CN103797365A - 用于评估性腺毒性的手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于性腺毒性的诊断法和化学化合物风险分级的毒理学评估领域。具体而言，它涉及用于诊断性腺毒性的方法。它还涉及一种用于确定化合物是否能够在受试者中诱导这种性腺毒性的方法，并涉及一种鉴定用于治疗性腺毒性的药物的方法。另外，本发明涉及用于诊断性腺毒性的装置和试剂盒。

Description

用于评估性腺毒性的手段和方法
本发明涉及用于性腺毒性的诊断法和化学化合物风险分级的毒理学评估领域。具体而言，它涉及用于诊断性腺毒性的方法。它还涉及一种用于确定化合物是否能够在受试者中诱导这种性腺毒性的方法并涉及一种鉴定用于治疗性腺毒性的药物的方法。另外，本发明涉及用于诊断性腺毒性的装置和试剂盒。
性腺毒性涵盖性腺(即睾丸或卵巢)的受损、疾病或病症。因而，基于性别，性腺毒性包括卵巢毒性或睾丸毒性。所述性腺毒性可以是化学诱导的增强或驱动的性腺毒性。
卵巢是成对器官且是生殖系统和内分泌系统的有机部分。卵巢是具有三种主要功能的复杂器官：产生能育性卵母细胞、合成类固醇激素和合成调节蛋白。这些复杂功能反映在结构及其组成细胞类型、卵泡连同其卵母细胞、黄体和间质腺的多样性方面。原始卵泡在胚胎发育期间形成并且代表一种储备。物种依赖性数目的卵泡在每个发情周期期间成熟以便排卵。形态根据发情周期的不同阶段、年龄和改变的内分泌功能而改变。在排卵后，形成黄体，它是短暂内分泌腺，但是在妊娠不存在的情况下，它退化。卵巢还含有间质腺组织连同以下细胞，这些细胞发生周期性形态学变化并分类成几种不同形态学类型的产类固醇细胞和分泌雄激素的细胞。
就功能多样性和其激素调节作用的复杂性提供多个化学紊乱潜在位点而言，卵巢毒性可能在受试者中因多种病症、疾病或医学状况而明显。可以检测到的形态学改变的范围是多样的并且反映形态学特征。损伤位于表面上皮、卵泡、黄体和/或间质腺处。许多不形成肿瘤的卵巢损害以不同的主要组织组分(即随着正在发育的卵泡的阶段枯萎的黄体和间质腺)增加或减少为特征。相反地，肿瘤损害不总是清楚地区分，原因在于卵巢组织的死亡多潜能性质和其表现为通常不存在于死亡成熟卵巢中的广泛多样性细胞类型(例如支持细胞肿瘤和生殖细胞肿瘤)的能力。
存在广泛类型的由以下组成的非肿瘤损害：上皮增生(间皮)和管状增生、卵母细胞破坏、卵泡发育停滞直至卵泡闭锁、卵泡及间质萎缩、超数排卵、卵泡黄体化、卵泡囊肿、黄体缩减/不存在、黄体增加/持续、黄体空泡变性、支持细胞样管状增生、间质腺肥大/增生萎缩、发情周期紊乱和卵巢系膜平滑肌增生。
卵巢肿瘤可以再划分成五个宽类别，包括上皮肿瘤、性索-间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、源自卵巢未特化软组织的肿瘤和从远离部位转移至卵巢的肿瘤。卵巢的上皮肿瘤包括囊腺瘤和囊腺癌、管状间质腺瘤和间皮瘤。管状腺瘤是小鼠中最重要的卵巢肿瘤，但是它们在大鼠中不常见，在其他动物物种中罕见，并且未在女性卵巢识别到。另一组重要的卵巢肿瘤是源自性索和/或卵巢基质的那些。这些包括卵泡颗粒细胞瘤、黄体瘤、卵泡膜瘤、支持细胞肿瘤、伴有来自卵巢基质的贡献的管状腺瘤和未分化的性索-间质肿瘤。卵泡颗粒细胞瘤是这种组中最常见的并且可以在与基因缺失、辐射、卵细胞毒性化学品和新生儿胸腺切除相关的内分泌长期扰动后在某些管状腺瘤或管状间质腺瘤内部形成。
归因于诱导卵巢毒性的物质的可能作用的多样性，紊乱的评估是相当复杂的过程。当前方法通常包括临床研究、病理和组织病理研究以及生物化学和激素分析。组织病理评估的主要缺点是，它们具有侵入性，并且甚至与临床病理测量或激素分析组合时，它们较不可靠，因为它们部分地基于实施研究的毒理学家的个人解释或用于激素测量的所选方法。
如果考虑到卵巢是生殖及内分泌系统的有机部分并且因而可能受化学诱导的损害损伤，则研究卵巢紊乱的重要性可能是明显的。另外，例如，在欧洲共同体的任何种类产业中使用的化学化合物现在将需要符合REACH(化学品注册、评估和许可)。应当理解化学化合物引起肾上腺皮质紊乱的潜力将视为化合物的高风险，并且因此，化合物将仅对有限的应用并且在遵守高安全标准时可用。(见Capen CC(2001)Overview of structural and functional lesions inendocrine organs of animals,Toxicol.Pathol.,29,8-33；Capen CC(2008)Toxicresponses of the endocrine system,第21章,引自：Casarett&Doull'sToxicology,The basic science of poisons,Klaassen CD(编著),McGraw-Hill P,第7修订版,New York(2008)；Capen CC,Martin SL(1989)Mechanisms thatlead to disease of the endocrine system in animals,Toxicol.Pathol.,17,234-249；Lewis DJ,Gopinath C(1998)The female reproductive system,第13章,407-428,引自：Target organ pathology,a basic text,Turton J和Hooson J(编著)Taylor&Francis,London,United Kingdom,1998；Mattison DR,Thomford PJ(1989)The mechanisms of action of reproductive toxicants,Toxicol.Pathol.,17,364-376；Foster PMD,Gray LE(2008)Toxic responses of the reproductivesystem,第20章,761-806,引自：Casarett&Doull's Toxicology,The basicscience of poisons,Klaassen CD(编著),McGraw-Hill P,第7修订版,New York(2008)。
睾丸是成对器官且是生殖系统和内分泌系统的有机部分。睾丸由管状区室和间质区室作为两种形态和功能不同的区域组成。曲细精管被间质组织包围，所述间质组织由含有产生睾酮的莱迪希细胞、巨噬细胞、淋巴液和血管的结缔组织组成。曲细精管衬有由处在各个发育阶段的生殖细胞组成的分层上皮和提供结构性和营养性支持的支持细胞。睾丸的主要功能是产生雄性生殖细胞、精子和雄性类固醇激素，包括睾酮和二氢睾酮，还产生少量雌激素。两种功能均处在垂体产生的促性腺激素的控制下。
睾丸精子生成包括几代生殖细胞的同步发育，所述同步发育涉及精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和未分化的精细胞形态转化成特化的活动精子。通过这种发育，生殖细胞内嵌在支持细胞的胞质过程内部。支持细胞从间质液转移必需分子至生殖细胞，合成生殖细胞代谢的必需底物，并且通常调节精子生成的进程直至完成。精子释放是一个需要支持细胞和精细胞之间特化连接分离的主动过程。新形成的精子释放至曲细精管液中并借助睾丸网转运至输出小管中并转运至附睾。精子生成依赖于生殖细胞、支持细胞、莱迪希细胞、管周细胞、间质巨噬细胞和血管系统的协调支持和相互作用。该过程的总体调节由下丘脑-垂体-莱迪希细胞内分泌轴介导，但是同等重要的是借助旁分泌因子局部调节细胞功能。
由于雄性生殖系统的功能多样性和其激素调节作用的复杂性提供多个化学紊乱的潜在位点，睾丸毒性可能在受试者中因各种病症、疾病或医学状况而明显。损伤可以导致来自睾丸的精子输出减少或睾酮分泌减少并干扰精子转运穿过管道系统，并且可用于受精的精子的品质也可能受损。作为它在精子生成中作用的结果，毒性的最常见靶细胞之一是支持细胞。对这种细胞的任何功能损害将对依赖性生殖细胞的存活产生快速的次生影响。生殖细胞特定群体的死亡可以在影响有丝分裂的细胞毒药物或仅影响粗线期和正在分裂的精母细胞的乙二醇醚的情况下见到。莱迪希细胞功能易受干扰类固醇生成途径或干扰其调节性激素-促黄体激素(LH)和催乳素的循环水平或受体结合作用的任何物质影响。
不管毒性损伤的原发部位是什么，大部分睾丸毒物将更大或更小程度地造成生殖细胞退化和耗尽。支持细胞对损伤的最常见形态学反应之一是空泡形成，随后生殖细胞退化、瓦解或页状剥落。取决于支持细胞损伤的严重性和持续时间，生殖细胞耗尽可以是部分或完全的，但是支持细胞仍保持完整，因为它们抵抗细胞死亡。许多影响精子生成的化学品通过它们对支持细胞(例如，DBCP、MEHP)的影响间接地发挥作用，而非直接作用于生殖细胞。四氢大麻酚(THC)在(包括支持细胞在内的)生殖系统中的几种部位发挥作用。
睾丸中的流体分泌发挥重要作用。间质液体组成与睾丸血浆的组成相似，但是还附加高水平由莱迪希细胞分泌的睾酮和雄甾烯二酮。对许多睾丸毒物观察到减少的液体分泌和管收缩(tubular contraction)。
间质莱迪希细胞的主要功能是类固醇生成，并且干扰这个途径的任何毒物将导致激素平衡方面的功能紊乱。间质莱迪希细胞经常随着年龄增长或在长期暴露于大剂量化学品后经历增殖性变化(增生/瘤形成)。许多非遗传毒物可以导致莱迪希细胞增生(雄激素受体拮抗剂、还原酶抑制剂、睾酮生物合成抑制剂、芳香酶抑制剂、多巴胺激动剂、雌激素激动剂/拮抗剂和GnRH激动剂)。在大鼠中诱导莱迪希细胞肿瘤的非遗传毒性化合物很可能在大多数暴露条件下与人鲜有相关性，因为人比大鼠定量地较不敏感。莱迪希(间质)细胞肿瘤属于慢性毒性/致癌性研究中啮齿类中更频繁出现的内分泌肿瘤。啮齿类睾丸肿瘤分成五个总体类别，包括源自性腺基质细胞的肿瘤、生殖细胞源肿瘤、源自附件结构或浆膜的肿瘤和一组源自睾丸的支撑结缔组织和血管的肿瘤。性腺基质的肿瘤包括源自莱迪希(间质)细胞、曲细精管的支持细胞的良性和恶性肿瘤以及存在两种细胞类型的混合物的罕有混合瘤。
