CN107556497B - 一种杂化水凝胶材料的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种杂化水凝胶材料的制备方法及其在组织工程、医用材料及药物负载方面的应用，该杂化水凝胶材料由聚多肽‑聚乙二醇‑聚多肽三嵌段共聚物与鱼精DNA静电结合制备而成，该方法成本低、形成条件温和并表现出响应性、可逆性和自愈性等特点；采用本发明所述的方法制备的杂化水凝胶材料，既具有共聚物的生物降解性和DNA的结构单元有序、可控，又具有瞬态网络结构的特征，同时解决了传统使用光引发剂和化学交联剂带来的毒性。

Description

一种杂化水凝胶材料的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及新材料技术领域，具体涉及一种基于聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物与DNA静电作用构建的杂化水凝胶材料的制备方法及应用。
背景技术
水凝胶材料是以水为分散介质的凝胶材料，是具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。由于其良好的性能，在组织工程和药物负载方面都具有广泛地应用前景，特别是基于聚多肽的水凝胶材料。
聚多肽的水凝胶材料具有生物可降解性与生物相容性，该类材料在生物医学材料领域应用时拥有独特的优势。专利CN104780909A公开了一种经由将胶凝剂在介质中加热搅拌使其溶解、分散后，一边搅拌一边放冷后，在室温下静置的工序的情况下，也能够形成水凝胶形成用材料，以及即使将水凝胶通过振荡溶胶化后，然后通过在室温下静置也能够再形成凝胶的水凝胶材料。专利CN106397793A公开了一种L-丙氨酸、L-谷氨酸-5-苄酯多肽共聚物水凝胶，为负载纳米银的聚乙二醇与聚(L-丙氨酸-co-L-谷氨酸-5-苄酯)的嵌段共聚物水溶液，该纳米银的水凝胶剂负载简便、负载量高并具有良好的体外抗菌效果。但是这种基于两亲性多肽之间或聚多肽之间二级结构的转变，来对水凝胶的结构与性能进行调控，这种凝胶网络形成机理在某些环境的应用过程中可能存在一定的局限性。
生物大分子DNA，除了能够作为基因载体的功能外，还是一类重要的天然聚电解质类高分子材料，由于其结构单元的有序性与可控性，被认为是构建超分子自组装结构的理想原材料。
由两种或两种以上不同类型高分子复合而成的杂化材料，由于可以同时兼具不同种类单体或聚合物的性质，使该类材料拥有独特的结构和功能。专利CN103910893A公开了一种聚多肽-DNA水凝胶及其制备方法，包括共价结合有单链DNA分子的多肽和具有两个粘性末端的双链DNA分子，通过单链DNA分子与双链DNA分子的互补形成交联结构，该水凝胶机械强度可调节、生物相容性良好。但是通过共价结合的方式，操作条件复杂、不可逆，同时也未公开通过静电作用构筑杂化超分子水凝胶材料的方法。
因此，本专利利用聚多肽与DNA分子这两类性能优良的可降解生物高分子作为主要构筑单元组分构建杂化超分子水凝胶材料，能够充分利用上述两者在结构与性质上的优势，赋予杂化材料更多的性能。
发明内容
本发明提供了一种通过苯丙氨酸与聚乙二醇末端羟基进行偶联反应的方法对聚乙二醇(PEG)端基进行改性，获得大分子引发剂-苯丙氨酸端基化聚乙二醇(NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2)，然后利用其末端氨基引发Lys(Z)-NCA的开环聚合，再经脱保护基团叔丁氧羰基后成功合成得到三嵌段共聚物PLL-b-PEG-b-PLL。进一步利用该三嵌段聚合物中两端聚赖氨酸中的氨基与DNA分子磷酸二酯键骨架中的磷酸基团，在一定的pH条件下，通过正负电荷之间的静电相互作用，构建杂化交联网络结构，从而建立一种构筑杂化超分子水凝胶材料，该杂化超分子水凝胶材料既具有共聚物的生物降解性和DNA的结构单元有序、可控，又由于是通过静电作用方式结合的杂化超分子而具有瞬态网络结构的特征，同时解决了传统使用光引发剂和化学交联剂带来的毒性。
本发明的第一方面，涉及一种杂化水凝胶材料的制备方法，由聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物与鱼精DNA以1:(10-20)的电荷摩尔比通过静电结合制备而成。
优选的，所述电荷摩尔比为1:(14-18)；进一步优选的，所述电荷摩尔比为1:16。
