生植物。举例来说，可以根据常规生长程序种植所得种子，并且在自花授粉后在植物上形成种子。或者，可以提取双单倍体植株以立即形成纯合植物，例如，如Coventry等人（1988,Manual for Microspore Culture Techniquefor Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication0489.Univ.of Guelph,Guelph,Ontario,Canada）所描述。可以收获在这一代或下一代中因这种自花授粉的结果而形成的额外种子并且针对突变等位基因的存在加以筛选。已知若干筛选特异性突变等位基因的技术，例如，Deleteagene^TM（基因缺失（Delete-a-gene）；Li等人,2001,Plant J27:235-242）使用聚合酶链反应（PCR）试验来筛选通过快中子诱变产生的缺失突变体，TILLING（靶向诱导的基因组局部损害；McCallum等人,2000,Nat Biotechnol18:455-457)鉴别EMS诱导的点突变等等。

另一种降低18:1-ACP或18:1-CoA作出的反馈抑制的方式为使用从其他生物体中分离的对反馈不敏感的ACCase或其亚单元，这些生物体如具有碳固定中而非脂肪酸合成中所涉及的多亚单元ACCase的细菌或古细菌。包括使用所谓的3-羟基丙酸循环进行碳固定的生物体（Hugler等人2003,Eur.J.Biochem.270,736-734）。对这些ACCase之一进行的表征指示其确实不受酰基-CoA抑制（Chuakrut等人2003,J.Bacteriol.185(3):938-947）。

因此，提供一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其是通过提供具有乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的植物细胞的质体来实现，这种乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元来自硫化叶菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、热变形菌目、热球菌目或盐杆菌目，例如勤奋金属球菌、布氏酸菌、硫磺矿硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热硫化叶菌、Cenarcheum symbiosum、闪烁古生球菌、丁酸栖高温菌、海生葡萄状嗜热菌、依赖热丝菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculumaerophilum、冰岛热棒菌、坎地热棒菌、激烈热棒菌、深海热棒菌、掘越氏热棒菌、死海盐盒菌、盐杆菌属NRC-1、Haloquatratum walsbyi、湖渊盐红菌或法老盐碱单孢菌。

适合的ACCase亚单元包括具有氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9或11的蛋白质，这些蛋白质可以由以下核苷酸序列编码：从位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID No.1、从位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQID No6、SEQ ID No8、SEQ ID No10。

乙酰基CoA羧化酶的其他适合亚单元为来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶（accC）、来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶载体蛋白（accB）、来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-α（accA）以及来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-β（accD），例如具有氨基酸序列SEQ ID No.13、15、17和19的蛋白质，这些蛋白质可以由核苷酸序列SEQ ID No.12、14、16和18编码。

也适合的有编码BCCP同源物的核苷酸序列，这种BCCP同源物来自金属硫化叶菌（Sulfolobus metallicus）（SEQ ID No.46）、来自布氏酸菌（SEQ ID No.47）、来自Sulfolobus tokodaii str.7（SEQ ID No.48）、来自霍斯酸菌（Acidianus hospitalis）W1（SEQ ID No.49）、来自勤奋金属球菌DSM5348（SEQ ID No.50）、来自铜绿金属球菌（Metalospheara cuprina）Ar-4（SEQ ID No.51）、来自嗜酸热硫化叶菌DSM639（SEQ ID No.52）、来自硫磺矿硫化叶菌P2（SEQ ID No.53）、来自硫磺矿硫化叶菌98/2（SEQ ID No.54）、来自冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus）L.S.2.15（SEQ ID No.55）、来自冰岛硫化叶菌M..14.25（SEQ ID No.56）、来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51（SEQID No.57）、来自冰岛硫化叶菌REY15A（SEQ ID No.58）、来自布尼广古菌（Aciduliprofundum boonei）T469（SEQ ID No.59）、来自绿曲挠丝状菌（Chloroflexus aggregans）DSM9485（SEQ ID No.60）、来自毛样颤绿菌（Oscillochloris trichoides）DG6（SEQ ID No.61）、来自卡斯特玫瑰弯菌（Roseiflexus castenholzii）DSM13941（SEQ IDNo.62）、来自玫瑰弯菌属（Roseiflexus sp.）RS-1（SEQ ID No.63）、来自橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus）ATCC23779（SEQ ID No.64）、来自利姆氨氧化古菌（Nitrosarchaeum limnia）SFB1（SEQ ID No.65）、来自海洋氨氧化泉古菌（Nitrosopumilis maritimus）SCM1（SEQID No.66）、来自I类泉古菌（Group I crenarchea）HF4000APKG6D3（SEQ ID No.67）、来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9（SEQ ID No.68）、来自海栖希普氏菌（Hippea maritima）DSM10411（SEQ ID No.69）或来自大西洋库斯菌（Croceibacter atlanticus）HTCC2559（SEQID No.70）；编码BC同源物的核苷酸序列，这种BC同源物来自霍斯酸菌W1（SEQ ID No.71）、来自Sulfolobus tokodaii str.7（SEQ IDNo.72）、来自布氏酸菌（SEQ ID No.73）、来自勤奋金属球菌DSM5348（SEQ ID No.74）、来自铜绿金属球菌Ar-4（SEQ ID No.75）、来自嗜酸热硫化叶菌DSM639（SEQ ID No.76）、来自冰岛硫化叶菌M.16.4（SEQ ID No.77）、来自冰岛硫化叶菌Y.G.57.14（SEQ ID No.78）、来自硫磺矿硫化叶菌98/2（SEQ ID No.79）、来自冰岛硫化叶菌L.D.8.5（SEQ ID No.80）、来自冰岛硫化叶菌M.14.25（SEQ ID No.81）、来自冰岛硫化叶菌HVE10/4（SEQ ID No.82）、来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51（SEQ ID No.83）、来自硫磺矿硫化叶菌P2（SEQ ID No.84）、来自冰岛硫化叶菌L.S.2.15（SEQ ID No.85）、来自冰岛硫化叶菌REY15A（SEQ ID No.86）、来自绿曲挠丝状菌DSM9485（SEQ IDNo.87）、来自毛样颤绿菌DG6（SEQ ID No.88）、来自玫瑰弯菌属RS-1（SEQ ID No.89）、来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941（SEQ ID No.90）、来自橙色滑柱菌ATCC23779（SEQ ID No.91）、来自海洋氨氧化泉古菌SCM1（SEQ ID No.92）、来自利姆氨氧化古菌SFB1（SEQID No.93）、来自I类泉古菌HF4000APKG6D3（SEQ ID No.94）或来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9（SEQ ID No.95）；编码CT同源物的核苷酸序列，这种CT同源物来自霍斯酸菌W1（SEQ ID No.96）、来自勤奋金属球菌DSM5348（SEQ ID No.97）、来自布氏酸菌（SEQID No.98）、来自铜绿金属球菌Ar-4（SEQ ID No.99）、来自硫磺矿硫化叶菌98/2（SEQ ID No.100）、来自Sulfolobus tokodaii str.7（SEQID No.101）、来自冰岛硫化叶菌M.14.25（SEQ ID No.102）、来自冰岛硫化叶菌L.D.8.5（SEQ ID No.103）、来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51（SEQ ID No.104）、来自硫磺矿硫化叶菌P2（SEQ ID No.105）、来自嗜酸热硫化叶菌DSM639（SEQ ID No.106）或来自布尼广古菌T469（SEQ ID No.107）；编码CTα同源物的核苷酸序列，这种CTα同源物来自绿曲挠丝状菌DSM9485（SEQ ID No.108）、来自毛样颤绿菌DG6（SEQ ID No.109）、来自玫瑰弯菌属RS-1（SEQ ID No.110）、来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941（SEQ ID No.111）、来自登斯氨菌（Amonifex degensii）KC4（SEQ ID No.112）、来自嗜热球杆菌（Sphaerobacter thermophilus）DSM20475（SEQ ID No.113）、来自玫瑰弯菌属RS-1（SEQ ID No.114）、来自橙色滑柱菌ATCC23779（SEQ ID No.115）或来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941（SEQ ID No.116）；编码CTβ同源物的核苷酸序列，这种CTβ同源物来自绿曲挠丝状菌DSM9485（SEQ ID No.117）、来自毛样颤绿菌DG6（SEQ IDNo.118）、来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941（SEQ ID No.119）、来自玫瑰弯菌属RS-1（SEQ ID No.120）、来自玫瑰弯菌属RS-1（SEQ IDNo.121）、来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941（SEQ ID No.122）、来自橙色滑柱菌ATCC23779（SEQ ID No.123）或来自嗜热球杆菌DSM20475（SEQ ID No.124）；或编码CT同源物的核苷酸序列，这种CT同源物来自海洋氨氧化泉古菌SCM1（SEQ ID No.125）、来自利姆氨氧化古菌SFB1（SEQ ID No.126）、来自I类泉古菌HF4000APKG6D3（SEQ ID No.127）或来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9（SEQ ID No.128）。

本文所提及的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体也适用于本发明。

术语“变体”打算意指实质上类似的序列。天然存在的等位基因变体可以借助于熟知的分子生物学技术来鉴别，例如使用如本文所概述的聚合酶链反应（PCR）和杂交技术。变体（核苷酸）序列还包括合成得到的（核苷酸）序列，例如通过使用定点诱变而产生的那些序列。一般来说，本文所描述的ACCase或亚单元的氨基酸序列变体将与本文所描述的ACCase或亚单元的氨基酸序列具有至少40%、50%、60%到70%，例如优选71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%到79%，一般至少80%，例如81%到84%，至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%到98%和99%的序列一致性，并且将保留乙酰基coA羧化酶活性（单独或与其他亚单元组合）。一般来说，核苷酸序列变体与编码本文所描述的ACCase或亚单元的核苷酸序列具有至少40%、50%、60%到70%，例如优选71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%到79%，一般至少80%，例如81%到84%，至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%到98%和99%的序列一致性，并且所编码的产物保留乙酰基CoA羧化酶活性（单独或与其他亚单元组合）。

