CN103749154A - 一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质及其使用方法，所述培养基质包括泥炭土和珍珠岩，所述泥炭土与珍珠岩的体积比为2:1~3:1。本发明所述培养基质能够为种子发芽和幼苗的根系生长提供充足的营养，疏松、透气性和保水性好有利于根系的发育，从而促进块菌菌根苗交叉感染效果，且原料易得，制备方法简单；通过采用与本发明所述培养基质配套使用的块菌菌根苗交叉感染方法，可大量节约菌种量，并促进块菌菌根苗感染的效果，比现有的接种方式大大缩短感染所需时间。

Description

一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质及其使用方法

技术领域

本发明属于块菌的培育种植领域，涉及一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质及其使用方法。

技术背景

商业块菌（truffle）作为世界顶级食材，在欧洲备受推崇。上世纪60年代开始，法国国家农业研究所 Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) ，与意大利的科学家联合开展了块菌栽培研究工作，以拯救欧洲的块菌产业。两国科学家在做了大量卓有成效的研究工作之后，获得了突破性的进展，成功培育出了块菌的菌根苗，并且掌握了大量扩繁高品质块菌菌根苗的技术。直到1975年，意大利科学家，在世界上首次采用温室培育块菌菌根苗营造的块菌人工林，产生了黑孢块菌。这个结果无论在块菌产业上，甚至在整个菌物学，菌根真菌栽培研究上，都是十分重大的进展，同时也标志着人工的方式，将可能使块菌产业化。1979年，同样的结果在法国也被完成。之后，法国科学家和意大利科学家发育了，用（Tuber melanosporum）子囊孢子接种橡树和榛子的技术，开始了块菌产业化的进程。国内90年代开始块菌栽培技术的研究，目前已有零星报道，从宿主植物的筛选，菌根苗接种技术，到检测技术已经在很多科研单位实现，为块菌产业化奠定了坚实的基础。但是常规的接种技术都是用孢子粉对单颗无菌苗接种，耗用菌种量较大，对于珍稀的块菌种子，特别是欧洲块菌，价格就过于昂贵。交叉感染技术可以有效节约菌种，但目前将交叉感染技术用于培育块菌菌根苗的研究还比较少，目前还未有专门用于块菌菌根苗交叉感染的培养基质，交叉感染的效果也还有待提高。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质，包括泥炭土和珍珠岩，所述泥炭土与珍珠岩的体积比为2:1~3:1。该培养基质通过泥炭土与珍珠岩的合理配比，利用泥炭土中丰富的腐殖质可以为块菌和树苗的生长尤其是树根的发育提供大量的营养，同时泥炭土具有疏松、透气的特点，有利于须根的生长，从而有利于树苗之间的交叉感染，提高感染率并缩短感染时间；添加适量的珍珠岩还可以进一步提高培养基质的疏松、透气性，并能够提高培养基质的保水性。

作为可选方式，所述培养基质中泥炭土与珍珠岩的体积比为7:3。

作为可选方式，所述培养基质中还含有生根粉，所述生根粉的质量占培养基质总质量的0.01%~0.1%。通过添加适量的生根粉，可以进一步促进宿主植株根系的发展，提高交叉感染效果。

作为可选方式，所述培养基质中还含有保水剂，所述保水剂的干重占培养基质总质量的5%~10%。通过添加保水剂可进一步提升培养基质的保水性，使培养基质具有更好的吸收存储并缓慢释放水分的功能。

作为可选方式，所述培养基质的制备方法为：按照配比将原料混合均匀，在126℃下灭菌3个小时，自然冷却，在无菌环境中放置一周后待用。

本发明还提供了上述培养基质的使用方法，即将其用于块菌菌根苗的交叉感染接种，具体步骤包括：

1）宿主植物种子的收集与处理：收集并挑选优质的宿主植物种子进行清洗和灭菌处理；

2）块菌菌种的收集与处理：收集成熟的块菌子实体，清洗灭菌后，加水粉碎成孢子悬浮液；

3）培养基质的灭菌处理；

4）播种及接种：将经步骤1）处理后的宿主植物种子和经步骤2）处理后的块菌菌种混合播种到灭菌处理后的培养基质中，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养，温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次；

5）菌根苗的培育：培养2~4个月后取出部分树苗进行移栽，将其余的树苗保留在培养基质中，并重新播入经步骤1）处理后的宿主植物种子，继续培养2~4个月后，重复上述移栽和播种操作。

