CN103772712B

CN103772712B - 一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法

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Publication number: CN103772712B
Application number: CN201210407780.2A
Authority: CN
Inventors: 吴一弦; 郭安儒; 杨璠; 刘小花
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN103772712A

Abstract

本发明涉及一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法，利用聚肽主链上的羧基侧基与单端聚四氢呋喃活性链进行可控反应，制备两者的接枝共聚物，利用聚肽主链上的羧基侧基与双端聚四氢呋喃活性链进行可控反应，制备两者的网络共聚物。该方法不仅可以有效地调节聚肽主链长度、聚四氢呋喃支链的数目和长度、接枝率或网络密度，而且可以保持共聚物中主链的螺旋结构。该共聚物材料综合了聚肽链段的可生物降解性以及聚四氢呋喃链段的自增强特性。

Description

一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法，属于高分子材料合成与制备领域。

背景技术：

多肽或聚肽在生物体内能够被酶降解，释放出无毒的小肽或小分子氨基酸，具有良好的生物降解性和生物相容性，在组织工程、药物释放载体、基因转染载体、大分子前体药物、生物材料表面修饰和组织工程支架等领域得到广泛应用，但其溶解性差别较大，降解周期及降解速率难以控制，导致一定的应用局限性。通过共聚方法改进聚肽材料，可把不同材料的优点结合起来，能赋予新材料特殊的性质，如聚肽与聚醚共聚物。

目前，聚肽与聚醚共聚物主要是聚肽与聚乙二醇的嵌段及接枝共聚物。对于聚肽与聚乙二醇的嵌段共聚物，主要包括聚谷氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物（可参见PolymerJournal1987,19,1329）、聚赖氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物（可参见Macromolecules1998,31,6071和BioconjugateChem.1996,7，144）及聚天冬氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物（可参见Biointerfaces1999,16，237），这些嵌段共聚物是通过将聚乙二醇的端基改性成氨基，作为大分子引发剂进一步引发α-氨基酸N-羧基环内酸酐（NCA）开环聚合得到嵌段共聚物。对于接枝共聚物，主要则是聚谷氨酸-聚乙二醇接枝共聚物，其合成方法是通过酯交换反应将聚乙二醇接入聚肽材料的支链(可参见Macromol.RapidCommun.,2004,25,1241；高等学校化学学报，2005,26,988)，或者将小分子量聚乙二醇（M_n＝100～200）与谷氨酸酯反应制备大分子单体，进一步通过大分子单体开环聚合制备了含有小分子量（M_n=100～200）聚乙二醇支链的聚谷氨酸酯（可参见化学学报，2008,66,1102），但难以设计合成出较长支链的聚谷氨酸酯与聚乙二醇的接枝共聚物。在现有技术中，聚肽与聚乙二醇接枝共聚物材料的制备方法复杂，收率低，支链数目和支链长度也难以调控，因此材料性能不可预期。此外，尽管聚乙二醇链段具有良好的生物相容性、抗凝血性、无毒和低免疫性，但因其极易吸水，会导致材料的力学性能大幅度降低，且使用场合受到限制。

聚四氢呋喃（PTHF）在医用聚酯材料中经常作为聚醚软段，具有生物相容性和安全性，已在人工血管、人工心脏、各类导管、填充物等植入材料中得到广泛应用。专利CN1844191A公开了以端氨基聚四氢呋喃为大分子引发剂来引发α-氨基酸-N-羧基环内酸酐（NCA）开环聚合的制备方法，共聚物的分子量为1800～50000，随着PTHF分子量增大，嵌段共聚效率下降。将端氨基官能化聚(-甲基-L-谷氨酸酯)与端异氰酸基官能化聚四氢呋喃作为大分子单体，进行缩合聚合，得到多嵌段型聚氨酯材料（可参见Polymer2000,41,473），但是大分子单体的制备方法较为复杂，聚合过程难以控制。

