发明内容
本发明针对现有CIC检测技术及检测过程中,不能同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好、不受干扰的技术问题,公开了一种解决了以上技术问题的用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC复溶剂。
为了解决上述技术问题,本发明通过下述技术方案得以解决。
一、针对CIC中抗原的部分:
一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC复溶剂,以如下体积比例配比计,各组分及含量为,135μl-165μl的CIC分离剂、290μl-315μl的CIC洗涤剂、5μl-16μl的CIC复溶剂、65μl-76μl的CIC抗原缓冲液解离剂和65μl-76μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,本发明的试剂配方可以使CIC中的抗原解离率达到76.5%-83.8%(抗原解离率:指CIC解离后检测到的抗原量与实际CIC中抗原量的百分比)。而蛋白酶类消化法、强酸解离法、表面活性剂解离法的抗原解离率均在10%-20%以下。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC分离剂的作用如下:当每1L的CIC分离剂中包括5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水时,被分离的CIC达到最大量,同时改用氯化钠也避免了传统沉淀方法中氟化钠残留对后续检测抗原的干扰。本发明采用的聚乙二醇,作为优选选用聚乙二醇6000;本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、35g-45g的聚乙二醇、8.0g-11.7g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。以上配方的CIC洗涤剂主要针对CIC分离剂的配方进行设计,其作用是洗去体液标本中多余的杂蛋白。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g-9.5g的氯化钠、0.01g-0.03g的氢氧化钠、50μl-500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.5g-9.5g的氯化钠、0.018g-0.025g的氢氧化钠、65μl-450μl的聚乙二醇辛基苯基醚、120μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g-8.5g的氯化钠、0.016g-0.025g的氢氧化钠、300μl-450μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度最小;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,300μl的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC的效果最为理想。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:3.5g-5.5g的甘氨酸、9.0ml-15.0ml质量分数为35%-37%的浓盐酸、0.35g-0.51g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC抗原缓冲液解离剂使CIC中抗原达到最大程度的解离。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照,抗原解离率达到76.5%-83.8%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:16g-24g的氨基丁三醇、5.7g-8.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC抗原缓冲液解离中和剂主要是对CIC解离后的抗原缓冲液解离剂进行中和,使渗透压、pH达到抗原的最适环境,以利于对抗原的检测。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
以上提到的该种免疫复合物缓冲解离剂应用于患有感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液的CIC中抗原的检测。感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病等患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液标本中是否存在相应CIC,我们可以通过分离CIC,从而推断患者血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液中是否存在相应特异性标志物的CIC以及含量高低,以了解CIC在上述疾病发生发展过程中的病理生理作用及相关性;相关标志物阴性体液标本中若检测到相应CIC中的抗原或抗体(通常情况下,抗原解离率高于抗体解离率),则能提高该标志物的检出率及对相应疾病的诊断灵敏度。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入135μl-165μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入290μl-315μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入5μl-16μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入65μl-76μl的抗原缓冲液解离剂和65μl-76μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入65μl-76μl的抗原缓冲液解离剂,在56℃空气孵育放置30min或在42℃水浴放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入65μl-76μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗原检测结果判断标准,如下表所示:
表1HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗原检测结果判断标准
注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml
该种利用免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法通过分离、洗涤、复溶、解离CIC、中和,然后采用(电)化学发光法、免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验等临床免疫学实验室常规方法进行特异灵敏、定量或半定量检测抗原,整个实验流程充分考虑到温度、渗透压、pH环境对CIC、抗原、抗体的影响,建立了特异性检测CIC中抗原(解离后)的标准操作流程,这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。
二、针对CIC中抗体的部分:
