CN103755794B - 一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，属于蛋白分离纯化方法的技术领域。其包括以下工艺步骤：1）制备虾肉丙酮粉；2）抽提虾过敏蛋白；3）硫酸铵分级沉淀；4）等电点沉淀；5）DEAE52阴离子交换层析；6）Sephadex G‑100 凝胶层析；7）免疫亲和层析。本发明首次采用致敏蛋白的表位抗体制备免疫亲和柱来纯化致敏蛋白，该方法对于表位序列已知的致敏蛋白的纯化快速简便，且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性，对于致敏蛋白的纯化具有重要的借鉴意义。

Description

一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化方法的技术领域，具体涉及一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法。

背景技术

根据蛋白质本身的物理化学特性的基础上发展起来的蛋白分离纯化方法主要有以下几种：一是基于蛋白质分子大小的透析、超滤、分析筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等；二是根据蛋白质的带点特性分离的等电点沉淀、离子交换层析、等点聚焦电泳等；三是根据蛋白质的溶解性分离的硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级等；四是根据蛋白质的变性与复性分离的，如采用尿素变性与复性方法从包涵体中纯化原核表达蛋白；五是根据蛋白质的结晶特性分离，如从鸡蛋中纯化溶菌酶等；六是根据蛋白质表面的表面特性分离，蛋白质的吸附层析；七是根据蛋白质的分子形状分离，如酶与底物、酶与抑制剂或激活剂、抗原与抗体、凝集素与葡萄糖等的分离常采用的亲和层析，等等（汪世华，2008）。

近年具有高选择性、高分辨率及高容量的亲和层析技术越来越受到人们的关注。亲和层析具有纯化过程简单、快速且分离效率高等特点，尤其对于含量极少、稳定性较差的生物活性物质尤为有效。同时，免疫亲和色谱因能将结构十分相近的目标物得以分离，也受到人们的亲睐。免疫亲和色谱利用抗原与抗体间高度的特异性及较高的亲和力可将非常相近的目标物得以区分，并且具有从大量复杂蛋白基质中一步分离出极少量目标物的优点，是目前最具选择性和最有效的纯化方法之一（黄昕等，1999）。通常认为在进行免疫纯化时需使用单克隆抗或多克隆抗体，最好是使用单抗，单抗特异性强，分离的目标抗原纯度更高。但是由于单抗制备技术难，成本高，常规实验室难以实现，这也限制了免疫亲和色谱的应用。

目前，虽然免疫亲和色谱也已经在一些领域开始使用，但是用于致敏蛋白的纯化方面却报道极少，但是基于较成熟的色谱制备技术，开展免疫亲和纯化致敏蛋白也具有乐观的前景。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法的技术方案。

所述的一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）制备虾肉丙酮粉

2）抽提虾过敏蛋白

3）硫酸铵分级沉淀

将步骤2）抽提得到的虾蛋白粗提液调pH 至7.4，缓慢加入硫酸铵至饱和度30%，低温下缓慢搅拌，静置，充分沉淀后离心，收集沉淀，得到虾蛋白；

4）等电点沉淀

将硫酸铵分级沉淀得到的虾蛋白用1×PBS充分溶解，逐滴加入50%（v/v）硫酸溶液，直到pH 至4.6，低温下缓慢搅拌，静置，充分沉淀后离心，收集沉淀，得到等电点沉淀后的虾蛋白，将等电点沉淀后的虾蛋白再用1×PBS充分溶解后，透析，冷冻干燥后得蛋白冻干粉；

5）DEAE52阴离子交换层析

用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子，将步骤4）得到的蛋白冻干粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配制成5mg/ mL溶液，充分溶解后于离心，取上清上样，上样后换用NaCl浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mol/L梯度洗脱，洗脱流速设为1 mL/min，自动收集器收集洗脱液，监测A280值，收集洗脱峰做SDS-PAGE，鉴定分离纯化效果；

6）Sephadex G-100 凝胶层析

先后用1×PBS及含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS平衡柱子，平横流速设为1 mL/min，将经步骤5）纯化获得的含目标蛋白的峰浓缩后，上样，用含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS的缓冲液洗脱，洗脱流速设为0.9 mL/min，自动收集器收集洗脱液，2 min/管，监测A280值，直到A280值接近0时，停止收集，收集洗脱峰做SDS-PAGE，得到目的蛋白的洗脱管；

