CN103732563A

CN103732563A - 18f-糖-叶酸类

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Publication number: CN103732563A
Application number: CN201280039178.6A
Authority: CN
Inventors: R·施布利; R·莫泽; C·M·穆勒; S·M·艾梅塔美; C·R·菲舍尔; V·格罗恩
Original assignee: Merck et Cie
Current assignee: Merck et Cie
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: IL230760A; ES2703107T3; AU2012298546A1; US10973936B2; DK2776382T3; PT2776382T; JP2014531411A; CN103732563B; JP6161209B2; AU2017203512A1; WO2013026842A1; SG10201606981QA; IL230760A0; US10322195B2; CA2839654A1; EP2776382A1; SG2014001085A; HK1194355A1; EA201400253A1; US20190255200A1

Abstract

本发明涉及新的¹⁸F-叶酸放射性药物，其中¹⁸F同位素经由辅基连接，更具体地经由具有糖基比如优选地基于吡喃糖苷或呋喃糖苷的环状单糖或寡糖的辅基连接，所述¹⁸F同位素共价连接至叶酸或其衍生物的谷氨酸部分，涉及其制备方法，以及其在诊断和监测癌症和炎症及自身免疫疾病及其治疗中的用途。

Description

18F-糖-叶酸类

技术领域

本发明涉及新的¹⁸F-叶酸(folate)放射性药物，其中¹⁸F同位素经由辅基连接，更具体地经由包括糖基（比如环状单糖或寡糖）的辅基连接，所述¹⁸F同位素共价连接至叶酸或其衍生物的谷氨酸（glutamate）部分，涉及其制备方法，以及其在诊断和监测癌症和炎症及自身免疫疾病及其治疗中的用途。

背景技术

用于递送效应子部分（比如诊断或治疗剂）的细胞特异性靶向是一个广泛研究的领域，并且已引起非侵入性诊断和/或治疗医学应用的发展。特别地，在核医学操作和治疗的领域中，其应用放射性物质发射电磁辐射（如γ-射线或光子或粒子发射辐射），需要这些放射性物质在靶向的细胞或组织中的选择性定位，以实现用于特异性组织的显像的高信号强度、评价疾病和/或监测治疗性治疗的作用，或者实现高辐射剂量，以用于给特定患病部位递送充足剂量的电离辐射，而在其它组织例如健康组织中无辐射损伤的风险。因此，重要关注的是确定和评价细胞特异性结构，并且特别是肿瘤(即癌症)或炎症和自身免疫性疾病中存在的结构，比如受体、抗原、半抗原等，它们可通过各自的生物学载体而特异性地被靶向。

叶酸受体(FR)已被确认为这些结构中的一种。FR是一种高度亲和性(K_D＜10^-9M)的膜相关蛋白。在正常组织和器官中，FR-表达高度局限于仅仅很少数器官(例如肾、肺、脉络丛和胎盘)，其中它大量地存在于上皮细胞的腔表面，并且因此不受循环中的叶酸(folate)供给。FR-α通常在多种特定细胞类型中过表达，比如上皮性肿瘤(例如卵巢、子宫颈、子宫内膜、乳房、结肠直肠、肾、肺、鼻咽)，而FR-β通常在白血病细胞中过表达(约70％的急性髓细胞性白血病(AML)为FR-β阳性)。因此，两者均可用作用于选择性肿瘤靶向的有价值的肿瘤标记物(Elnakat and Ratnam，Adv.Drug Deliv.Rev.2004；56：1067-84)。另外，已经在活化(而不是休眠的)巨噬细胞上发现了FR-β同工型。活化的巨噬细胞参与炎症病理学，比如例如类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎、肾小球肾炎、感染等。

文献报告了一些临床前研究，其涉及用于检测/定位炎症位点的基于叶酸(folate)的成像试剂以及这些疾病的叶酸受体靶向疗法。最近，已公开的临床研究报告在患有类风湿关节炎的患者中使用FolateScan（叶酸扫描）的成像研究结果(Turk等人,Arthritis andRheumatism2002,45,1947-1955;Paulos等人,Adv.Drug Deliv.Rev.2004,56,1205-1217;Chen等人,Arthritis Research&Therapy2005,7,310-317;Hattori等人,Biol.&Pharm.Bull.2006,29,1516-1520;Chandraseka等人,J.Biomed.Mat.Res.Part A2007,82,92-103;Varghese等人,Mol.Pharmaceutics2007,4,679-685;Low等人Discovery and development offolic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy ofcancer and inflammatory diseases2008,41,120-129;Matteson等人,Clinical and Experimental Rheumatology2009,27,253-259)。

