CN103805704A - 大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记方法和相应的引物，所述方法利用自主克隆的大麦sdw1/denso半矮杆基因与正常基因相比，denso基因在第1外显子存在7个bp的缺失，sdw1基因是整个基因序列的缺失，设计合成了用于检测Indel标记Indel-denso的引物，利用所述引物进行PCR扩增能够检测和区分大麦品种中的是否含sdw1/denso基因以及所含基因的具体形式。本发明所述的方法可以用于含sdw1/denso突变基因的大麦半矮杆品种鉴定和选育，能够极其显著地提高sdw1/denso基因的选择效率和鉴定效率，加速大麦半矮杆的育种进程。

Description

大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记及其应用

一、技术领域

本发明涉及鉴别大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记方法及相应引物，所述方法属于农业生物技术工程领域，可以用于含sdw1/denso突变基因的大麦矮杆品种鉴定和选育。本发明所述的鉴别sdw1/denso基因的分子标记方法和引物能够极其显著地提高sdw1/denso基因的选择效率和鉴定效率，加速大麦半矮杆的育种进程。

二、背景技术

大麦是世界第四大禾谷类作物，其种植面积和总产量仅次于小麦、水稻和玉米，目前世界大麦总产量约为1.3～1.5亿吨。我国大麦面积和总产次于水稻、小麦、玉米和粟居第5位。高产是大麦育种的首要目标，而抗倒性是大麦高产、稳产的先决条件。倒伏不但使大麦产量降低、收获困难，还降低大麦品质，使啤酒大麦贬为饲料大麦，进一步降低其经济价值。因此大麦抗倒性育种尤为重要。

作物的矮杆育种工程始于上世纪六、七十年代。由于矮杆、半矮杆作物抗倒性强、耐施重肥、高种植密度、高收获指数和生物转化率，故在作物育种中占据主导地位，掀起了以水稻矮杆育种为首的“绿色革命”。水稻中应用最广泛的半矮杆品种是国际水稻所培育的携带sd1半矮杆基因的“IR8”（PNAS2002,99:9043-9048）。sd1编码赤霉素合成途径中的关键限速酶GA20氧化酶，半矮杆机制是由于该基因383bp碱基的缺失导致其编码的氨基酸提前终止或是由于单碱基替换导致氨基酸移码，造成GA20氧化酶失活或是部分活性丧失引起的（PNAS2002,99:9043-9048）。sd1品种因其株高适中，对生长发育和产量负面影响小，不易倒伏，因此广受水稻育种家亲睐。相对于水稻sd1，大麦广泛育种应用的半矮杆基因有hcm1、uzu1，sdw1/denso和ari-e。目前，hcm1和ari-e未被克隆；uzu1基因即HvBRI1于2003年被克隆，该基因的单碱基替换能明显降低大麦对芸苔素内酯（一种植物生长调节剂）的响应，从而降低了株高（Plant Physiol2003，133:1209-1219）。sdw1/denso依赖不同的环境能降低株高10-20cm，大麦sdw1与denso互为等位基因（Crop Sci2000,40:352-358），表现为赤霉素不敏感(Barley Genet Newsl1995，24:56–59)。但两者有不同的来源和育种应用，sdw1来源于X射线诱变的挪威品种“Jotun”，广泛应用于美国、加拿大和澳大利亚的饲料大麦育种，而denso来自丹麦的“Abed Denso”和捷克的“Diamant”，主要用于欧洲啤酒大麦育种（Funct Integr Genomics2009,9:255-262）。Grausgruber等报导大麦品种Diamant（携带denso基因）及其等位基因已被用于150多个大麦品种中（Plant breed2002,121:411-416）。表明sdw1/denso半矮杆基因在欧美大麦育种中应用非常广泛，而在国内却未曾报道。

sdw1/denso基因于1993年被定位于大麦3HL，其后通过不同遗传群体的QTL定位以及相关分析发现sdw1/denso基因除影响株高外，在不同遗传背景下与诸多表型、生理和农艺性状相关，如苗期匍匐生长、维管束大小、叶片厚度、产量、抽穗期等(JAppl Genetics2013,381-390)。但sdw1/denso基因与这些农艺性状的关系是由于一因多效还是基因的紧密连锁不得而知，因此获得与目的基因紧密连锁的分子标记或是该基因序列，不仅能有效鉴定含有目的基因的半矮杆品种，同时也能区分基因在不同遗传背景下与诸多相关农艺性状的关系。