在上述方法中，通过保留部分树苗，然后播入新的宿主植物种子，可以使保留的菌根苗交叉感染新生的树苗，从而大量节约菌种，上述步骤5）可以循环操作从而持续培养菌根苗；而采用本发明所述的培养基质可以有效提高感染效果，并保证营养供应。

作为可选方式，在上述方法中，所述步骤4）和5）中还可以在播种培养2个月后，采用尿素质量百分含量为0.1%的尿素稀溶液浇灌一次。通过施加少量尿素可以促进树苗根系的发展，有利于提高感染率。

作为可选方式，在上述方法中，所述取出移栽部分的树苗占树苗总数的一半，所述移出的树苗与保留的树苗相间隔。间隔取苗有利于交叉感染的进行，保留一半的树苗也更有利于交叉感染，且有利于持续产出菌根苗。

作为可选方式，在上述方法中，在所述步骤2）中将所述孢子悬浮液与发好水的保水剂混合然后不断添加无菌水，直到保水剂达到饱和的吸水能力，使孢子悬浮液将被均匀地吸附到保水剂表面。使块菌菌种被均匀地吸附到保水剂表面有利于菌种充分利用保水剂中的水分。作为进一步的可选方式，所述步骤4）具体为：在底部有孔的播种盆内铺垫5cm厚的灭菌培养基质，然后铺垫一层2-3cm厚的吸附了块菌孢子的保水剂，在保水剂上覆盖一层3cm厚的灭菌培养基质，然后播入处理好的宿主植物种子，最后在种子表面覆盖一层2cm厚的灭菌培养基质，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养。温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次。菌种与宿主种子分层布置，使菌种位于宿主种子的下层更有利于菌种感染宿主的根系，提高菌种的利用率。

作为可选方式，在上述方法中，所述步骤1）中的宿主植物种子包括榛子种子和松树种子，榛子种子和松树种子的数量比例为1:400~1:600；所述步骤5）中取出移栽部分的树苗均为松树苗，榛子树苗全部保留，重新播入的宿主植物种子均为松树种子。榛子树苗根系发达，根系生长快，且易存活，在播种并保留少量榛子树苗，作为接种源更有利于交叉感染。

作为可选方式，在上述方法中，所述步骤1）中宿主植物种子的收集与处理方法具体为：收集良种的松树种子，以及当年优质的榛子种子，松树种子用水除去空壳后晾干，装在玻璃罐中常温储藏备用；榛子种子用水除去不饱满和霉烂的种子后，装于瓶中3-8℃低温冷藏；将两种种子用0.1%的高锰酸钾液浸泡处理30min后，用自来水冲洗去表面残留的高锰酸钾溶液，然后再用清水浸泡1-3天，再对榛子种子脱壳并在50ppm的赤霉酸（GA）溶液中再浸泡20小时。

作为可选方式，在上述方法中，所述步骤2）中的块菌菌种的收集与处理方法具体为：在块菌成熟的季节收集成熟、直径在3-5cm、无损伤、香味相对较浓的欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌子实体，洗干净，晾干后，在75%的酒精内浸泡3min，然后在酒精灯上漂烧灭菌，保存于3-5℃的温度下备用；将块菌用打浆机添加无菌水均匀打浆，制成块菌孢子悬浮液。

作为可选方式，本发明所述块菌为中华块菌、印度块菌、欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌中的任意一种。

作为可选方式，所述宿主植株为云南松，华山松，滇榛或栎类等常见的块菌宿主植株中的至少一种。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

本发明所述培养基质能够为种子发育和幼苗及根系生长提供充足的营养，疏松、透气性和保水性好有利于根系的发展，从而促进块菌菌根苗交叉感染效果，大大缩短感染所需时间，且原料易得，制备方法简单。

本发明所述培养基质的使用方法，可有效节约菌种，并促进块菌菌根苗交叉感染的效果。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用的泥炭土、珍珠岩、保水剂均为市售商品。以下实施例中所用的云南松，华山松，滇榛或栎树等宿主植株种子以及中华块菌和印度块菌菌种均采集自凉山州冕宁县和会东县，欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌来源于意大利都灵，还可选用采至攀枝花的攀枝花块菌菌种。本领域技术人员可灵活选用其他来源的原料。