因此，在过去15年中，集中研究了叶酸(基于通过苯甲酰氨基部分缀合至谷氨酸的蝶啶骨架)及其衍生物，其作为递送治疗和/或诊断试剂至带有叶酸受体的细胞群的靶向试剂，以便实现治疗和/或诊断试剂在上述细胞中相对于普通细胞的选择性浓缩。

已知且已经在(临床前)临床上评价了多种叶酸衍生物和缀合物，包括叶酸类放射性药物(Leamon和Low,Drug Discov.Today2001;6:44-51;US4,276,280)、氟化叶酸化疗剂(US4,628,090)，含化疗剂的叶酸-缀合物(Leamon和Reddy,Adv.Drug Deliv.Rev.2004;56:1127-41;Leamon等人，Bioconjugate Chem.2005;16:803-11)，含有蛋白和蛋白毒素的叶酸-缀合物(Ward等人，.J.Drug Target.2000;8:119-23;Leamon等人，J.Biol.Chem.1993;268:24847-54;Leamon and Low,J.Drug Target.1994;2:101-12)，含有反义寡聚核苷酸的叶酸-缀合物(Li等人，Pharm.Res.1998;15:1540-45;Zhao and Lee,Adv.Drug Deliv.Rev.2004;56:1193-204)，含有脂质体的叶酸-缀合物(Lee和Low,Biochim.Biophys.Acta-Biomembr.1995;1233:134-44;Gabizon等人，Adv.Drug Deliv.Rev.2004;56:1177-92)，含有半抗原分子的叶酸-缀合物(Paulos等人，Adv.Drug Deliv.Rev.2004;56:1205-17)，含有MRI造影剂的叶酸-缀合物(Konda等人，Magn.Reson.Mat.Phys.Biol.Med.2001;12:104-13)等。

叶酸放射性药物可以特别用于对癌症和炎症和自身免疫病治疗的有效性的改善的诊断和评价。这可以包括治疗反应的评价和/或预测，并因此包括辐射剂量测定法的改善。适用于放射成像的典型显影术是本领域已知的，包括正电子发射断层摄影(PET)、平面或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像、γ照相技术、闪烁技术等。

PET和SPECT都使用放射性示踪剂来对所选靶标位点进行成像、测绘和测量活性。但是，PET使用需要邻近回旋加速器的正电子发射核素，SPECT使用通过发生器系统可获得的单光子发射核素，其可以使得SPECT的使用更方便。然而，SPECT提供比PET更低的敏感性，并且除了少量方法外缺少定量方法。在PET的情况下，正电子湮灭引起511keV的两束γ射线，这为发展良好的定量方法提供了基础。因此，PET是最尖端功能成像技术之一，其评价配体或代谢性底物在脑和其它器官中的区域摄取和亲和力，并从而提供基于代谢活性的成像测量。例如，其通过将正电子发射同位素给予受试者，并且随着其发生放射性衰变通过PET扫描仪检测正电子/电子湮灭导致的γ射线来实现。

在适合用于PET的同位素的选择中需要考虑的因素包括正电子发射同位素的足够的半衰期，以允许在施用于患者之前制备任选在可药用载体中的诊断组合物，以及足够剩余的半衰期以产生足够的活性以允许PET扫描的体外测量。此外，适合的同位素应当具有足够短的半衰期以限制患者暴露于不必要的辐射。通常，用于PET的合适的放射性药物可以是基于金属同位素的，例如镓或铜。然而，这二者需要螯合剂以用于俘获该金属，其可能对立体和化学性质有作用。可选地，放射性药物可以基于共价连接的同位素，其提供了最小的结构变化。用于共价连接并且适用于PET扫描的放射性核素通常是具有短半衰期的同位素，比如¹¹C(约20min)、¹³N(约10min)、¹⁵O(约2min)、¹⁸F(约110min)。