我们前期研究发现大麦sdw1/denso与水稻sd1为同源基因，并用同源克隆法获得了sdw1/denso的2号外显子（325bp）序列、1号外显子（287bp）和3号外显子（161bp）的部分序列（Funct Integr Genomics2009,9:255-262）。实时荧光定量PCR分析发现sdw1/denso的基因表达量与正常基因型差异显著，因此可用基因表达标记鉴定sdw1/denso不同等位基因（Theor Appl Genet2011，122(8):1451-1460）。但由于该法需要提取RNA、反转录合成cDNA第一链，然后进行实时荧光定量PCR分析进行鉴定，操作复杂、比较费时费力费财。在前期研究基础上，我们通过3’端RACE获得3’端序列；通过Genome walking(染色体步移)获得5’端序列，最后通过序列拼接和验证获得了sdw1/denso全长基因组序列。基因结构与水稻sd1相似，由3个外显子和2个内含子组成，包含1245bp碱基组成的开放阅读框（ORF），cDNA序列与sd1同源性高达88%。通过测序分析4份denso品种和3份sdw1品种，发现denso基因在起始位点之后的102-108位置缺失7bp（GACTCCC），导致翻译提前终止；而sdw1整个基因序列都缺失。

三、发明内容

技术问题

为了有效快捷地鉴定大麦品种中是否含有sdw1/denso基因，本发明提供了一种鉴别大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记方法，该方法通过对标记位点的比较，可以鉴定大麦中有无sdw1/denso半矮杆基因。利用这个标记进行sdw1/denso基因的半矮秆育种辅助选择可以保证100%的准确率，进而预测大麦株高，加快大麦半矮杆育种进度。

技术方案

本发明所述的用于鉴定大麦半矮秆基因sdw1/denso的基因标记方法包括如下步骤：

（1）大麦品种基因组DNA的提取，采用SDS快速提取法；

（2）用权利要求1所述引物对大麦基因组DNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系为：2×Taq Master Mix5μl，10pmol/L的引物对0.4μl，50ng/μl模板DNA1μl，灭菌蒸馏水3.2μl；反应总量10μl。PCR反应在ABI-Veriti梯度PCR仪上进行，反应程序包括：94℃预变性3min，每个循环94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。其中所用的用于鉴定大麦sdw1/denso基因的基因标记引物序列如下：

Indel-denso正向引物序列：AAGAACCATCCCTGACGCGCC

Indel-denso反向引物序列：CGGCGGAGGGGTCAATGCTGG。

（3）反应产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。

如果产生129bp的一条谱带（大片段），则为正常基因的大麦品种；如果有122bp的一条谱带（小片段），则为denso半矮杆基因的大麦品种；如果无任何片段检测到，则为sdw1半矮杆基因的大麦品种。

有益效果

本发明利用分子生物学的方法获得大麦sdw1/denso的基因标记，该标记优点具体归纳如下：

（1）对大麦半矮杆品种的有效利用，首先必须建立在明确基因来源的基础上。目前发现的大麦半矮杆品种较多，有些品种其系谱不清或系谱缺失，导致其矮源不清晰。传统的等位性分析不仅工作量大而且周期长，利用本发明的Indel-denso标记可以简单快速的鉴定sdw1/denso半矮杆等位基因。

（2）本发明所获得的基因标记是根据sdw1/denso内部产生的碱基或基因缺失，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。