一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC复溶剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,135-165μl的CIC分离剂、290-315μl的CIC洗涤剂、5-16μl的CIC复溶剂、65-76μl的CIC抗体缓冲液解离剂和65-76μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。以制备的HBsAg-抗HBs免疫复合物为例,本发明的试剂配方可以使CIC中的抗体解离率达到37.5%-51.0%(抗体解离率:指CIC解离后检测到的抗体与实际CIC中抗体量的百分比)。而现有的CIC检测技术因为抗体被破坏或一些干扰因素的存在,无法检测CIC中的抗体。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC分离剂的作用如下:当每1L的CIC分离剂中包括5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水时,被分离的CIC达到最大量,同时改用氯化钠也避免了传统沉淀方法中氟化钠残留对后续检测抗体的干扰。本发明采用的聚乙二醇,作为优选选用聚乙二醇6000;本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、35g-45g的聚乙二醇、8.0g-11.7g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。以上配方的CIC洗涤剂主要针对CIC分离剂的配方进行设计,其作用是洗去体液标本中多余的杂蛋白。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g-9.5g的氯化钠、0.01g-0.03g的氢氧化钠、50μl-500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.5g-9.5g的氯化钠、0.018g-0.025g的氢氧化钠、65μl-450μl的聚乙二醇辛基苯基醚、120μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g-8.5g的氯化钠、0.016g-0.025g的氢氧化钠、300μl-450μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度明显减少;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选,每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计,以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度最小;采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚,300μl的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC的效果最为理想。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100,本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分:3.5-5.5g的甘氨酸、4.0ml-6.0ml质量分数为35%-37%的浓盐酸、4.4g-6.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC抗体缓冲液解离剂使CIC中抗体达到最大程度的解离。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照,抗体解离率达到37.5%-51.0%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分:6.8g-10.0g的氨基丁三醇、6.5g-9.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC抗体缓冲液解离中和剂主要是对CIC解离的抗体缓冲液解离剂进行中和,使渗透压、pH达到抗体的最适环境,以利于对抗体的检测。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
以上提到的该种免疫复合物缓冲解离剂应用于患有感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液的CIC中抗体的检测。感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病等患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液标本中是否存在相应CIC,我们可以通过分离CIC,从而推断患者血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液中是否存在相应特异性标志物的CIC以及含量高低,以了解CIC在上述疾病发生发展过程中的病理生理作用及相关性;相关标志物阴性体液标本中若检测到相应CIC中的抗原或抗体(通常情况下,抗原解离率高于抗体解离率),则能提高该标志物的检出率及对相应疾病的诊断灵敏度。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗体的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入135μl-165μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入290μl-315μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入5μl-16μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入65μl-76μl的抗体缓冲液解离剂和65μl-76μl的抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗体解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入65μl-76μl抗体缓冲液解离剂,在15℃放置30min(在15℃空气孵育放置30min或在15℃℃水浴放置30min),得到解离液;
F.CIC抗体解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入65μl-76μl抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为测定值。
HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗体检测结果判断标准,如下表所示:
表2HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗体检测结果判断标准
注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=10mIU/ml
该种利用免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法通过分离、洗涤、复溶、解离CIC、中和,然后采用(电)化学发光法、免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验等临床免疫学实验室常规方法进行特异灵敏、定量或半定量检测抗体,整个实验流程充分考虑到温度、渗透压、pH环境对CIC、抗原、抗体的影响,建立了特异性检测CIC中抗体(解离后)的标准操作流程,这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明改进了现有技术中,CIC检测技术特异性差的缺点。直接检测CIC中的抗原或抗体。
(2)本发明改进了现有技术中,CIC检测技术灵敏度低的缺点,通过免疫复合物缓冲解离剂解离CIC中的抗原或抗体,再通过特异性检测CIC中的抗原或抗体,使抗原、抗体检测结果达到ng/ml和mIU/ml的水平,从而精确地计算CIC含量。
(3)本发明重复性好,适合批量使用,提高了工作效率。重复性与临床免疫学实验室常规检测抗原或抗体的变异度相当,一次解离可利用多种方法检测多个项目。
(4)本发明解决了现有CIC检测技术不能同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好的问题。本发明既可以特异灵敏定量检测CIC中的抗原或抗体;又可以对多份体液标本中同一种CIC进行批量检测(如同时检测多份血清标本中的HBsAg-抗-HBs免疫复合物);还可以对同一份体液标本中多种CIC进行高效检测(如对同一份血清标本中的HBsAg-抗-HBs、HBeAg-抗-HBe、HCV-cAg-抗-HCV、HIV-P24-抗-HIV等免疫复合物,或IgM、IgG、IgA型免疫复合物同时进行检测)。此外,本发明不需要特殊的仪器设备,适用于临床免疫学实验室常规的抗原、抗体检测项目;真正做到一次解离,同时检测多个项目,重复性(CV值)达到15%-20%以下。