迄今为止，许多基于螯合物的叶酸放射性药物已经被合成并且被成功地评价为用于对叶酸受体-阳性肿瘤成像的诊断剂(例如，用¹¹¹In、^99mTc和⁶⁷Ga标记的(Leamon等人,Bioconjug Chem2002,13(6):1200;Siegel等人,J.Nucl.Med.2003,44:700;Müller等人,J.Organomet.Chem.2004,689:4712;Müller等人Bioconjug Chem2008,17(3):797;Müller等人Nucl Med Biol2011,38(5):715)，其用于SPECT；或者是用⁶⁸Ga标记的，用于PET(Mathias等人,Nucl.Med.Biol.2003,30(7):725;Fani等人,Eur J Nucl Med MolImaging2011,38(1):108)。

另外，因此对具有共价连接的同位素的叶酸放射性药物越来越感兴趣的，特别是¹⁸F-标记的叶酸放射性药物，因为其优异的成像特征、¹⁸F的长半衰期(约110分钟)和因为通过发射具有最低正电子能量的正电子进行¹⁸F衰变，这使得用高分辨率PET能够获得最清晰的图像。另外，¹⁸F的更长半衰期(与其它同位素比如⁶⁸Ga相比)也允许更复杂的合成并且呈卫星式分布在不具放射化学设施的PET中心。

迄今为止，文献中的报道包括具有直接连接叶酸分子或通过辅基连接的¹⁸F同位素的¹⁸F-标记的叶酸衍生物(WO2006/071754,WO2008/098112,WO2008/125613,WO2008/125615,WO2008/125617,Bettio等人,J.Nucl.Med.,2006,47(7),1153;Ross等人,Bioconjugate Chem.,2008,19,2402,Ross等人,J.Nucl.Med.,2010,51(11),1756)。

然而，许多方法仍然具有缺点，包括耗时的放射合成得到低放射化学产率或对于分子成像目的不利的药代动力学等。

因此，仍然需要适用于肿瘤的代谢成像以改善癌症和炎症及自身免疫疾病的诊断和治疗的特性放射性药物。

申请人现已经发现制备新的¹⁸F-标记叶酸放射性药物的有效且多用途的方法，其中¹⁸F同位素经由辅基引入，更具体地经由具有糖基（比如环状单糖或寡糖）的辅基(其优选地基于吡喃糖苷或呋喃糖苷)引入。该基团的一个主要成员是例如2-¹⁸F氟-2-脱氧-D-葡萄糖(¹⁸F-FDG)，其是全世界用于体内评价人体中区域葡萄糖代谢率的最广泛使用的PET示踪剂之一。采用PET的已批准诊断用途包括其用于心肌存活性的测定和癌症、癫痫和阿尔茨海默病的检测。然而，使用¹⁸F-FDG作为用于放射合成¹⁸F-标记化合物的结构单元或辅基的实例极其少。

申请人已经发现本发明的新化合物能够克服已知缀合物的缺点，且由于显示一些如下优点(由于例如其化学和/或物理性质，特别是其亲水性特性等)而满足目前需要：比如以低配体浓度提高标记效率、更好的生物分布、增加靶组织吸收和更好地从非靶组织和器官清除。

而且，本发明的新化合物以良好产率获得，以满足用于人类临床应用的期望。另外，新的放射合成适用于在自动化的合成组件中进行，这使得满足GMP指南要求的快速且方便的标记程序。初步体外和体内研究表明它们作为用于FR-阳性肿瘤的有力诊断试剂的适用性。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及新的¹⁸F-叶酸-缀合物，其包括叶酸基团和¹⁸F-取代的糖基，该¹⁸F-取代的糖基连接叶酸的α-羧酸基或γ-羧酸基或者连接α-羧酸基和γ-羧酸基两者，更特别地涉及式I的化合物，

其中

Z为蝶酸酯基(pteroate)或其衍生物，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，而

Q₁、Q₂彼此独立地为H、保护基或式-L-A-L′-¹⁸F的基团，其中

L、L′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，而

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂中的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。

更具体地，本发明涉及具有式II的化合物

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

R₁、R₂彼此独立地为H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR₅、-COR₅、-COOR₅、-NHR₅、-CONHR₅、-CONHR₅，其中R₅代表H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR′、-COR′、-COOR′或-NHR′，其中R′为H或C(1-8)烷基，

R₃、R₄彼此独立地为H、亚硝基、C(1-12)烷基、-OR′、-COR′或卤素取代的-COR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L、L′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，而

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。

在具体实施方案中，糖基为基于吡喃糖苷的环状单糖或环状寡糖，优选地选自阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖，或基于呋喃糖苷的环状单糖或环状寡糖，优选地选自核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖，优选葡萄糖和半乳糖。

