CN103804437A

CN103804437A - 一种烷基糖苷类生物抑菌剂

Info

Publication number: CN103804437A
Application number: CN201310196997.8A
Authority: CN
Inventors: 张文文; 杨敬辉; 庄义庆
Original assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Current assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CN103804437B

Abstract

本发明涉及一种烷基糖苷类生物抑菌剂的分离、纯化和鉴定。本发明从来源于泌乳奶牛牛粪中分离出了链霉菌NF0919菌株发酵产物提取、分离、纯化得到的一种烷基糖苷类化合物。经试验证实，该化合物具有多种抗菌效果。

Description

一种烷基糖苷类生物抑菌剂

技术领域：

本发明涉及一种烷基糖苷类化合物的提取、分离、纯化与鉴定，且该化合物具有抑制水稻纹枯病菌的作用，可以作为一种生物抑菌剂进行使用。

背景技术：

植物病原真菌是危害农作物的主要病原微生物类群，给农业生产造成巨大的损失。目前，化学农药在控制植物病害造成的损失上仍起着主要作用。但是化学农药的大量使用，已经对人类环境造成了严重的危害，并且增加了病害的抗药性。从天然资源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点。

农用抗生素（Agricultural antibiotics）是由细菌、真菌、放线菌等微生物在发酵过程中所产生的次级代谢产物，能在低浓度下选择性的防治农作物病虫害，或调节植物生长发育（邓洪渊,2005）。这类物质均为化学结构复杂的非单一化合物，具有良好的内吸性和选择性，可直接利用或经过加工改造而制成（文才艺,2004）。后来人们将具有抗病毒、抗癌细胞、抑制酶活性的微生物产生的活性物质也归入其范畴之中。

农用抗生素是随着医用抗生素的发展而发展起来的，至今不过50多年的历史。最早美国、日本先后采用链霉素（Streptomycin）、土霉素（Oxytertracyline）、灰黄霉素（Griseofulvin）等医用抗生素来防治植物病害，取得了一定效果。1944年，Brown和Boyle采用青霉素的粗品有效地防治了由几种细菌引起的冠瘿病（唐韵,2003）。1946年，美国厄普约翰公司研究发现放线菌酮（Cycloheximide）对植物真菌类有高度的抗菌活性，之后人们又发现了链霉素和氯霉素等对植物细菌和真菌病害有很好的防治效果，从而意识到抗生素在农业上的发展潜力。1958年日本研制成功杀稻瘟素-S(Bblasticidin-S)，并于1961年大面积应用于稻瘟病的防治，基本上取代了有机汞，有机砷等毒性高，对环境污染严重的化学农药，使农用抗生素的研究进入了一个新的阶段。随后又相继开发了春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxin）、有效霉素（Vzlidamycin）等高效低毒无公害的新的农用抗生素并远销许多国家（沈寅初,1996）。尤其近几年，日本还研究筛选出新的杀虫素和除草素，从而进一步加速了农用抗生素的发展，从而引起各国的重视。俄罗斯、美国、日本、德国、意大利、印度、丹麦等国已把农用抗生素的研究开发列入国家重点计划，受到特别重视。我国是农用抗生素生产与应用的大国，也是农用抗生素研究开展较早的国家，开始于上个世纪50年代初期。1953年，著名植病学家尹莘耘先生从陕西径阳分离到“5406”菌株，对棉花黄枯萎病有一定的防治效果，揭开了我国农用抗生素研究的序幕。当时国内农用抗生素研究基础进展较慢，到70年代以后才逐渐取得较大突破进入蓬勃发展时期。相继成功开发了井冈霉素、春雷霉素、农抗120、多抗霉素、灭瘟素、公主岭霉素、浏阳霉素、莫能霉素、南昌霉素等，为我国农用抗生素的发展应用奠定了基础。其中井冈霉素是目前为止我国最成功的农用抗生素，其产生菌与日本早期发现的有效霉素结构相似,称为吸水链霉菌井冈变种（Strepomyces hygroscopicus var jinggonggensis yen）（沈寅初,1985)，对水稻纹枯病有特效，它的成功开发使我国水稻纹枯病从此得到了有效控制。进入90年代，我国的农用抗生素研究开发进入一个新的发展高潮，研制成功了阿维菌素、中生菌素、宁南霉素和华光霉素等农用抗生素品种，成为世界上生产抗生素产量最多的国家之一（沈寅初,1997;商瑞,2008）。从产业化规模和研究深度上来看,阿维菌素、井冈霉素、赤霉素、苏云金杆菌（简称Bt）4个品种已成为我国生物农药产业中的领军产品,而农用抗生素中链霉素、农抗120、多抗霉素和中生菌素等品种已成为我国生物农药产业的中坚力量。以上产品已占到生物农药现有市场规模的90%左右,它们的发展趋势代表了我国未来生物农药产业市场的发展方向(魏海燕,2008)。农用抗生素的迅速发展和新产品不断投放市场，使得该领域的研究方兴未艾，已成为研制新农药的一条主要途径（Copping LG,2007;Dayan FE,2009）。

经田间连续多年的防治试验证明，我室筛选的生防新菌种——黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株的发酵代谢产物对葡萄炭疽病等重大为害高效农业作物的病原菌有很好防控效果，菌种详细信息请见授权专利ZL201010236886.1。

发明内容：

本发明的目的在是提供一种具有抑菌效果的烷基糖苷类化合物的分离纯化鉴定方法，其特征是含有烷基糖苷类结构骨架，命名为：6（2-甲基-3,5,6-三羟基-四氢吡喃-4-氧基）-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-羧酸-2,3,4,5,5-羧酸-庚脂，结构式如图6所示，图6中R1、R2、R3、R4、R5、R6均为甲基。