变体包括（但不限于）缺失、添加、取代、插入。

出于本发明的目的，以百分比表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”是指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置数（×100）除以进行比较的位置数。空位，即，比对中残基存在于一个序列中而不存在于另一个序列中的位置，被视为具有非相同残基的位置。两个序列的“最佳比对”是通过根据Needleman和Wunsch全局比对算法（Needleman和Wunsch,1970,J Mol Biol48(3):443-53）在欧洲分子生物学开放软件套件（EMBOSS，Rice等人,2000,Trends inGenetics16(6):276-277；参看例如http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）中使用默认设置（空位开放罚分=10（对于核苷酸）/10（对于蛋白质）并且空位延伸罚分=0.5（对于核苷酸）/0.5（对于蛋白质））在整个长度上比对两个序列而找到。对于核苷酸来说，所用的默认记分矩阵为EDNAFULL；并且对于蛋白质来说，默认记分矩阵为EBLOSUM62。

“严格杂交条件”可以用于鉴别与给出的核苷酸序列实质上一致的核苷酸序列。严格条件为序列依赖性的并且在不同情形中将不同。一般来说，严格条件被选为在规定离子强度和pH下低于特定序列的热熔点（T_m）约5℃。T_m为50%的目标序列与完全匹配的探针杂交时的温度（在规定离子强度和pH下）。典型地，将选择盐浓度在pH7下为约0.02摩尔浓度并且温度为至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或提高温度会增加严格度。RNA-DNA杂交（使用例如100nt的探针的诺瑟杂交（Northern blot））的严格条件为例如包括在63℃下于0.2X SSC中至少洗涤一次持续20分钟的那些条件，或等效条件。

“高严格度条件”可以例如通过在65℃下于含有6x SSC（20x SSC含有3.0M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH7.0）、5x邓哈特溶液（Denhardt's）（100X邓哈特溶液含有2%聚蔗糖（Ficoll）、2%聚乙烯吡咯烷酮、2%牛血清白蛋白）、0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）以及20μg/ml变性载体DNA（单链鱼精子DNA，其平均长度为120-3000个核苷酸）作为非特异性竞争子的水溶液中杂交而提供。在杂交之后，高严格度洗涤可以分几个步骤完成，其中最后洗涤（约30分钟）在杂交温度下于0.2-0.1×SSC、0.1%SDS中进行。

“中等严格度条件”是指等效于在上文所描述的溶液中但在约60-62℃下杂交的条件。中等严格度洗涤可以在杂交温度下于1x SSC、0.1%SDS中完成。

“低严格度”是指等效于在上文所描述的溶液中于约50-52℃下杂交的条件。低严格度洗涤可以在杂交温度下于2x SSC、0.1%SDS中完成。也参看Sambrook等人(1989)以及Sambrook和Russell(2001)。

将适合的ACCase或其亚单元提供给细胞的质体可以通过提供具有表达一个或多个编码ACCase亚单元的DNA区的一个或多个DNA分子的植物而便利地实现，所述DNA区可操作地连接到植物可表达启动子和任选地在植物中发挥功能的转录终止区和/或聚腺苷酸化区。一个或多个DNA分子可以提供给核，在这种情况下编码区应可操作地连接到质体靶向信号。或者，一个或多个DNA分子可以被整合到质体的基因组中，其中植物可表达启动子为可在植物质体中表达的启动子，并且任选的终止区为质体转录的终止区。用于在质体中表达的DNA分子可以包含一个或多个编码区，后者布置在操纵子中。

在本发明的另一个实施方案中，通过降低植物质体中18:1-CoA和/或18:1-ACP的水平来防止反馈抑制。

降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平可以通过提高所述细胞的质体中FATA酶的水平来实现，例如通过从嵌合DNA构筑体中过度表达。

适合FAT A编码DNA区的实例为编码氨基酸序列SEQ ID No20的核苷酸序列，例如核苷酸序列SEQ ID No.21或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的核苷酸序列。

降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平还可以通过提高所述植物细胞中酰基-CoA结合蛋白的水平来实现，例如通过从嵌合DNA构筑体中过度表达。

适合ACB蛋白的实例为编码氨基酸序列SEQ ID No23或SEQID No.25的核苷酸序列，例如从核苷酸103到2109的核苷酸序列SEQ ID No.22或从核苷酸106到384的核苷酸序列SEQ ID No.24，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的核苷酸序列。

如本文所用的术语“植物可表达启动子”意指能够在植物细胞中控制（起始）转录的DNA序列。其包括植物来源的任何启动子；而且包括能够在植物细胞中引导转录的非植物来源的任何启动子，即，病毒或细菌来源的某些启动子，如CaMV35S（Harpster等人,1988Mol.Gen.Genet.212,182-190）、地三叶斑点病毒启动子4号或7号（WO9606932）或T-DNA基因启动子；而且包括组织特异性或器官特异性启动子，包括（但不限于）种子特异性启动子（例如WO89/03887）、器官原基特异性启动子（An等人,1996,The Plant Cell8,15-30）、茎干特异性启动子（Keller等人,1988,EMBO J.7,3625-3633）、叶特异性启动子（Hudspeth等人,1989,Plant Mol Biol12,579-589）、叶肉特异性启动子（如光可诱导Rubisco启动子）、根特异性启动子（Keller等人,1989,Genes Devel.3,1639-1646）、块茎特异性启动子（Keil等人,1989,EMBO J.8,1323-1330）、维管组织特异性启动子（Peleman等人,1989,Gene84,359-369）、雄蕊选择性启动子（WO89/10396、WO92/13956）、开裂区特异性启动子（WO97/13865），等等。

种子特异性启动子在本领域中众所周知，包括DE10211617中所描述的来自蚕豆（Vicia faba）的USP启动子；WO2009/073738中所描述的启动子序列；如WO2009/077478中所描述的用于种子特异性基因表达的来自欧洲油菜的启动子；US2007/0022502中所描述的植物种子特异性启动子；WO03/014347中所描述的植物种子特异性启动子；WO2009/125826中所描述的种子特异性启动子；WO2006/005807中所描述的ω_3脂肪酸去饱和酶家族的启动子等等。

植物可表达启动子应优选地为异源启动子，即，启动子在其自然环境中通常不与在根据本发明的DNA分子中可操作地连接到其上的编码DNA区相关联。

信号肽为引导蛋白质运输的短（3-60个氨基酸长度）肽链。信号肽也可以被称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。在这个系统中所用的‘转运肽’是指将蛋白质靶向其他细胞器（如线粒体、叶绿体和非原质体）的前序列的部分。质体转运肽是指将蛋白质靶向质体的转运肽。质体转运肽在本领域中众所周知（参看例如Patron和Waller,2007Bioessays,29(10)1048-1058的综述）。

适合的叶绿体靶向肽包括拟南芥atS1A核酮糖1,5二磷酸羧化酶小亚单元基因的转运肽（De Almeida等人(1989).Molecular andGeneral Genetics218:78-86；SEQ ID No:38-39）、基于双子叶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚单元叶绿体靶向序列的共有序列的合成叶绿体靶向前序列（Marillonnet等人(2004)Proceedings NationalAcademy Science101:6852-6857；SEQ ID No:40-41）、来自马铃薯（Solanum tuberosum）核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚单元的转运肽的芸苔密码子使用改适的编码序列（Fritz等人1993Gene,137(2):271-4；SEQ ID No:42-43）、含有玉米（Zea mays，corn）和向日葵（Helianthus annuus，sunflower）的RuBisCO小亚单元基因的序列的优化转运肽的编码序列（Lebrun等人,1996美国专利US5510471；SEQ ID No:44-45），或来自编码Δ9-18:0-ACP去饱和酶的蓖麻（Ricinus Communis）cDNA的转运肽（Shanklin等人1991ProcNatl Acad Sci U S A.3月15日;88(6):2510-4；SEQ ID No:36-37）。

用于质体转化的方法在本领域中是已知的。Maliga,2004（AnnuRev Plant Biol.2004;55:289-313）提供这些方法的综述。芸苔属中的质体转化已描述于美国专利6,891,086中，由Nugent等人,2006（PlantScience170(1)135-142）或由Cheng等人2010（Plant Cell Rep.29(4)371-381描述。用于大豆质体转化的方法已由Dufourmantel等人2004,Plant Mol.Biol55(4)479-489描述。

质体可表达启动子在本领域中也是众所周知的并且包括质体核糖体RNA操纵子启动子（Suzuki等人2003,Plant Cell,15,195-205)。Kung和Lin编译了60个来自高等植物的叶绿体启动子序列（1985,Nucl.Acids Res.11:7543-7549）。

用以获得转基因植物的方法不应被认为对本发明来说至关重要，并且可以使用适合于特定植物种类的任何转化方法和再生。这些方法在本领域中众所周知并且包括土壤杆菌介导的转化、粒子枪递送、显微注射、完整细胞的电穿孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、硅晶须介导的转化等。然后可以使以这种方式获得的转化细胞再生成成熟的可育植物。

所获得的转化植物可以按常规育种方案使用以产生具有相同特征的更多转化植物或将根据本发明的嵌合基因引入到相同或相关植物种类的其他品种中或杂交植物中。从转化植物获得的种子含有本发明的嵌合基因作为稳定的基因组插入物并且也被本发明所涵盖。

本文所描述的方法和手段被认为适用于所有植物细胞和植物，双子叶和单子叶植物细胞和植物包括（但不限于）棉花、芸苔属蔬菜、油菜、小麦、玉米（corn/maize）、大麦、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、蔬菜（包括菊苣、莴苣、番茄）、烟草、马铃薯、甜菜、番木瓜、菠萝、芒果、拟南芥，以及园艺、花艺或林业中所用的植物。尤其适合的是产油植物，例如油菜籽（芸苔属）、亚麻（Linumusitatissimum）、红花（Carthamus tinctorius）、向日葵、玉米、大豆（Glycine max）、芥（芸苔属和白芥（Sinapis alba））、海甘蓝（Crambeabyssinica）、芝麻菜（Eruca sa、va）、油棕榈（Elaeis guineeis）、棉籽（棉属（Gossypium spp.））、落花生（Arachis hypogaea）、椰子（Cocusnucifera）、蓖麻、芫荽（Coriandrum sativum）、南瓜（Cucurbita maxima）、巴西果（Bertholletia excelsa）或荷荷芭（Simmondsia chinensis）、亚麻荠（Camelina sativa)、麻风树（Jatropha curcas）、蓝蓟属（Echiumspp.）、金盏草（Calendula officinalis）、橄榄（Olea europaea）、小麦（小麦属（Triticum spp.））、燕麦（燕麦属（Avena spp.））、黑麦（Secalecereale）、稻（Oryza sativa）、雷斯克勒属（Lesquerella spp.）、萼距花属（Cuphea spp.）、白池花（Limnanthes alba）、鳄梨（Persea Americana）、榛子（Corylus）、芝麻（Sesamum indicum）、红花（Carthamus tinctorius）、油桐（Aleurites fordii）、罂粟（Papaver somniferum）、烟草（烟草属（Nicotiana spp.））。