因此，在具体实施方案中，本发明涉及具有式IIIa、IIIb、IIIc的化合物，

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基，

R₆、R₉为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在具体实施方案中，本发明的化合物为区域异构纯形式。因此，在某些实施方案中，本发明的化合物包括¹⁸F-取代的糖基，其仅连接α-羧酸基，在其它实施方案中，本发明的化合物包括¹⁸F-取代的糖基，其仅连接叶酸的γ-羧酸基。

在一个进一步的方面，本发明提供用于合成本发明的化合物(区域异构纯形式或区域异构体的混合物)的方法。

在仍然一个进一步的方面，本发明提供药物组合物，其包含诊断成像量，可选的，与治疗有效量所选治疗剂相组合的，及其可药用载体。

在一个进一步的方面，本发明提供将本发明的化合物和/或药物组合物方便有效地给药于有此需要的受试者以用于诊断成像或放疗监测的用途。本发明的方法的受试者优选地为哺乳动物，比如动物或人类，优选人类。

在一个进一步的方面，本发明单瓶或多瓶试剂盒，其除了包含放射性核素离子本身之外，还包含需要制备本发明化合物的所有组分。

本发明的其它特征和优点将根据下述详细说明和权利要求书变得显而易见。

附图简述

图1∶(A)γ-叶酸炔前体的合成方案；(B)α-叶酸炔前体的合成方案。

图2∶(A)[¹⁸F]-或[¹⁹F]-葡萄糖叶酸(folate)化合物的γ-区域异构体的合成方案；(B)[¹⁸F]-或[¹⁹F]-葡萄糖叶酸化合物的α-区域异构体的合成方案。

图3∶两种区域异构体α-葡萄糖叶酸和γ-葡萄糖叶酸和叶酸(正方形表示γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸、菱形表示α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸、三角形表示叶酸)的置换曲线。

图4∶(A)60min p.i.，α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸和γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸之间的生物分布数据的比较；(B)90min p.i，α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸和γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸之间的生物分布数据的比较。

图5∶在75-105min p.i的时间点，(a):肿瘤，(b):肝脏，(c)∶胆囊，(d)∶肾脏，(e)∶肠/粪便，α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸和γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的最大强度PET图像。发明详述

在第一个方面，本发明涉及新的¹⁸F-叶酸-缀合物，其包括蝶酸酯基（pteroate）或叶酸基团(folate)(或其衍生物)和¹⁸F-取代的糖基(下文也称为本发明的化合物)，其中¹⁸F-取代的糖基连接叶酸的α-羧酸基或γ-羧酸基或者连接α-羧酸基和γ-羧酸基二者，更特别地涉及式I的化合物，

其中

Z为蝶酸酯基或其衍生物，

Y₁,、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，而

L、L′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NHR′、COOR′、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，而

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂中的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。

更具体地，式I的化合物可以由具有式Ia、Ib、Ic的化合物表示：

其中

Z为蝶酸酯基或其衍生物，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NHR′、COOR′、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

A₁、A₂彼此独立地为糖基，而

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基。

除非另有说明，否则下文给出的所有定义应用于整个文本(包括所有结构式)。

如本文使用的术语“叶酸(folate)”指基于蝶酸酯基团的化合物，其是通过肽键偶联至谷氨酸(或其衍生物)。如本文使用的术语“蝶酸酯基（pteroate）”代表缩合的嘧啶杂环，其连接至氨基苯甲酰基部分。如本文所用“缩合的嘧啶杂环”包括与其它5-或6-元杂环稠合的嘧啶，得到蝶啶(也即稠合的6-6杂环)或吡咯并嘧啶双环(也即稠合的6-5杂环)。缩合的嘧啶杂环的衍生物包括碳环衍生物，比如吲哚和异吲哚，喹啉和异喹啉，等。如本文所用“缩合的嘧啶杂环，其连接至氨基苯甲酰基部分”也包括三稠合环系，也即其中氨基苯甲酰基部分的氨基团与缩合的嘧啶杂环形成一个进一步的稠环，得到稠合的6-6-6，6-6-5，6-5-6，或6-5-5杂环。如本文使用的优选的叶酸化合物代表是基于叶酸基团(folate)骨架，即蝶酰基-谷氨酸，具体为N-[4-[[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-(或D-)谷氨酸及其衍生物。因此，由于蝶酸酯基结构为叶酸基团(folate)结构的前体，蝶酸酯基的优选的代表包括具有通常已知叶酸化合物(folate)结构的相似衍生物，其包括任选经取代的叶酸、亚叶酸、蝶呤酰多聚谷氨酸(pteropolyglutamic acid)、5,10-次甲基-5,6,7,8-四氢叶酸和叶酸受体结合性蝶啶，比如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸、及其脱氮和二脱氮类似物。叶酸，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸是用于本发明化合物的优选基本结构。术语“脱氮（deaza）”和“二脱氮（dideaza）”类似物指本领域所知的类似物，其用碳原子取代天然叶酸结构中的一个或两个氮原子。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、和10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括，例如1,5-二脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮、和5,8-二脱氮类似物。优选的脱氮类似物化合物包括N-[4-[2-[(6R)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(洛美曲索)和N-[4-[1-[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(依达曲沙)。