7）免疫亲和层析

pena1多克隆抗体装柱制作免疫亲和柱层析柱，将目的蛋白用0.1 mol/L Tris缓冲液稀释，过0.45m微孔滤膜后上样，常温孵育30 min后，用足量的0.1 mol/L Tris缓冲液做冲洗柱子，直到收集液中A280接近0时，换用pH 2.4、0.1 mol/L glycine盐溶液做洗脱液洗柱，待检测洗脱液A280接近0时停止洗脱，收集洗脱液得到虾致敏蛋白pena1。

所述的一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于所述的步骤1）中制备虾肉丙酮粉具体包括：将去头去壳去肠线的虾肉于匀浆机中匀浆，加生理盐水悬浮，再向悬浮液中加入4倍体积的冷丙酮，充分混匀，0℃不断搅拌30 min后8000 r/min离心15 min，回收沉淀物，重新用冷丙酮悬浮并混匀，重复上述过程，将沉淀物转移至干净滤纸上，于通风橱中分散，干燥后得虾肉丙酮粉。

所述的一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于所述的步骤2）中抽提虾过敏蛋白具体包括：取步骤1）得到的虾肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液，所述的抽提液为pH 7.4、含5 mmol/L二硫苏糖醇的1 mol/L，4℃低温搅拌过夜，4℃，8000 r/min离心15 min后，收集上清液，得到虾蛋白粗提液。

所述的一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于所述的步骤3）中4℃低温下缓慢搅拌1.5 h，静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30 min后，收集沉淀。

所述的一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于所述的步骤4）中4℃低温下缓慢搅拌1 h，静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30 min后，收集沉淀。

本发明在充分总结前人研究的基础上，以现代生物技术的发展为辅助，探索一种利用致敏蛋白表位抗体亲和纯化相应的致敏蛋白，一方面可以免去纯化目的蛋白所需的繁琐的操作，另一方面也是对新方法、新技术的探索。

本发明首次采用致敏蛋白的表位抗体制备免疫亲和柱来纯化致敏蛋白，该方法对于表位序列已知的致敏蛋白的纯化快速简便，且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性，对于致敏蛋白的纯化具有重要的借鉴意义。

附图说明

图1为蛋白(NH₄)₂SO₄结合pI沉淀的SDS-PAGE分析图，图中：M蛋白Marker，1-蛋白抽提液，2、4、6、8分别是饱和度为30%、40%、50%、60%的(NH₄)₂SO₄溶液沉淀后的蛋白溶液，3、5、7、9分别经30%、40%、50%、60%的(NH₄)₂SO₄沉淀后又经pI沉淀后的蛋白溶液，10、11分别是经30%、40%(NH₄)₂SO₄及pI沉淀后的上清液；

图2为虾致敏蛋白等电点沉淀后的阴离子交换层析图；

图3为SDS-PAGE分析虾致敏蛋白经阴离子交换层析得到的蛋白峰图；

图4为虾致敏蛋白阴离子交换P3峰的凝胶层析图；

图5为SDS-PAGE分析虾致敏蛋白经凝胶层析得到的蛋白P1峰图；

图6为Western Blot分析虾致敏蛋白经凝胶层析得到的蛋白P1峰图；

图7为间接竞争标准曲线图；

图8为洗脱液洗脱效果图；

图9为洗脱峰的电泳图，图中M: 蛋白分子量marker，1:上样液，2、3洗脱峰；

图10为洗脱峰的免疫印记图，图中M: 蛋白分子量marker，1: 阴性对照， 2洗脱峰；

图11为免疫亲和柱的柱容量。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

一、试剂的配置

1、十二烷基硫酸钠（10% SDS，W/V）：将10 g SDS加入80 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100 mL，常温下贮存。

2、过硫酸铵（10% AP，W/V）：将1 g AP用蒸馏水定容至10 mL，4℃储存，或分装后-20℃冷冻保存。

3、Tris-HCl缓冲液（1 mol/L，pH 6.8）：将12.1 g Tris加入60 mL蒸馏水中，充分溶解后，缓慢加浓盐酸调pH 至6.8，待溶液冷却至室温后，蒸馏水定容至100 mL，4℃储存。

4、Tris-HCl缓冲液（1.5 mol/L，pH 8.8）：将18.15 g Tris加入60 mL蒸馏水中，充分溶解后，缓慢加浓盐酸调pH 至8.8，待溶液冷却至室温后，蒸馏水定容至100 mL，4℃储存。

5、凝胶贮液（30% Acr-0.8% Bis）：将29.2 g丙烯酰胺（Acr）、0.8 g甲叉双丙烯酰胺（Bis）用80 mL蒸馏水充分溶解后，定容至100 mL，0.45 µm微孔滤膜过滤，滤液储存于棕色瓶中，4℃存放。