本文所描述的方法和手段也可以用于藻类，例如二形栅藻（Scenedesmus dimorphus）、眼虫藻（Euglena gracilis）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、颗石藻（Pleurochrysis carterae）、小三毛金藻（Prymnesium parvum）、周氏扁藻（Tetraselmis chui）、四鞭片藻（Tetraselmis suecica）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、微拟球藻（Nannochloropsis salina）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）、杜氏盐藻（Dunaliella tertiolecta）、微绿球藻属（Nannochloris spp.）或螺旋藻属（Spirulina spp.）。

如本文所用的“芸苔属植物”为属于欧洲油菜、芸苔或芥菜种类之一的植物。或者，植物可以属于来源于这些芸苔种类相互杂交的种类，如芸苔复合双二倍体新种（B.napocampestris）；或这些芸苔种类之一与十字花科（Cruciferacea）的另一个种类进行人工杂交的种类。如本文所用的“油籽植物”是指欧洲油菜、芸苔、埃塞俄比亚芥、黑芥（Brassica nigra）或芥菜种类中的任一种。

如本文所用的“包含”应被解释为指定所提到的规定特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。因此，举例来说，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所列举的更多的核苷酸或氨基酸，即，嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上经过定义的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。

除非实施例中另有规定，否则所有重组DNA技术都是根据如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷中所描述的标准方案来进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOS Scientific Publications Ltd（UK）和BlackwellScientific Publications（UK）联合出版的由R.D.D.Croy所著的PlantMolecular Biology Labfax(1993)中。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Brown(1998)Molecular Biology LabFax,第二版,Academic Press(UK)的第I卷和第II卷。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可以见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press和McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第一版,Springer Verlag,Germany中。

在通篇描述和实施例中，提及以下序列：

SEQ ID No.1：勤奋金属球菌的生物素羧化酶（accC）和BCCP（accB）亚单元的核苷酸序列

SEQ ID No.2：勤奋金属球菌的accC亚单元的氨基酸序列

SEQ ID No.3：勤奋金属球菌的accB亚单元的氨基酸序列

SEQ ID No.4：勤奋金属球菌的羧基转移酶（pccB）的核苷酸序列

SEQ ID No.5：勤奋金属球菌的羧基转移酶（pccB）的氨基酸序列

SEQ ID No.6：来自Cenarcheum symbiosum的BCCP的核苷酸序列

SEQ ID No.7：来自Cenarcheum symbiosum的BCCP的氨基酸序列

SEQ ID No.8：来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶的核苷酸序列

SEQ ID No.9：来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶的氨基酸序列

SEQ ID No.10：来自Cenarcheum symbiosum的羧基转移酶的核苷酸序列

SEQ ID No.11：来自Cenarcheum symbiosum的羧基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID No.12：来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶（accC）的核苷酸序列

SEQ ID No.13：来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶（accC）的氨基酸序列

SEQ ID No.14：来自橙色绿屈挠菌的BCCP（accB）的核苷酸序列

SEQ ID No.15：来自橙色绿屈挠菌的BCCP（accB）的氨基酸序列

SEQ ID No.16：来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-α（accA）的核苷酸序列

SEQ ID No.17：来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-α（accA）的氨基酸序列

SEQ ID No.18：来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-β（accD）的核苷酸序列

SEQ ID No.19：来自橙色绿屈挠菌的羧基转移酶-β（accD）的氨基酸序列

SEQ ID No.20：编码来自蓖麻的FATA的核苷酸序列

SEQ ID No.21：来自蓖麻的FATA的氨基酸序列

SEQ ID No.22：乙酰基CoA结合蛋白ACBP4的核苷酸序列

SEQ ID No.23：乙酰基CoA结合蛋白ACBP4的氨基酸序列

SEQ ID No.24：乙酰基CoA结合蛋白ACBP6的核苷酸序列

SEQ ID No.25：乙酰基CoA结合蛋白ACBP6的氨基酸序列

SEQ ID No.26：用于克隆欧洲油菜ACP的正向引物

SEQ ID No.27：用于克隆欧洲油菜ACP的反向引物

SEQ ID No.28：用于克隆欧洲油菜BC的正向引物

SEQ ID No.29：用于克隆欧洲油菜BC的反向引物

SEQ ID No.30：用于克隆欧洲油菜BCCP的正向引物

SEQ ID No.31：用于克隆欧洲油菜BCCP的反向引物

SEQ ID No.32：用于克隆欧洲油菜CT-α的正向引物

SEQ ID No.33：用于克隆欧洲油菜CT-α的反向引物

SEQ ID No.34：用于克隆欧洲油菜CT-β的正向引物

SEQ ID No.35：用于克隆欧洲油菜CT-β的反向引物

SEQ ID No.36：来自编码δ9-18:0-ACP去饱和酶的蓖麻cDNA的转运肽的核苷酸序列

SEQ ID No.37：来自编码δ9-18:0-ACP去饱和酶的蓖麻cDNA的转运肽的氨基酸序列

SEQ ID No.38：来自拟南芥atS1A核酮糖1,5二磷酸羧化酶小亚单元的转运肽的核苷酸序列

SEQ ID No.39：来自拟南芥atS1A核酮糖1,5二磷酸羧化酶小亚单元的转运肽的氨基酸序列

SEQ ID No.40：基于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的合成叶绿体靶向前序列的核苷酸序列

SEQ ID No.41：基于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的合成叶绿体靶向前序列的氨基酸序列

SEQ ID No.42：来自马铃薯核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚单元的转运肽的芸苔密码子使用改适的编码序列的核苷酸序列

SEQ ID No.43：来自马铃薯核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚单元的转运肽的芸苔密码子使用改适的编码序列的氨基酸序列