实施例1 制备培养基质

分别按照泥炭土与珍珠岩的体积比为2:1、7:3和3:1的比例将两者均匀混合，得到三种培养基质分别编号为1号、2号、3号。

取上述培养基加入生根粉，混合均匀，控制生根粉的质量占培养基质总质量的0.1%~1%。制得一系列含生根粉的培养基质，取其中泥炭土与珍珠岩的体积比为7:3，生根粉的质量占培养基质总质量的百分比分别为0.01%、0.05%、0.1%的三种培养基质分别编号为4号、5号、6号。

取上述含生根粉和不含生根粉的两个系列的培养基质加入保水剂，混合均匀，控制保水剂的质量占培养基质总质量的5%~10%，得一系列含保水剂的培养基质，取其中泥炭土与珍珠岩的体积比为7:3，保水剂的质量占培养基质总质量的百分比分别为5%、7%、10%的三种培养基质分别编号为7号、8号、9号。

作为可选方式，可将上述培养基质在126℃下灭菌3个小时，自然冷却，在无菌环境中放置一周后待用。

实施例2：

将实施例1中所述培养用于块菌菌根苗的交叉感染接种，分别取1-9号培养基质作为9个实验组，并分别取河沙：蛭石：珍珠岩=1:1:1（体积比）的混合基质和纯泥炭土作为对照组1和对照组2，各组均按照以下具体步骤操作：

1）宿主植物种子的收集与处理：收集并挑选优质的宿主植物（本例中选择云南松）种子进行清洗和灭菌处理；

2）块菌菌种的收集与处理：收集成熟的块菌子实体，清洗灭菌后，加水粉碎成孢子悬浮液；

3）培养基质的灭菌处理：将上述培养基质在126℃下灭菌3个小时，自然冷却，在无菌环境中放置一周后待用，如果在制备时已做过灭菌处理，此处可不再进行灭菌处理；

4）播种及接种：将经步骤1）处理后的宿主植物种子和经步骤2）处理后的块菌菌种混合播种到灭菌处理后的培养基质中，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养，温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次；

5）菌根苗的培育：培养2~4个月（每个实验组和对照组均设3个平行试验，分别在培养2、3、4个月后取苗移栽）后取出部分树苗进行移栽，将其余的树苗保留在培养基质中，并重新播入经步骤1）处理后的宿主植物种子，继续培养2~4个月后，重复上述移栽和播种操作。

    对取出的树苗的根系进行观察，并统计感染率（被感染的树苗数量占被移出树苗数量的比例）。观察结果显示9个实验组中的树苗的根系均比两个对照组的根系发达，说明本发明所述的培养基有利于宿主植株根系的生长发育。9个实验组的树苗的根系发达程度由优到劣的顺序为：6号、5号、4号、9号、8号、7号、2号、3号、1号，对照组2中由于培养基质太紧实不利于根系的生长，树苗移出也比较困难。可见生根粉的加入有利于促进根系生长，保水剂的加入也能在一定程度上促进根系生长。对感染的菌根苗进行观察，肉眼可以看到须根膨大，二叉分枝或者丛状分枝，显微镜下可以看到感染的根部表面不规则的三角形或多角型网纹，实验组的菌根苗与两个对照组的菌根苗相比，菌株更为粗壮、健康。各组的感染率结果如表1所示。从表中可以看出感染率的变化趋势与树苗的根系发达程度的变化趋势基本一致，采用本发明所述的各种培养基质可使树苗在短期内迅速大面积感染，可大大缩短感染所需时间。各实验组经过几轮的反复移出和重新播种后感染率变化均不明显，可保持稳定的持续交叉感染。

                    表1 各培养基质对应的感染率

     在本实施例中还选取2号、6号和9号三个实验组考察了树苗的移出比例和移出方式对感染率的影响，分别设置了随机移取三分之一、随机移取三分之二和间隔取苗三种移出方式，结果显示：采用间隔取苗的方式，每次移出约一半的树苗，可使感染率提高2%~4%。

   实施例3：

   按照实施例2所述的操作步骤，在所述步骤2）中将所述孢子悬浮液与发好水的保水剂混合然后不断添加无菌水，直到保水剂达到饱和的吸水能力，使孢子悬浮液将被均匀地吸附到保水剂表面。选取6号培养基质步骤4）中将松树种和吸附了孢子悬浮液的保水剂混合播种于培养基质中，其余操作均与实施例2中相同。感染率统计结果显示：采用方式可以实施例2中6号培养基质各时间段对应的感染率的基础上提高2~3%。