6、10×电极缓冲液（Tris-Glycine，pH 8.3）：将188 g Glycine、30.2 g Tris、10.0 g SDS，加入800 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1000 mL，常温保存，使用时配置成为1×电极缓冲液，调pH 至8.3。

7、2×蛋白质样品缓冲液（Loading Buffer）：取0.24 mL Tris-HCl缓冲液（1 mol/L，pH 6.8）、1 mL 50%甘油、0.8 mL 10% SDS、40 mg溴酚蓝，7.76 mL蒸馏水，0.2 mL β-疏基乙醇，充分混合后，4℃存放。

8、蛋白凝胶染色液（R-250考马斯亮蓝）：将1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中，向烧杯中加入250 mL的异丙醇，搅拌使溶解，再加入100 mL冰乙酸，650 mL蒸馏水，充分搅拌，用滤纸除去不溶性颗粒后，常温保存。

9、凝胶脱色液：将50 mL乙醇、100 mL冰乙酸、850 mL蒸馏水，混匀后备用。

免疫印迹试剂的配制

1、10×转膜缓冲液（pH 7.6）：将29 g Tris-Base、144 g Glycine，加入800 mL蒸馏水中，充分溶解后4℃保存。使用时取上述溶液100 mL，再加入500 mL蒸馏水，200 mL甲醇，混匀后，逐滴加入浓盐酸调pH 至7.6，后定容到1000 mL备用。

2、10×TBS：将24.2 g Tris-Base，85 g NaCl，加入800 mL蒸馏水中，充分溶解后，用适量蒸馏水溶解，用浓盐酸调节pH 至7.6，定容至1000 mL。

3、洗膜缓冲液（TBS/T）：量取100 mL10×TBS加入1 mL 吐温-20，定容至1000 mL。

4、封闭缓冲液：将15 mL 10×TBS、5 g脱脂奶粉、50 μL 吐温-20，加入80 mL蒸馏水充分混匀，定容至100 mL，4℃保存。

5、10×丽春红储液：将2 g丽春红、30 g三氯乙酸，30 g磺基水杨酸，溶于蒸馏水解并定容至100 mL。使用时蒸馏水稀释成1×使用液。

6、Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.5）：将21 g Tris-Base，溶于 80 mL 蒸馏水中，用浓 盐酸调pH 至7.5，后定容至100 mL。

7、DAB母液：将0.1 g DAB 溶于20 mL Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.5）中，充分混匀，4℃保存。

8、DAB显色液：取1 mL DAB 母液，5 mL Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.5），5 μL30%的H2O2，加4 mL蒸馏水混合均匀，现配现用。

CNBr-Activated Sepharose 4B偶联抗体所需试剂的配制

1、偶联缓冲液（0.2 mol/L NaHCO3+0.5 mol/L NaCl，pH 8.3）：称取16.8 gNaHCO3，29.22 g NaCl加800 mL蒸馏水充分溶解后，1 mol/LHCl调pH 至8.3，后定容至1000mL。

2、封闭缓冲液（0.2 mol/L 甘氨酸）：称取15.014 g Glycine，加800 mL蒸馏水充分溶解后，6 mol/L NaOH调pH 至8.0，后定容至1000 mL。

3、冲洗缓冲液（0.1 mol/L NaAC+0.5 mol/L NaCl，pH 4.0）：称取13.61 g NaAC∙3H2O，29.22 g NaCl，加800 mL蒸馏水充分溶解后，浓盐酸调pH 4.0，后定容至1000 mL。

4、Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 8.0）：称取12.11 g Tris-Base、29.22 g NaCl，加800mL蒸馏水充分溶解后，6 mol/L NaOH调pH 至8.0，后定容至1000 mL。

二、实验方法：虾致敏蛋白Pena 1提取、纯化及鉴定

1、制备虾肉丙酮粉

将去头去壳去肠线的虾肉于匀浆机中匀浆，1 g组织加1.5 mL生理盐水悬浮。然后向悬浮液中加入4倍体积的冷丙酮，充分混匀，0℃不断搅拌30 min后8000 r/min离心15min，回收沉淀物，重新用冷丙酮悬浮并混匀，重复上述过程。将沉淀物转移至干净滤纸上，于通风橱中分散，干燥后得丙酮粉。若遇较大块状物，低温下研磨成粉。