为了简单有效地合成多肽或聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物或网络共聚物，达到主链长度、支链长度、接枝效率及网络密度的可调控的目的，本发明提出一种新型制备方法，利用多肽或聚肽主链上的官能基团，如-COOH，与聚四氢呋喃活性链端进行反应得到两者接枝共聚物或网络共聚物。本发明的制备方法简便易控，可有效地调节聚肽主链长度、聚四氢呋喃支链的数目和长度及网络密度。多肽或聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物或网络共聚物具有两亲性，且PTHF支链的引入，可改善材料的抗湿强度和柔韧性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法，利用不同分子量（M_n=2000～100000）的聚肽主链上的-COOH侧基与不同用量、不同分子量（M_n=200～8000）的单端聚四氢呋喃活性链进行反应，得到不同主链长度、接枝数目、接枝密度和支链长度的聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物，如接枝率（G_e）可在5%～85%范围内调节；同样，将聚肽主链上的-COOH侧基与不同用量、不同分子量（M_n=200～8000）的双端聚四氢呋喃活性链进行反应，得到不同网络密度和支链长度的聚肽与聚四氢呋喃的网络共聚物。优选聚肽链段的数均分子量为2000～40000，聚四氢呋喃链段的数均分子量为600～3000。

本发明的方法，通过开环聚合反应制得不同分子量的聚四氢呋喃活性链，再通过聚四氢呋喃活性链与聚肽分子链上羧基（-COOH）的亲核反应，从而将聚四氢呋喃链段键接到聚肽主链上。对于单端聚四氢呋喃活性链与聚肽反应，制得聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物；对于双端聚四氢呋喃活性链与聚肽反应，制得聚肽与聚四氢呋喃的网络共聚物。具体制备步骤和条件如下：

A：聚四氢呋喃活性链的合成

采用单官能引发剂或双官能引发剂进行四氢呋喃本体聚合或溶液聚合，反应体系中四氢呋喃浓度为3.0～12.3mol/L，四氢呋喃与引发剂的摩尔比为5～200：1，聚合温度-10～35℃，聚合时间5～120分钟。单体四氢呋喃可直接使用，也可配制成溶液后使用。在单官能引发剂或双官能引发剂的作用下，进行本体开环聚合或溶液开环聚合，得到预定分子量的相应的得到单端或双端聚四氢呋喃活性链溶液。

所述的单官能引发剂选自三氟甲基磺酸甲酯、三氟甲基磺酸乙酯、三氟甲基磺酸丙酯、三氟甲基磺酸丁酯、三氟甲基磺酸丙烯酸乙酯、三氟甲基磺酸丙烯酸丁酯、三氟甲基磺酸己酯、三甲硅基三氟甲磺酸酯、三乙基硅烷三氟甲磺酸酯、叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯、2-(三甲基硅基)苯基三氟甲磺酸酯、三氟乙酸甲酯、三氟乙酸乙酯、三氟乙酸异丙酯或三氟乙酰乙酸乙酯；

双官能引发剂选自三氟甲基磺酸酐、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐或七氟丁酸酐。

单体四氢呋喃浓度优选为5.0～8.8mol/L，聚合温度优选为-10～23℃，聚合反应时间优选为5～40分钟。单官能引发剂优选三氟甲基磺酸甲酯或三氟乙酸乙酯，双官能引发剂优选三氟甲基磺酸酐或三氟乙酸酐。

溶液聚合中，配制四氢呋喃溶液所用溶剂可选自二氯甲烷、二氯乙烷、二氯丙烷、二氯丁烷、三氯甲烷、三氯乙烷、三氯丙烷、三氯丁烷、三氯戊烷、一氯代苯、邻二氯代苯、间二氯代苯、对二氯代苯、1,2,4-三氯代苯中的一种或它们的混合物。

B：聚肽与聚四氢呋喃共聚物的合成

将步骤A的聚四氢呋喃活性链溶液加入到聚肽与卤代烃的混合溶液中，同时加入质子捕获剂，其中聚四氢呋喃活性链与聚肽结构单元中羧基的摩尔比为0.01～0.9，质子捕获剂与聚四氢呋喃活性链摩尔比为1.2～4，于-10～35℃下进行终止反应，反应时间为1～60分钟。经纯化、真空干燥得到接枝共聚物，优选的反应温度为-10～23℃，反应时间为20～60分钟。

所述的质子捕获剂为含氮的有机化合物，选自吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,6-二叔丁基吡啶、三甲胺、三乙胺或三丙胺。

所述的卤代烃选自二氯甲烷、二氯乙烷、二氯丙烷、二氯丁烷、三氯甲烷、三氯乙烷、三氯丙烷、三氯丁烷、三氯戊烷、一氯代苯、邻二氯代苯、间二氯代苯、对二氯代苯、1,2,4-三氯代苯中的一种或它们的混合物。