在本实施例所述的方法中如果将步骤4）调整为：在底部有孔的播种盆内铺垫5cm厚的灭菌培养基质，然后铺垫一层2-3cm厚的吸附了块菌孢子的保水剂，在保水剂上覆盖一层3cm厚的灭菌培养基质，然后播入处理好的宿主植物种子(宿主植物种子均匀散满培养基质表面)，最后在种子表面覆盖一层2cm厚的灭菌培养基质，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养。温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次。感染率统计结果显示：通过分层播种还可以使感染率提高5~8%。

实施例4：

按照实施例2所述的操作步骤，采用6号培养基质，在所述步骤1）中，将滇榛种子和华山松种子作为宿主植物种子，控制榛子种子和松树种子的数量比例为1:400~1:600，以保证每个播种盆中能保持4~6株滇榛；在所述步骤5）中取出移栽部分的树苗均为华山松苗，滇榛树苗全部保留，重新播入的宿主植物种子均为华山松种子。感染率统计结果显示：通过保留滇榛，利用滇榛庞大的根系，可以使感染率提高10~20%。

实施例5：

在上述实施例2-4中，在播种培养2个月后，采用尿素质量百分含量为0.1%的尿素稀溶液浇灌一次。感染率统计结果显示：通过施加尿素可以使感染率提高1~3%。

实施例6：

选取泥炭土与珍珠岩的体积比为7:3，生根粉的质量占培养基质总质量的百分比1%，保水剂的质量占培养基质总质量的百分比为5%的混合基质作为培养基质进行块菌菌根苗的交叉感染接种，具体步骤如下：

1）宿主植物种子的收集与处理：收集良种的松树种子，以及当年优质的榛子种子，松树种子用水除去空壳后晾干，装在玻璃罐中常温储藏备用；榛子种子用水除去不饱满和霉烂的种子后，装于瓶中3-8℃低温冷藏；将两种种子用0.1%的高锰酸钾液浸泡处理30min后，用自来水冲洗去表面残留的高锰酸钾溶液，然后再用清水浸泡1-3天，再对榛子种子脱壳并在50ppm的GA溶液中再浸泡20小时；

2）块菌菌种的收集与处理：在块菌成熟的季节收集成熟、直径在3-5cm、无损伤、香味相对较浓的欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌子实体，洗干净，晾干后，在75%的酒精内浸泡3min，然后在酒精灯上漂烧灭菌，保存于3-5℃的温度下备用；将块菌用打浆机添加无菌水均匀打浆，制成块菌孢子悬浮液，将所述孢子悬浮液与发好水的保水剂混合然后不断添加无菌水，直到保水剂达到饱和的吸水能力，使孢子悬浮液将被均匀地吸附到保水剂表面；

3）培养基质的灭菌处理：将上述培养基质在126℃下灭菌3个小时，自然冷却，在无菌环境中放置一周后待用，如果在制备时已做过灭菌处理，此处可不再进行灭菌处理；

4）播种及接种：在底部有孔的播种盆内铺垫5cm厚的灭菌培养基质，然后铺垫一层2-3cm厚的吸附了块菌孢子的保水剂，在保水剂上覆盖一层3cm厚的灭菌培养基质，然后播入处理好的松树种子和榛子种子(种子均匀散满培养基质表面)，控制榛子种子和松树种子的数量比例为1:400~1:600，以保证每个播种盆中能保持4~6株榛子树苗，最后在种子表面覆盖一层2cm厚的灭菌培养基质，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养。温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次；

5）菌根苗的培育：培养2个月后取出部分松树苗进行移栽，将其余的树苗保留在培养基质中（榛子树苗全部保留），并重新播入经步骤1）处理后的松树种子，继续培养2个月后，重复上述移栽和播种操作。