归因于诱导睾丸毒性的物质的可能作用的多样性，睾丸紊乱的评估是相当复杂的过程。当前方法通常包括临床研究、病理和组织病理研究以及生物化学和激素分析。然而，所述生物标志物受到相当复杂地调节并且变化有时可以甚至在相当进展的阶段出现。组织病理评估的主要缺点是，它们具有侵入性，并且甚至与临床病理测量或激素分析组合时，它们较不可靠，因为它们部分地基于实施研究的毒理学家的个人解释或用于激素测量的所选方法。
如果考虑到睾丸是生殖及内分泌系统的有机部分并且因而可能受化学诱导的损害损伤，则研究睾丸紊乱的重要性可能是明显的。另外，例如，在欧洲共同体的任何种类产业中使用的化学化合物现在将需要符合REACH(化学品注册、评估和许可)。应当理解化学化合物引起肾上腺皮质紊乱的潜力将视为化合物的高风险，并且因此，化合物将仅对有限的应用并且在遵守高安全标准时可用。(见Capen CC(2001)Overview of structural and functional lesions inendocrine organs of animals,Toxicol.Pathol.,29,8-33；Creasy DM(1998)Themale reproductive system,第12章,371-405,引自：Target organ pathology,abasic text,Turton J和Hooson J(编著)Taylor&Francis,London,UnitedKingdom,1998；Creasy DM(2001)Pathogenesis of male reproductive toxicity,Toxicol.Pathol.,29,64-76；Foley GL(2001)Overview of male reproductivepathology,Toxicol.Pathol.,29,49-63；Foster PMD,Gray LE(2008)Toxicresponses of the reproductive system,第20章,761-806,引自：Casarett&Doull's Toxicology,The basic science of poisons,Klaassen CD(编著),McGraw-Hill P,第7修订版,New York(2008)；Heindel JJ,Treinen KA(1989)Physiology of the male reproductive system:Endocrine,paracrine and autocrineregulation,Toxicol.Pathol.,17,411-445；Mattison DR,Thomford PJ(1989)Themechanisms of action of reproductive toxicants,Toxicol.Pathol.,17,364-376；Utiger RD(2010)Anatomy of the testis in Encyclopedia Britannica.2010年10月26日获自Encyclopedia Britannica Online:http://www.britannica.com/EBchecked/topic/588769/testis)。
以高效及可靠方式评估化学化合物的毒理学特性和特别是评估性腺毒性的敏感及特异性方法仍不可获得，但是将是高度期待的。
因此，本发明的技术问题可以视为提供用于符合前述需求的手段和方法。这个技术问题通过权利要求中表征及下文描述的实施方案来解决。
因此，本发明涉及一种用于诊断性腺毒性的方法，所述方法包括：
(a)确定疑似遭遇性腺毒性的受试者的测试样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量，和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此诊断性腺毒性。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述受试者已经与疑似能够诱导性腺毒性的化合物接触。
本发明还涉及一种确定化合物是否能够在受试者中诱导性腺毒性的方法，所述方法包括：
(a)确定已经与疑似能够诱导性腺毒性的化合物接触的受试者的样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此确定化合物诱导性腺毒性的能力。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述化合物选自以下的至少一种化合物：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛（Lysmeral）、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选的实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示性腺毒性。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示性腺毒性。
在本发明方法的又一个实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示性腺毒性。
本发明还构思了一种鉴定用于治疗性腺毒性的物质的方法，所述方法包括步骤：
(a)确定遭遇性腺毒性的受试者的样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量，所述受试者已经与疑似能够治疗性腺毒性的候选物质接触；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此鉴定能够治疗性腺毒性的物质。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的不同的量指示能够治疗性腺毒性的物质。
在前述方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗性腺毒性的物质。
在前述方法的又一个优选的实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗性腺毒性的物质。
本发明还涉及选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物或针对所述生物标志物的检测剂用于诊断受试者样品中性腺毒性的用途。
另外，本发明涉及一种用于诊断疑似遭遇性腺毒性的受试者的样品中性腺毒性的装置，所述装置包含：
(a)分析单元，其包含针对选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的检测剂，所述分析单元允许确定样品中存在的所述生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的，
(b)包含存储的参考和数据处理器的评价单元，所述评价单元允许相对于存储的参考，比较由分析单元确定的所述至少一种生物标志物的量，由此诊断性腺毒性。
在本发明装置的一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示不存在性腺毒性。
在本发明装置的另一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示不存在性腺毒性。
另外，本发明涉及一种用于诊断性腺毒性的试剂盒，所述试剂盒包含针对至少一种生物标志物的检测剂和针对至少一种生物标志物的标准物，所述标准物的浓度是源自已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或源自已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组。
本发明尤其涵盖一种用于诊断卵巢毒性的方法，所述方法包括：
(a)确定疑似遭遇卵巢毒性的受试者的测试样品中选自表6a或6b中至少一种生物标志物的量，和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此诊断卵巢毒性。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述受试者已经与疑似能够诱导卵巢毒性的化合物接触。
本发明还涉及一种确定化合物是否能够在受试者中诱导卵巢毒性的方法，所述方法包括：
(a)确定已经与疑似能够诱导卵巢毒性的化合物接触的受试者的样品中选自表6a或6b的至少一种生物标志物的量；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此确定化合物诱导卵巢毒性的能力。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述化合物是选自以下的至少一种化合物：米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选的实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示卵巢毒性。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示卵巢毒性。
在本发明方法的又一个实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示卵巢毒性。
本发明还构思了一种鉴定用于治疗卵巢毒性的物质的方法，所述方法包括步骤：
