CN103749306B

CN103749306B - 一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法

Info

Publication number: CN103749306B
Application number: CN201410031189.0A
Authority: CN
Inventors: 慕徳宇; 房用; 慕宗昭; 梁玉; 王月海; 王强
Original assignee: Northwest A&F University; Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Northwest A&F University; Shandong Academy of Forestry
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: CN103749306A

Abstract

本发明公开了一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法。它包括白榆无性系外植体的采集、消毒、接种和继代培养，接种和继代培养的条件是：在本发明研发的EM培养基中进行，培养温度为白天（或光照条件下）25℃±2℃，夜间（或黑暗条件下）18℃±2℃，光照时间为每天12小时，湿度90%以上。采用本发明的培养基和方法，白榆无菌苗平均高增殖率提高5倍以上，平均增殖系数提高2.3倍以上。

Description

一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种白榆离体繁殖方法，特别涉及一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法。

背景技术

白榆（Ulmus pumila L.），为榆科（Ulmaceae）榆属（Ulmus）植物，变种较多，并且榆树历来是我国北方城市五大乡土园林树种[杨树（Populus）、柳树（Salix）、榆树（Ulmus）、槐树（Sophora）、臭椿（Ailanthus）]之一，也是世界四大行道绿化树种之一，有着较为广泛的应用领域。

白榆为我国栽培历史悠久的乡土树种，因其具有抗干旱、耐高温、耐严寒、速生性、材质好、耐瘠薄、抗盐碱等特点，多用于盐碱地与干旱瘠薄地区造林。白榆木性坚韧，纹理通达清晰，硬度与强度适中，可供家具、装修等用。白榆树皮、叶片、果实均可食用，是良好的药材。

由于人口的急剧增加、工业化的高速发展，加以不合理灌溉、耕作方式的应用，使得大面积良田逐渐退化为弃耕的次生盐渍化土地，造成了严重的生态环境恶化，极大地限制了盐碱地城区绿化的发展。白榆作为我国主要的园林乡土观赏树种之一，对烟尘、二氧化硫和氟化氢等有毒气体抗性强，并且具有极高的环境适应性、抗污染、抗病虫、宜繁殖和较强的耐盐碱特性，使得白榆极有希望成为盐碱地区园林绿化骨干树种。

木本植物在植物组织培养生产中的成功经验与案例相对草本植物较为罕见，适宜不同木本植物生长的基础培养基的匮乏导致木本植物难以大规模生产。另外，白榆无性繁殖主要靠嫁接，繁殖速度慢，严重制约白榆的发展。因此，针对白榆的极大开发价值，亟待开发一种针对白榆生长基础培养基。

目前白榆培养及繁殖中，可以使用的基本培养基有MS（孙震、王静华，侯建生，刘桂林等人对白榆组培苗增殖继代的研究所使用的基本培养基）、DKW（木本松属植物生产用基本培养基）、WPM（M.P.Corchete,J.J.Diez,and T.Valle.等人对白榆组培苗增殖继代的研究所使用的基本培养基）。上述培养基的增值率低，造成耐盐碱速生白榆工厂化生产的高成本及资源浪费。

发明内容

本发明的目的在于为木本植物白榆提供一个适宜工厂化生产的离体快速繁殖方法。采用该离体快速繁殖方法解决了白榆工厂化生产的需要，且白榆长势旺盛，后代性状稳定，降低生产成本，提高经济效益。

本发明的技术方案是：一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法，其特征是，

（1）外植体的采集：耐盐碱速生白榆外植体采集时间最佳为春季（外植体刚刚萌芽季节），晴天上午进行；选取幼嫩组织或器官；用湿纱布裹住，置于低温保鲜盒内，带回实验室；

（2）外植体消毒：首先对白榆无性系外植体进行修剪，保留芽与生长点；在不伤及外植体的条件下用软毛刷刷洗表面；用浓度小于1%的低浓度洗衣粉（或餐洗净）水冲洗2-3次（除去外植体表面的泥土、浮沉等），再用流动的自来水冲洗20-40分钟；并转移至超净工作台，用75%酒精浸泡20-40秒，无菌水冲洗3-4次，然后再用0.02-0.1%升汞浸泡5-10分，用无菌水冲洗4-5次；

（3）外植体接种：将带有生长点或芽的外植体切下1-2cm一段，置于EM培养基中培养；培养温度为白天（或光照条件下）25℃±2℃，夜间（或黑暗条件下）18℃±2℃光照时间为每天12小时，湿度90%以上；一段时间后（1至2周）生长点或芽萌发，形成叶片组织，且培养基中没有细菌、真菌等出现，即无菌苗的获得；