SEQ ID No.44：含有玉米和向日葵的RuBisCO小亚单元基因的序列的优化转运肽的核苷酸序列

SEQ ID No.45：含有玉米和向日葵的RuBisCO小亚单元基因的序列的优化转运肽的氨基酸序列

SEQ ID No.46：来自金属硫化叶菌的BCCP同源物

SEQ ID No.47：来自布氏酸菌的BCCP同源物

SEQ ID No.48：来自Sulfolobus tokodaii str.7的BCCP同源物

SEQ ID No.49：来自霍斯酸菌W1的BCCP同源物

SEQ ID No.50：来自勤奋金属球菌DSM5348的BCCP同源物

SEQ ID No.51：来自铜绿金属球菌Ar-4的BCCP同源物

SEQ ID No.52：来自嗜酸热硫化叶菌DSM639的BCCP同源物

SEQ ID No.53：来自硫磺矿硫化叶菌P2的BCCP同源物

SEQ ID No.54：来自硫磺矿硫化叶菌98/2的BCCP同源物

SEQ ID No.55：来自冰岛硫化叶菌L.S.2.15的BCCP同源物

SEQ ID No.56：来自冰岛硫化叶菌M..14.25的BCCP同源物

SEQ ID No.57：来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51的BCCP同源物

SEQ ID No.58：来自冰岛硫化叶菌REY15A的BCCP同源物

SEQ ID No.59：来自布尼广古菌T469的BCCP同源物

SEQ ID No.60：来自绿曲挠丝状菌DSM9485的BCCP同源物

SEQ ID No.61：来自毛样颤绿菌DG6的BCCP同源物

SEQ ID No.62：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的BCCP同源物

SEQ ID No.63：来自玫瑰弯菌属RS-1的BCCP同源物

SEQ ID No.64：来自橙色滑柱菌ATCC23779的BCCP同源物

SEQ ID No.65：来自利姆氨氧化古菌SFB1的BCCP同源物

SEQ ID No.66：来自海洋氨氧化泉古菌SCM1的BCCP同源物

SEQ ID No.67：来自I类泉古菌HF4000APKG6D3的BCCP同源物

SEQ ID No.68：来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9的BCCP同源物

SEQ ID No.69：来自海栖希普氏菌DSM10411的BCCP同源物

SEQ ID No.70：来自大西洋库斯菌HTCC2559的BCCP同源物

SEQ ID No.71：来自霍斯酸菌W1的BC同源物

SEQ ID No.72：来自Sulfolobus tokodaii str.7的BC同源物

SEQ ID No.73：来自布氏酸菌的BC同源物

SEQ ID No.74：来自勤奋金属球菌DSM5348的BC同源物

SEQ ID No.75：来自铜绿金属球菌Ar-4的BC同源物

SEQ ID No.76：来自嗜酸热硫化叶菌DSM639的BC同源物

SEQ ID No.77：来自冰岛硫化叶菌M.16.4的BC同源物

SEQ ID No.78：来自冰岛硫化叶菌Y.G.57.14的BC同源物

SEQ ID No.79：来自硫磺矿硫化叶菌98/2的BC同源物

SEQ ID No.80：来自冰岛硫化叶菌L.D.8.5的BC同源物

SEQ ID No.81：来自冰岛硫化叶菌HVE10/4的BC同源物

SEQ ID No.82：来自冰岛硫化叶菌M.16.4的BC同源物

SEQ ID No.83：来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51的BC同源物

SEQ ID No.84：来自硫磺矿硫化叶菌P2的BC同源物

SEQ ID No.85：来自冰岛硫化叶菌L.S.2.15的BC同源物

SEQ ID No.86：来自冰岛硫化叶菌REY15A的BC同源物

SEQ ID No.87：来自绿曲挠丝状菌DSM9485的BC同源物

SEQ ID No.88：来自毛样颤绿菌DG6的BC同源物

SEQ ID No.89：来自玫瑰弯菌属RS-1的BC同源物

SEQ ID No.90：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的BC同源物

SEQ ID No.91：来自橙色滑柱菌ATCC23779的BC同源物

SEQ ID No.92：来自海洋氨氧化泉古菌SCM1的BC同源物

SEQ ID No.93：来自利姆氨氧化古菌SFB1的BC同源物

SEQ ID No.94：来自I类泉古菌HF4000APKG6D3的BC同源物

SEQ ID No.95：来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9的BC同源物

SEQ ID No.96：来自霍斯酸菌W1的CT同源物

SEQ ID No.97：来自勤奋金属球菌DSM5348的CT同源物

SEQ ID No.98：来自布氏酸菌的CT同源物

SEQ ID No.99：来自铜绿金属球菌Ar-4的CT同源物

SEQ ID No.100：来自硫磺矿硫化叶菌98/2的CT同源物

SEQ ID No.101：来自Sulfolobus tokodaii str.7的CT同源物

SEQ ID No.102：来自冰岛硫化叶菌M.14.25的CT同源物

SEQ ID No.103：来自冰岛硫化叶菌L.D.8.5的CT同源物

SEQ ID No.104：来自冰岛硫化叶菌Y.N.15.51的CT同源物

SEQ ID No.105：来自硫磺矿硫化叶菌P2的CT同源物

SEQ ID No.106：来自嗜酸热硫化叶菌DSM639的CT同源物

SEQ ID No.107：来自布尼广古菌T469的CT同源物

SEQ ID No.108：来自绿曲挠丝状菌DSM9485的CTα同源物

SEQ ID No.109：来自毛样颤绿菌DG6的CTα同源物

SEQ ID No.110：来自玫瑰弯菌属RS-1的CTα同源物

SEQ ID No.111：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的CTα同源物

SEQ ID No.112：来自登斯氨菌KC4的CTα同源物

SEQ ID No.113：来自嗜热球杆菌DSM20475的CTα同源物

SEQ ID No.114：来自玫瑰弯菌属RS-1的CTα同源物

SEQ ID No.115：来自橙色滑柱菌ATCC23779的CTα同源物

SEQ ID No.116：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的CTα同源物

SEQ ID No.117：来自绿曲挠丝状菌DSM9485的CTβ同源物

SEQ ID No.118：来自毛样颤绿菌DG6的CTβ同源物

SEQ ID No.119：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的CTβ同源物

SEQ ID No.120：来自玫瑰弯菌属RS-1的CTβ同源物

SEQ ID No.121：来自玫瑰弯菌属RS-1的CTβ同源物

SEQ ID No.122：来自卡斯特玫瑰弯菌DSM13941的CTβ同源物

SEQ ID No.123：来自橙色滑柱菌ATCC23779的CTβ同源物

SEQ ID No.124：来自嗜热球杆菌DSM20475的CTβ同源物

SEQ ID No.125：来自海洋氨氧化泉古菌SCM1的CT同源物

SEQ ID No.126：来自利姆氨氧化古菌SFB1的CT同源物

SEQ ID No.127：来自I类泉古菌HF4000APKG6D3的CT同源物

SEQ ID No.128：来自I类泉古菌HF4000ANIW97P9的CT同源物

SEQ ID No.129：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧基载体蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No.130：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧基载体蛋白的核苷酸序列（针对在拟南芥中表达进行密码子优化）

SEQ ID No.131：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶的氨基酸序列

SEQ ID No.132：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶的核苷酸序列（针对在拟南芥中表达进行密码子优化）

SEQ ID No.133：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的羧基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID No.134：N端连接有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体蛋白的来自Cenarcheum symbiosum的羧基转移酶的核苷酸序列（针对在拟南芥中表达进行密码子优化）

实施例

实施例1：实验程序

细胞培养物生长和分析

通过修改（Shi等人2008,Plant Cell Tiss Org,92131-139），使冬油菜（Brassica napus cv Jet Neuf）悬浮细胞培养物于NLN培养基中生长（Lichter1982,Z.Pflanzenphysiol,105,427-434）。在50μmol m^-1s^-1的恒定荧光下，使细胞在160rpm振荡下于25℃下以50mL或100mL体积（分别在125mL或250mL烧瓶中）生长。对于持续长于两天的实验，每48小时更新培养基。吐温-酯获自Sigma（St.Louis,MOUSA）。150mM储备溶液是通过将9.8g溶解于50mL水中而制成，并且在添加到培养物中之前将其过滤灭菌。每八天完成继代培养，并且用约200mg细胞接种新的培养物。通过用布氏漏斗（Buchnerfunnel）过滤来收集细胞，用蒸馏水冲洗三次，并且立即在预先称重的铝箔袋中于液氮中冷冻。通过冻干已知鲜重的细胞来确定干重与鲜重比。对于SDS-PAGE来说，在3体积（w/v）的50mM Tris-CI（pH7.5）、10mM KCI、5mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM DTT、0.1%TritonX-100中提取蛋白质，并且通过布拉福德试验（Bradford assay）定量。

脂质提取和定量

通过在500μL甲醇:氯仿:甲酸（20:10:1v/v）中使用玻璃珠均化两次，从至多100mg鲜重的冷冻细胞中提取脂质。用500μL的1MKCI、0.2M H₃PO₄提取组合的有机溶剂，并且回收有机相，在N₂下干燥，并再悬浮于己烷中。通过使用硅胶G TLC Uniplates（Analtech,Newark,DE,USA）进行TLC来分离脂质类别，其中己烷:乙醚:乙酸（80:20:1，v/v）用于中性脂质或丙酮:甲苯:水（91:30:7v/v）与0.15M硫酸铵浸渍板用于极性脂质。负载相当于10或20mg鲜重。用碘蒸气使脂质可视化。

通过分析脂肪酸甲酯（FAME）完成脂肪酸定量。FAME通过以下方式制备：在85℃下于1mL含12%（w/w）BCl₃的甲醇中孵育17:0内标物和脂质提取物或从TLC板上刮下的二氧化硅粉末1小时，将其用1mL水和2mL己烷提取，然后在N₂下干燥。用配备有60m×250μm SP-2340毛细管柱（Supelco）的HP6890气相色谱-火焰电离检测器（Agilent Technologies）或HP5890气相色谱-质谱仪（Hewlett-Packard）分析悬浮于己烷中的FAME。氦流速为1.1mLmin^-1并且烘箱温度始于100℃，以15℃min^-1升到240℃并且在那个温度下保持5分钟。用HP5973质量选择检测器（Hewlett-Packard）进行质谱分析。

1-¹³C-油酰基-吐温合成

1-¹³C-油酸获自剑桥同位素实验室（Cambridge IsotopeLaboratories）（Andover,MA,USA）。定制吐温-酯是通过使酰氯与吐温骨架反应而合成。吐温骨架如先前所描述加以合成（Terzaghi1986,Plant Physiol,82,771-779）和纯化（Wisnieski等人1973,Proc Natl.Acad Sci USA,70,3669-3673）。酰氯是通过首先使350mg1-¹³C-油酸悬浮于10mL CH₂Cl₂中而制备。将这种溶液于冰上冷却，在氩气下干燥，并且与2.5摩尔当量的乙二酰氯反应。经30分钟逐滴添加DMF（5-10滴）直到CO和CO₂不再从溶液中鼓泡为止。在真空下去除过量乙二酰氯，并且使酰氯悬浮于8mL CH₂Cl₂中。将约25mg4-二甲氨基吡啶和750μL N,N-二异丙基乙胺溶解于2mL CH₂CI₂中，并且添加到溶解于8mL CH₂Cl₂中的1g吐温骨架中。添加酰氯到溶解的吐温骨架中，并且在25℃下搅拌反应物24小时。通过色谱法纯化吐温-酯并且通过GC-MS和NMR验证。使1-¹³C-油酰基-吐温悬浮于水中，过滤灭菌，并且添加到培养基中，吐温-80也是如此。如上文所描述完成脂质提取和GC/MS。检测并定量¹³C-脂肪酸并且如先前所描述（Schwender等人2003,J Biol Chem,278,29442-29453）针对天然同位素丰度进行校正。

¹⁴C标记

所有放射性同位素都获自American Radiolabeled Chemicals（St.Louis,MO USA）。在以约20mg FW mL^-1的培养密度继代培养之后5天对细胞进行标记，并且在16小时前更新培养基。对于标记来说，从每个烧瓶中小心移出三个1mL细胞等分试样，并且在25℃下于偶尔振荡下用0.2μCi的1,2-¹⁴C-乙酸盐（50-60mCi mmol^-1）或2-¹⁴C-丙二酸盐（40-60mCi mmol^-1）标记15分钟。将氟吡甲禾灵（Sigma）溶解于DMSO中并且在标记之前30分钟添加。如本文所描述提取脂质并通过TLC分离。通过磷光成像检测放射性并且使用ImageQuant软件（GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA）定量。通过如上文所描述制得FAME，如（Koo,Fulda,Browse和Ohlrogge2005,Plant J,44,620-632）所描述通过TLC分离甲酯并且通过磷光成像测量放射性来确定标记并入到个别脂肪酸中的情况。

游离脂肪酸、酰基-CoA和酰基-ACP提取

通过在2mL沸腾异丙醇中淬灭约300mg冷冻细胞5分钟，从组织中提取游离脂肪酸。一旦冷却，即添加2mL0.9%NaCl并且用4mL己烷提取脂质两次。通过TLC分离中性脂质并且刮下游离脂肪酸，制成FAME，并且如上文所描述通过GC-FID或GC-MS分析。从约15mg FW的细胞中提取酰基-CoA并且如先前所描述（Larson和Graham2001,Plant J,25,115-125）进行定量。提取酰基-ACP并且如先前所描述（Kopka,Ohlrogge和Jaworski1995,Anal Biochem,224,51-60）进行定量，其中有以下修改：1）所用内标物为11:0-CoA（Sigma）和如先前所描述（Broadwater和Fox1999,Protein Expr Purif,15,314-326）从菠菜ACP制得的17:0-ACP。2）完全溶解TCA沉淀蛋白需要用MOPS缓冲液提取三次，而不是只提取一次。