(5)本发明消除了现有CIC检测技术中抗原或抗体检测过程中的干扰物质。本发明通过使用CIC抗体缓冲液解离中和剂,保障了抗原或抗体检测过程中没有任何物质干扰检测结果。
(6)本发明改进了蛋白酶类消化法、强酸解离法、表面活性剂解离法仅能检测游离抗原或抗体阴性标本的缺点。本发明对游离抗原或抗体无论是阴性还是阳性的标本均适用,本发明通过将CIC从体液标本中分离出来,避免了体液标本中游离抗原或抗体阳性对分离CIC中的抗原或抗体检测的干扰。
(7)本发明避免了渗透压、pH对抗原抗体检测的影响。本发明使检测体系的渗透压、pH值处于抗原或抗体的最适环境,从而避免了渗透压、pH对抗原抗体检测的影响。
(8)本发明适用于低浓度CIC的检测。本发明可以通过CIC分离、调整解离体积达到浓缩CIC的目的,从而大大提高了CIC中抗原或抗体的检出率。
(9)本发明也涉及利用上述免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,通过分离、洗涤、复溶、解离CIC、中和,最后检测样品中的CIC。不仅建立了特异性检测CIC中抗原(解离后)的标准操作流程,还建立了特异性检测CIC中抗体(解离后)的标准操作流程,这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。
(10)本发明适合在临床免疫学实验室常规检测。标本处理相对简便,是目前现有CIC检测技术中操作比较方便、能在临床实验室普及、对疾病诊断最有价值的方法。
具体实施方式
实施例1
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测胸腹水样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,135μl的CIC分离剂、290μl的CIC洗涤剂、5μl的CIC复溶剂、65μl的CIC抗原缓冲液解离剂和65μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、70g的聚乙二醇、6.2g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、35g的聚乙二醇、8.0g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g的氯化钠、0.01g的氢氧化钠、50μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:3.5g的甘氨酸、9.0ml质量分数为35%的浓盐酸、0.35g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:16g的氨基丁三醇、5.7g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测胸腹水样本,再分别加入135μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入290μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入5μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入65μl的抗原缓冲液解离剂和65μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入65μl的抗原缓冲液解离剂,在56℃空气孵育放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入65μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
待测胸腹水样本的测试结果:测得的空白值<Cutoff,测定值>Cutoff。即待测胸腹水样本中存在CIC,具体含量根据测定值大小判断。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml]。
实施例2
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测脑脊液样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,165μl的CIC分离剂、315μl的CIC洗涤剂、16μl的CIC复溶剂、76μl的CIC抗原缓冲液解离剂和76μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、90g的聚乙二醇、9.2g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、45g的聚乙二醇、11.7g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.5g的氯化钠、0.03g的氢氧化钠、500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:5.5g的甘氨酸、15.0ml质量分数为37%的浓盐酸、0.51g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:24g的氨基丁三醇、8.6g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测脑脊液样本,再分别加入165μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入315μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入16μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入76μl的抗原缓冲液解离剂和76μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入76μl的抗原缓冲液解离剂,在42℃水浴放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入76μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
待测脑脊液样本的测试结果:测得的空白值<Cutoff,测定值<Cutoff。即待测脑脊液样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml]。
实施例3
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗原缓冲液解离剂和70μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:4.5g的甘氨酸、12ml质量分数为36%的浓盐酸、0.43g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:20g的氨基丁三醇、7.3g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
一种利用上述所述的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,其特征在于:检测CIC中抗原的方法,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入150μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入300μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入10μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂和70μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂,在56℃空气孵育放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入70μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值>Cutoff,测定值>Cutoff,且测定值<130%空白值。即待测样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml]。