(a)确定遭遇卵巢毒性的受试者的样品中选自表6a或6b的至少一种生物标志物的量，所述受试者已经与疑似能够治疗卵巢毒性的候选物质接触；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此鉴定能够治疗卵巢毒性的物质。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的不同的量指示能够治疗卵巢毒性的物质。
在前述方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：米非司酮和盐酸雷洛昔芬。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗卵巢毒性的物质。
在前述方法的又一个优选的实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗卵巢毒性的物质。
本发明还涉及选自表6a或6b的至少一种生物标志物或针对所述生物标志物的检测剂用于诊断受试者样品中卵巢毒性的用途。
另外，本发明涉及一种用于诊断疑似遭遇卵巢毒性的受试者的样品中卵巢毒性的装置，所述装置包含：
(a)分析单元，其包含针对选自表6a或6b的至少一种生物标志物的检测剂，所述分析单元允许确定样品中存在的所述生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的，
(b)包含存储的参考和数据处理器的评价单元，所述评价单元允许相对于存储的参考，比较由分析单元确定的所述至少一种生物标志物的量，由此诊断卵巢毒性。
在本发明装置的一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或已经与选自米非司酮和盐酸雷洛昔芬的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示存在卵巢毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示不存在卵巢毒性。
在本发明装置的另一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知未遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或尚未与选自米非司酮和盐酸雷洛昔芬的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示存在卵巢毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示不存在卵巢毒性。
另外，本发明涉及一种用于诊断卵巢毒性的试剂盒，所述试剂盒包含针对至少一种生物标志物的检测剂和针对至少一种生物标志物的标准物，所述标准物的浓度是源自已知遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组或源自已知未遭遇卵巢毒性的受试者或受试者组。
另外，本发明涵盖一种用于诊断睾丸毒性的方法，所述方法包括：
(a)确定疑似遭遇睾丸毒性的受试者的测试样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a或5b中任一表的至少一种生物标志物的量，和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此诊断睾丸毒性。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述受试者已经与疑似能够诱导睾丸毒性的化合物接触。
本发明还涉及一种确定化合物是否能够在受试者中诱导睾丸毒性的方法，所述方法包括：
(a)在已经与疑似能够诱导睾丸毒性的化合物接触的受试者的样品中确定已经与疑似能够诱导睾丸毒性的化合物接触的受试者的测试样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a或5b中任一表的至少一种生物标志物的量；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此确定化合物诱导睾丸毒性的能力。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述化合物选自以下的至少一种化合物：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮。在所述方法的一个更优选的实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示睾丸毒性。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示睾丸毒性。
在本发明方法的又一个实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，生物标志物的在测试样品中与参考相比不同的量指示睾丸毒性。
本发明还构思了一种鉴定用于治疗睾丸毒性的物质的方法，所述方法包括步骤：
(a)确定遭遇睾丸毒性的受试者的样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a或5b中任一表的至少一种生物标志物的量，所述受试者已经与疑似能够治疗睾丸毒性的候选物质接触；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此鉴定能够治疗睾丸毒性的物质。
在前述方法的一个优选实施方案中，所述参考源自(i)遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的不同的量指示能够治疗睾丸毒性的物质。
在前述方法的另一个优选实施方案中，所述参考源自(i)已知未遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗睾丸毒性的物质。
在前述方法的又一个优选的实施方案中，所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。在所述方法的一个更优选实施方案中，测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗睾丸毒性的物质。
本发明还涉及选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a或5b中任一表的至少一种生物标志物或针对所述生物标志物的检测剂用于诊断受试者样品中睾丸毒性的用途。
另外，本发明涉及一种用于诊断疑似遭遇睾丸毒性的受试者的样品中睾丸毒性的装置，所述装置包含：
(a)分析单元，其包含针对选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a或5b中任一表的至少一种生物标志物的检测剂，所述分析单元允许确定样品中存在的所述生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的，
(b)包含存储的参考和数据处理器的评价单元，所述评价单元允许相对于存储的参考，比较由分析单元确定的所述至少一种生物标志物的量，由此诊断睾丸毒性。
在本发明装置的一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮，所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示存在睾丸毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示不存在睾丸毒性。
在本发明装置的另一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知未遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松和2,5-己二酮，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示存在睾丸毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示不存在睾丸毒性。
另外，本发明涉及一种用于诊断睾丸毒性的试剂盒，所述试剂盒包含针对至少一种生物标志物的检测剂和针对至少一种生物标志物的标准物，所述标准物的浓度是源自已知遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组或源自已知未遭遇睾丸毒性的受试者或受试者组。
以下定义和解释在已作必要修正的情况下适用于本发明的先前全部实施方案以及下文中描述的实施方案。
根据本发明提到的方法可以基本上由前述步骤组成或可以包括其他步骤。其他步骤可以涉及样品预处理或评价通过所述方法获得的诊断结果。本文中他处描述优选的其他评价步骤。这些方法可以部分地或完全由自动化辅助。例如，涉及确定生物标志物的量的步骤可以由机器人和自动化读数装置自动化。同样地，涉及比较数量的步骤可以由合适的数据处理装置(如计算机)自动化，所述数据处理装置包含当执行时自动实施该比较的程序代码。这种情况下的参考将从从存储的参考(例如，从数据库)提供。应当理解该方法优选地是对受试者样品离体(ex vivo)实施，即不对人体或动物体实施的方法。