酶试验

所有化学品都获自Sigma并且放射性同位素获自AmericanRadiolabeled Chemicals。以¹⁴C-NaHC0₃并入到酸和稳定产物中的乙酰基-CoA依赖性并入来测量ACCase活性。通过在3体积（w/v）的50mM Tris-Cl（pH7.5）、100mM KCl、5mM MgCl₂、1mM DTT、0.1%TritonX-100、10%甘油和植物蛋白酶抑制剂混合液（Sigma）中磨碎鲜活细胞来制备粗细胞提取物。在冰上缓缓混合匀浆10分钟，然后以3000g离心5分钟。用PD-10柱（GE Life Sciences）完成提取物脱盐。试验条件如先前所描述（Thelen和Ohlrogge2002,ArchBiochem Biophys,400,245-257）。通过添加5μ1L细胞提取物起始反应，并且通过添加15μL12N HCL而终止。在55℃下完全干燥内含物，并且使固体再悬浮于30μL水中并通过液体闪烁光谱法计数。始终包括负的乙酰基-CoA对照。试验进行30分钟，例外的是测量代谢物的作用（10分钟）。在细胞提取之后立即将代谢物添加到反应物中以保留不稳定的硫酯键。在乙醇中制得FFA储备溶液并且使酰基-CoA悬浮于水中。所用酰基-ACP如针对菠菜ACP所描述（Broadwater和Fox1999,Protein Expr Purif,15,314-326）而制得，例外的是替代地使用BnACP（GenBank：X13127.1）。从细胞提取物中使用以下引物克隆ACP cDNA：并有6x his标签的F-GCGGCCAAACCAGAGACG（SEQ ID No.26）和R-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTCTTGGCTTGCACCAGCTCT（SEQ ID No.27）。如先前所描述（Eccleston和Ohlrogge1998,PlantCell,10,613-622）对粗细胞提取物进行酰基-ACP硫酯酶试验，例外的是试验缓冲液与ACCase试验相同。

qPCR分析

使用Trizol试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）从培养细胞中分离RNA并且用DNase处理。使用Bio-Rad（Hercules,CA,USA）iScript cDNA合成试剂盒从1μg总RNA合成cDNA。用1:50cDNA产物和SSO Fast EvaGreen超混液（Bio-Rad）进行qPCR。参照基因为ACT7和UBC21，其使用如先前所描述的引物（Chen等人2010Anal Biochem,405,138-140）。实验基因的引物如下：BC，生物素羧化酶（GenBank：A Y034410.1），F-TTGGTGAAGCTCCTAGCAACCAGT（SEQ ID No.28）和R-TTCTTCATCGTCTCCCTGGCAGTT（SEQ ID No.29）；BCCP，生物素羧基载体蛋白（GenBank：X90730.1），F-AGTGACTAACGGTGGGTGCTTGAA（SEQ ID No.30），R-TGATAAACTGGAGCTGGTGGTGGT（SEQ ID No.31）；CT-α，羧基转移酶-α（GenBank GQ341624.1），F-TACGTGACAGCTCGCCTCAAGAAA（SEQ ID No.32），R-CAAACCAGTTTCAGCCGCCATCTT（SEQ ID No.33）；CT-β，羧基转移酶-β（GenBank：Z50868.1），F-GGAGCACGAATGCAAGAAGGAAGT（SEQ ID No.34），R-ACATACCCAAACTTGCTGTCACCC（SEQ ID No.35）。使用REST软件（Qiagen,Valencia,CA,USA）计算相对表达水平。

实施例2：确立向欧洲油菜悬浮细胞补给脂肪酸的条件

为了研究脂肪酸合成的反馈调控，有必要首先确立可以补给脂肪酸同时使任何负面多向性效应最小化的条件。主要含有油酸（18:1）的市售吐温-80当以至多10mM的浓度添加时对生长速率没有影响（图1a）。与发育中的胚胎极其类似的细胞蛋白质组成在吐温-80补给八天之后似乎不受影响（图1b）。细胞的水含量也不受影响；鲜重与干重比对于对照为16.2±0.4并且对于10mM吐温-80补给的细胞为16.0±0.5。如对于大豆细胞培养物所报导（Terzaghi1986,PlantPhysiol,82,771-779），欧洲油菜细胞的脂肪酸组成被吐温-80改变。定量来自吐温-80补给八天的细胞的极性脂质和TAG并且结果示于图2中。在两种脂质类别中，18:1依赖于吐温-80的浓度而积累到一定水平。对于极性脂质（即，膜脂质）来说，这是通过降低所有其他脂肪酸的量来实现，作为市售吐温-80的微量组分的棕榈油酸（16:1）除外（图2a）。另一方面，所有脂肪酸在TAG中保持恒定或增加（图2b）。尽管有这些变化，但总脂肪酸量保持恒定（图2c），并且除了TAG以外，极性和中性脂质概况似乎未有改变（图1c）。

为了定量来自吐温-80的脂肪酸对脂肪酸组成的变化所作的贡献，我们合成1-¹³C-油酰基-吐温并且进行时程实验：其中外源脂肪酸可以通过¹³C同位素的存在加以区别（图3）。在10mM¹³C-油酰基-吐温存在下正好三小时之后，¹³C-18:1占总18:1的约10%，从而指示快速吸收和并入。随着时间的发展，标记出现在去饱和产物（18:2和18:3）中并且到48小时为止¹³C标记的比例增加到18-碳脂肪酸的约70%。标记在任何其他脂肪酸中未被检测到，包括延伸产物。在TAG的情况下，个别脂肪酸量的增加主要是由于¹³C-18:1的吸收和代谢（图3b）。对于极性脂质来说，¹³C-18:1不仅是18:1量增加的原因，而且实际上置换内源脂肪酸。这从以下事实显而易见：未标记的脂肪酸减少，而¹³C标记增加（图3a）。这种效应可以归因于周转的增加或从头脂肪酸合成的减少。这种效应似乎对未标记（即，从头）脂肪酸具特异性，从而指示合成减少。

实施例3：质体ACCase对吐温-80有反应而受可逆抑制

通过添加¹⁴C-乙酸盐示踪物测量脂肪酸合成的反馈抑制。图4a显示，¹⁴C-乙酸盐并入到脂质中的速率确实在添加10mM吐温-80到培养基中之后三小时就降低40%。甾醇合成依赖于乙酰基-CoA和ATP，这两者都是脂肪酸合成所需要的。因此，如果脂肪酸合成因底物限制而受抑制的话，那么甾醇生物合成也会如此。¹⁴C-乙酸盐并入到甾醇中不受吐温-80补给所影响，而并入到游离脂肪酸中反映出总脂质的情况（图5），从而显示影响限于脂肪酸合成。我们发现，反馈抑制程度依赖于培养基中吐温-80的浓度（图4b）并且在去除吐温-80之后是完全可逆的（图4c）。这些结果与反馈抑制的生物化学作用模式相一致。三小时时间点用于这项研究的其余部分以将最大反馈抑制的时段与由长期吐温-80补给所引起的大体脂肪酸组成变化而产生的任何脂质体内平衡机制分开。

植物含有质体和细胞溶质ACCase和FAS酶系统，这两者都能够将¹⁴C-乙酸盐并入到脂肪酸中。比较个别脂肪酸种类中标记的分布因此可以提供关于这些路径的相对贡献的信息。吐温-80补给在使¹⁴C-乙酸盐并入到脂肪酸中减少40%（图6a）的同时，并不影响标记模式（图6b）。这与质体内从头脂肪酸合成的减少而非细胞溶质伸长的减少相一致，细胞溶质伸长的减少会导致长链脂肪酸中标记的比例较高。也在氟吡甲禾灵存在下进行¹⁴C-乙酸盐标记，氟吡甲禾灵为多功能（细胞溶质）ACCase的特异性抑制剂。¹⁴C-乙酸盐并入受氟吡甲禾灵抑制的程度与细胞溶质伸长活性成比例，而抗氟吡甲禾灵并入是来自质体内的从头路径。图6c显示，氟吡甲禾灵在存在或不存在吐温-80的情况下以相同量抑制¹⁴C-乙酸盐并入，如由抑制曲线彼此平行的事实显而易见。然而，抗氟吡甲禾灵并入（由曲线下面积代表）在含10mM吐温-80的培养物中减少约一半，这显示了吐温-80补给特定地抑制质体中的从头脂肪酸合成。

这些资料显示，质体中的ACCase或FAS的某种下游组分在添加吐温-80后受抑制。为了分开这些可能性，我们利用以下事实：外源丙二酸盐可以被转化成丙二酰基-CoA并且由FAS使用，从而绕开ACCase反应（Kannangara等人1973,Plant Physiol,52,156-161）。如果ACCase是唯一抑制点的话，那么从头脂肪酸的¹⁴C-丙二酸盐标记的速率在含或不含吐温-80的培养物中应该相同。图6d显示，与¹⁴C-乙酸盐标记的对照相比，¹⁴C-丙二酸盐并入到16和18碳脂肪酸中不受吐温-80抑制。因此，ACCase而非FAS受吐温-80补给所抑制。组合起来，来自图6的资料明确地将质体ACCase鉴别为吐温-80诱导的反馈抑制的目标。

实施例4：ACCase活性和信息在吐温补给的细胞中未有降低

进行基因表达分析和酶试验以更好地了解在吐温-80补给期间ACCase活性的明显降低。定量实时PCR用于测量编码质体ACCase亚单元的基因的表达。选择用于分析的特异性基因为最初被鉴别为在欧洲油菜植物中胚胎表达的那些基因（Elborough等人1996,Biochemical Journal,315,103-112）。表1显示，全部四种基因的表达不受三小时吐温-80处理所影响。另外，来自相同细胞的粗提取物的ACCase活性的测量结果揭示，最大ACCase活性在很大程度上不受影响（表1）。脱盐提取物得到相同结果。用氟吡甲禾灵处理使得活性降低约15%，从而指示质体ACCase在这些试验中占主导（图7a）。通过脱磷酸化而灭活（Savage和Ohlrogge1999,Plant J,18,521-527）或通过与ΡII蛋白发生2-氧化戊二酸依赖性相互作用而抑制（FeriaBourrellier等人,2010,Proc Natl Acad Sci USA,107,502-507）已被提议作为调控ACCase活性的其他手段。如果脱磷酸化涉及到反馈中，那么将预期用磷酸酶处理使来自受抑制细胞的ACCase活性降低的程度小于对照。如果涉及到ΡII相互作用，那么有可能在2-氧化戊二酸存在下孵育将使来自吐温补给的提取物的ACCase的抑制程度大于对照。在磷酸酶处理粗提取物之后或在5mM2-氧化戊二酸存在下进行的ACCase试验揭示对照与吐温-80补给的培养物之间没有差异（图7b），这与对吐温-80诱导的反馈具有极小作用或无作用的这些机制相一致。总之，这些结果指示，质体ACCase转录物或蛋白质量的降低和已知的翻译后机制不是在吐温-80补给下所观测到的反馈抑制的原因。