优选的，所述的聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物为聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸；聚赖氨酸侧链上的氨基的解离常数为10.5左右，因此在通常为pH中性的生物体系水溶液中，能够以正电荷的解离状态存在；DNA作为天然阴离子性聚电解质，其骨架结构磷酸二酯键中的磷酸基团，在水溶液中通常以负电荷的解离状态存在，从而使其能够与上述合成得到的带正电荷的聚赖氨酸侧链利用静电相互作用形成偶联结合位点。三嵌段共聚物中聚赖氨酸嵌段带正电荷的侧基可以与DNA骨架中带负电荷的磷酸基团形成稳定的铆合位点，同时共聚物中间嵌段电中性的柔性PEG链段作为交联网络连接结构，使形成的水凝胶材料具有更多地结构可控性。
本发明所述的杂化水凝胶材料的制备方法步骤如下：
1)将聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物与鱼精DNA分别溶解于水；
2)将步骤1)中溶解的聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物与溶解的鱼精DNA混合。
优选的，所述步骤2)中按照DNA磷酸二酯键中带负电荷的磷酸基团与三嵌段共聚物中聚赖氨酸侧链质子化的氨基正电荷，两者之间的电荷摩尔比例为(10-20):1混合，常温下，静置过夜，利用翻转样品管的方法，确定形成杂化水凝胶结构的最低成胶质量浓度；进一步优选的，所述两者之间的电荷摩尔比例为(14-18):1；最优选的，两者之间的电荷摩尔比例为16:1；其中，聚赖氨酸带正电荷的氨基与DNA结构中带负电荷的磷酸基团的电荷浓度分别控制在20mM。
本发明所述的聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸三嵌段共聚物合成步骤如下：
1)将苯丙氨酸端基化聚乙二醇油浴、干燥、冷却；
2)将Lys(Z)-NCA溶解于DMF中；
3)将步骤2)中溶解的Lys(Z)-NCA转移至步骤1)产物中，获得混合液；
4)确认步骤3)中的混合液反应完全后，沉淀，得到初步处理物，将初步处理物水解；
5)调节pH值、透析、干燥得到聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸产物。
优选的，所述步骤1)中油浴温度为45-55℃，优选为50℃，所述干燥为真空干燥，干燥约4小时，冷却至室温；所述步骤2)中将Lys(Z)-NCA在手套箱中溶解于干燥DMF中；所述步骤3)中用注射器抽取后转移到上述反应体系中，其中Lys(Z)-NCA：苯丙氨酸端基化聚乙二醇＝(3-20):1，优选的，Lys(Z)-NCA：苯丙氨酸端基化聚乙二醇＝(8-20):1，最优选的，Lys(Z)-NCA/苯丙氨酸端基化聚乙二醇＝10:1，并将获得的混合液氮气保护、35-45℃，优选为40℃，反应三天；所述步骤4)中确认反应完全利用FT-IR光谱，并利用产物的1H-NMR相应特征吸收峰面积比例关系，计算得聚合度。所述步骤4)中混合液沉淀采用乙醚，所述的水解采用氢溴酸和冰醋酸水解，更优选的，所述的步骤4)为混合液采用乙醚沉淀、三氟乙酸(TFA)溶解沉淀物、5倍当量的氢溴酸和冰醋酸水浴水解后，再进行乙醚沉淀；所述步骤5)中用稀HCl调节pH值，使沉淀物溶解于水中进行透析，所述干燥为将透析液冷冻干燥，得到聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸产物。
在本发明的一个实施例中，所述聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的结构式如下：
其中，所述结构式中n为3～6；优选的，所述结构式中n为4～5；进一步优选的，所述结构式中n为4。
本发明所述的初步处理物的结构式如下：
本发明所述的苯丙氨酸端基化聚乙二醇合成步骤如下：
1)聚乙二醇与N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸进行偶联反应，得到偶联物；
2)所述步骤1)中反应完全后，过滤除杂，得到粗产物；
3)将步骤2)中的粗产物脱去保护基团叔丁氧羰基，洗涤，得到苯丙氨酸端基化聚乙二醇，所述苯丙氨酸端基化聚乙二醇为两端修饰有伯胺基的大分子引发剂的聚乙二醇。
其中，所述苯丙氨酸端基化聚乙二醇的结构式如下：
优选的，所述步骤1)中偶联反应为聚乙二醇与N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸冰水浴中溶解于二氯甲烷中，向其中加入DCC和DMAP后0℃的冰水浴中反应2h，然后室温过夜；所述步骤2)中所述过滤包括常温过滤和冷却过滤；所述步骤3)中所述保护基团为叔丁氧羰基(Boc)，脱去保护基团叔丁氧羰基的方法为加入5倍当量的三氟乙酸，所述洗涤所用洗涤液为饱和NaHCO3、H2O、HCl和饱和NaCl洗涤分液。
本发明所述的Lys(Z)-NCA合成步骤如下：