2、抽提虾过敏蛋白

取虾丙酮粉按1:10比例加入抽提液（1 mol/L KCl，其中含5 mmol/L二硫苏糖醇，pH 7.4），低温搅拌过夜。4℃，8000 r/min离心15 min后，收集上清液，得到虾蛋白粗提液。

3、硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）分级沉淀

将虾蛋白粗提液调pH 至7.4，缓慢加入(NH₄)₂SO₄至以下饱和度：30%、40%、50%、60%。4℃低温下缓慢搅拌1.5 h，后静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30 min后，收集沉淀，得到对应饱和度下的虾蛋白，SDS-PAGE鉴定分离纯化效果。

SDS-PAGE分析

（1）凝胶的配制

凝胶的配置见表1，分离胶首先抽气30min，抽气完毕，加入10％AP和TEMED，配好后迅速混匀，灌胶。加入少量蒸馏水，待出现明显界面时倾去蒸馏水，加入浓缩胶，并插入梳子。

表1 SDS-PAGE电泳凝胶的配方

试剂	13％分离胶(mL)	5％浓缩胶(mL)
			H2O	3.000	3.400
30％Acrylamide	4.200	0.830
			1.0M Tris-HCl(pH6.8)	/	0.630
1.5M Tris-HCl(pH8.8)	2.500	/
			10％SDS	0.100	0.050
10％AP	0.100	0.050
			TEMED	0.004	0.005

（2）电泳

样品处理：将待测样品与上样缓冲液各20µL混合，沸水浴5min，放冷，然后1000r/min离心5min。

上样：电泳槽中槽中加入电泳缓冲液，用微量加样器吸取预染的标准分子量蛋白和处理好的样品各15µL,轻轻深入加样槽底部，小心加样勿与缓冲液混合，注意勿插入胶内。

电泳：电泳缓冲液灌满前后槽，接通电源。在恒压条件下，先用80V低电压，待样品在浓缩胶内浓缩成一条线并进入分离胶后（约20min），改变电压至120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部1cm左右停止。

染色：卸开电泳槽，排出电泳缓冲液，撬开胶板，取出凝胶，将凝胶置于培养皿中，倒入考马斯亮蓝R-250染色液在水平摇床上染色1h。

脱色照相：倒出染色液，加入脱色液，放在脱色摇床上轻摇脱色至条带清晰，背景透亮无蓝色为止，照相。

4、等电点（pI）沉淀

将(NH₄)₂SO₄分级沉淀得到的蛋白用1×PBS充分溶解，逐滴加入50%（v/v）硫酸溶液，直到pH 至4.6。低温下缓慢搅拌1 h，后静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30min后，收集沉淀，得到对应饱和度下等电点沉淀后的虾蛋白，将上述蛋白用1×PBS充分溶解后，低温蒸馏水透析48 h，期间换透析液数次。将目的蛋白含量较高的冷冻干燥后得蛋白冻干粉，-20℃低温保存。同时SDS-PAGE鉴定分离纯化效果。

5、DEAE52阴离子交换层析

将装好阴离子交换柱（直径2.6×20 cm），用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子，将步骤4的蛋白用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配制成5mg/ mL溶液，充分溶解后于4℃，12000 r/min离心30 min，取上清上样，上样后换用NaCl浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mol/L梯度洗脱，洗脱流速设为1 mL/min。自动收集器收集洗脱液，监测A280值，收集洗脱峰做SDS-PAGE，鉴定分离纯化效果。

6、Sephadex G-100 凝胶层析

装好层析柱（直径1.6×60 cm），先后用1×PBS及含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS平衡柱子，平横流速设为1 mL/min。将经步骤5纯化获得的含目标蛋白的峰浓缩后，上样。用含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS的缓冲液洗脱，洗脱流速设为0.9 mL/min，自动收集器收集洗脱液，2 min/管，监测A280值，直到A280值接近0时，停止收集。收集洗脱峰做SDS-PAGE，得到目的蛋白（36 kD）的洗脱管。

7、Western Blot鉴定纯化后的Pena1活性

采用免疫印迹验证以上3-6步分离纯化得到目的蛋白的活性。具体步骤如下：

(1) 制备转膜胶：将纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，取下凝胶，其中1块做考染，另1块切去浓缩胶，去离子水小心漂洗干净后放入转膜缓冲液平衡10 min。

(2) 准备NC膜及滤纸：按照1块胶1张NC膜和6张滤纸，滤纸要略小于胶，膜要略大于胶，剪裁时要注意戴手套防止污染膜。裁剪好的NC膜于蒸馏水的平皿中，水平摇床缓慢振瑶直至浸湿至饱和，此过程约1 h，然后将膜转移至95%的乙醇中浸泡5 s，再于转膜缓冲液中平衡10 min。同时将裁剪好的滤纸和胶在转膜缓冲液中平衡至饱和。