（4）继代培养：将获得的无菌苗按照生产目的切分为单芽、茎段或者丛生芽备用（1-2cm每段）；然后在EM培养基中继代培养，培养温度为白天（或光照条件下）25℃±2℃，夜间（或黑暗条件下）18℃±2℃光照时间为每天12小时，湿度90%以上，继代培养周期根据瓶内EM培养基量分为3至4周，按切苗标准，平均扩繁系数可达6倍以上。

其中，EM培养基，包括以下含量的各种组分：CaCl₂·2H₂O441mg/L，NH₄NO₃1600mg/L，KNO₃2022mg/L，NaCl907mg/L，MgSO₄3361mg/L，NaH₂PO₄·2H₂O312mg/L，K₂SO₄350mg/L，Na₂SO₄300mg/L，CaCl₂230mg/L，CoCl₂·6H₂O0.24mg/L，CuSO₄·5H₂O0.375mg/L，H₃BO₃9.3mg/L，MnSO₄·H₂O16.9mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L，ZnSO₄·7H₂O11.5mg/L，KI0.83mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L，Na₂EDTA·2H₂O37.25mg/L，肌醇108mg/L，甘氨酸3.75mg/L，烟酸5mg/L，V6（盐酸吡哆醇）1.2mg/L，V1（盐酸硫铵素）13.5mg/L，生物素0.2mg/L，叶酸0.88mg/L，维生素C1.76mg/L，核黄素1.9mg/L。

进一步地，上述EM培养基还包括下述组分：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.2mg/L。

进一步地，上述M培养基还包括辅料为：琼脂7g/L，糖30g/L。

本发明的有益效果是：与现有方法相比，采用EM培养基，在相同激素条件下（甚至于较高浓度激素相比），白榆无菌苗平均高增殖率提高5倍以上，平均增殖系数提高2.3倍以上。经实践证明，采用该快速繁殖方法解决了白榆工厂化生产的需要，且长势旺盛，后代性状稳定，降低生产成本，提高经济效益。

附图说明

图1为4个白榆无性系在5种培养基中的芽团分化率对比图；从图1可以看出，4个白榆无性系在A2（EM）培养基中的芽团分化率明显高于A1、A3、A4、A5培养基中的芽团分化率；

图2为4个白榆无性系在5种培养基中的单株净高生长率对比图；从图2可以看出，4个白榆无性系在A2培养基中的单株净高生长率明显高于A1、A3、A4、A5培养基中的高生长率；

图3为286号白榆在A1-A5五种培养基中生长量对比；

图4为65225号白榆在在A1-A5五种培养基中生长量对比。

具体实施方式

为了充分表现本项发明的创新性、实用性、高效性等特点，下面进一步详细阐述本发明。实施例1

（1）白榆无性系外植体的采集：耐盐碱速生白榆外植体采集时间为春季（外植体刚刚萌芽季节）晴天上午进行；选取幼嫩组织或器官；用湿纱布裹住，置于低温保鲜盒内，带回实验室；

（2）外植体消毒：首先对白榆无性系外植体进行修剪，保留芽与生长点；在不伤及外植体的条件下用软毛刷刷洗表面；用浓度小于1%的低浓度洗衣粉水冲洗2-3次（除去外植体表面的泥土、浮沉等），再用流动的自来水冲洗30分钟；并转移至超净工作台，用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3-4次，然后再用0.1%升汞浸泡10分钟，用无菌水冲洗4-5次；

（3）外植体接种：将带有生长点或芽的外植体切下1-2cm一段，置于EM基本培养基中培养；培养温度为白天（或光照条件下）25℃±2℃，夜间（或黑暗条件下）18℃±2℃；光照时间为每天12小时，湿度90%以上；一段时间后（1至2周）生长点或芽萌发，形成叶片组织，且培养基中没有细菌、真菌等出现，即无菌苗的获得；

（4）预处理：选择生长周期、培养条件、健康程度一致的白榆无菌苗，并将白榆无菌苗切分为大小相同单芽、丛生芽多个备用。

生长环境为：温度白天25℃（±2℃）/夜间18℃（±2℃），12小时光照时间，每天的无菌环境下继代增殖培养21d-28d。

本发明所需继代增殖激素主要包括低浓度6-BA，以保证白榆无菌苗的正常生长，以及琼脂7g/L，白糖(S)30g/L为辅料。

为了对比现有白榆生产培养基和本发明的差别，本发明选取ms+BA0.2+S3%（A1）、EM+6-BA0.2+S3%（A2）、dkw+6-BA0.2+S3%（A3）、wpm+6-BA0.5+S3%（A4）、wpm+6-BA0.2+S3%（A5），5种基本培养基并加不同激素进行比较分析，最终确定最佳培养基，即EM培养基（具体成分见发明内容部分）。