如本文所用，术语“诊断”指评估概率，其中根据所述概率，受试者正在遭遇某种病状，如中毒，(本文中称作疾病或病症)或具有遭遇这种病状的素质。对素质的诊断有时可以称作预后或预测受试者未来将在预定时间窗内形成该病状的可能性。如本领域技术人员将理解，这种评估尽管优选是对100%待诊断的受试者正确，但通常可能不是对100%待诊断的受试者正确。然而，该术语要求可以将统计显著部分的受试者鉴定为遭受该病状或具有易遭受该病状的素质。某个部分是否为统计显著可以在不另外费力的情况下由本领域技术人员使用使用各种熟知的统计评价工具(例如，置信区间确定、p-值测定、Student t-检验、Mann-Whitney检验等)确定。能在Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983中找到详细内容。优选的置信区间是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。p-值是优选地0.2、0.1、0.05。
本发明的诊断还包括对病状或其症状以及其素质的监测、证实和分类。监测是指持续追踪已经诊断的病状或素质。监测例如涵盖确定该病状或素质的进展、确定特定治疗对病状进展的影响或预防性措施如预防性治疗或膳食对具有疾病素质的受试者中病状之形成的影响。证实涉及增强或证明对已经使用其他指示物或标志物确定的病状或该病状素质的诊断。分类涉及(i)将病状划分成不同类别，例如，对应于伴随病状的症状的强度，或(ii)区分伴随病状的不同阶段、疾病或病症。病状的素质可以基于风险程度(即受试者稍后将形成该病状的概率)分类。另外，分类还优选地包括将作用模式分配给待通过本发明方法测试的化合物。具体而言，本发明的方法允许确定化合物的具体作用模式，对于所述化合物而言，这种作用模式尚未已知。这优选地通过以下方式实现：将针对代表所述化合物的至少一种生物标志物或生物标志物谱确定的量与针对作用模式已知的称作参考的化合物所确定的生物标志物或生物标志物谱的量比较。因为确定了化合物的分子靶，所以作用模式的分类允许甚至更可靠地评估该化合物的毒性。
如本文所用的术语“性腺毒性”涉及性腺(即卵巢或睾丸)的任何损伤或受损，其导致受损的性腺功能。优选地，性腺的生殖相关功能受性腺毒性影响。优选地，如本文所用的性腺毒性由施用化学化合物或药物诱导或是施用化学化合物或药物的结果，即所谓毒素诱导的性腺毒性。更优选地，性腺毒性是卵巢毒性或睾丸毒性。优选地，性腺毒性伴有细胞死亡和/或性腺中细胞功能的受损。
卵巢毒性优选地由来自以下组一种或多种疾病或病症表现：非肿瘤损害，由上皮增生(间皮)和管状增生、卵母细胞破坏、卵泡发育停滞直至卵泡闭锁、卵泡及间质萎缩、超数排卵、卵泡黄体化、卵泡囊肿、黄体缩减/不存在、黄体增加/持续、黄体空泡变性、支持细胞样管状增生、间质腺肥大/增生萎缩、发情周期紊乱、卵巢系膜平滑肌增生或卵巢肿瘤组成。卵巢肿瘤可以优选地再划分成五个宽类别，包括上皮肿瘤、性索-间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、源自卵巢未特化软组织的肿瘤和从远离部位转移至卵巢的肿瘤。卵巢的上皮肿瘤包括囊腺瘤和囊腺癌、管状间质腺瘤和间皮瘤。管状腺瘤是小鼠中最重要的卵巢肿瘤，但是它们在大鼠中不常见，在其他动物物种中罕见，并且未在女性卵巢识别到。另一组重要的卵巢肿瘤是源自性索和/或卵巢基质的那些。这些包括卵泡颗粒细胞瘤、黄体瘤、卵泡膜瘤、支持细胞肿瘤、伴有来自卵巢基质的贡献的管状腺瘤和未分化的性索-间质肿瘤。卵泡颗粒细胞瘤是这种组中最常见的并且可以在与基因缺失、辐射、卵细胞毒性化学品和新生儿胸腺切除相关的内分泌长期扰动后在某些管状腺瘤或管状间质腺瘤内部形成。
如本文所用，卵巢毒性优选地涉及内分泌卵巢毒性。这种毒性可以伴随受损的雌激素和/或孕酮产生和相关的病症。
睾丸毒性优选地由来自以下组的一个或多个疾病或病症表现：间质莱迪希细胞增生或瘤形成或莱迪希细胞肿瘤。莱迪希(间质)细胞肿瘤属于慢性毒性/致癌性研究中啮齿类中更频繁出现的内分泌肿瘤。啮齿类睾丸肿瘤分成五个总体类别，包括源自性腺基质细胞的肿瘤、生殖细胞源肿瘤、源自附件结构或浆膜的肿瘤和一组源自睾丸的支撑结缔组织和血管的肿瘤。性腺基质的肿瘤包括源自莱迪希(间质)细胞、曲细精管的支持细胞的良性和恶性肿瘤以及存在两种细胞类型的混合物的罕有混合瘤。
如本文所用，睾丸毒性优选地是指睾丸毒性、基于铃兰醛的毒性、睾丸毒性和/或睾丸退化。
如果确定选自表1a或1b的生物标志物，则优选地诊断睾丸毒性。
如果确定选自表3a或3b的生物标志物，则优选地诊断基于铃兰醛的毒性。
如果确定选自表4a或4b的生物标志物，则优选地诊断睾丸毒性。
如果确定选自5a或5b的生物标志物，则优选地诊断睾丸退化。
性腺毒性的前述表现的症状和临床体征是本领域技术人员熟知的并且在标准毒理学书籍，例如H.Marquardt,S.G.
Figure BDA0000477056750000161
,R.O.McClellan,F.Welsch(编著),“Toxicology”,第13章：The Liver,1999,Academic Press,London中描述。
根据本发明，发现表中所列的多于一种生物标志物的组合进一步增强诊断，因为每种生物标志物是用于诊断的明显统计独立的预测物。另外，性腺毒性的特异性还显著地增加，因为抵消了来自其他组织对标志物丰度的影响。因而，如本文所用，术语“至少一种”优选地指至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种在后续表的任一表中提到的生物标志物的组合。优选地，在任一表中提及的全部生物标志物均根据本发明方法组合地确定。
如下列出待作为单一生物标志物确定或下文以组合方式提及的特别优选的生物标志物：
用于诊断卵巢毒性的优选生物标志物组或组合包括以下生物标志物、基本上由以下生物标志物组成或选自以下生物标志物：胆固醇、二十二碳五烯酸(C22:顺[7,10,13,16,19]5)、花生四烯酸(C20:顺[5,8,11,14]4)、脂质级分的肌醇或二十二碳六烯酸(C22:顺[4,7,10,13,16,19]6)。
用于诊断基于铃兰醛的毒性的优选生物标志物组或组合包括以下生物标志物、基本上由以下生物标志物组成或选自以下生物标志物：二十四烷酸(C24:0)、神经酰胺(d18:1,C24:0)、3-O-甲基鞘氨醇(d18:1)、赖氨酸或鞘磷脂(d18:1,C24:0)
用于诊断睾丸毒性的优选生物标志物组或组合包括以下生物标志物、基本上由以下生物标志物组成或选自以下生物标志物：二十四烷酸(C24:0)、神经酰胺(d18:1,C24:0)、鞘磷脂(d18:1,C24:0)、赤型-鞘氨醇或神经酰胺(d18:1,C24:1)。
用于诊断睾丸毒性的优选生物标志物组或组合包括以下生物标志物、基本上由以下生物标志物组成或选自以下生物标志物：二十四烷酸(C24:0)、胆固醇、硬脂酸(C18:0)、赖氨酸或3-O-甲基鞘氨醇(d18:1)。
用于诊断睾丸退化的优选生物标志物组或组合包括以下生物标志物、基本上由以下生物标志物组成或选自以下生物标志物：尿嘧啶、葡萄糖、肌醇、苹果酸盐或油酸(C18:顺[9]1)。
因而，优选地，至少一种生物标志物优选地是针对相应疾病的选自前述组的至少一种生物标志物或至少一种生物标志物是由针对相应疾病的前述生物标志物构成或包含针对相应疾病的前述生物标志物的生物标志物组合。已经鉴定前述生物标志物和生物标志物组合作为具有特别高的诊断价值的关键生物标志物，如后续实施例中更详细地描述。
另外，仍可以额外地确定其他生物标志物或临床参数，包括已知的代谢物、遗传突变、转录物和/或蛋白质数量或酶活性。可以根据本发明方法确定的这类额外的临床或生物化学参数是本领域熟知的。
如本文所用，术语“生物标志物”指这样的化学化合物，其在样品中的存在或浓度指示病状(优选地，如本文提到的性腺毒性)的存在或不存在或强度。该化学化合物优选地是代谢物或从其衍生的分析物。分析物是可以与生物中存在的实际代谢物相同的化学化合物。然而，该术语还包括这类代谢物的衍生物，所述衍生物内源地生成或在分离或样品预处理期间或因实施本发明方法而生成，例如，在纯化和/或确定步骤期间生成。在具体情况下，分析物还以化学特性如溶解度来表征。归因于所述特性，分析物可以在纯化和/或确定过程期间获得的极性或脂质级分中出现。因而，化学特性并且优选地，溶解度，应当导致分析物在纯化和/或确定过程期间所获得的极性或脂质级分中出现。因此，视作分析物在纯化和/或确定过程期间所获得的极性或脂质级分中出现的所述化学特性和尤其溶解度应当进一步表征分析物并且辅助其鉴定。下文描述关于这些化学特性可以怎样确定并且视为在后续实施例中存在的细节内容。优选地，分析物以定性和定量方式代表代谢物并且因此自然而然允许得出以下结论：在受试者中或至少在所述受试者的测试样品中代谢物存在或不存在或代谢物的量。虽然生物标志物、分析物和代谢物在本文中以单数形式提到，但所述术语是还包括复数形式的术语，即指相同分子种类的多个生物标志物、分析物或代谢物分子。另外，本发明的生物标志物并不必然地与一个分子种类相对应。相反，生物标志物可以包含化合物的立体异构体或对映异构体。另外，生物标志物也可以代表生物类别的异构分子的异构体的总和。所述异构体应当在一些情况下显示相同分析特征，并且因此是通过各种分析方法不可区分的，所述分析方法包括在下文描述的后续实施例中应用的那些。然而，异构体将共有至少相同的总式参数并且因此，在例如脂类的情况下，共有相同的链长度和脂肪酸和/或鞘碱部分中相同的双键数目。
如本文所用，术语“测试样品”指待用于通过本发明方法诊断性腺毒性的样品。优选地，所述测试样品是生物样品。来自生物来源的样品(即生物样品)通常包含多种代谢物。待用于本发明方法中的优选生物样品是来自体液、优选地血液、血浆、血清、唾液、胆汁、尿或脑脊液的样品，或(例如通过活组织检查)源自细胞、组织或器官、优选地源自肝脏的样品。更优选地，样品是血液、血浆或血清样品，最优选地，是血浆样品。生物样品源自如本文中他处所述的受试者。用于获得前述不同类型的生物样品的技术是本领域熟知的。例如，血液样品可以通过采血获得，而组织或器官样品将例如通过活组织检查获得。