（3）育种中半矮杆性状的观察必须等到成熟期才能进行，而利用本发明的标记可以在苗期判断其株高的基因型，为有效选育半矮秆大麦品提供依据。

（4）利用本发明方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。

附图说明

图1sdw1/denso等位基因第1外显子序列比对。

半矮杆品种Diamant（携带denso基因）、Jotun（携带sdw1基因）与AC Metcalfe（携带正常基因）第1外显子序列比对图。其中Diamant品种中第1外显子起始位点后102-108位置缺失7bp,Jotun品种整个基因序列缺失。

图2Indel-denso分子标记对供试品种的选择效果图。

1-5泳道为中、高杆品种，依次为余姚红大麦、浙皮8号、扬农啤4号、早熟3号和AC Metcalfe。6-9泳道为denso品种，依次为Diamant、Triumph、Franklin和Baudin。10-12泳道为sdw1品种，依次为Jotun、UC828、Yerong。

图3Indel-denso引物筛选sdw1/denso半矮杆品种。

1-12泳道为中杆和高杆品种，余姚红大麦、浙皮8号、花30、扬农啤4号、早熟3号、扬农啤8号、昆仑3号、凤大麦6号、澳选3号、单2、AC Parkhill和ACMetcalfe。13-25泳道为denso品种，依次为Diamant、法瓦维特、甘啤2号、甘啤3号、甘啤6号、甘啤7号、S500、云大麦2号、云大麦4号、云大麦6号、云啤11号、保大麦14号和501（美）。26-29泳道为sdw1品种，依次为Jotun、UC828、Yerong和鉴35。

五、具体实施方法

（1）供试材料

试验材料为5份大麦中、高杆品种，4份半矮杆denso品种和3份半矮秆sdw1品种。5份中、高杆品种包括：余姚红大麦、浙皮8号、扬农啤4号、早熟3号和ACMetcalfe。denso品种包括：Diamant、Triumph、Franklin和Baudin。sdw1品种包括Jotun、UC828和Yerong。

（2）半矮杆基因sdw1/denso基因标记的获得

根据序列比对和测序结果，利用Oligo7软件将半矮杆基因sdw1/denso第1外显子7bp缺失（图1）设计成Indel标记，命名为Indel-denso。

（3）DNA提取

取大麦叶片100mg左右，利用简易快速法提取DNA，具体操作步骤如下：

①取100mg左右新鲜大麦叶片（-20℃保存的叶片），装入1.5ml离心管。

②加入钢珠（2mm直径）1粒，盖紧离心管，置于高通量组织研磨仪（QIAGENTissuelycerⅡ）中研磨1分钟，震动频率为1200次/分钟。

③加入325μl提取液（0.15M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05M EDTA和2%SDS），充分混匀。

④加入110μl醋酸钾（浓度为5M），充分混匀。

⑤冰浴10分钟。

⑥12000rpm速离心15分钟，将上清液转入一新的离心管，加入400μl无水乙醇和15μl醋酸钠（浓度为3M，PH=5.2）。回收钢珠。

⑦充分混匀后，12000rpm离心10分钟。

⑧去掉上清，400μl70%乙醇清洗。

⑨12000rpm离心5分钟，弃70%乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于100μlTE(1/10),－20℃保存备用。

（4）PCR反应及电泳检测

PCR扩增反应体系为：2×Taq Master Mix5μl，10pmol/L的引物对0.4μl，50ng/μl模板DNA1μl，灭菌蒸馏水3.2μl；反应总量10μl。PCR反应在ABI-Veriti梯度PCR仪上进行，反应程序包括：94℃预变性3min，每个循环94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

（5）检测结果分析

利用Indel-denso对12份供试材料进行基因型检测，第1外显子缺失的能扩增出122bp的DNA条带（小片段）；目的基因缺失的未能扩增出DNA条带；无任何缺失的能扩增129bp的DNA条带（大片段）（图2）。图2所示Diamant、Triumph、Franklin和Baudin能扩增出小片段，说明这些品种在第1外显子都存在7bp的碱基缺失；Jotun、UC828和Yerong未能扩增出任何条带，表明这些品种中该基因缺失。