实施例4
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗原缓冲液解离剂和70μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.5g的氯化钠、0.018g的氢氧化钠、65μl的聚乙二醇辛基苯基醚、120μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:4.5g的甘氨酸、12ml质量分数为36%的浓盐酸、0.43g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:20g的氨基丁三醇、7.3g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
一种利用根据权利要求3所述的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,其特征在于:检测CIC中抗原的方法,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入150μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入300μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入10μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂和70μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂,在56℃空气孵育放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入70μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值>Cutoff,测定值>Cutoff,且测定值<130%空白值。即待测样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml]。
实施例5
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗原缓冲液解离剂和70μl的CIC抗原缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.8g的氯化钠、0.018g的氢氧化钠、65μl的聚乙二醇辛基苯基醚、120μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离剂包括以下组分:4.5g的甘氨酸、12ml质量分数为36%的浓盐酸、0.43g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗原缓冲液解离中和剂包括以下组分:20g的氨基丁三醇、7.3g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上提到的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗原的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
一种利用根据权利要求3所述的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,其特征在于:检测CIC中抗原的方法,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入150μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入300μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入10μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂和70μl的抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗原解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入70μl的抗原缓冲液解离剂,在56℃空气孵育放置30min,得到解离液;
F.CIC抗原解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入70μl抗原缓冲液解离中和剂,混匀后检测HBsAg,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值>Cutoff,测定值>Cutoff,且测定值<130%空白值。即待测样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=0.05IU/ml]。
实施例6
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,135μl的CIC分离剂、290μl的CIC洗涤剂、5μl的CIC复溶剂、65μl的CIC抗体缓冲液解离剂和65μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、70g的聚乙二醇、6.2g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、35g的聚乙二醇、8.0g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:8.0g的氯化钠、0.01g的氢氧化钠、50μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分:3.5g的甘氨酸、4.0ml质量分数为35%的浓盐酸、4.4g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分:6.8g的氨基丁三醇、6.5g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗体的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入135μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入290μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入5μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入65μl的抗体缓冲液解离剂和65μl的抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗体解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入65μl抗体缓冲液解离剂,在15℃放置30min,得到解离液;
F.CIC抗体解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入65μl抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值>Cutoff,测定值>Cutoff,且测定值<130%空白值。即待测样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例7