(3) 准备转膜：将于转膜缓冲液中饱和的转印海绵，用玻璃棒滚压除去气泡，将转膜夹完全浸没于转膜缓冲液中，按照“海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵”的顺序制备好转膜夹，各层尽量避免有气泡，盖上转印夹并扣紧。将转印夹放入转移槽中，转印夹的黑色筛板孔贴近转移槽的黑色端，保证凝胶与阴极相连，NC膜与阳极相连，注满转膜缓冲液，加盖。

(4) 电转膜：将电泳槽置于冰水中，接通电源，96 mA，转膜1.5 h。

(5) NC膜染色：取出转印后的NC膜浸于丽春红使用液中，振摇约1 min，观察，若膜上出现清晰的粉红色蛋白带，说明转膜成功，停止染色，蒸馏水洗去染色液。

(6) NC膜漂洗及封闭：将NC膜浸于足量的TBS/T洗涤液中，振摇洗涤3次，每次10min。洗涤后的膜正面朝上完全浸没于封闭液中，4℃封闭过夜。

(7) 加一抗：用封闭液将虾过敏患者的血清按1:50稀释后置于平皿中，封闭后的膜正面朝上浸没于稀释液中，盖上皿盖，37℃摇动孵育1.5 h。取出膜用预先37℃温育的足量的TBS/T振摇洗涤5次，每次5 min。

(8) 加二抗：用封闭液将HRP标记的羊抗人IgG按1:800稀释后置于平皿中，将洗涤后的膜正面朝上浸没于稀释液中，盖上皿盖，37℃摇动孵育1 h。取出膜用预先37℃温育的足量的TBS/T振摇洗涤4次，每次5 min，最后用1×TBS振摇洗涤2次，每次5 min。

(9) 膜显色：将膜浸没于配制好的DAB显色液中，37℃避光显色至蛋白条带显色清晰后，立即用蒸馏水漂洗3次，每次5 min，终止反应。漂洗后的膜在滤纸上吸干，出现棕色条带的为阳性，及时封膜摄像。

8、间接竞争ELISA检测方法的建立

在优化的抗原、抗体最佳反应浓度下，以Pena1为包被原，以梯度稀释的Pena1为竞争物，测定吸光值OD450，同时设置空白对照，根据标准竞争曲线测定样品中Pena1的含量。以Pena1浓度的对数值为横坐标，抑制率（IC）为纵坐标绘制抑制率曲线，其中IC=OD样品/OD对照。

9、免疫亲和柱的制备

（1）抗体与凝胶偶联：用HCl（1 mmol/L，pH 3.0）充分溶胀1.0 g凝胶CNBr-Activated SepHarose 4B，然后将活化好的凝胶加入经偶联缓冲液（0.2 mol/L NaHCO₃，含0.5 mol/L NaCl，pH 8.4）透析过夜的pena1多克隆抗体中，4℃震荡过夜。Bradford法测定偶联前后溶液中抗体的变化量，评定免疫亲和柱的偶联率，其中偶联率=（偶联前抗体的总量-偶联后抗体总量）×100%/偶联前抗体的总量。

（2）凝胶封闭：用偶联缓冲液洗掉未偶联的抗体后，将偶联抗体的凝胶转移至封闭液（0.2 mol/L 甘氨酸，pH 8.0）4℃震荡过夜，封闭任何活化的基团。

（3）偶联介质平衡：先后用0.1 mol/L的乙酸/乙酸纳（含0.5 mol/L NaCl，pH4.0）、0.1 mol/L的Tris-HCl（含0.5 mol/L NaCl，pH 8.0）交替洗涤三次，后用PBS（0.01mol/L，pH 7.4）洗涤两次。

（4）亲和柱装填：将偶联好的介质装填得到层析柱中（1×5 cm），其柱床体积为2.5mL。

10、免疫亲和柱效能的测定

（1）免疫亲和柱洗脱液的纯化效果鉴定

将虾蛋白抽提液用0.1 mol/L Tris缓冲液稀释，过0.45μm微孔滤膜后上样。常温孵育30 min后，用足量的0.1 mol/L Tris缓冲液做冲洗柱子，直到收集液中A280接近0时，换用0.1 mol/L glycine（pH 2.4）盐溶液做洗脱液洗柱，待检测洗脱液A280接近0时停止洗脱，另外，洗脱前，在收集的试管中每管加100 μL 0.5 mol/L K₂HPO₄溶液以中和洗脱液的pH至中性，防止洗脱下的蛋白变性失活。免疫亲和柱洗脱结束后及时用PBS（0.01 mol/L，pH7.4）平衡供重复使用。SDS-PAGE和Western Blot对洗脱峰进行纯度及活性鉴定。