表1.对吐温-80有反应的基因表达和ACCase活性

实施例5：ACCase受含有18:1的吐温抑制

市售吐温-80含有脂肪酸的混合物。为了剖析个别组分的影响，测试多种吐温-酯对脂肪酸合成的影响。个别吐温的组成以及¹⁴C-乙酸盐标记实验的结果列于表2中。仅含有饱和脂肪酸的吐温-40和吐温-60对脂质的乙酸盐标记的抑制程度并不与主要含有18:1的吐温-80或吐温-85相同。定制合成的吐温-18:1也产生最大抑制。另外，（最有可能）通过补给到丙二酰基-CoA库中而刺激脂肪酸产生的丙二酸盐补给不会抑制¹⁴C-乙酸盐并入（图8），这表明ACCase不太可能受体内丙二酰基-CoA抑制。总之，这些结果指向18:1或下游代谢物为反馈抑制的原因。

表2.脂质的¹⁴C-乙酸盐标记受多种吐温的抑制

实施例6：吐温-80抑制的机制

吐温-脂肪酸酯进入细胞中并且被水解而得到游离脂肪酸（Terzaghi1986Plant Physiol,82,771-779）。游离脂肪酸可以通过酯化成CoA或ACP而活化，随后沉积于细胞脂质中。在吐温-80补给的细胞中测量稳态库酰基-ACP和酰基-CoA以及游离脂肪酸（FFA）。在三小时补给之后，18:1FFA出现，而在未处理的细胞中没有检测到（图9a）。同样地，18:1-ACP和18:1-CoA在吐温-80补给之后量加倍，而大多数其他分子种类下降（图9b、c）。在设计用于区别来自吐温的脂肪酸的并入与反馈抑制的二次效应的独立实验中，在¹³C-油酰基-吐温补给的细胞中分析FFA和酰基ACP。结果为在3小时，99.1±2.2%的18:1FFA和46.2±4.2%的18:1-ACP含有¹³C-油酸（图9），这意味着在这些代谢物中观测到的增加是来自吐温的脂肪酸的直接并入的结果。测试18:1FFA、18:1-ACP和18:1-CoA对ACCase酶活性的影响。首先，基于图9中的值范围和细胞的水含量来计算这些中间物的体内浓度。18:1FFA的细胞内浓度据估算为0-100μΜ。18:1-ACP的估算浓度为0.6-1.2μΜ。然而，考虑到酰基-ACP限于质体，在发育中的胚胎中质体的体积被确定为细胞的10%（Mansfield和Briarty1992,Can J Bot,70,151-164），估算值增加到5-10μΜ。总细胞18:1-CoA据估算为1-3μΜ。这些值确立待测试的浓度的范围。当包括在粗细胞提取物的试验中时，至多10μΜ的FFA对ACCase活性没有影响（图10a）。当测试酰基-ACP和酰基-CoA的影响时，作出两个考虑。首先，硫酯键在ACCase试验中所用的碱性条件下不稳定，并且与粗提取物中所存在的硫酯酶组合，酰基-ACP和酰基-CoA可能快速降解。使用与ACCase试验相同的条件测量硫酯酶活性。使用3μΜ（150pmol试验^-1）1-¹⁴C-油酰基-ACP作为底物，发现硫酯酶活性为7.9±2.2pmol min^-1，这意味着到20分钟为止所有酰基-ACP都降解。因此，ACCase试验的持续时间从30分钟缩短到10分钟，并且在粗提取物之后立即添加代谢物以减少硫酯键断裂。第二个考虑因素为大肠杆菌ACCase仅受其自身的同源酰基-ACP抑制（Davis和Cronan2001,J Bacteriol,183,1499-1503）。因此，在种子中高度表达的ACP（Safford等人1988Eur J.Biochem.,174,287-295）从细胞培养物中克隆并且用于这些实验中。当18:1-ACP以≥3μΜ的浓度包括在内时观测到ACCase的抑制（图10b）。使用18:1-CoA观测到类似影响（图10c）。在两种情况下，抑制为部分抑制。对18:1酰基部分的抑制的特异性与引起最大反馈的含有18:1的吐温（表2）相一致。作为对照，测试作为ACCase抑制剂的吐温-80本身并且发现其对活性没有影响（图7c），从而指示抑制不是由吐温-酯引起，而是由其下游代谢物引起。

对植物中脂肪酸合成的反馈抑制的先前研究证实其存在于具有被建议作为抑制位点的ACCase或FAS的营养组织中（Ramli等人2002Biochem J,364,393-401；Shintani和Ohlrogge1995Plant J,7,577-587；Terzaghi1986a Plant Physiol,82,780-786）。通过使用独特的类胚胎细胞系，证实在预期脂肪酸合成速率较高的组织中存在反馈调控。放射性标记实验用于牵涉作为特异性抑制位点的质体ACCase。通过分析基因表达和酶活性而削减ACCase的转录和转录后调控。最后，使反馈抑制与体外抑制ACCase活性的18:1-ACP和18:1-CoA的量增加相关联。基于这些结果，我们提出一种机制：其中18:1-ACP和/或18:1-CoA的浓度通过其对质体ACCase的生物活性抑制而介导植物脂肪酸合成的反馈调控（图11）。

此处所用的欧洲油菜细胞系快速输入和并入来自吐温的脂肪酸。这些细胞能够耐受高于约10倍的吐温-80浓度并且需要更高水平来实现等效反馈抑制，如先前针对烟草和大豆细胞培养物所报导（Shintani和Ohlrogge1995，同上；Terzaghi1986b，同上）。TAG为欧洲油菜细胞中的外源脂肪酸的强有力的汇点反映了其合成储油的倾向。这种代谢倾向可以解释为何需要较高浓度的吐温-80来诱导反馈，这与例如细胞年龄或渗透性的物理解释相反。对烟草的先前研究报导了脂肪酸合成的中间物的产生速率，而没有报导其实际库大小（Shintani和Ohlrogge1995，同上）。长链ACP的合成减少得出以下结论：其不太可能涉及到反馈中。确实，在我们的系统中，大多数酰基-ACP在吐温补给之后减少。然而，18:1-ACP实际上由于来自吐温的脂肪酸的并入而增加。定位于质体的酰基-ACP合成酶已被鉴别为能够将FFA酯化成ACP（Koo等人2005,J Biol Chem,279,16101-16110）。通过KAS的副反应（Alberts等人1972,J Biol Chem,247,3190-3198）或通过脂肪酸-磷酸泛酰巯基乙胺臂由holo-ACP合酶从酰基-CoA转移到apo-ACP（Lambalot和Walsh1995,J Biol Chem,270,24658-24661），酰基-ACP也可以从酰基-CoA和游离ACP合成。外源脂肪酸如何进入质体中是未知的。在这项工作中所报导的酰基-ACP的量比菠菜叶子中高约10倍，但个别分子种类的组成是类似的（Kopka等人1995Anal Biochem,224,51-60）。这种定量差异可能归因于所用细胞的类胚胎身份（以及相关的较高脂肪酸合成速率）。加强这个概念的事实为酰基-CoA含量更偏向于来自欧洲油菜种子而非叶子（Larson和Graham2001,Plant J,25,115-125）。

在吐温补给期间脂肪酸合成速率的降低可能是由于外源脂肪酸的代谢，从而导致游离ACP和CoA的缺乏。如果这是实情，那么ACP或CoA的缺乏将表现为¹⁴C-乙酸盐和¹⁴C-丙二酸盐并入到脂肪酸中减少。然而，只有¹⁴C-乙酸盐的并入减少，这指示作用对ACCase活性具特异性。质体ACCase为反馈调控的目标与其作为脂肪酸合成的限速步骤相一致（Ohlrogge和Jaworski1997,Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol,48,109-136）。FAS的抑制将可预测地导致丙二酰基-CoA的积累。在缺乏FAS活性的情况下，丙二酰基-CoA将为质体中的终末产物，因此ACCase的抑制比FAS的抑制更有效。在细胞溶质中，丙二酰基-CoA是类黄酮生物合成所需要的并且ACCase活性损失导致胚胎致死（Baud等人2003,Plant J,33,75-86）。细胞溶质ACCase的这种附带功能可以解释其对反馈效应的明显免疫。已知质体ACCase由体内多种因子调控。尽管在其他情况下显而易见，但转录和翻译后调控在吐温-80诱导的反馈的情况下没有被检测到。光间接通过光合作用诱导的基质pH、Mg2+浓度和还原电势的变化来调控ACCase。这项研究中所用的细胞以异养方式并且在恒定光中生长，由此怀疑光合作用对基质环境或ACCase活性具有很大影响。ATP是ACCase反应所需要的并且其在质体中的可用性也可能影响活性。已显示长链酰基-CoA通过抑制ATP输入而减少分离质体中的脂肪酸合成（Fox等人2001,Plant Physiol,126,1259-1265；Johnson等人2000,Biochem J,348,145-150）。然而，这是所有长链CoA的一般作用并且长链酰基-CoA的组合量不受吐温补给所影响，由此不太可能抑制ATP输入。另外，甾醇生物合成和细胞生长速率也不受吐温补给所影响，这两者都将受有限的ATP供给不利地影响。