术语“糖基”涵盖基于环状糖单元的环状单糖和环状寡糖。如本文使用的术语“糖单元”指环状糖单元，其指直链(单-/寡-)糖的细胞内环状半缩醛或半缩酮形式。单糖包括一个糖单元，而寡糖指一系列糖单元，优选地包括2至20个糖单元，优选2至10个糖单元，更优选地单糖、二糖和三糖。寡糖可以是直链或支链的，寡糖内的糖单元彼此由α-或β(1-2)、(1-4)或(1-6)键连接。优选地，所选寡糖为直链的，更优选地，所述寡糖是直链的且寡糖内的糖单元由α-或β-(1-4)键连接。在最优选的实施方案中，寡糖为直链的且寡糖之内的糖单元由α(1-4)键连接。

因此，在特定实施方案中，A(或A₁和A₂)包括1至10、优选1至6、更优选地1、2或3个糖单元。

优选地，糖单元为吡喃糖苷或呋喃糖苷及其天然和合成衍生物，优选地吡喃糖苷选自阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖和岩藻糖，或呋喃糖苷选自核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。术语衍生物指任何化学或酶修饰的单糖单元，包括通过氧化，脱氧，优选地氢原子、卤素原子、氨基或硫醇基等取代一个或多个羟基，以及羟基或氨基的烷基化、酰基化、硫酸化或磷酸化获得的那些。本发明的优选的糖单元包括例如葡萄糖和半乳糖。

因此，在一个特定实施方案中，糖基A(或A₁、A₂)为单糖，选自核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、岩藻糖，优选葡萄糖和半乳糖。

在另一个特定实施方案中，糖基A(或A₁、A₂)为包括至少2个、优选地2至20个糖单元的寡糖，所述糖单元相同或不同且各自选自核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、

古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、岩藻糖，优选葡萄糖和半乳糖。

在更具体的实施方案中，寡糖可以是(a)二糖，例如乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、蜜二糖、樱草糖、芸香糖；(b)二糖同系物，例如麦芽三糖、异麦芽三糖、麦芽四糖、异麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、乳三糖、乳四糖；(c)糖醛酸，例如葡糖醛酸、半乳糖醛酸；(d)支链的寡糖，例如潘糖、异葡糖基麦芽糖；(e)氨基单糖，例如半乳糖胺、葡萄糖胺、甘露糖胺、岩藻糖胺、奎诺糠胺(quinovosamine)、神经氨酸、胞壁酸、乳糖二元胺、acosamine、bacillosamine、六碳氨糖(daunosamine)、脱氧糖胺、福诺糖胺(forosamine)、加拉糖胺、卡那霉素水解物、kansosamine、碳霉糖、海藻糖胺、perosamine、pneumosamine、绛红糖胺(purpurosamine)、紫红霉胺；(f)改性糖，例如阿比可糖、amicetose、arcanose、蛔糖、波伊文糖、马铃薯三糖、查耳糖、红霉支糖、可立糖、磁麻糖、2-脱氧核糖、2-脱氧葡萄糖、迪吉糖、毛地黄糖、洋地黄毒糖、evalose、evernitrose、金缕梅糖、甘露三糖、蜜二糖、碳霉糖、mycinose、黑曲霉糖、诺维糖、齐墩果糖、泊雷糖、rhodinose、芸香糖、箭毒羊角拗糖、景天庚糖、茄三糖、槐糖、链霉糖、松二糖、泰威糖。