前述样品优选地在它们用于本发明的方法之前预处理。如下文更详细地描述，所述预处理可以包括为释放或分离化合物或除去过多材料或废物所需要的处理。合适的技术包括离心、提取、分级、超滤、蛋白质沉淀，随后实施化合物的过滤和纯化和/或富集。另外，实施其他预处理，目的是以适于化合物分析的形式或浓度提供化合物。例如，如果在本发明的方法中使用气相色谱偶联质谱法，则将需要在所述气相色谱之前衍生化该化合物。合适和必需的预处理取决于用于实施本发明方法的手段并且是本领域技术人员熟知的。如之前描述的预处理样品也由如根据本发明使用的术语“样品”包含。
如本文所用的术语“受试者”指动物，优选地涉及哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、猪、绵羊、犬、猫、马、猴或奶牛，并且还优选地涉及人。更优选地，受试者是啮齿类，并且最优选地是大鼠。可以采用本发明方法诊断的其他动物是鱼类、鸟类或爬行类。优选地，所述受试者接触于疑似能够诱导性腺毒性的化合物或已经与之接触。已经与疑似诱导性腺毒性的化合物接触的受试者可以例如是实验室动物，如在用于例如化合物毒性的筛选分析法中使用的大鼠。疑似已经与能够诱导性腺毒性的化合物接触的受试者可以还是待诊断以选择合适治疗的受试者。优选地，如本文所用的能够诱导性腺毒性的化合物是17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬
如本文所用，术语“确定该量”指确定生物标志物(即代谢物或分析物)的至少一个特征性特征。本发明的特征性特征是表征生物标志物的物理和/或化学特性(包括生物化学特性)的特征。这类特性例如包括分子量、粘度、密度、电荷、自旋、光学活性、颜色、荧光、化学发光、元素组成、化学结构、与其他化合物反应的能力、在生物读出系统中激发反应的能力(例如，诱导报道基因)等。所述特性的值可以充当特征性特征并且可以通过本领域熟知的技术确定。另外，特征性特征可以是通过标准操作(例如，数学计算如乘法、除法或对数演算)从生物标志物的物理和/或化学特性的值推导出的任何特征。最优选地，至少一个特征性特征允许确定和/或化学鉴定生物标志物及其量。因此，特征值，优选地，还包含信息，所述信息涉及推导出特征值的生物标志物的丰度。例如，生物标志物的特征值可以是质谱中的峰。这种峰含有生物标志物的特征信息，即m/z(质/荷比)信息，以及与样品中所述生物标志物(即其量)的丰度相关的强度值。
如之前讨论，根据本发明方法待确定的至少一种生物标志物可以优选地定量或半定量地确定。对于定量确定，将确定生物标志物的绝对量或精确量；或生物标志物的相对量将基于针对上文中提到的特征性特征所确定的值来确定。相对量可以在其中可以不确定或应当不确定生物标志物的精确量的情况下确定。在这种情况下，可以确定生物标志物存在的量是否相对于以第二量包含所述生物标志物的第二样品放大或削减。因此，定量分析生物标志物还包括有时所称的生物标志物半定量分析。
另外，如在本发明方法中使用的确定优选地包括在先前所提到的分析步骤之前使用化合物分离步骤。优选地，所述化合物分离步骤导致由样品包含的至少一种生物标志物的时间分辨分离。因此，根据本发明优选待使用的合适分离技术包括全部色谱分离技术，如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层层析、大小排阻或亲和层析。这些技术是本领域技术人员熟知的并且可以由本领域技术人员在不另外费力的情况下应用。最优选地，LC和/或GC是由本发明方法构思的色谱技术。用于这类生物标志物确定的合适装置是本领域熟知的。优选地，使用质谱法，特别是气相色谱质谱法(GC-MS)，液相色谱质谱法(LC-MS)、直接注入质谱法或傅立叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICR-MS)、毛细管电泳质谱法(CE-MS)、高效液相色谱偶联质谱法(HPLC-MS)、四极质谱法、任何依次耦合质谱法，如MS-MS或MS-MS-MS、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、热解质谱法(Py-MS)、离子迁移率质谱法或时间飞行质谱法(TOF)。最优选地，使用LC-MS和/或GC-MS，如下文详细描述。所述技术在Nissen1995,Journal of Chromatography A,703:37-57、US4,540,884或US5,397,894中公开，所述文献的公开内容因而通过引用的方式并入作为参考。作为替代或除质谱技术之外，以下技术可以用于化合物确定：核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅立叶变换红外分析(FT-IR)、紫外(UV)光谱法、折射率(RI)、荧光检测、放射化学检测、电化学检测、光散射(LS)，色散拉曼光谱法或火焰电离检测(FID)。这些技术是本领域技术人员熟知的并且可以在不另外费力的情况下应用。本发明的方法应当优选地由自动化辅助。例如，样品加工或预处理可以由机器人自动化。数据处理和比较优选地由合适的计算机程序和数据库辅助。如前文所述的自动化允许以高通量方案使用本发明的方法。
另外，也可以通过特异性化学或生物测定法确定生物标志物。所述测定法应当包含允许特异性检测样品中生物标志物的手段。优选地，所述手段能够特异性识别生物标志物的化学结构或能够基于生物标志物与其他化合物反应的能力或它在生物读出系统中激发反应的能力(例如，诱导报道基因)特异性鉴定该生物标志物。能够特异性识别生物标志物的化学结构的手段优选地是与生物标志物特异性结合的检测剂，更优选地是与化学结构特异性相互作用的抗体或其他蛋白质，如受体或酶，或适配子。例如，可以使用生物标志物作为抗原，通过本领域熟知的方法获得特异性抗体。如本文提到的抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及其能够结合抗原或半抗原的片段，如Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括人源化杂合抗体，其中显示所需抗原特异性的非人类供体抗体的氨基酸序列与人类接纳体抗体的序列组合。另外，涵盖单链抗体。供体序列通常将至少包括供体的结合抗原的氨基酸残基，但是也可以包含供体抗体的结构上和/或功能上相关的其他氨基酸残基。可以通过本领域熟知的几种方法制备这类杂合体。能够特异性识别代谢物的合适蛋白质优选地是参与所述生物标志物的代谢转化的酶。所述酶可以利用生物标志物(例如，代谢物)作为底物或可以将底物转化成生物标志物，例如，代谢物。另外，所述抗体可以用作基础以产生特异性识别生物标志物的寡肽。这些寡肽应当例如包含针对所述生物标志物的酶结合结构域或袋。基于抗体和/或酶的合适测定法可以是RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、夹心酶免疫试验、电化学发光夹心免疫测定法(ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定法(DELFIA)或固相免疫试验。与生物标志物特异性结合的适配子可以通过本领域熟知的方法产生(Ellington1990,Nature346:818-822；Vater2003,Curr Opin Drug Discov Devel6(2):253-261)。另外，也可以基于生物标志物与其他化合物反应的能力，即通过特定化学反应鉴定生物标志物。另外，可以基于生物标志物在生物读出系统中激发反应的能力而确定样品中的生物标志物。应当将生物学反应作为读数检出，所述读数表示由样品包含的代谢物的存在和/或其量。生物学反应可以例如是诱导细胞或生物的基因表达或表型反应。
术语“参考”指至少一种生物标志物的特征性特征的值，并且优选地，指表示可能与性腺毒性相关的所述生物标志物的量的值。
这类参考优选地从源自遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品获得或从源自已经与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触的受试者或受试者组的样品获得。受试者或受试者组可以分别通过局部或全身施用模式与所述化合物接触，只要该化合物变得生物可利用即可。在下文后续实施例中描述前述化合物的优选施用模式。
备选地，但是却仍是优选地，参考可以从下述样品获得，所述样品源自尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触的受试者或受试者组或相对于性腺毒性和更优选地也相对于其他疾病而言的健康受试者或这类受试者的组。
可以如上文所述就生物标志物的量确定参考。具体而言，优选地通过以下方式从如本文提到的受试者组的样品获得参考：分别确定来自该组的每位个体的样品中至少一种生物标志物各自的相对量或绝对量并且随后确定所述相对量或绝对量或通过使用本文中他处所提到的统计技术从其中推导出的任何参数的中位数或平均值。备选地，参考可以优选地通过确定样品中至少一种生物标志物各自的相对量或绝对量来获得，所述样品来自如本文提到的受试者组的样品的混合物。这种混合物优选地由来自样品的等体积部分组成，其中所述样品从所述组的每位个体获得。