1)将原料H-Lys(Z)-OH和三光气溶解于溶剂中；
2)步骤1)中反应完全后得到α-赖基酸-N-羧基-环内酸酐粗产品；
3)将步骤2)中获得的粗产品置于手套箱中，重结晶得到Lys(Z)-NCA产物。
其中，所述Lys(Z)-NCA的结构式如下：
优选的，所述步骤1)中H-Lys(Z)-OH为0.8g，2.85mmol-1.5g，5.35mmol，对应的所述三光气为0.339g，1.14mmol-0.635g，2.14mmol，进一步优选的，所述H-Lys(Z)-OH为1.00g，3.57mmol，所述三光气为0.42g，1.43mmol，所述溶剂为无水四氢呋喃(THF)；所述步骤2)中反应温度为45-55℃，优选为50℃，至澄清后继续反应0.5-1.5h，优选为1h，所述粗产品为α-赖基酸-N-羧基-环内酸酐；所述步骤3)中重结晶所用溶剂为无水四氢呋喃和正己烷混合溶剂，所述重结晶次数优选为3次。
本发明的第二方面，涉及根据上述所述的方法获得的杂化水凝胶材料。
本发明所述的杂化水凝胶材料制备原料包括聚多肽-聚乙二醇-聚多肽和鱼精DNA。
优选的，所述聚多肽-聚乙二醇-聚多肽为聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸；所述聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与鱼精DNA的电荷摩尔比例为1:(10-20)；进一步优选的，所述聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与鱼精DNA的电荷摩尔比例为1:(14-18)；最优选的，所述聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸与鱼精DNA的电荷摩尔比例为1:16。
本发明所述的聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的制备原料包括引发剂和Lys(Z)-NCA。
优选的，所述原料中引发剂与Lys(Z)-NCA的质量比为1:(3-20)；进一步优选的，所述原料中引发剂与Lys(Z)-NCA的质量比为1:(8-20)；最优选的，所述原料中引发剂与Lys(Z)-NCA的质量比为1:10。
在本发明的一个实施例中，所述引发剂为苯丙氨酸端基化聚乙二醇。
优选的，所述杂化水凝胶材料的制备原料中还包括3-7倍当量的三氟乙酸；进一步优选为5倍当量的三氟乙酸。
本发明所述引发剂的制备原料包括以下组分和质量含量：
优选的，所述引发剂的制备原料包括以下组分和质量含量：
在本发明的一个实施例中，所述引发剂的制备原料包括以下组分和质量含量：
本发明所述Lys(Z)-NCA由L-赖氨酸(H-Lys(Z)-OH)与三光气反应制得，其中：
H-Lys(Z)-OH 0.8g，2.85mmol-1.5g，5.35mmol
三光气 0.339g，1.14mmol-0.635g，2.14mmol
优选的，由1.00g，3.57mmol的H-Lys(Z)-OH与0.42g，1.43mmol的三光气反应制得。
本发明的第三方面，涉及来源于上述所述的方法或所述的杂化水凝胶材料在组织工程、医用材料及药物负载方面的应用。
本发明所述的二氯甲烷(H2CCl2)、四氢呋喃(THF)和正己烷经高纯氮鼓泡除氧再利用活性氧化铝柱干燥后使用。
本发明所述的杂化超分子水凝胶材料既具有共聚物的生物降解性和DNA的结构单元有序、可控，又具有瞬态网络结构的特征，同时解决了传统使用光引发剂和化学交联剂带来的毒性；同时采用本发明的方法制备杂化超分子水凝胶材料，成本低、简便、高效、形成条件温和并表现出响应性、可逆性和自愈性等特点，利用静电作用构建超分子网络结构的策略，在制备更加复杂的功能化材料方面具有潜在的应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的合成过程；
图2：Lys(Z)-NCA的合成过程；
图3：聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸(PLL-b-PEG-b-PLL)三嵌段共聚物的合成过程；
图4：核磁氢谱图，其中，A为PZLL-Phe-PEG-Phe-PZLL的核磁氢谱图，B为PLL-Phe-PEG-Phe-PLL的核磁氢谱图；
图5：NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2与引发聚合产物PZLL-Phe-PEG227-Phe-PZLL体积排阻色谱(SEC)的表征；