（2）免疫亲和柱容量的确定

分别配制浓度为2、4、6、8、10、12 mg/mL的Pena1溶液，直接过亲和柱，经ic-ELISA检测Pen a 1的吸附量随添加量的变化情况，确定亲和柱的吸附容量。

（3）免疫亲和柱的回收率和重复使用性测定

采用样品添加回收测定免疫亲和柱的回收率：将不含虾肉原料的猫粮碾碎，称1 g于烧杯中，添加的虾蛋白Pena1，加入0.01 mol/L，pH 7.4的PBS，搅拌浸提，然后将提取液9000 r/min离心20 min，取上清液过免疫亲和柱，间接竞争ELISA法测定回收率。免疫亲和柱稳定性检测：通过对同一根亲和柱重复上样、洗脱、再生循环操作，检测亲和柱的吸附量、回收量与上样量间的关系，考量亲和柱的稳定性，操作中每次样品上样1 mL，浓度为1 μg/mL。

三、结果分析

1、虾致敏蛋白Pena1纯化效果鉴定

1.1 虾致敏蛋白的(NH₄)₂SO₄及pI沉淀效果

蛋白质在较高浓度的中性盐溶液中会沉淀析出，此过程成为盐析，由于盐析过程通常不会导致蛋白变性，是活性蛋白粗提常用的主要方法之一。蛋白质盐析中最常用的盐是(NH₄)₂SO₄，不同分子量的蛋白质沉淀所需的盐离子浓度不同，因此实验中为充分分离36kD的目标蛋白，分别设置了不同饱和度的(NH₄)₂SO₄浓度。同时，由于不同的蛋白质所含氨基酸数目和种类的不同，因而其所含有的带点基团的种类及数目不同，因此其等电点也不同。研究表明36 kD的Pen a 1的pI为4.6。综上，本发明采用(NH₄)₂SO₄分级沉淀结合pI沉淀初步分离纯化目标蛋白，SDS-PAGE结果如图1。由图可知，3号电泳条带系先经过30%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀后又经pI沉淀后的蛋白样液，36 kD的蛋白含量较高，且杂蛋白相对最少，因此确定饱和度为30%的(NH₄)₂SO₄，及pI沉淀是优选的蛋白初级分离条件。

1.2 DEAE52阴离子交换层析效果鉴定

由于不同蛋白质所带电荷的种类及数量不同，因此不同蛋白质与带电的凝胶颗粒的电荷作用不同。这样当混合蛋白流经带点凝胶时，即可实现分离的效果。同时由于目的蛋白Pen a 1所带负电荷较多，试验中采用DEAE(二乙基氨基乙基)作为层析介质的阴离子交换层析。利用氯离子作为平衡离子。分别用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mol/L NaCl梯度洗脱，每种洗脱液收集12 mL，分成3管进行收集，结果见图2。由图2可知，共出现3个洗脱峰，收集洗脱峰进行SDS-PAGE分析，结果见图3。结果显示，峰P1为未结合在离子交换介质的蛋白组分，峰P2所含极微量的蛋白，SDS-PAGE无法识别，峰P3主要为目标蛋白所在峰，该峰含有三条电泳条，其分子量分别约为20 kD、36 kD、100 kD，其中36 kD条带为目的蛋白条带，该峰对应的NaCl洗脱梯度为0.35 mol/L。

1.3 虾致敏蛋白的Sephadex G-100 凝胶层析结果

凝胶层析又称分子筛层析，交联葡聚糖（Sephadex G）是最常用的多孔凝胶，由于其具有多孔性质，当蛋白溶液流经此凝胶时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻力作用不同而先后流出，从而实现分离纯化的目的。根据目标蛋白的分子量选择分离分子质量范围为4-150 kD的Sephadex G-100凝胶。将经阴离子交换层析的样品浓缩后上样4 mL，经洗脱液洗脱后，结果如图4。由图可知，洗脱过程出现两个洗脱峰P1、P2，根据蛋白分子量大小及出峰顺序，判断洗脱峰P1为目标蛋白峰，收集该峰做SDS-PAGE分析，结果见图5。由SDS-PAGE结果分析，样品经阴离子交换进一步经凝胶层析后，在36 kD附近只有一条蛋白条带，且该条带清晰，这说明经过两步层析后，36 kD的目标蛋白纯度较高。