另外，参考还优选地可以是经计算的参考，最优选地是源自个体群体的至少一种生物标志物各自的相对量或绝对量的平均值或中位值。所述个体群体是本发明方法待研究的受试者所来源的群体。然而，应当理解为确定经计算的参考而待研究的受试者群体优选地由表观健康的受试者(例如未治疗过)组成或包含许多位表观健康的受试者，所述受试者多到足以在统计上抵抗因所述群体中存在试验对象所致的显著平均数或中位数变化。可以如本文中他处所述那样确定该群体的所述个体的至少一种生物标志物的绝对量或相对量。如何计算合适的参考值，优选地，平均数或中位数，是本领域熟知的。用于计算合适参考的其他技术包括使用接收者操作特征(ROC)曲线计算法优化，所述计算法也是本领域熟知的并且可以基于给定的受试者组群在不另外费力的情况下，对具有给定特异性和灵敏度的分析系统实施计算。之前所指的受试者群体或组应当包含多位受试者，优选地，至少5、10、50、100、1,000或10,000位受试者至多达整个群体。更优选地，在这个情境下提到的受试者组是具有统计上代表给定群体的大小的受试者组，即统计代表性样品。应当理解通过本发明方法待诊断的受试者和所述多个受试者中的受试者具有相同的物种并且优选地具有相同的性别。
更优选地，参考将存储于合适的数据存储介质如数据库中，并且因此还可用于未来的诊断。这还允许有效地诊断性腺毒性素质，因为一旦(在未来)已经证实从中获得相应参考样品的受试者(确实)形成性腺毒性，则可以在数据库中鉴定合适的参考结果。
术语“比较”指评估至少一种生物标志物的定性或定量确定的量是否与参考相同或与参考不同。
在参考结果从源自遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触的受试者或受试者组的样品获得的情况下，可以基于从测试样品获得的量和前述参考之间相同或相似性的程度，即基于就至少一种生物标志物而言相同的定性或定量组成而诊断性腺毒性。相同的量包括这些量，所述量并不以统计显著方式不同并且优选地至少处于参考的第1和第99百分位数、第5和第95百分位数，第10和第90百分位数，第20和第80百分位数、第30和第70百分位数、第40和第60百分位数之间、更优选地，参考的第50、第60、第70、第80、第90或第95百分位数之间的区间内部。从源自遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触的受试者或受试者组的样品获得的参考可以在本发明的方法中应用，以便诊断性腺毒性或用于确定化合物是否能够在受试者中诱导性腺毒性。在这种情况下，优选地，至少一种生物标志物的与参考基本上相同的量将指示存在性腺毒性或能够诱导性腺毒性的化合物，而至少一种生物标志物的与参考不同的量将指示不存在性腺毒性或不能够诱导性腺毒性的化合物。另外，从源自遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触的受试者或受试者组的样品获得的参考可以用于鉴定治疗性腺毒性的物质。在这种情况下，优选地，至少一种生物标志物的与参考不同的量指示适于治疗性腺毒性的物质，而至少一种生物标志物的与参考基本上相同的量将指示不能够治疗性腺毒性的物质。
在参考结果从源自尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触或未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品获得的情况下，可以基于从测试样品获得的测试量和前述参考之间的差异，即就至少一种生物标志物而言定性或定量组成的差异而诊断所述性腺毒性。
如果使用如上所述的经计算的参考，则同样适用。
差异可以是至少一种生物标志物的绝对量或相对量增加(有时称作生物标志物的上调；还见实施例)或所述量的减少或不存在可检测量的生物标志物(有时称作生物标志物的下调；还见实施例)。优选地，相对量或绝对量的差异是显著的，即处于参考的第45和第55百分位数、第40和第60百分位数、第30和第70百分位数、第20和第80百分位数、第10和第90百分位数、第5和第95百分位数、第1和第99百分位之间数之间的区间外部。
从尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触或未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品获得的参考可以在本发明的方法中应用，以便诊断性腺毒性或用于确定化合物是否能够在受试者中诱导性腺毒性。在这种情况下，优选地，至少一种生物标志物的与参考不同的量将指示存在性腺毒性或能够诱导性腺毒性的化合物，而至少一种生物标志物的与参考基本上相同的量将指示不存在性腺毒性或不能够诱导性腺毒性的化合物。另外，从尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触或未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品获得的参考可以用于鉴定治疗性腺毒性的物质。在这种情况下，优选地，至少一种生物标志物的与参考基本上相同的量指示适于治疗性腺毒性的物质，而至少一种生物标志物的与参考不同的量将指示不适于治疗性腺毒性的物质。
优选的参考是在后续表中提到的那些或可以在后续实施例后产生的那些。另外，相对差异，即各个生物标志物的量的增加(上调)或减少(下调)，优选地是下表中列举的那些。另外，优选地，观察到的差异(即增加或减少)的程度优选地是根据下表中所示因素的增加或减少。
优选地，当选自表1a、3a、4a、5a或6a时，至少一种生物标志物相对于从源自尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触或未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品所获得的参考并且更优选地如所述表中所示的参考而增加。
优选地，当选自表1b、3b、4b、5b或6b时，至少一种生物标志物相对于从源自尚未与17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬接触或未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组的样品所获得的参考并且更优选地如所述表中所示的参考而减少。
比较优选地由自动化辅助。例如，可以使用合适的计算机程序，所述计算机程序包含用于比较两个不同数据集(例如，包含特征性特征的值的数据集)的算法。这类计算机程序和算法是本领域熟知的。不限于上文所述，也可以手工地实施比较。
术语“用于治疗性腺毒性的物质”指这样的化合物，所述化合物可以直接干扰引起在本说明书中其他地方提到的性腺毒性的生物学机制。备选地，优选的化合物还可以干扰与性腺毒性相关的症状的形成或进展。通过本发明方法待鉴定的物质可以是有机和无机化学品，如小分子、多核苷酸、包括siRNA、核酶或微RNA分子的寡核苷酸、肽、包括抗体的多肽或其他人工或生物聚合物，如适配子(aptamer)。优选地，该物质适合作为药物、前药或用于开发药物或前药的前导物质。
应当理解如果本发明的方法待用于鉴定用于治疗性腺毒性的药物或用于毒理学评估化合物(即确定化合物是否能够诱导性腺毒性)，则可以出于统计原因研究多位受试者的试样。优选地，这种试验对象组群内部的代谢组学应当尽可能地相似，以避免例如由除了待研究化合物之外的多种因素造成的差异。待用于所述方法的受试者优选地是实验室动物如啮齿类并且更优选地是大鼠。应当进一步理解所述实验室动物应当优选地在完成本发明的方法后处死。试验组群的全部受试者和参考动物应当在相同条件下维持以避免任何差异性环境影响。WO2007/014825中详述了提供这类动物的合适条件和方法。所述条件在此通过引用方式并入作为参考。
本发明的方法可以优选地用本发明的装置实施。如本文所用的装置应当包括至少前述单元。该装置的单元彼此有效连接。怎样以运行方式连接单元将取决于包括于该装置中的单元的类型。例如，当在分析单元中应用自动定性或定量确定至少一种生物标志物的手段情况下，通过所述自动运行单元获得的数据可以由评价单元处理，例如，由作为数据处理器的计算机上运行的计算机程序处理以促进诊断。在这种情况下，优选地，所述单元由单一装置包含。然而，分析单元和评价单元也可以物理地分离。在这种情况下，有效连接可以借助单元之间允许数据传输的有线和无线连接实现。无线连接可以使用无线局域网(WLAN)或互联网。接线可以由单元之间的光缆连接和非光缆连接实现。用于有线连接的电缆优选地适于高通量数据传输。
用于确定至少一种生物标志物的优选分析单元包括特异性识别如本文中他处所述的至少一种生物标志物的检测剂，如抗体、蛋白质或适配子，和使所述检测剂与待测试样品接触的区带。检测剂可以固定在用于接触的区带上或可以在已经加载样品后施加至所述区带。分析单元应当优选地适用于定性和/或定量确定检测剂和至少一种生物标志物的复合物的量。应当理解当检测剂与至少一种生物标志物结合时，至少一种生物标志物、检测剂或两者的至少一种可度量物理或化学特性将改变，从而可以通过检测器测量所述改变，优选地，所述检测器包含于分析单元中。然而，在使用分析单元如测试条的情况下，检测器和分析单元可以是仅为测量才置于一起的分别的组件。基于至少一种可度量物理或化学特性的检测到的改变，分析单元可以计算如本文中他处所述的至少一种生物标志物的强度值。随后可以为进一步加工和评价将所述强度值传输至评价单元。最优选地，至少一种生物标志物的量可以基于使用如本文中他处所述的检测剂的技术，通过ELISA、EIA或RIA确定。备选地，如本文提到的分析单元优选地包括用于分离生物标志物的设备，如色谱设备，和用于确定生物标志物的设备，如光谱测定设备。上文已经详细描述了合适的设备。待用于本发明系统中的用于分离化合物的优选设备包括色谱设备，更优选地用于液相色谱、HPLC和/或气相色谱的设备。用于确定化合物的优选设备包括质谱设备，更优选地，GC-MS、LC-MS、直接注入质谱法、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四极质谱法、依次耦合质谱法(包括MS-MS或MS-MS-MS)、ICP-MS、Py-MS或TOF。分离和确定设备优选地彼此偶联。最优选地，LC-MS和/或GC-MS用于根据本发明提到的分析单元中。