所述聚肽为天然多肽或采用下列方法制得的合成聚肽：

首先，在25～65℃下，以四氢呋喃为溶剂，将氨基酸和/或其衍生物与三光气(化学名称：双(三氯甲基)碳酸酯)按摩尔比0.2～0.6反应，反应时间为0.5～6小时，用烷烃或石油醚沉淀，过滤干燥得到相应的α-氨基酸-N-羧基环内酸酐。然后，在20～60℃条件下，采用三乙胺为引发剂，引发相应α-氨基酸-N-羧基环内酸酐在N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、三氟乙酸或二氧六环等极性溶剂中进行开环聚合，反应时间为2～72小时，用甲醇沉淀，经真空干燥，得到相应的聚氨基酸酯，包括均聚物与共聚物。通过调节引发剂与不同α-氨基酸-N-羧基环内酸酐的摩尔比，可得到不同分子量的聚氨基酸酯。

所述的氨基酸和/或其衍生物为γ-苄基-L-谷氨酸酯(BLG)、γ-乙基-L-谷氨酸酯(ELG)、γ-甲基-L-谷氨酸酯(MLG)、β-苄酯-L-天冬氨酸(BLA)、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸(ZLL)、ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸(TLL)中的一种或它们的混合物。

所得到的相应聚氨基酸酯为γ-苄基-L-谷氨酸酯、γ-乙基-L-谷氨酸酯、-甲基-L-谷氨酸酯、β-苄酯-L-天冬氨酸、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸、-三氟乙酰基-L-赖氨酸的均聚物中一种或者它们的共聚物中的一种。

在20~70℃下，以三氟乙酸或二氯乙酸为溶剂将聚氨基酸酯溶解，加入10~35wt%HBr的醋酸溶液反应0.5~7小时，HBr与聚氨基酸酯结构单元的摩尔比为1～5，用丙酮沉淀，得到相应的聚肽。

通过调节聚氨基酸酯、三氟醋酸、HBr的醋酸溶液的用量，反应时间及反应温度，可以实现完全水解，得到聚肽，最后真空干燥至恒重。所得到的聚肽为L-谷氨酸酯、L-天冬氨酸、L-赖氨酸的均聚物中一种或者它们的共聚物中的一种。

单端聚四氢呋喃活性链与聚肽反应得到接枝共聚物，双端聚四氢呋喃活性链与聚肽反应得到网络共聚物。

本发明方法通过可控/活性开环聚合方法与有机反应方法相结合，将聚肽与聚四氢呋喃进行化学键接，制备了聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物或网络共聚物两亲性材料，并可有效调节主链长度、支链数目和长度接枝率、网络密度等结构参数，特别是聚四氢呋喃链端键接到聚肽分子链上的效率很高，可高达100%，还可以保持共聚物中聚肽主链的螺旋结构。聚肽与聚四氢呋喃的接枝共聚物或网络共聚物两亲性材料，将聚肽及聚四氢呋喃的优异特点有机地结合起来，是具有优异的生物相容性、化学稳定性、抗湿强度并可结晶自增强的新型材料。

本发明提供的制备方法，运用活性/可控开环聚合调节大分子链的可控性以及活性链端的高效可控反应，无需外加催化剂，反应条件温和，操作简便，工艺简单并易于调控，对材料分子结构及性能的可设计性强，有利于从调节微观结构来调控宏观性能，并降低材料的制造成本。

采用美国Waters515.2410型凝胶渗透色谱仪(GPC)测定聚合物的分子量及分子量分布，柱温25℃，四氢呋喃为流动相，流速为1.0mL/min，不同分子量的聚苯乙烯标样为校正曲线。采用Bruker公司AV400MHz的¹H、¹³C-NMR在25℃下表征聚合物的分子链组成、序列结构，CDCl₃为溶剂，以四甲基硅烷为标准参照物。采用TAInstrument公司的Q200型差示量热扫描仪（DSC）测定聚合物的热力学行为。采用重庆光电XSZ-HS3型偏光显微镜(POM)观察聚合物薄膜的结晶现象。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进一步说明，但不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：

聚(L-谷氨酸)-g-聚四氢呋喃接枝共聚物

A：聚肽的制备

在氮气保护下，将4.0gγ-苄酯-L-谷氨酸（BLG）溶于40mL四氢呋喃（THF）中，加入2.0g三光气，在60℃搅拌下反应2小时至澄清溶液，生成γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，用正己烷沉淀，24h后该沉淀物用乙酸乙酯溶解/正己烷沉淀反复进行两次，过滤干燥得BLG-NCA产品，收率为78%；将2.0gBLG-NCA溶于氯仿，加入40mg三乙胺，在25℃搅拌条件下反应72小时，用正己烷沉淀，然后真空干燥，得到聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)（PBLG），收率为78%；将1.0gPBLG溶解于三氟醋酸（[PBLG]＝0.04g/mL），在每10mL溶液中加入1mL33wt%HBr的醋酸溶液，在室温下搅拌1.5h，生成的聚(L-谷氨酸)（PLGA）用丙酮沉淀后在40℃下真空干燥至恒重，得到相应聚肽。