图6：三嵌段共聚物PLL-b-PEG-b-PLL与鱼精DNA形成超分子凝胶结构示意图，其中，A：三嵌段共聚物与阴离子DNA利用静电相互作用形成偶联结合位点；B：形成空间网络结构的杂化水凝胶材料的过程；C：稳定的水凝胶结构。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例所用的材料、仪器：
L-赖氨酸：H-Lys(Z)-OH上海吉尔生化，99％；
N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸：Boc-Phe-OH，上海吉尔生化，99％；
N,N'-二环己基碳二亚胺：DCC，上海吉尔生化，99％；
三光气：上海吉尔生化，99％；
4-二甲氨基吡啶：DMAP，阿拉丁，99％；
三氟乙酸：TFA，阿拉丁，99.5％；
鱼精DNA(2000bp)、聚乙二醇(HO-PEG-OH，Mn＝10 000g/mol)：Sigma-Aldrich；
去离子水(电阻率＞18MΩ·cm-1)：Millipore Milli-Q纯化。
实施例1
1、原料
1.1合成大分子引发剂NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的原料
1.2合成Lys(Z)-NCA的原料
H-Lys(Z)-OH 1g，3.57mmol
三光气 0.42g，1.43mmol
1.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的原料
NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2 1g，0.1mmol
Lys(Z)-NCA 0.31g，1mmol
1.4合成杂化水凝胶的原料
聚赖氨酸带正电荷的氨基与DNA结构中带负电荷的磷酸基团的电荷浓度分别控制在20mM，三嵌段共聚物与鱼精DNA的电荷摩尔比例1:16。
2、制备方法
2.1合成苯丙氨酸端基化聚乙二醇(NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2)
苯丙氨酸端基化聚乙二醇(NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2)的合成过程如图1所示，具体步骤如下：
第一步：聚乙二醇(HO-PEG227-OH)与N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(Boc-Phe-OH)进行偶联反应，得到偶联物；
将HO-PEG227-OH与Boc-Phe-OH冰水浴中溶解于200mL二氯甲烷中，向其中加入DCC和DMAP后0℃的冰水浴中反应2h，进一步将反应体系升温到室温下反应过夜；
第二步：过滤除杂，得到粗产物；
通过过滤的方法除去产生的不溶性副产物N,N'-二环乙基脲(DCU)，并利用冷却过滤的方法再进一步除去残余的DCU后得到粗产物。
第三步：将粗产物脱去保护基团叔丁氧羰基，洗涤，得到苯丙氨酸端基化聚乙二醇，所述苯丙氨酸端基化聚乙二醇为两端修饰有伯胺基的大分子引发剂的聚乙二醇。
在粗产物中加入5倍当量的三氟乙酸脱去末端的保护基团(Boc)，再依次用饱和NaHCO3、H2O、HCl和饱和NaCl洗涤分液，得到NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2。
2.2合成Lys(Z)-NCA
Lys(Z)-NCA的合成过程如图2所示，具体步骤如下：
将原料H-Lys(Z)-OH和三光气于无水四氢呋喃(THF)溶剂中、50℃反应至澄清后再继续反应一个小时；反应完全后得到α-赖基酸-N-羧基-环内酸酐(NCA)粗产品；将获得的NCA单体粗产物置于手套箱中，经THF与正己烷混合溶剂重结晶纯化三次后得最终的Lys(Z)-NCA产物。
2.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸(PLL-b-PEG-b-PLL)三嵌段共聚物
聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的合成过程如图3所示，具体步骤如下：
将NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2在50℃油浴真空干燥4h后冷却到室温，并将Lys(Z)-NCA在手套箱中溶解于干燥DMF中，然后用注射器抽取后转移到上述反应体系中，得混合液；将混合液氮气保护、40℃下反应三天，利用FT-IR光谱确认反应完全得到粗产物，取少量粗产物配制成5mg/mL进行SEC/LLS测试，确定多分散性(PDI)与分子量，并利用产物的1H-NMR相应特征吸收峰面积比例关系，计算得到引发聚合的两端聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为4；加入大量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解粗产物，加入5倍当量的氢溴酸/冰醋酸(HBr/CH3COOH)于冰水浴中反应4h(图3)，后加入过量的乙醚沉淀。最后将沉淀产物用稀HCl调节适当pH值，使其溶解于水中进行透析，透析液冷冻干燥后得到产物聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸。通过1H-NMR确认脱保护基团叔丁氧羰基反应进行完全，最终得到产物PLL4-b-PEG227-b-PLL4。其中体积排除色谱/激光散射(SEC/LLS)使用SSI泵连接到Wyatt OptilabDSP和Wyatt DAWN EOS激光散射检测器，以0.02M LiBr的DMF溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，测量温度为50℃，样品浓度大约为5mg/mL。
2.4合成杂化水凝胶
将鱼精DNA和2.3制备的三嵌段共聚物PLL4-b-PEG45-b-PLL4分别溶解于水中，按照DNA磷酸二酯键中带负电荷的磷酸基团与三嵌段共聚物中聚赖氨酸侧链质子化的氨基正电荷，按两者之间的电荷摩尔比例混合进行混合后，常温下静置过夜，利用翻转样品管的方法，确定形成杂化水凝胶结构的最低成胶质量浓度。
3、结果
关于对PEG末端羟基进行改性的策略，不仅具有合成方法简单高效的特点，而且改性后末端苯丙氨酸侧基上的苄基在1H-NMR中具有特征的化学位移，从而使端基改性后的产物易于进行表征。在NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的合成过程中，得到粗产物产率为80％，去除保护基叔丁氧羰基后得到的NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2产物产率为75％。
通过开环聚合的方法，以NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2作为大分子引发剂，在一定条件下，合成出三嵌段共聚物PZLL-Phe-PEG-Phe-PZLL。利用Bruker AV400FT-NMR核磁共振仪测定1H-NMR谱图(图4A)中化学位移3.3-3.8的PEG亚甲基单元与化学位移4.9-5.1聚赖氨酸嵌段侧链苄基中亚甲基吸收峰面积的比例，估算PZLL嵌段的聚合度，并由于PEG两端的伯胺基引发NCA开环聚合的几率相等，因此可以推断合成的PZLL-b-PEG-b-PZLL三嵌段共聚物中两端PZLL嵌段的聚合度为4个单元左右。从1H-NMR(图4B)表征结果可以看出，PZLL侧链的苄氧羰基中亚甲基的吸收峰(化学位移4.9-5.1)，在上述脱保护反应后完全消失，最终确定了我们成功合成得到两端各含有4个赖氨酸嵌段的三嵌段共聚物PLL4-b-PEG227-b-PLL4。通过以0.02mol/L LiBr DMF溶液为流动相的SEC/LLS获得的分子量分布PDI＝1.08(如图5)，证明上述合成得到的聚合物具有较好的多分散性。
得到的三嵌段共聚物PLL-b-PEG227-b-PLL具有如下特点：首先该聚合物中间嵌段为水溶性且生物相容性较好的聚乙二醇链段，并且该PEG的链段较长(227个单元)，使其在构筑杂化材料时具有良好的柔性；另外该三嵌段共聚物两端为生物可降解性的聚赖氨酸嵌段，有利于其在生物医用材料方面的应用。
使用英国Malvern公司Nano ZS ZEN3600型Zeta电位粒度仪侧量Zeta电位，结果证明，20mg/mL的上述三嵌段共聚物水溶液的Zeta电位为+10mV左右，证明该三嵌段共聚物中两侧聚赖氨酸嵌段在适当的pH的条件下带有一定的正电荷。该三嵌段共聚物与阴离子DNA利用静电相互作用形成偶联结合位点如图6A所示，同时三嵌段共聚物中柔性且链段长度较长的PEG227能够作为桥链结构，将聚氨基酸与DNA形成的偶联位点连接起来，最终形成具有空间网络结构的杂化水凝胶材料(图6B)，同时两种组分总的质量浓度为3％左右的情况下，形成的稳定水凝胶结构如图6C所示。
实施例2
1、原料
1.1合成大分子引发剂NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的原料
1.2合成Lys(Z)-NCA的原料
H-Lys(Z)-OH 0.8g,2.85mmol
三光气 0.339g,1.14mmol
1.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的原料
NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2 0.8g,0.08mmol
Lys(Z)-NCA 0.49g,1.6mmol
1.4合成杂化水凝胶的原料
聚赖氨酸带正电荷的氨基与DNA结构中带负电荷的磷酸基团的电荷浓度分别控制在20mM，三嵌段共聚物与鱼精DNA的电荷摩尔比例1:10。
2、制备方法
2.1合成苯丙氨酸端基化聚乙二醇(NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2)的方法同实施例1。
2.2合成Lys(Z)-NCA
Lys(Z)-NCA的合成过程如图2所示，具体步骤如下：
将原料H-Lys(Z)-OH和三光气于无水四氢呋喃(THF)溶剂中、45℃反应至澄清后再继续反应1.5小时；反应完全后得到α-赖基酸-N-羧基-环内酸酐(NCA)粗产品；将获得的NCA单体粗产物置于手套箱中，经THF与正己烷混合溶剂重结晶纯化三次后得最终的Lys(Z)-NCA产物。
2.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸(PLL-b-PEG-b-PLL)三嵌段共聚物
聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的合成过程如图3所示，具体步骤如下：
将NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2在55℃油浴真空干燥4h后冷却到室温，并将Lys(Z)-NCA在手套箱中溶解于干燥DMF中，然后用注射器抽取后转移到上述反应体系中，得混合液；将混合液氮气保护、45℃下反应三天，利用FT-IR光谱确认反应完全得到粗产物，取少量粗产物配制成5mg/mL进行SEC/LLS测试，确定多分散性(PDI)与分子量，并利用产物的1H-NMR相应特征吸收峰面积比例关系，计算得到引发聚合的两端聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为6；加入大量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解粗产物，加入5倍当量的氢溴酸/冰醋酸(HBr/CH3COOH)于冰水浴中反应4h(图3)，后加入过量的乙醚沉淀。最后将沉淀产物用稀HCl调节适当pH值，使其溶解于水中进行透析，透析液冷冻干燥后得到产物聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸。通过1H-NMR确认脱保护反应进行完全，最终得到产物PLL6-b-PEG227-b-PLL6。
2.4合成杂化水凝胶的方法同实施例1。
3、结果
在NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的合成过程中，得到粗产物产率为62％，去除保护基叔丁氧羰基后得到的NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2产物产率为57％。
应用1H-NMR表征确定了我们成功合成得到两端各含有6个赖氨酸嵌段的三嵌段共聚物PLL6-b-PEG227-b-PLL6，并具有很好的多分散性。
在通过三嵌段共聚物与DNA静电合成水凝胶材料时，两种组分总的质量浓度为2.5％左右的情况下，形成的稳定水凝胶结构。
实施例3
1、原料
1.1合成大分子引发剂NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的原料
1.2合成Lys(Z)-NCA的原料
H-Lys(Z)-OH 1.5g,5.35mmol
三光气 0.635g,2.14mmol
1.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的原料
NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2 1.2g,0.12mmol
Lys(Z)-NCA 0.294g,0.96mmol
1.4合成杂化水凝胶的原料
聚赖氨酸带正电荷的氨基与DNA结构中带负电荷的磷酸基团的电荷浓度分别控制在20mM，三嵌段共聚物与鱼精DNA的电荷摩尔比例1:20。
2、制备方法
2.1合成苯丙氨酸端基化聚乙二醇(NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2)的方法同实施例1。
2.2合成Lys(Z)-NCA
Lys(Z)-NCA的合成过程如图2所示，具体步骤如下：
将原料H-Lys(Z)-OH和三光气于无水四氢呋喃(THF)溶剂中、55℃反应至澄清后再继续反应0.5小时；反应完全后得到α-赖基酸-N-羧基-环内酸酐(NCA)粗产品；将获得的NCA单体粗产物置于手套箱中，经THF与正己烷混合溶剂重结晶纯化三次后得最终的Lys(Z)-NCA产物。