在一个更优选的实施方案中，糖基A(或A₁、A₂)为单糖或寡糖，因此包括选自下述的一个或多个(相同或不同的)糖单元：葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡糖醛酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、乳糖、乳四糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖和神经氨酸。

糖基A、或A₁和A₂被至少一个¹⁸F原子取代，所述¹⁸F原子可以直接通过共价键或通过如本文定义的连接基L′(或L₁′和L₂′)连接至至少一个糖单元。在寡糖的情况下，¹⁸F-原子可以连接至寡糖内的任何糖单元，优选地A或A₁和A₂中的未端糖单元。末端糖单元指无连接(在单糖的情况下)或仅连接至一个相邻糖单元(在寡糖的情况下)的糖单元。应当理解，本发明的所有异构体，包括对映异构体、非对映异构体、旋转异构体、互变异构体、区域异构体及消旋物都预期属于本发明的一部分。本发明包括光学纯形式的立体异构体或其混合物，包括外消旋混合物。异构体可以使用常规方法制备，通过使光学纯或光学富集起始原料反应或通过分离式I的化合物的异构体制备。这特别地应用于基团A(或A₁、A₂)，其指式I的化合物(和随后的分子式)中存在的糖基或氨基酸基，其可以以天然L-或非天然的D-形式存在，即谷氨酸部分(或其衍生物)。本发明还包括纯形式的区域异构体，即具有相同经验式、但具有不同基团Q₁和Q₂连接的本发明的化合物，更特别地，其中¹⁸F-取代的糖基仅连接叶酸的α-羧酸基(即，α-区域异构体)或仅连接叶酸的γ-羧酸基(即，γ-区域异构体)。虽然有时，仅优选一个特定连接位置(α或γ)，由此产生两种纯形式的区域异构体，本发明还包括两种区域异构体的混合物以及其中两个位置被¹⁸F-取代的糖基取代的本发明的化合物。

更具体地，本发明涉及式II的化合物

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂中的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。

如上对于式I的化合物所述的，式II的化合物可以由具有式IIa、IIb、IIc的化合物表示：

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

R₃、R₄彼此独立地为H、亚硝基、C(1-12)烷基、-OR′、-COR′或卤素取代的-COR'，其中R'代表H或C(1-8)烷基，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal、OH、NHR′、COOR′、NO₂所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R'代表H或C(1-8)烷基，

A₁、A₂彼此独立地为糖基，而

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基。

应当理解，缩写“N”和“C”为所有可能饱和度的代表，即N包括-NH-和-N=键，C包括-CH₂-和-CH=键。

进一步理解，(H)_q代表所指环上(即，X₃、C6、C7和X₄上)的所有氢取代基。例如，对于完全饱和的5,8-二脱氮类似物(X₃=X₄=C)，q=7，对于具有X₃=X₄=N的完全不饱和的类似物，q=1。

术语“烷基”，当单独或组合使用时，指包含指定碳原子数的直链或支链烷基。因此，术语“C(1-12)烷基”指其碳链为直链或支链且包括1至12个碳原子的烃基。优选的烷基包括C(1-8)烷基(比如对于Sp)，其指其碳链为直链或支链的且包含1至8个碳原子的烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、2,3-二甲基丁烷、新己基、庚基、辛基。更优选的烷基为包含1至6个C原子，更优选1至4个碳原子的C(1-6)烷基。

术语“链烯基”，单独或与其它基团组合，指具有一个或多个碳-碳双键的如上定义的直链或支链烷基。因此，术语“C(2-12)链烯基”。指其碳链为直链或支链且包括1至12个碳原子和一个或多个碳-碳双键的烃基。优选的链烯基包括C(2-8)链烯基比如亚甲基、乙烯、丙烯、异丙烯、丁烯、叔丁烯、仲丁烯、异丁烯、戊烯、异戊烯、戊二烯、异戊二烯、己烯等。优选的链烯基包含2至6、更优选2至4个碳原子。

如本文使用的术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的如上定义的直链或支链烷基。优选的炔基包含2至6、更优选2至4个碳原子。