本发明装置的评价单元优选地包括数据处理设备或计算机，其适应于执行用于实施如本文中他处所述的比较的规则。另外，评价单元优选地包括具有存储的参考的数据库。如本文所用的数据库包括在合适存储介质上的数据集合。另外，该数据库优选地还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选地是基于网络、分层或面向对象的数据库管理系统。另外，数据库可以是联邦或综合数据库。更优选地，数据库将作为分布式(联邦)系统如作为客户-服务器-系统执行。更优选地，将数据库结构化以便允许检索算法将试验数据集与由数据集合构成的数据集比较。具体而言，通过使用这种算法，可以就指示性腺毒性的相似或相同数据集检索数据库(例如查询检索)。因而，如果可以在数据集合中鉴定到相同或相似的数据集，则试验数据集将与性腺毒性相关。评价单元也可以优选地包括其他数据库或与之有效关联，所述其他数据库具有基于建立的性腺毒性诊断对治疗性或预防性介入或改进生活方式的推荐。所述其他数据库可以优选地用通过评价单元所获得的诊断结果自动检索，以确定对于已经从中获得测试样品的受试者合适的推荐，目的是治疗或预防性腺毒性。
在本发明装置的一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示不存在性腺毒性。
在本发明装置的另一个优选实施方案中，所述存储的参考是源自已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示不存在性腺毒性。
该装置因此也可以在没有专门医学知识的情况下由通过医疗工作人或患者使用，尤其在包括作出推荐的专家系统时使用。该装置还适于贴近患者应用，因为该装置可以改造成便携样式。
术语“试剂盒”指前述组分的集合，所述组分优选地分别或在单一容器中提供。该容器还包括用于实施本发明方法的说明书。这些说明书可以处于手册的形式或可以由在计算机或数据处理装置上执行时能够实施本发明方法中所提到的比较并且因此建立诊断的计算机程序代码提供。计算机程序代码可以在数据存储介质或设备如光或磁存储介质(例如，光盘(CD)、CD-ROM、硬盘、光储存介质或磁盘盒)上或直接在计算机或数据处理装置上提供。结合本发明试剂盒所提到的“标准”是当至少一种生物标志物在溶液中存在或在预定体积溶液中溶解时，选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的与所述至少一种生物标志物的下述量相似的量，所述量存在于(i)已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬或(ii)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
有利地，已经在作为本发明基础的研究中发现，如本文中指出的至少一种生物标志物的量允许诊断性腺毒性，具体而言，由17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬诱导的性腺毒性。通过确定增加数目的或甚至全部的前述生物标志物，甚至将更多地改善该方法的特异性和准确度。代谢组学的定量和/或定性组成相对于这些特定生物标志物的变化在所述毒性的其他体征临床上出现之前就指示性腺毒性。与本发明提供的生物标志物确定相比，目前用于诊断性腺毒性的形态学、生理学以及生物化学参数较不特异性并且较不灵敏。归功于本发明，可以更有效地和可靠地评估化合物的性腺毒性。另外，基于前述研究结果，可用于治疗性腺毒性的药物筛选测试法是可行的。通常而言，本发明构思了受试者样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物或针对所述生物标志物的检测剂的用途，用于诊断性腺毒性、用于确定化合物是否能够诱导性腺毒性或用于鉴定能够治疗性腺毒性的物质。另外，本发明总体上构思了受试者样品中至少一种生物标志物或针对该生物标志物的检测剂用于鉴定易响应性腺毒性治疗的受试者的用途。在本发明的这种情境下待使用的优选检测剂是本文中他处所提到的那些。另外，本发明的方法可以有利地以装置实施。另外，可以提供允许实施所述方法的试剂盒。
本发明还涉及数据集合，所述数据集合包含在表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b的任一表中所述的生物标志物的特征值。术语“数据集合”指可以按物理和/逻辑方式归结分组的数据汇集。因此，可以在单独的数据存储介质中或在彼此有效连接的物理分立的数据储存介质中实施数据集合。优选地，借助数据库实施数据集合。因此，如本文所用的数据库包括在合适存储介质上的数据集合。另外，该数据库优选地还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选地是基于网络、分层或面向对象的数据库管理系统。另外，数据库可以是联邦或综合数据库。更优选地，数据库将作为分布式(联邦)系统如作为客户-服务器-系统执行。更优选地，将数据库结构化以便允许检索算法将试验数据集与由数据集合构成的数据集比较。具体而言，通过使用这种算法，可以就指示性腺毒性的相似或相同数据集检索数据库(例如查询检索)。因而，如果可以在数据集合中鉴定到相同或相似的数据集，则试验数据集将与性腺毒性相关。因此，从数据集合获得的信息可以用来基于从受试者获得的试验数据集诊断性腺毒性。
另外，本发明涉及包含所述数据集合的数据存储介质。如本文所用的术语“数据存储介质”涵盖基于单一物理实体的数据储存介质，如CD、CD-ROM、硬盘、光储存介质或磁盘盒。另外，该术语还包括由物理分立的实体组成的数据储存介质，所述数据储存介彼此以如此方式有效连接，以至于提供前述数据集合，优选地，以合适查询检索的方式提供。
本发明还涉及一个系统，该系统包含：
(a)用于比较样品中所包含的从表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b任一表中列出的生物标志物中选出的至少一种生物标志物特征值的设备，所述设备有效连接至
(b)本发明的数据存储介质。
如本文所用的术语“系统”指彼此有效连接的不同设备。所述设备可以在单一装置中实现或可以在彼此有效连接的物理分立的装置中实现。用于比较生物标志物的特征值的设备优选地基于如之前提到的比较算法运行。数据存储介质，优选地包含前述数据集合或数据库，其中每种存储的数据集指示性腺毒性。因而，本发明的系统允许确定试验数据集是否包含于存储在数据存储介质中的数据集合中。因此，本发明的系统可以作为诊断性腺毒性中的诊断手段应用。在系统的一个优选实施方案中，包含用于确定样品的生物标志物的特征值的设备。术语“用于确定生物标志物的特征值的设备”优选地指用于确定生物标志物的前述设备，如质谱设备、ELISA设备、NMR设备或用于实施分析物的化学或生物测定的设备。
上文所提及的全部参考均就以上描述中明确提到的其完整公开内容以及其特定公开内容，通过引用的方式并入作为参考。
以下实施例仅用于说明本发明的目的。无论如何，它们应当不被解释为在任何方面限制本发明的范围。
实施例
实施例：与性腺毒性相关的生物标志物
在28日期间，对雄性大鼠和雌性大鼠各5只的组每日一次用所指示的化合物给药(关于化合物、施加的剂量和施用细节，见下表10)。
研究中的每个剂量组由每种性别5只大鼠组成。雄性动物和雌性动物各5只的额外组充当对照。在开始处理期之前，供应时为62-64日龄的动物适应于舍饲和环境条件7日。将动物群体的全部动物在相同的恒定温度(20-24±3℃)和相同的恒定湿度(30-70%)下维持。动物群体的动物随意采食。待使用的食物基本上不含化学污染物或微生物污染物。还随意提供饮用水。因此，水不含如欧洲饮用水指令98/83/EG中制定的化学污染物和微生物污染物。照明期是12小时光照，随后12小时黑暗(12小时光照，从6:00至18:00，和12小时黑暗，从18:00至6:00)。研究在AAALAC批准的实验室中根据德国动物福利法和欧洲理事会指令86/609/EE进行。根据OECD407用于啮齿类中重复剂量28日口服毒性研究的化学品检验指南安排测试系统。如表10中所述那样投予和施用下表1至表9中的测试物质(化合物)。
在第7、14和28日早晨，从麻醉的禁食动物的眶后静脉丛取得血液。从每只动物，采集1ml血液，以EDTA作为抗凝血剂。将样品离心以便产生血浆。全部血浆样品用N2气覆盖并随后存储在-80°C直至分析。
对于基于质谱的代谢物概况分析，提取血浆样品并且获得极性级分和非极性(脂质)级分。对于GC-MS分析，将非极性级分在酸性条件下用甲醇处理以产生脂肪酸甲酯。在分析之前，将两种级分进一步用盐酸O-甲基-羟胺和吡啶衍生化以使氧代基团转化成O-甲基肟并且随后用甲硅烷基化剂衍生化。在LC-MS分析中，将两种级分均在适宜的溶剂混合物中重构。通过在反相分离柱上梯度洗脱进行HPLC。如WO2003073464中所述应用允许与完整筛选分析平行地靶向和高灵敏度MRM(多反应监测)概况分析的质谱检测。
通过在线SPE-LC-MS(固相提取-LC-MS)测量类固醇和它们的代谢物。如Yamada等人(Yamada2002,Journal of Analytical Toxicology,26(1):17-22))所述，通过在线SPE-LC-MS测量儿茶酚胺和它们的代谢物。
在综合的分析验证步骤后，将每种分析物的数据针对来自汇集样品的数据归一化。这些样品在整个过程期间平行地进行以解释过程变异性。通过使用WELCH检验比较处理组的均值和相应的未处理对照组的均值，确定对性别、处理持续时间和代谢物特异的处理组值的显著性并且用相对于对照的处理率和p-值定量。
通过下表中分析物的排序确定每种毒性模式的最重要生物标志物。因此，将(表中显示的)给定模式的参考处理中的代谢变化与其他不相关处理中相同代谢物的变化比较。对于每种代谢物，获得参考和对照处理的T-值并且由Welch检验比较以评估这两个组是否为显著差异。取相应T值的最大绝对值表示该模式的最重要代谢物。