ACCase受18:1-ACP的抑制与大肠杆菌的反馈机制（Davis和Cronan2001J Bacteriol,183,1499-1503）和质体ACCase的原核进化起源（Cronan和Waldrop2002Prog Lipid Res,41,407-435）相一致。然而，先前显示，酰基-ACP并不抑制植物ACCase（Roesler等人1996,Plant Physiol,113,75-81）。这个矛盾可能是由于若干方法差异。作为差异之一，大肠杆菌ACCase只有在使用大肠杆菌而非菠菜酰基-ACP时才受抑制（Davis和Cronan2001，同上）。在当前研究中，欧洲油菜酰基-ACP用于抑制欧洲油菜ACCase。另一方面，Roesler和共同工作者在具有蓖麻和豌豆ACCase的试验中使用菠菜酰基-ACP。因此，似乎ACCase的抑制依赖于ACP的来源。

另一个差异在于在这项研究和大肠杆菌研究中，酶试验是对粗提取物进行，而Roesler和共同工作者使用半纯化的ACCase。酶可以在纯化期间经过修饰（例如通过磷酸化或蛋白水解）以促使其对酰基-ACP无反应，或在粗提取物中可能存在促进ACCase抑制的某种其他因子。ACCase的酰基-CoA抑制关于酵母和动物ACCase已有报导（Ogiwara等人1978,Eur J Biochem,89,33-41），并且关于纯化的植物酶也有报导（Nikolau和Hawke1984,Arch Biochem Biophys,228,86-96；Roessler1990,Plant Physiol,113,75-81）。

呈吐温-80形式的外源脂肪酸的供给为用于阐明生物化学机制的非生理处理，从而产生这些结果是否牵涉到整个植物的问题。质体脂肪酸合成以16:0-ACP或18:1-ACP的产生而终止。这些产物然后被硫酯酶裂解并且游离脂肪酸在从质体中输出后转化成酰基-CoA。ACCase（Thelen和Ohlrogge2002,Arch Biochem Biophys,400,245-257）、FAS（Roughan和Ohlrogge1996,Plant Physiol,110,1239-1247）、硫酯酶（Shine等人1976,Arch Biochem Biophys,172,110-116）以及酰基-CoA合成酶（Andrews和Keegstra1983,PlantPhysiol,72,735-740）全部都与叶绿体膜缔合并且已提出其形成使脂肪酸合成的中间物从乙酰基-CoA通向酰基-CoA的超复合体（Koo等人2004,J Biol Chem,279,16101-16110；Thelen和Ohlrogge2002,Arch Biochem Biophys,400,245-257）。假定这种膜缔合有助于质体中脂肪酸的产生与其在细胞溶质中需求之间通信。在这种复合体内，18:1-ACP和18:1-CoA的局部浓度可以达到高于上文所估算的1-3μΜ范围的水平。ACCase仅仅受此处所用的代谢物浓度的生理范围的部分抑制。部分抑制足以说明此处所见的反馈的量值。ACCase受18:1-ACP的抑制是可行的，因为酰基-ACP主要出现在质体中。然而，18:1-CoA先前在分离的叶绿体中无法检测到（Post-Beittenmiller等人1991,J Biol Chem,266,1858-1865），并且关于酰基-CoA的结果并未提供区室特异性信息。然而，在质体中存在可以使用18:1-CoA作为底物的酶，如G3P-酰基转移酶（Frentzen等人1983Eur J Biochem,129,629-636）。另外，分离的叶绿体能够将外源18:1-CoA并入到脂质中，这指示吸收和并入的能力（Kjellberg等人2000,Biochim Biophys Acta,1485,100-110）。可以预见细胞溶质酰基CoA处于低需求的情况，从而使得从头18:1-CoA的扩散以低于其合成的速率发生，由此使得在质体中积累。当与KAS使游离CoA与酰基-ACP发生酰基转移的能力（Alberts等人1972）组合时，似乎合理的是，18:1-CoA可以在质体中积累并且抑制ACCase。

在此处所用的细胞系中存在完全反馈是令人感兴趣的，因为其证实反馈可以在类种子组织中发生并且此时脂肪酸合成为主要代谢功能。这可以解释为何ACCase的过度表达使得种子中的脂肪酸产生有极小增加（Roesler等人1997,Plant Physiol,113,75-81）。还暗示，含油种子已演变出克服反馈抑制的手段。硫酯酶可以用于降低抑制性18:1-ACP的水平，并且欧洲油菜硫酯酶确实偏好18:1-ACP作为底物并且在胚胎发育期间得以诱导（Hellyer等人1992,Plant Mol Biol,20,763-780）。支持这个概念的事实为反馈抑制在大肠杆菌中通过硫酯酶的过度抑制而减轻（Jiang和Cronan1994,J Bacterial,176,2814-2821），并且在欧洲油菜中通过中链硫酯酶的过度表达而间接减少18:1-ACP使得脂肪酸合成速率较高（Eccleston和Ohlrogge1998,Plant Cell,10,613-622）。反馈抑制还可以解释欧洲油菜中的合成与组装之间的油积累的共享控制（Ramli等人2002a,Biochem J,364,393-401）。已表明，消耗细胞溶质中的酰基-CoA的二酰甘油酰基转移酶（DGAT）对油积累施加控制（Perry等人1999Phytochemistry,52,799-804；Weselake等人2008Prog Lipid Res,38,401-460），并且拟南芥中这种酶的过度表达使得油含量提高（Jako等人2001,PlantPhysiol,126,861-874）。脂肪酸合成增加为油含量提高的逻辑前提。相反地，DGAT缺乏的拟南芥asi1（tag1）突变体与野生型相比具有较少油并且¹⁴C-乙酸盐并入到脂质中减少，这指示脂肪酸合成减少（Katavic等人,1995,Plant Physiol,108,399-409）。以这些结果和当前研究为前提，DGAT可以通过消耗细胞溶质中的酰基-CoA，由此驱使从头脂肪酸从质体中经载体输出并且防止反馈抑制来对油积累施加控制。

脂肪酸生物合成为对ATP和还原剂有高需求的基本生物合成路径。因此，其调控将在许多水平上发生似乎合乎逻辑。设计这项工作以处理生物化学反馈中的早期事件。然而，反馈在长期吐温补给期间持续发生（这项研究，Shintani和Ohlrogge1995）并且通过与其他系统类比可能涉及一系列动态机制，这些机制能够快速、然后持续地对脂肪酸的过度供给作出反应。另外，ACCase受酰基-ACP的抑制只有在分析粗细胞提取物时才观测到的事实留下了某种其他因子为抑制所需要的可能性。

实施例7：构筑T-DNA载体和分离具有替代ACC亚单元的转基因植物

使用标准重组DNA技术，以下嵌合基因通过可操作地连接以下DNA片段而产生：

载体MS1

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自勤奋金属球菌的生物素羧化酶的从核苷酸位置331到核苷酸位置1860的SEQ ID No.1的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体MS2

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自勤奋金属球菌的生物素羧化酶载体蛋白的从核苷酸位置1860到核苷酸位置2360的SEQ ID No.1的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体MS3

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区

·编码来自勤奋金属球菌的羧基转移酶蛋白的从核苷酸位置659到核苷酸位置2230的SEQ ID No.2的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CS1

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶载体蛋白的SEQ ID No.6的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CS2

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自Cenarcheum symbiosum的生物素羧化酶的SEQ ID No.8的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CS3

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自Cenarcheum symbiosum的羧基转移酶的SEQ ID No.10的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CA1

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶的SEQ ID No.12的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CA2

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自橙色绿屈挠菌的生物素羧化酶载体蛋白的SEQ ID No.14的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CA3

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自橙色绿屈挠菌的生物素羧基转移酶α的SEQ ID No.16的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体CA4

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码叶绿体靶向信号的DNA区（SEQ ID36-37）

·编码来自橙色绿屈挠菌的生物素羧基转移酶β的SEQ ID No.18的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体MS1、MS2和MS3的嵌合基因被组合在一个T-DNA载体中，其进一步包含选择标记基因。

同样地，载体CS1、CS2和CS3的嵌合基因被组合在一个T-DNA载体中，其进一步包含选择标记基因。

此外，载体CA1、CA2、CA3和CA4的嵌合基因被组合在一个T-DNA载体中，其进一步包含选择标记基因。

使用常规方法将T-DNA载体引入到包含辅助型Ti质粒的土壤杆菌菌株中。基本上如De Block等人(1989),Plant Physiol.91:694所描述而获得、培养并转化欧洲油菜的下胚轴外植体以将嵌合基因转移到欧洲油菜植物中。

鉴别转基因欧洲油菜植物并且分析其油含量的增加。

实施例8：构筑T-DNA载体和分离过度表达FAT A蛋白的转基因植物

载体RC1

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码来自蓖麻的FAT蛋白的SEQ ID No.20的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

将嵌合基因以及选择标记基因引入到左侧与右侧T-DNA边界之间。

使用常规方法将T-DNA载体引入到包含辅助型Ti质粒的土壤杆菌菌株中。基本上如De Block等人(1989),Plant Physiol.91:694）所描述而获得、培养并转化欧洲油菜的下胚轴外植体以将嵌合基因转移到欧洲油菜植物中。

鉴别转基因欧洲油菜植物并且分析其油含量的增加。

实施例9：构筑T-DNA载体和分离过度表达酰基-CoA结合蛋白的转基因植物

载体ACBP4

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码来自拟南芥的ACBP4蛋白的从核苷酸103到核苷酸2109的SEQ ID No.22的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

载体ACBP6

·双倍增强CaMV35S启动子区

·编码来自拟南芥的ACBP6蛋白的从核苷酸106到核苷酸384的SEQ ID No.24的DNA区

·来自3'胭脂碱合酶基因的转录终止和聚腺苷酸化信号。

将嵌合基因以及选择标记基因（独立地）引入到左侧与右侧T-DNA边界之间。

鉴别转基因欧洲油菜植物并且分析其油含量的增加。

实施例10：构筑T-DNA载体和分离过度表达酰基-CoA结合蛋白的转基因植物

如Tzfira等人,2005Plant Mol.Biol.57,503-516所描述，将各自配备有来自蓖麻硬脂酰基-ACP去饱和酶的叶绿体转运肽的CsACCase（来自Cenarcheum symbiosum的ACCase）亚单元克隆到pSAT表达系统中。对于密码子优化的CsACCase亚单元来说，用EcoRI和BamHI将BCCP（SEQ ID No:129-130）克隆到pSAT1-mcs中，用BglII和XbaI将BC（SEQ ID No:131-132）克隆到pSAT4-mcs中，并且使用EcoRI和BamHI将CT（SEQ ID No:133-134）克隆到pSAT5-mcs中。所有三个表达盒都含有35S启动子。