实际应用：

我们利用本发明所述的Indel-denso引物筛选了562份国内外品种，其中引进品种206份，地方品种167份、育成品种189份，电泳结果分析发现denso品种有12份，sdw1品种1份，这些品种株高在64-84cm之间，属于半矮杆型。国内地方品种中无sdw1/denso基因；携带denso品种的国外品种有法瓦维特、S500和501（美）；携带denso的国内选育品种分布于甘肃省和云南省，分别是甘啤2号、甘啤3号、甘啤6号、甘啤7号、云大麦2号、云大麦4号、云大麦6号、云啤11号、保大麦14号（附表1）。系谱分析发现，法瓦维特组合为Diamant×Fillnion（Diamant即为辐射诱变获得的denso品种），由甘肃农业科学院1984年从匈牙利引进的荷兰品种，原名Favorit,曾用名匈84-62，组合为Diamant/Fillnion，经选育后定名为甘啤1号，因此法瓦维特（甘啤1号）的denso基因来自Diamant。甘啤3号和甘啤7号由甘肃省农业科学院利用叙利亚品种抗旱品种S-3为母本、法瓦维特为父本，通过选育不同的单株育成的啤酒大麦品种，因此这2个品种都有法瓦维特的血统，携带来自Diamant的denso基因。甘啤2号也是甘肃省农业科学院从墨西哥引进的F1代材料，编号为M90-9-10-4，经标记检测和测序分析，证实携带denso基因。甘啤6号组合为NMN3//862659/吉53，其中NMN3品种从墨西哥引进，经标记检测和测序分析结果吻合，携带denso基因。

S500是1986年云南省弥渡县种子管理站从墨西哥国际小麦玉米改良中心引进的品种，其组合代号为ARVPO“S”，系谱不详，目前为云南省大麦品种区域试验的对照品种。我们通过测序发现S500携带的基因为denso。云啤11号亲本之一为S500，因此携带desno基因。云大麦2号、云大麦4号、云啤6号和保大麦14号都是从墨西哥国际小麦玉米改良中心引进，测序发现携带denso基因。501（美）是从美国引进的品种，系谱无从查证，测序分析发现携带denso基因，与标记检测一致。

鉴35是六棱裸麦，株高为80cm，由江苏省农科院从国外引进的品种，系谱信息无从查证，分子标记检测为携带sdw1基因。

附表1：Indel-denso分子标记鉴定的sdw1/denso半矮杆品种

由此可见，利用本发明的Indel-denso标记的检测能区分sdw1/denso不同等位基因，为培育大麦半矮杆品种，实现分子标记辅助选择。

本发明的大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记及其应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.一种鉴定大麦半矮杆基因sdw1/denso的基因标记引物对，其特征在于，所述引物序列如下：

Indel-denso正向引物序列：AAGAACCATCCCTGACGCGCC

Indel-denso反向引物序列：CGGCGGAGGGGTCAATGCTGG。

2.一种利用权利要求1所述的引物对鉴定大麦半矮杆基因sdw1/denso的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）提取大麦品种基因组DNA；

（2）利用权利要求1所述引物对大麦基因组DNA进行PCR扩增；

（3）对PCR扩增产物进行电泳，如果产生129bp的一条谱带，则为正常基因的大麦品种；如果有122bp的一条谱带，则为denso半矮杆基因的大麦品种；如果未检测到任何片段，则为sdw1半矮杆基因大麦品种。

3.根据权利要求2所述的鉴定大麦半矮杆基因sdw1/denso的方法，其特征是：

所述步骤（2）的PCR扩增反应体系为：T2×Taq Master Mix5μl，10pmol/L的引物对0.4μl，50ng/ul的模板DNA1μl，灭菌蒸馏水3.2μl；反应总量10μl；PCR反应在ABI-Veriti梯度PCR仪上进行，反应程序包括：94℃预变性3min，每个循环94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。

4.根据权利要求2所述的鉴定大麦半矮杆基因sdw1/denso的方法，其特征是：所述步骤（3）反应产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，用硝酸银染色。

5.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4任一项所述的方法在大麦品种选育中的用途。

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