上述的图6化合物的制备方法，菌株提取液草酸沉淀后离心浓缩成褐色浸膏，乙酸乙酯超声提取，提取液浓缩为浸膏；用氯仿和甲醇进行硅胶柱梯度洗脱后，用甲醇与水进行葡聚糖凝胶LH-20柱梯度洗脱，分离纯化。

上述的图6化合物经高效液相色谱分析后进行核磁共振谱分析确定结构式。

上述的图6化合物可用于防治水稻纹枯病。

本发明采用活性物质跟踪分离纯化方法，测试了发酵原液、发酵提取液、各馏分纯化液和图6化合物对水稻纹枯病菌的抑制作用。经试验证实发酵原液、发酵提取液、各馏分纯化液和图6化合物对水稻纹枯病菌都具有抑制作用，其中图6化合物对水稻纹枯病菌的抑制作用最大，图6化合物可溶于水和甲醇，黄色油状物，可以作为一种生物抑菌剂用于水稻病菌的防治中。

附图说明：

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明方法的核磁共振氢谱图；

图3为本发明方法的核磁共振碳谱图；

图4为本发明方法的分子结构图（加C、H位移），（i中阿拉伯数字为核磁共振谱中碳原子的化学位移，ii中阿拉伯数字为核磁共振谱中氢原子的化学位移）；

图5为空白对照(i),发酵原液(ii)，发酵提取液(iii)和单体化合物(iiii)的抑菌活性；

图6为本发明方法的分子结构图（化学物结构式）

具体实施方式：

1菌种的发酵

将冰箱里保存的NF0919斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10d，挑取1cm²大小的菌块接种于种子培养基中（250ml三角瓶装量50ml），置于摇床上180rpm，30℃培养40h，按10%的接种量接入发酵培养基中（250ml三角瓶装量50ml），置于摇床上180rpm，30℃培养7d。

2抗菌活性物质的提取

将发酵液离心，滤液加草酸调pH至3.5，静止2h后离心，滤液浓缩成褐色糊状。浓缩液∶乙酸乙酯=1：2比例进行超声辅助萃取0.5h，反复萃取数次至萃取液无色透明。将乙酸乙酯萃取液真空浓缩成浸膏。

3洗脱液抗菌活性检测

以水稻纹枯病菌为指示菌,进行抗菌活性检测。将含有抗菌活性的洗脱液分别浓缩至干。得到抗菌物质粗品。将0.5mL药液与9.5mL培养基在培养皿内混匀，制成含各样品20倍的PSA培养基，采用无菌水作空白对照，各处理重复2次。将保留的水稻纹枯病菌转接到PSA平皿中，在25℃下活化48h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为4mm的菌饼，并转接到含药的PSA平皿和空白对照中。25℃培养48h，待对照中菌落快长满平皿时，采用十字交叉法量取菌落直径。计算菌落直径均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率：菌丝生长平均抑制率={(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值)/(对照菌落直径均值-接种菌饼直径)}×100%

4抗真菌活性物质纯品的制备

(1)硅胶柱梯度洗脱：经条件摸索后确定甲醇：氯仿=A100:0、B95:5、C90:10、D85：15、E80:20、F75:25、D70:30、H65:35.将提取液上柱子，按照梯度洗脱条件进行梯度洗脱，收集馏分合并后得w1、w2、w3、w4、w5、w6.（以抑菌率为标准确定有效成分的含量）结果见表1.

(2)葡聚糖凝胶柱梯度洗脱：经条件摸索后确定甲醇：水=A100:0、B95:5、C90:10、D85：15、E80:20、F75:25、D70:30、H65:35、I60:40、G55:45、K50:50。将硅胶层析后的W1馏分浓缩后上葡聚糖凝胶柱，按照梯度洗脱条件进行梯度洗脱，收集馏分合并后得W1-1、W1-3、W1-8、W1-10、W1-11、W1-12、W1-13、W1-14、W1-15。（以抑菌率为标准确定有效成分的含量）结果见表1.

表1分离纯化各馏分的抑菌率

5单体化合物的纯度检测

C18反相柱，柱温度30摄氏度，紫外检测器，检测波长为双波长305、210nm，进样20微升，梯度洗脱，流速1ML/min。流动相A：甲醇，流动相B：纯水，流动相当天过滤后使用。

6单体化合物结构鉴定

核磁共振谱(C、H谱)测定采用瑞士布鲁克公司AVANCEA-600或DRX-400型核磁共振仪，样品为W1-3，做一维核磁无内标。结果见附图2-4。

Claims

1.一种烷基糖苷类化合物，其特征是含有烷基糖苷类结构骨架，结构式为图6所示，命名为：6（2-甲基-3,5,6-三羟基-四氢吡喃-4-氧基）-3,4,5-三羟基-四氢吡喃-2-羧酸-2,3,4,5,5-羧酸-庚脂。

2.如权利要求1所述的图6化合物，其特征所述的R1、R2、R3、R4、R5、R6均为甲基。

3.权利要求1所述的图6化合物的制备方法，菌株提取液草酸沉淀后离心浓缩成褐色浸膏，乙酸乙酯超声提取，提取液浓缩为浸膏；用甲醇与水进行葡聚糖凝胶LH-20柱梯度洗脱后，反复用氯仿和甲醇进行硅胶柱梯度洗脱，分离纯化。

4.权利要求1所述的图6化合物经高效液相色谱分析后进行核磁共振谱分析确定结构式。

5.权利要求1所述的图6化合物可用于防治水稻纹枯病。