实验处理结果：

①不同培养基芽团分化率的对比结果

由4个白榆无性系在5个不同类型扩繁培养基上的对比试验，得出白榆无性系芽团扩繁增值试验数据的平均值，见表1。

表1 4个白榆无性系在5种培养基中的芽团分化率

根据表3中4个白榆无性系在5个不同类型扩繁培养基上的生长量情况统计值，使用sigmaplot软件作图，绘制4个白榆无性系进行同无性系芽团分化率柱状图进行比较与分析，详见附图1。从图表1和图1可以看出，4个白榆无性系在A2（EM）培养基中的芽团分化率明显高于A1、A3、A4、A5培养基中的芽团分化率。

②不同培养基单株净高生长率的对比

由4个白榆无性系在5个不同类型扩繁培养基上的对比试验，得出白榆无性系单株净高生长率试验数据的平均值，见表2。

表2 4个白榆无性系在5种培养基中的单株净高生长率

根据表2中4个白榆无性系在5个不同类型扩繁培养基上的生长量情况统计值，使用sigmaplot软件作图，绘制4个白榆无性系进行同无性系单株净高生长率柱状图进行比较与分析，详见附图2。

从表2和图2可以看出，4个白榆无性系在A2培养基中的单株净高生长率明显高于A1、A3、A4、A5培养基中的高生长率。

本发明试验生长情况对比结果详见附图3-图4。从图3-图4可以看出：286号和65225号白榆在A2培养基中的长势良好。

在上述白榆基本培养基中，使用EM培养基继代后的白榆无菌苗生长量均大于其他对比组，且长势良好，经过多代培养增值系数较为稳定，此配方不仅保持了耐盐白榆的优良特性，而且在保证耐盐速生白榆生产数量与质量的前提下降低了生产成本，在规模化生产中，带来了更高的经济效益。

通过上述两个试验结果的分析与处理，可以明显看出，在相同激素浓度条件下白榆基本培养基较其他类型培养基在无菌苗平均高增殖率提高5倍以上，平均增殖系数提高2.3倍以上。而在生产过程中，在一定范围内随着激素的增加，繁殖系数会有明显提高。本实验培养基以低浓度激素为例，对比不同基本培养基对耐盐碱速生白榆生长与繁殖系数的影响，在较高浓度生长激素处理下平均繁殖系数可达6倍以上，且无菌苗生长旺盛。因此，以EM培养基为基础的培养基最适宜耐盐碱速生白榆无菌苗生长。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法，其特征是，

（1）白榆无性系外植体的采集：选取耐盐碱速生白榆的幼嫩组织或器官，低温保鲜状态下带回实验室；

（2）外植体消毒：对白榆无性系外植体进行修剪，保留芽与生长点；然后进行清洗和消毒；

（3）外植体接种：将带有生长点或芽的白榆无性系外植体切下1-2cm一段，置于EM培养基中培养；培养温度为白天或光照条件下25℃±2℃，夜间或黑暗条件下18℃±2℃；光照时间为每天12小时；湿度为90%以上；1-2周后生长点或芽萌发，形成叶片组织，获得无菌苗；

（4）继代培养：将获得的无菌苗切分为单芽、茎段或者丛生芽备用；然后在EM培养基中继代培养，培养温度为白天或光照条件下25℃±2℃，夜间或黑暗条件下18℃±2℃；光照时间为每天12小时；湿度为90%以上，继代培养周期为3-4周；

所述EM培养基由以下含量的组分组成：CaCl₂·2H₂O 441mg/L， NH₄NO₃ 1600 mg/L，KNO₃ 2022 mg/L，NaCl 907 mg/L，MgSO₄ 3361 mg/L，NaH₂PO₄·2H₂O 312 mg/L，K₂SO₄ 350 mg/L，Na₂SO₄ 300 mg/L，CaCl₂ 230 mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.24 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.375 mg/L，H₃BO₃ 9.3 mg/L，MnSO₄·H₂O 16.9 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 11.5 mg/L，KI 0.83 mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，Na₂EDTA·2H₂O 37.25mg/L，肌醇 108 mg/L，甘氨酸3.75 mg/L，烟酸5 mg/L，VB₆1.2 mg/L，VB₁13.5 mg/L，生物素0.2 mg/L，叶酸 0.88 mg/L，维生素C 1.76 mg/L，核黄素1.9 mg/L，6-BA 0.2mg/L，琼脂7g/L，糖30g/L。

2.如权利要求1所述的一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法，其特征是，所述耐盐碱速生白榆无性系外植体采集时间为春季晴天上午进行。

3.如权利要求1所述的一种耐盐碱速生白榆离体快速繁殖方法，其特征是，所述步骤（2）外植体消毒具体为：在不伤及外植体的条件下用软毛刷刷洗表面；用浓度小于1%的低浓度洗衣粉水冲洗2-3次，再用流动的自来水冲洗20-40分钟；并转移至超净工作台，用75%酒精浸泡20-40秒，无菌水冲洗3-4次，然后再用0.02-0.1%升汞浸泡5-10分，用无菌水冲洗4-5次。