B：聚四氢呋喃活性链的合成

在氮气保护下，向10mL含有THF与氯仿的溶液([THF]＝6.2mol/L)中加入0.2mL三氟甲基磺酸甲酯，在20℃下引发THF进行活性开环聚合反应10分钟，得到单端聚四氢呋喃活性链溶液。

C：聚肽与聚四氢呋喃接枝共聚物的合成

搅拌条件下，向20mLPLGA的氯仿溶液([PLGA]＝3.6mmol/L)中，加入1.5mLC步骤的聚四氢呋喃活性链溶液，于20℃下反应30分钟，再加入0.06mL的2,6-二甲基吡啶（DMP）继续搅拌2h。得到的产物依次经氯仿、四氢呋喃溶剂纯化，纯化后产物于40℃恒温真空干燥18小时，得到0.6g接枝共聚物聚(L-谷氨酸)g-聚四氢呋喃(PLGA-g-PTHF)。接枝率为25%，主链PLGA的数均分子量（M_n）为2300，支链PTHF的M_n为1100。

实施例2：

聚(L-谷氨酸)g-聚四氢呋喃接枝共聚物

A：同实施例1中A。

B：采用本体聚合，其他条件同实施例1中B。

C：20℃下，20mLPLGA/氯仿溶液([PLGA]＝3.6mmol/L)与0.3mLB步骤的聚四氢呋喃活性链溶液反应30分钟，再加入0.012mL的2,6-二甲基吡啶（DMP）继续搅拌2h，其他条件同实施例1中C，得到0.24g接枝共聚物PLGA-g-PTHF。接枝率为5%，主链PLGA的M_n为2300，支链PTHF的M_n为1100。

实施例3：

聚(L-谷氨酸)g-聚四氢呋喃接枝共聚物

A：同实施例1中A。

B：改变三氟甲基磺酸甲酯的加入量为0.3mL，其它条件同实施例1中B。

C：20℃下，20mL上述PLGA的氯仿溶液([PLGA]＝3.6mmol/L)与4mLB步骤的聚四氢呋喃活性链溶液反应30分钟，其他条件同实施例1中C，得到1.2g接枝共聚物PLGA-g-PTHF。接枝率为81%，主链PLGA的M_n为2300，支链PTHF的M_n为700。

实施例4：

聚(L-谷氨酸)g-聚四氢呋喃接枝共聚物

A：改变三乙胺的加入量为8mg，反应时间为72h，其它条件同实施例1中A，BLG-NCA的收率为31%，PBLG的收率为75%。

B：同实施例3中B。

C：20℃下20mL上述PLGA的氯仿溶液([PLGA]＝1.8mmol/L)与10mLB步骤的聚四氢呋喃活性链溶液反应60分钟，其他条件同实施例1中C，得到1.9g接枝共聚物PLGA-g-PTHF。接枝率为46%，主链PLGA的M_n为21000，支链PTHF的M_n为700。

实施例5：

聚谷氨酸-l-聚四氢呋喃网络共聚物

A：同实施例1中A。

B：改变引发剂为三氟甲基磺酸酐，加入量为0.5mL，其他条件同实施例1中B。

C：20℃下，40mL上述PLGA的氯仿溶液([PLGA]＝1.8mmol/L)与4mLB步骤的聚四氢呋喃活性链溶液反应60分钟，再加入0.54mL的2,6-二甲基吡啶（DMP）继续搅拌2h，其他条件同实施例1中C，得到1.3g网状接枝共聚物PLGA-l-PTHF。网络密度为24%，主链PLGA的M_n为2300，支链PTHF的M_n为800。