种子一般在播种后7天和10天内萌发，榛子萌发稍慢，甚至15天，20天陆续萌发。对感染的菌根苗进行观察，肉眼可以看到须根膨大，二叉分枝或者丛状分枝，显微镜下可以看到感染的根部表面不规则的三角形或多角型网纹。培养两个月后的感染率可达99%以上。采用200克的块菌，成功的交差感染出3500多株菌根苗，而现有的菌根苗培养技术中每株无菌苗需要的接种量3g，接种3500株需要10.5kg块菌种子，因此本方法可大量节省接种量。在本实施例中分别采用中华块菌、印度块菌、欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌作为菌种都取得了基本相同的结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进块菌菌根苗交叉感染的培养基质，其特征在于，所述培养基质包括泥炭土和珍珠岩，所述泥炭土与珍珠岩的体积比为2:1~3:1。

2.根据权利要求1所述的培养基质，其特征在于，所述泥炭土与珍珠岩的体积比为7:3。

3.根据权利要求1或2所述的培养基质，其特征在于，还含有生根粉，所述生根粉的质量占培养基质总质量的0.01%~0.1%。

4.根据权利要求1-3中任意一个所述的培养基质的使用方法，其特征在于，将其用于块菌菌根苗的交叉感染接种，具体步骤包括：

1）宿主植物种子的收集与处理：收集并挑选优质的宿主植物种子进行清洗和灭菌处理；

2）块菌菌种的收集与处理：收集成熟的块菌子实体，清洗灭菌后，加水粉碎成孢子悬浮液；

3）培养基质的灭菌处理，所述培养基质为权利要求1-3中任意一个所述的培养基质；

4）播种及接种：将经步骤1）处理后的宿主植物种子和经步骤2）处理后的块菌菌种混合播种到灭菌处理后的培养基质中，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养，温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次；

5）菌根苗的培育：培养2~4个月后取出部分树苗进行移栽，将其余的树苗保留在培养基质中，并重新播入经步骤1）处理后的宿主植物种子，继续培养2~4个月后，重复上述移栽和播种操作。

5.根据权利要求4所述的培养基质的使用方法，其特征在于，所述取出移栽部分的树苗占树苗总数的一半，所述移出的树苗与保留的树苗相间隔。

6.根据权利要求4所述的培养基质的使用方法，其特征在于，在所述步骤2）中将所述孢子悬浮液与发好水的保水剂混合然后不断添加无菌水，直到保水剂达到饱和的吸水能力，使孢子悬浮液将被均匀地吸附到保水剂表面。

7.根据权利要求6所述的培养基质的使用方法，其特征在于，所述步骤4）具体为：在底部有孔的播种盆内铺垫5cm厚的灭菌培养基质，然后铺垫一层2-3cm厚的吸附了块菌孢子的保水剂，在保水剂上覆盖一层3cm厚的灭菌培养基质，然后播入处理好的宿主植物种子，最后在种子表面覆盖一层2cm厚的灭菌培养基质，用无菌水一次灌透，放置无菌培养室培养，温度控制在25.1-28.5℃，每周浇水2-3次。

8.根据权利要求4所述的培养基质的使用方法，其特征在于，所述步骤1）中的宿主植物种子包括榛子种子和松树种子，榛子种子和松树种子的数量比例为1:400~1:600；所述步骤5）中取出移栽部分的树苗均为松树苗，榛子树苗全部保留，重新播入的宿主植物种子均为松树种子。

9.根据权利要求8所述的培养基质的使用方法，其特征在于，所述步骤1）中宿主植物种子的收集与处理方法具体为：收集良种的松树种子，以及当年优质的榛子种子，松树种子用水除去空壳后晾干，装在玻璃罐中常温储藏备用；榛子种子用水除去不饱满和霉烂的种子后，装于瓶中3-8℃低温冷藏；将两种种子用0.1%的高锰酸钾液浸泡处理30min后，用自来水冲洗去表面残留的高锰酸钾溶液，然后再用清水浸泡1-3天，再对榛子种子脱壳并在50ppm的赤霉酸（GA）溶液中再浸泡20小时。

10.根据权利要求4所述的培养基质的使用方法，其特征在于，所述步骤2）中的块菌菌种的收集与处理方法具体为：在块菌成熟的季节收集成熟、直径在3-5cm、无损伤、香味相对较浓的欧洲夏块菌和欧洲黑孢块菌子实体，洗干净，晾干后，在75%的酒精内浸泡3min，然后在酒精灯上漂烧灭菌，保存于3-5℃的温度下备用；将块菌用打浆机添加无菌水均匀打浆，制成块菌孢子悬浮液。