2.3合成聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸(PLL-b-PEG-b-PLL)三嵌段共聚物
聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸的合成过程如图3所示，具体步骤如下：
将NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2在45℃油浴真空干燥4h后冷却到室温，并将Lys(Z)-NCA在手套箱中溶解于干燥DMF中，然后用注射器抽取后转移到上述反应体系中，得混合液；将混合液氮气保护、35℃下反应三天，利用FT-IR光谱确认反应完全得到粗产物，取少量粗产物配制成5mg/mL进行SEC/LLS测试，确定多分散性(PDI)与分子量，并利用产物的1H-NMR相应特征吸收峰面积比例关系，计算得到引发聚合的两端聚氨基酸嵌段的聚合度DPn为3；加入大量乙醚沉淀后，用少量三氟乙酸(TFA)溶解粗产物，加入5倍当量的氢溴酸/冰醋酸(HBr/CH3COOH)于冰水浴中反应4h(图3)，后加入过量的乙醚沉淀。最后将沉淀产物用稀HCl调节适当pH值，使其溶解于水中进行透析，透析液冷冻干燥后得到产物聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸。通过1H-NMR确认脱保护基团叔丁氧羰基反应进行完全，最终得到产物PLL3-b-PEG227-b-PLL3。
2.4合成杂化水凝胶的方法同实施例1。
3、结果
在NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2的合成过程中，得到粗产物产率为73％，去除保护基叔丁氧羰基后得到的NH2-Phe-PEG227-Phe-NH2产物产率为64％。
应用1H-NMR表征确定了我们成功合成得到两端各含有3个赖氨酸嵌段的三嵌段共聚物PLL3-b-PEG227-b-PLL3，并具有很好的多分散性。
在通过三嵌段共聚物与DNA静电合成水凝胶材料时，两种组分总的质量浓度为4％左右的情况下，形成的稳定水凝胶结构。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种杂化水凝胶材料的制备方法，其特征在于，由聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物与鱼精DNA以1:(10-20)的电荷摩尔比通过静电结合制备而成， 所述聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物合成步骤如下：
1)将苯丙氨酸端基化聚乙二醇油浴、干燥、冷却；
2)将Lys(Z)-NCA溶解于DMF中；
3)将步骤2)中溶解的Lys(Z)-NCA转移至步骤1)中产物中，获得混合液；
4)确认步骤3)中的混合液反应完全后，沉淀，获得初步处理物，将初步处理物水解；
5)调节pH值、透析、干燥得到聚赖氨酸-聚乙二醇-聚赖氨酸产物；
所述聚多肽-聚乙二醇-聚多肽三嵌段共聚物的结构式如下：
其中，所述结构式中n为3～6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸端基化聚乙二醇合成步骤如下：
1)聚乙二醇与N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸进行偶联反应，得到偶联物；
2)所述步骤1)中反应完全后，过滤除杂，得到粗产物；
3)将步骤2)中的粗产物脱去保护基团叔丁氧羰基，洗涤，得到苯丙氨酸端基化聚乙二醇。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸端基化聚乙二醇的结构式如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Lys(Z)-NCA合成步骤如下：
1)将原料H-Lys(Z)-OH和三光气溶解于溶剂中；
2)步骤1)中反应完全后得到粗产品；
3)将步骤2)中获得的粗产品重结晶得到Lys(Z)-NCA产物；
所述Lys(Z)-NCA的结构式如下：
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法获得的杂化水凝胶材料。
6.权利要求5所述的杂化水凝胶材料在组织工程、医用材料及药物负载方面的应用。
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