实施例6：

聚谷氨酸-l-聚四氢呋喃网络共聚物

A：同实施例4中A。

B：同实施例5中B。

C：同实施例5中C，得到1.64g网状接枝共聚物PLGA-l-PTHF。网络密度为31%，主链PLGA的M_n为21000，支链PTHF的M_n为800。

实施例7：

聚谷氨酸-l-聚四氢呋喃网络共聚物

A：同实施例5中A。

B：只是改变引发剂为三氟甲基磺酸酐，加入量为0.15mL，其他条件同实施例1中B。

C：同实施例5中C，得到1.17g网状接枝共聚物PLGA-l-PTHF。网络密度为9%，主链PLGA的M_n为2300，支链PTHF的M_n为2600。

实施例8：

聚谷氨酸-l-聚四氢呋喃网络共聚物

A：同实施例4中A。

B：改变引发剂为三氟甲基磺酸酐，加入量为0.15mL，其他条件同实施例1中B。

C：同实施例1中C，得到1.6g网状接枝共聚物PLGA-g-PTHF。网络密度为12%，主链PLGA的M_n为21000，支链PTHF的M_n为2600。

Claims

1.一种聚肽与聚四氢呋喃共聚物的制备方法，先通过开环聚合反应制得聚四氢呋喃活性链，再通过聚四氢呋喃活性链与聚肽分子链上羧基进行亲核反应，将聚四氢呋喃链键接到聚肽分子链上，制得聚肽与聚四氢呋喃的共聚物；其特征是：具体制备步骤和条件为：

A.聚四氢呋喃活性链的合成

采用单官能引发剂或双官能引发剂进行四氢呋喃本体聚合或溶液聚合，反应体系中四氢呋喃浓度为3.0～12.3mol/L，四氢呋喃与引发剂的摩尔比为5～200：1，聚合温度为-15～35℃，聚合时间为5～120分钟，得到单端或双端聚四氢呋喃活性链溶液；

所述的单官能引发剂选自三氟甲基磺酸甲酯、三氟甲基磺酸乙酯、三氟甲基磺酸丙酯、三氟甲基磺酸丁酯、三氟甲基磺酸丙烯酸乙酯、三氟甲基磺酸丙烯酸丁酯、三氟甲基磺酸已酯、三甲硅基三氟甲磺酸酯、三乙基硅烷三氟甲磺酸酯、叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯、2-(三甲基硅基)苯基三氟甲磺酸酯、三氟乙酸甲酯、三氟乙酸乙酯、三氟乙酸异丙酯或三氟乙酰乙酸乙酯；

双官能引发剂选自三氟甲基磺酸酐、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐或七氟丁酸酐；

B：聚肽与聚四氢呋喃共聚物的合成

将聚四氢呋喃活性链溶液加入到聚肽与卤代烃的混合溶液中，同时加入质子捕获剂，其中聚四氢呋喃活性链与聚肽结构单元中羧基的摩尔比为0.01～0.9，质子捕获剂与聚四氢呋喃活性链摩尔比为1.2～4.0，于-10～35℃下进行反应，反应时间为1～60分钟，经纯化、真空干燥得到相应的共聚物；

所述的质子捕获剂为含氮的有机化合物，选自吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,6-二叔丁基吡啶、三甲胺、三乙胺或三丙胺；

所述聚肽为天然多肽或采用下列方法制得的合成聚肽：

以四氢呋喃为溶剂，将氨基酸和/或其衍生物与三光气在25～65℃反应0.5～6小时，生成相应的α-氨基酸-N-羧基环内酸酐；以三乙胺进一步引发α-氨基酸-N-羧基环内酸酐于20～60℃下进行开环聚合，反应时间为2～72小时，形成相应的聚氨基酸酯；在聚氨基酸酯与三氟乙酸或二氯乙酸的混合溶液中，加入HBr的醋酸溶液，于20～70℃下，反应0.5～7小时，产物经纯化、干燥得到聚肽。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征是：所述的氨基酸和/或其衍生物为γ-苄基-L-谷氨酸酯、γ-乙基-L-谷氨酸酯、γ-甲基-L-谷氨酸酯、β-苄酯-L-天冬氨酸、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸、ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸中的一种或它们的混合物。

3.根据权利要求1的制备方法，其特征是：步骤A中聚合反应体系中单体四氢呋喃浓度为5.0～8.8mol/L。

4.根据权利要求1的制备方法，其特征是：步骤B中单官能引发剂为三氟甲基磺酸甲酯或三氟乙酸乙酯，双官能引发剂为三氟甲基磺酸酐或三氟乙酸酐，聚合温度为-10～23℃，聚合时间为5～40分钟。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征是：步骤B中反应温度为-10～23℃，反应时间为20～60分钟。

6.根据权利要求1的制备方法，其特征是：HBr的醋酸溶液的质量浓度为10～35wt％，HBr与聚肽中结构单元的摩尔比为1～5。