1.4纯化后的Pena1活性鉴定

对经凝胶层析纯化后的36 kD的目标蛋白用虾过敏患者的血清进行免疫印迹分析，结果如图6。在分子量为36 kD附近显示出了清晰的印迹条带，说明经多步分离纯化的Pena1蛋白活性保持良好。

2、间接竞争ELISA检测方法的建立

用ic-ELISA制作标准曲线，将纯化的Pen a 1蛋白按100、10、1、1×10^-1、1×10^-2和1×10^-3µg/ mL进行梯度稀释，结果如图7所示，线性方程为：y=0.62085+0.16006x (R2=0.9841)，Pena1蛋白浓度在10^-2-10 μg/mL之间与抑制率呈现良好的线性关系。

2.1抗体与凝胶介质的偶联率的测定

Bradford法测定蛋白含量，以蛋白浓度mg/mL为横坐标，以吸光度值A595为纵坐标，绘制牛血清白蛋白标准曲线：y=3.455x+0.0157(R2=0.9972)。测定偶联前后溶液中抗体的变化量，见表2。计算偶联率=（偶联前抗体的总量-偶联后抗体总量）×100%/偶联前抗体的总量。由标准曲线及表中数据进行计算，得出抗体与凝胶介质的偶联率为90.76%，偶联效果较好。

表2 抗体与凝胶介质的偶联率

	A595	液体总量/ mL	蛋白总量/mg
				偶联前（Un-coupled）	1.9634	15.0	16.92
偶联后（Coupled）	0.1794	16.5	1.564

3免疫亲和柱效能的测定

3.1免疫亲洗脱液的纯化效果鉴定

制备好的免疫亲和柱，采用0.1 mol/L Tris为上样缓冲液有利于减少抗体与蛋白间非特异性吸附，上样后常温孵育30 min是为了使目的蛋白与抗体充分结合，形成紧密的结合物，再用足量的0.1 mol/L Tris缓冲液冲洗柱子可以洗去吸附于介质内部及柱空隙中残留的杂质，适当的清洗可以提高回收产物的纯度，但也应注意不可过度清洗，否则会造成目标产物的损失增多。选用免疫亲和柱常用的洗脱剂0.1 mol/L glycine（pH 2.4）做该柱的洗脱剂，洗脱效果见图8。由洗脱峰型可知，在5 mL附近目的蛋白被洗脱下来，洗脱峰较典型，说明洗脱液在洗脱结合在免疫亲和柱上的蛋白时洗脱的较为彻底，杂峰极少，也证明在免疫亲和柱的特异性较好。

对于致敏蛋白的纯化，纯度和活性是要同时考虑的。因此，采用SDS-PAGE和Western Blot对洗脱峰进行鉴定。由图9、图10可知，洗脱峰中36 kD的目标蛋白Pena1纯度比较理想，免疫印迹图证明纯化后的Pen a 1保持了其免疫活性。

3.2免疫亲和柱容量的确定

亲和柱中偶联在凝胶介质上的抗体量是固定的，因此亲和柱可吸附抗原的最大量也是固定的，在抗体吸附量尚未达到饱和时，柱子吸附抗原的量与添加抗原量的呈正相关，继续添加抗原的量，超出柱子的最大吸附量时，就会造成分离的目标物无法被彻底分离出来。由图11可得出亲和柱的吸附量随添加量的情况，每毫升凝胶介质的最大吸附容量约为2.84 mg，当Pena1量超过亲和柱的最大载荷时，亲和柱的吸附容量保持不变，因此在实际应用时要根据样品中Pena1大致水平，对样品进行适当稀释，以达到充分分离的作用。

3.3免疫亲和柱的回收率及重复使用性测定

对亲和柱进行添加回收试验，将高中低三个梯度即1000 ng、500 ng、100 ng纯化后的Pena1分别添加到1g样品中，每个梯度三个重复，将样品浸提液过柱，间接竞争ELISA法测定回收率，结果见表3。可见免疫亲和柱的回收率在89.6%-93.6%之间，符合技术要求。

表3加标回收率和变异系数测定

亲和柱的重复使用性是衡量亲和柱使用寿命及稳定性的重要指标。试验对亲和柱的重复使用性进行了测定，结果见表4。该柱重复使用8次柱容量下降36%左右，至第5次使用后其回收率已经下降到72.7%，回收率已经不能达到实验要求，说明该试验所制备的亲和柱可以重复使用4次，要想延长其使用寿命还需进一步探索优化。