下表中显示了表明处理大鼠后性腺毒性的血浆代谢物组的变化：
表1a：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸毒性)的标志物；将显著上调变化(p-值≤0.1)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000331
表1b：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸毒性)的标志物；将显著下调变化(p-值≤0.1)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000332
表2：所选择分析物的化学/物理特性。本文中通过化学和物理特性表征这些生物标志物。
Figure BDA0000477056750000351
Figure BDA0000477056750000361
Figure BDA0000477056750000371
Figure BDA0000477056750000381
Figure BDA0000477056750000391
表3a：雄性大鼠中性腺毒性(基于铃兰醛的睾丸毒性)的标志物；将显著上调变化(p-值≤0.1)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000401
表3b：雄性大鼠中性腺毒性(基于铃兰醛的睾丸毒性)的标志物；将显著下调变化(p-值≤0.1)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000402
Figure BDA0000477056750000411
表4a：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸毒性)的标志物；将显著变化(p-值≤0.05)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000412
表4b：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸毒性)的标志物；将显著变化(p-值≤0.05)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000421
表5a：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸退化)的标志物；将显著上调变化(p-值≤0.2)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
表5a：雄性大鼠中性腺毒性(睾丸退化)的标志物；将显著上调变化(p-值≤0.2)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000431
Figure BDA0000477056750000441
Figure BDA0000477056750000451
表6a：雌性大鼠中性腺毒性(内分泌卵巢毒性)的标志物；将显著上调变化(p-值≤0.2)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000452
表6b：雌性大鼠中性腺毒性(内分泌卵巢毒性)的标志物；将显著下调变化(p-值≤0.2)标出(*)。对于一些代谢物(以#标记)，在表2中提供额外的信息。
Figure BDA0000477056750000453
Figure BDA0000477056750000461
表7：化合物和剂量施用方案
Figure BDA0000477056750000471

Claims (20)

1.一种用于诊断性腺毒性的方法，包括：
(a)确定疑似遭遇性腺毒性的受试者的测试样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量，和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此诊断性腺毒性。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者已经与疑似能够诱导性腺毒性的化合物接触。
3.一种确定化合物是否能够在受试者中诱导性腺毒性的方法，包括：
(a)确定已经与疑似能够诱导性腺毒性的化合物接触的受试者的样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此确定化合物诱导性腺毒性的能力。
4.权利要求2或3的方法，其中所述化合物是选自以下的至少一种化合物：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述参考源自(i)遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
6.权利要求5的方法，其中测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示性腺毒性。
7.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述参考源自(i)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
8.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。
9.权利要求7或8的方法，其中测试样品中生物标志物与参考相比不同的量指示性腺毒性。
10.一种鉴定用于治疗性腺毒性的物质的方法，包括步骤：
(a)确定遭遇性腺毒性的受试者的样品中选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的量，所述受试者已经与疑似能够治疗性腺毒性的候选物质接触；和
(b)将步骤(a)中确定的量与参考比较，由此鉴定能够治疗性腺毒性的物质。
11.权利要求10的方法，其中所述参考源自(i)遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
12.权利要求11的方法，其中测试样品中生物标志物与参考的不同的量指示能够治疗性腺毒性的物质。
13.权利要求10的方法，其中所述参考源自(i)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或(ii)尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
14.权利要求10的方法，其中所述参考是针对受试者群体中生物标志物的经计算的参考。
15.权利要求13或14的方法，其中测试样品中生物标志物与参考的基本上相同的量指示能够治疗性腺毒性的物质。
16.选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的用途或针对所述生物标志物的检测剂的用途，用于诊断受试者样品中的性腺毒性。
17.一种用于诊断疑似遭遇性腺毒性的受试者的样品中性腺毒性的装置，包含：
(a)分析单元，其包含针对选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的检测剂，所述分析单元允许确定样品中存在的所述生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的，
(b)包含存储的参考和数据处理器的评价单元，所述评价单元允许相对于存储的参考，比较由分析单元确定的所述至少一种生物标志物的量，由此诊断性腺毒性。
18.权利要求17的装置，其中所述存储的参考是源自已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示不存在性腺毒性。
19.权利要求17的装置，其中所述存储的参考是源自已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组的参考：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬，并且所述数据处理器执行指令以相对于存储的参考，比较由分析单元确定的至少一种生物标志物的量，其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比不同的量指示存在性腺毒性或其中测试样品中至少一种生物标志物与参考相比基本上相同的量指示不存在性腺毒性。
20.一种用于诊断性腺毒性的试剂盒，包含针对选自表1a、1b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a或6b中任一表的至少一种生物标志物的检测剂和针对所述至少一种生物标志物的标准物，所述标准物的浓度源自(i)已知遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或已经与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬；或源自(ii)已知未遭遇性腺毒性的受试者或受试者组或尚未与选自以下的至少一种化合物接触的受试者或受试者组：17-α-乙炔雌二醇、铃兰醛、2-甲氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基咪唑、苯基保泰松、2,5-己二酮、米非司酮和盐酸雷洛昔芬。
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