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,165μl的CIC分离剂、315μl的CIC洗涤剂、16μl的CIC复溶剂、76μl的CIC抗体缓冲液解离剂和76μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、90g的聚乙二醇、9.2g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、45g的聚乙二醇、11.7g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.5g的氯化钠、0.03g的氢氧化钠、500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分:5.5g的甘氨酸、6.0ml质量分数为37%的浓盐酸、6.6g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分:10.0g的氨基丁三醇、9.6g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗体的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入165μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入315μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入16μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入76μl的抗体缓冲液解离剂和76μl的抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗体解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入76μl抗体缓冲液解离剂,在15℃放置30min,得到解离液;
F.CIC抗体解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入76μl抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值<Cutoff,测定值>Cutoff。即待测样本中存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例8
一种免疫复合物缓冲解离剂,每150μl的待测样本加入以下组分的免疫复合物缓冲解离剂,150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗体缓冲液解离剂和70μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中,每1L的CIC分离剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分:6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分:9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分:4.5g的甘氨酸、5.0ml质量分数为36%的浓盐酸、5.5g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分:8.4g的氨基丁三醇、8.0的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法,检测CIC中抗体的方法,以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例,由下述步骤组成,
A.分离:向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本,再分别加入150μl的CIC分离剂;混匀后,在37℃放置30min,进行离心,离心结束后弃去上清液;
B.洗涤:向两支离心管中,分别加入300μl的CIC洗涤剂,离心后,弃去上清液,并将CIC沉淀物沥干;
C.复溶:分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中,加入10μl的CIC复溶剂,离心管安装于振荡器上,振荡至溶液中无块状沉淀物;
D.空白样品检测:将一支离心管标记为空白样品管,并加入70μl的抗体缓冲液解离剂和70μl的抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为空白值;
E.CIC抗体解离:将另一支离心管标记为测定样品管,并加入70μl抗体缓冲液解离剂,在15℃放置30min,得到解离液;
F.CIC抗体解离中和:向步骤E中得到的解离液中,加入70μl抗体缓冲液解离中和剂,混匀后检测抗-HBs,将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果:测得的空白值<Cutoff,测定值<Cutoff。即待测样本中不存在CIC。[注:在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法),Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例9
1.采用实施例3所述的免疫复合物缓冲解离剂与表面活性剂解离法检测HCV-Ag-抗-HCV免疫复合物的结果比较
随机收集日常工作中ELISA检测血清抗-HCV阳性标本共22份,分别采用实施例3所述的检测CIC的方法和表面活性剂解离技术对22份血清标本进行解离,然后采用ELISA法HCV-Ag试剂盒同时检测HCV-Ag,结果见表3。
表3实施例3对丙肝患者CIC中的HCV-Ag检测结果(n=22)
2.采用实施例3所述的免疫复合物缓冲解离剂与强酸解离法、胃蛋白酶消化法检测HBsAg-抗-HBs免疫复合物的结果比较
随机收集日常工作中ELISA检测急性乙肝病人刚进入恢复期(血清HBsAg阴性,抗-HBe和抗-HBc阳性,抗-HBs弱阳性或阴性)标本共37份,分别采用实施例3所述的检测CIC的方法和强酸解离法、胃蛋白酶消化法对37份血清标本进行解离,然后采用化学发光法i2000免疫分析仪检测HBsAg,结果见表4。
表4实施例3对游离HBsAg阴性的乙肝患者CIC中HBsAg检测结果(n=37)
3.采用实施例3所述的免疫复合物缓冲解离剂与抗C1q抗体包被微孔的抗Ig免疫捕获法(C1q免疫捕获法)、抗Igs抗体包被微孔的抗Ig免疫捕获法(抗Ig免疫捕获法)检测HBsAg-抗-HBs免疫复合物的结果比较
随机收集日常工作中ELISA检测慢性乙肝病人(血清HBsAg、抗-HBe和抗-HBc阳性)标本共52份,分别采用实施例3所述的检测CIC的方法和C1q免疫捕获法、抗Ig免疫捕获法对52份血清标本进行解离,然后采用ELISA法检测HBsAg,结果见表5。
表5实施例3对慢性乙肝患者CIC中的HBsAg检测结果(n=52)
4.采用实施例8所述的免疫复合物缓冲解离剂与胃蛋白酶消化法、强酸解离法、表面活性剂活检测自身抗体免疫复合物的结果比较
随机收集日常工作中自身免疫性疾病患者(活动期与静止期系统性红斑狼疮SLE,干燥综合症SS,类风湿关节炎RA等)标本各1份,分别采用实施例8所述的免疫复合物缓冲解离剂、胃蛋白酶消化法、强酸解离法和表面活性剂解离法对其血清标本进行解离,然后采用欧蒙免疫印迹试验(WB)检测自身抗体谱,结果见表6。
表6实施例8对自身免疫性疾病患者CIC中的自身抗体检测结果
注:±、+、++、+++代表阳性程度递增,-代表阴性结果。*因未将CIC分离后进行抗-dsDNA检测,故检测到的抗-dsDNA阳性无法判断该抗体是否来自CIC中的抗体还是游离抗体。
5.采用实施例3和实施例8所述的免疫复合物缓冲解离剂检测不同体液中CIC中的抗原或抗体结果
收集日常工作中慢性乙肝患者的尿液各13份,长期使用胰岛素治疗的II型糖尿病患者血清15份,睾酮水平低下致不孕不育患者的血清11份,类风湿关节炎患者关节腔液7份,采用实施例3和实施例8对上述体液标本CIC中的抗原或抗体进行解离,然后采用ELISA、化学发光法、免疫印迹试验检测相应的抗原或抗体,其中尿液进行10倍沉淀浓缩,结果见表7。
表7实施例3和实施例8对不同体液中CIC中的抗原或抗体检测结果
病种 |
标本类型 |
例数 |
检测项目 |
实施方法 |
阳性率(%) |
乙肝患者 |
尿液 |
13 |
HBsAg |
实施例3 |
38.5 |
II型糖尿病 |
血清 |
15 |
胰岛素抗体 |
实施例8 |
46.7 |
不孕不育 |
血清 |
11 |
睾酮 |
实施例3 |
27.3 |
类风湿关节炎 |
关节腔液 |
7 |
抗-CCP、抗-RA33 |
实施例8 |
100 |
总之,以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰,皆应属本发明专利的涵盖范围。