表4 免疫亲和柱的重复使用性测定

上样次数(Sample number)	1	2	3	4	5	6	7	8
									柱容量(column capacity)/ng	1000.0	968.5	933.2	896.3	832.2	799.1	721.8	638.5.
回收率(Recovery rate) /%	92.2	90.0	88.6	80.5	72.7	63.6	56.2	49.4

四、小结

1. 依次采用了饱和度为30%的硫酸铵沉淀、pH 4.6的等电点沉淀、DEAE阴离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析的方法，从虾肉中分离得到了36 kD的目标蛋白Pena 1，且其免疫活性良好。

2. 将纯化后的抗体与CNBr-Activated Sepharose 4B凝胶介质偶联制备了免疫亲和柱。该亲和柱每毫升偶联介质可吸附2.84 mg Pen a 1蛋白，亲和柱的加标回收率为89.6%-93.6%，符合技术要求，该亲和柱可重复使用4次。

本发明首次采用致敏蛋白的表位抗体制备免疫亲和柱来纯化致敏蛋白，该方法对于表位序列已知的致敏蛋白的纯化快速简便，且可很好的保持致敏蛋白的免疫活性，对于致敏蛋白的纯化具有重要的借鉴意义。

Claims (1)

1.一种虾致敏蛋白pena1提取纯化方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）制备虾肉丙酮粉

将去头去壳去肠线的虾肉于匀浆机中匀浆，加生理盐水悬浮，再向悬浮液中加入4倍体积的冷丙酮，充分混匀，0℃不断搅拌30 min后8000 r/min离心15 min，回收沉淀物，重新用冷丙酮悬浮并混匀，重复上述搅拌、离心和回收沉淀物的过程，将沉淀物转移至干净滤纸上，于通风橱中分散，干燥后得虾肉丙酮粉；

2）抽提虾过敏蛋白

取步骤1）得到的虾肉丙酮粉按1:10比例加入抽提液，所述的抽提液为1 mol/L KCl，其中含5 mmol/L 二硫苏糖醇，pH7.4，4℃低温搅拌过夜，4℃，8000 r/min离心15 min后，收集上清液，得到虾蛋白粗提液；

3）硫酸铵分级沉淀

将步骤2）抽提得到的虾蛋白粗提液调pH 至7.4，缓慢加入硫酸铵至饱和度30%，4℃低温下缓慢搅拌1.5 h，静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30 min后，收集沉淀，得到虾蛋白；

4）等电点沉淀

将硫酸铵分级沉淀得到的虾蛋白用1×PBS充分溶解，逐滴加入50%v/v硫酸溶液，直到pH 至4.6，4℃低温下缓慢搅拌1 h，静置4 h，充分沉淀后于4℃，9000 r/min离心30 min后，收集沉淀，得到等电点沉淀后的虾蛋白，将等电点沉淀后的虾蛋白再用1×PBS充分溶解后，透析，冷冻干燥后得蛋白冻干粉；

5）DEAE52阴离子交换层析

用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl充分平衡柱子，将步骤4）得到的蛋白冻干粉用20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl配制成5mg/ mL溶液，充分溶解后离心，取上清上样，上样后换用NaCl浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mol/L梯度洗脱，洗脱流速设为1 mL/min，自动收集器收集洗脱液，监测A280值，收集洗脱峰做SDS-PAGE，鉴定分离纯化效果；

6）Sephadex G-100 凝胶层析

先后用1×PBS及含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS平衡柱子，平横流速设为1 mL/min，将经步骤5）纯化获得的含目标蛋白的峰浓缩后，上样，用含有0.5 mol/L NaCl的1×PBS的缓冲液洗脱，洗脱流速设为0.9 mL/min，自动收集器收集洗脱液，2 min/管，监测A280值，直到A280值接近0时，停止收集，收集洗脱峰做SDS-PAGE，得到目的蛋白的洗脱管；

7）免疫亲和层析

pena1多克隆抗体装柱制作免疫亲和柱层析柱，将目的蛋白用0.1 mol/L Tris缓冲液稀释，过0.45m微孔滤膜后上样，常温孵育30 min后，用足量的0.1 mol/L Tris缓冲液做冲洗柱子，直到收集液中A280接近0时，换用pH 2.4、0.1 mol/L glycine盐溶液做洗脱液洗柱，待检测洗脱液A280接近0时停止洗脱，收集洗脱液得到虾致敏蛋白pena1。