含有来自pSAT4-nptII（Genbank编录号AY818371）和pSAT6-DsRed2-C1（Genbank编录号AY818375）的表达盒的pPZP-RCS2-nptII-dsRed用于克隆CsACCase表达盒并且还用作空载体对照。pPZP-RCS2被设计用于克隆多个表达盒（Goderis等人,2002）并且是基于二元载体pPZP200（genbank编录号U10460，Hajdukiewicz等人,1994）。

将含有优化CsACCase基因的表达盒从个别pSAT载体切下并且插入到pPZP-RCS2-nptII-dsRed中。因为nptII在pPZP-RCS2的pSAT4插入位点中，所以含有CsACCase基因的最终构筑体不含有nptII。其被CsBC基因置换，这个CsBC基因被克隆到pSAT4-mcs中并且因此必须插入到pPZP-RCS2的pSAT4插入位点中。

最终构筑体具有pPZP-RCS2骨架，其在位点1中具有CsBCCP，在位点4中具有CsBC，在位点5中具有CsCT，并且在位点6中具有DsRed。所有盒都由35S启动子驱动。

使用常规方法将T-DNA载体（具有或不具有CsACCase亚单元）引入到包含辅助型Ti质粒的土壤杆菌菌株中，并且使用土壤杆菌菌株以常规方式转化拟南芥。

获得用CsACCase亚单元（ACCase L1-13）或用“空载体”（EVL1-9）转化的转基因拟南芥系列。通过测定每个种子的脂肪酸甲酯（FAME）的含量（以μg表示）来分析T2种子的种子油含量（每个系列3个样品）。

结果概述于表3中并且以图形呈现于图12中。如从这些结果可以推出，若干Accase系列具有高于若干EV L对照系列的种子油含量。

表3.种子油含量

Claims

1.一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含防止所述植物的所述细胞中的质体乙酰基CoA羧化酶受18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的反馈抑制的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述防止反馈抑制是通过提供具有乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元的植物细胞、尤其植物细胞的质体来实现，所述乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元与所述植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对所述反馈抑制的敏感性较小。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶变体或其亚单元是由所述植物细胞中的变体等位基因编码。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶变体或其亚单元是由引入到所述植物细胞中的转基因编码。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物细胞具有来自使用3-羟基丙酸循环进行碳固定的生物体的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：硫化叶菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、热变形菌目、热球菌目或盐杆菌目。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：勤奋金属球菌、布氏酸菌、硫磺矿硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热硫化叶菌、Cenarcheumsymbiosum、闪烁古生球菌、丁酸栖高温菌、海生葡萄状嗜热菌、依赖热丝菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculum aerophilum、冰岛热棒菌、坎地热棒菌、激烈热棒菌、深海热棒菌、掘越氏热棒菌、死海盐盒菌、盐杆菌属NRC-1、Haloquatratum walsbyi、湖渊盐红菌或法老盐碱单孢菌。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：勤奋金属球菌、布氏酸菌或Cenarcheum symbiosum。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物细胞具有来自橙色绿屈挠菌的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。

10.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物细胞具有SEQ IDNo46-128中任一项的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述植物细胞具有包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子：

a）植物可表达启动子；

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述DNA分子进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述编码区包含以下核苷酸序列：从位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ IDNo.1、从位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16或SEQ ID No.18，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的编码区。

14.根据权利要求11或13所述的方法，其中所述植物可表达启动子为在质体中表达的启动子并且其中所述终止和/或聚腺苷酸化区为在质体中发挥功能的转录终止区。

15.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述DNA分子被整合于所述植物细胞的核基因组中。

16.根据权利要求11、13或14所述的方法，其中所述DNA分子被整合于所述植物细胞的质体的基因组中。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述防止反馈抑制是通过降低所述植物细胞的质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平来实现。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平是通过提高所述细胞的所述质体中FATA酶的水平来实现。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述FATA酶的水平是通过将包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子引入到所述植物细胞中来提高：

a）植物可表达启动子；

b）编码FATA酶的DNA区；以及任选地

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述FATA酶包含从以下各项中选出的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID No21，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列。

21.根据权利要求19所述的方法，其中编码所述FATA酶的所述DNA区包含来自以下任一项的核苷酸序列：核苷酸序列SEQ ID No20，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核苷酸序列。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述DNA分子进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区。

23.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述植物可表达启动子为在质体中表达的启动子并且其中所述终止和/或聚腺苷酸化区为在质体中发挥功能的转录终止区。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述降低质体中18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白的水平是通过提高所述植物细胞中酰基-CoA结合蛋白的水平来实现。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述酰基-CoA结合蛋白的水平是通过将包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子引入到所述植物细胞中来提高：

a）植物可表达启动子；

b）编码酰基-CoA结合蛋白的DNA区；以及任选地

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酰基-CoA结合蛋白包含从以下各项中选出的氨基酸序列：SEQ ID No23或SEQ ID No25中任一项的氨基酸序列，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述植物细胞是在植物中。

28.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述油含量是在所述植物的储油部分中得到增加。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述油含量是在所述植物的种子中得到增加。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述植物是从以下各项中选出的产油植物：油菜、向日葵、红花、大豆、棕榈、麻风树、亚麻、海甘蓝、亚麻荠、玉米、芝麻、蓖麻子。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物是欧洲油菜、芸苔、芥菜、埃塞俄比亚芥。

32.一种植物，其质体中包含一个或多个ACCase变体酶或其亚单元，所述ACCase变体酶或其亚单元与所述植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小。

33.根据权利要求32所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自使用3-羟基丙酸循环进行碳固定的生物体。

34.根据权利要求33所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：硫化叶菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、热变形菌目、热球菌目或盐杆菌目。

35.根据权利要求34所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：勤奋金属球菌、布氏酸菌、硫磺矿硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热硫化叶菌、Cenarcheum symbiosum、闪烁古生球菌、丁酸栖高温菌、海生葡萄状嗜热菌、依赖热丝菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculum aerophilum、冰岛热棒菌、坎地热棒菌、激烈热棒菌、深海热棒菌、掘越氏热棒菌、死海盐盒菌、盐杆菌属NRC-1、Haloquatratum walsbyi、湖渊盐红菌或法老盐碱单孢菌。

36.根据权利要求33所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自从以下组中选出的生物体：勤奋金属球菌、布氏酸菌或Cenarcheum symbiosum。

37.根据权利要求32所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元是来自橙色绿屈挠菌。

38.根据权利要求32所述的植物，其包含有包含以下可操作地连接的DNA片段的DNA分子：

a）植物可表达启动子；

b）编码一个或多个乙酰基CoA-羧化酶亚单元的一个或多个编码区，其具有从氨基酸序列SEQ ID No2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列，优选地为异源编码区；或与从氨基酸序列SEQ ID No2、3、5、7、9、11、13、15、17或19或SEQ ID No46-128中任一项中选出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的编码区；以及任选地

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

39.根据权利要求38所述的植物，其中所述DNA分子进一步包含编码叶绿体靶向肽的DNA区。

40.根据权利要求38所述的植物，其中所述编码区包含以下核苷酸序列：从位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID No.1、从位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQ ID No.1、SEQID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16或SEQ ID No.18，或与其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的编码区。

41.根据权利要求38或40所述的植物，其中所述植物可表达启动子为在质体中表达的启动子并且其中所述终止和/或聚腺苷酸化区为在质体中发挥功能的转录终止区。

42.一种根据权利要求32至41中任一项所述的植物的细胞、组织、储油组织或种子。

43.一种油，其来源于根据权利要求31至41中任一项所述的植物。

44.一种嵌合DNA，其包含以下可操作地连接的DNA片段：

a）植物可表达启动子；

b）编码一个或多个乙酰基CoA-羧化酶亚单元的一个或多个编码区，其具有从氨基酸序列SEQ ID No.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中选出的氨基酸序列，优选地为异源编码区；或与从氨基酸序列SEQ ID No2、3、5、7、9、11、13、15、17或19或SEQ ID No46-128中任一项中选出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的编码区；以及任选地

c）在植物细胞中发挥功能的转录终止和/或聚腺苷酸化区。

45.一种与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的质体乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元的用途，其用于增加植物细胞中的油含量。

46.一种用以分离与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体的方法，其包含以下步骤：

a）产生一大批来源于优选来自植物的反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的变体乙酰基CoA-羧化酶；

b）在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温存在下鉴别所述变体乙酰基CoA-羧化酶中每一种的酶促活性；

c）分离在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白存在下与所述反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有较大酶促活性的那些酶变体。

47.一种用以增加植物细胞中的油含量的方法，其包含以下步骤：

a）根据权利要求45所述的方法分离与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小的乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体；

b）将所述乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元的变体引入到植物中，优选地通过从编码所述乙酰基CoA-羧化酶的DNA构筑体转录。

48.一种用以分离包含编码质体乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元的变体等位基因的植物细胞或植物的方法，所述质体乙酰基CoA-羧化酶变体酶或其亚单元与植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比对18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白作出的反馈抑制的敏感性较小，所述方法包含以下步骤：

a）提供植物细胞或植物的群体，其各自包含一大批变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元；

b）在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白或18:1吐温存在下鉴别所述变体乙酰基CoA-羧化酶或其亚单元中每一种的酶促活性；

c）分离包含在18:1-辅酶A或18:1-酰基载体蛋白存在下与所述反馈抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有较大酶促活性的酶变体的那些植物细胞或植物。

49.一种植物细胞或植物，其是通过根据权利要求48所述的方法获得。

50.一种生产食物、饲料或工业产品的方法，其包含

a）获得根据权利要求32至41和49中任一项所述的植物或其部分；以及

b）从所述植物或其部分制备所述食物、饲料或工业产品。

51.根据权利要求50所述的方法，其中

a）所述食物或饲料为油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白质；或

b）所述工业产品为生物燃料、纤维、工业化学品、医药品或营养保健品。