如本文使用的术语“卤素”指任何7族元素，包括氟、氯、溴、碘。

如本文使用的术语“卤素取代的”指其具有代替至少一个氢的卤素部分的烷基。

在优选的实施方案中，R₁和R₂可以彼此独立地为H、C(1-12)烷基、-OR₅、-NHR₅，更优选-OR₅、-NHR₅，其中R₅为H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR′、-COR′、-COOR′、或-NHR′，其中R′为H或C(1-8)烷基；和/或R₃为H、C(1-12)烷基或-CO-C(1-8)烷基；和/或R₄为H、亚硝基、-O-C(1-8)烷基或-CO-C(1-8)烷基。

本领域已知和描述的偶联化学可用于经由本发明的化合物的连接基L(或L₁、L₂)和L′(或L₁′、L₂′)将¹⁸F同位素缀合至叶酸化合物的糖基。这种方法在本领域技术人员的平均技术范围之内，并且仅需要现有技术可用的标准合成策略的常规实验和最佳化。典型的偶联策略包括胺、醇或硫醇官能团与醛、羧酸或活化羧酸官能团之间的反应，或环化加成反应比如链接反应。本领域技术人员将得知期望的官能团必须作为所选连接基L(或L₁、L₂)和L′(或L₁′、L₂′)的端基存在。优选的偶联策略包括例如标准肽偶联化学，其中使用例如EDC、DCC、pyBOP或其它羧酸酯活化剂使胺与羧酸反应，形成酰胺键，或环化加成反应，例如基于链接-化学的偶联，其中叠氮基与炔反应，形成氮杂杂环。

基团L₁、L₁′、L₂和L₂′彼此独立地为共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：Hal、OH、NHR′、CO₂R′，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR'-、-NR'-CO-、-CO-NR'或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基。表述“直链或支链的C(1-50)烷基”，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：Hal、OH、NHR′、CO₂R′，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR'-、-NR'-CO-、-CO-NR'”，可以包括连接基比如亲水性低聚/聚合基团，比如低聚醚/聚醚、低聚肽/多肽、低聚酰胺/聚酰胺、低聚胺/聚胺、低聚酯/聚酯、低聚糖/多糖、多元醇、多电荷种类或其任意其它组合。

在一个实施方案中，这样的亲水性低聚/聚合基团包括低聚醚/聚醚，比如低聚/聚醚，更具体地为聚乙二醇(PEG)和相关均聚物，比如聚丙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙烯醇、聚甲基丙二醇和聚羟基丙烯基氧化物，或小烷氧基单体的杂聚物，比如聚乙二醇/聚丙二醇，典型地具有2至25、优选2至10个氧化烯基。

在另一个实施方案中，这样的亲水性低聚/聚合基团包括低聚肽/多肽，比如亲水性肽序列或聚氨基酸及其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚门冬氨酸、聚门冬酰胺，其中每个肽序列或聚氨基酸典型地具有2至12个、优选2至6个氨基酸残基。

优选地，L₁和L₂为直链或支链的C(1-24)、更优选C(1-12)、最优选C(1-6)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：OH、NHR′、CO₂R′，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被五-或六-元杂环、优选五元氮杂环比如三唑或四唑取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基、或如上定义的亲水性低聚/聚合基团。

基团L₁′和L₂′优选地为共价键或直链或支链的C(1-24)烷基，更优选C(1-12)烷基，最优选C(1-6)烷基，其为未取代的或被至少一个选自Hal、OH、NHR′、CO₂R′的基团取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR'-、-NR'-CO-、-CO-NR'，其中R′代表H或C(1-8)烷基。更优选地，L₁′和L₂′为共价键或直链或支链的C(1-12)烷基，更优选C(1-6)烷基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR'-、-NR'-CO-、-CO-NR'，其中R′代表H或C(1-8)烷基。

基团m为1、2或3，优选2。

在特定实施方案中，Y₁和/或Y₂优选地为N，并且因此B₂为甲酰胺保护基。

如本文使用的术语“保护基”(或端基)指Y₁和/或Y₂的合适的保护基。这些保护基取决于官能基(通常为氨基或甲酰胺、羧基或硫代羰基官能基)的性质，因此是可变的。氨基官能基的合适的保护基包括例如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基、甲氧基-或乙氧基-羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、乙酰基或三氟乙酰基、苄基或2,4,6-三甲氧基苄基、邻苯二甲酰基、和三苯甲基或甲苯磺酰基保护基。酰胺官能基的合适的保护基包括例如对-甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苄基、苄基、O-硝基苄基、二(对-甲氧基苯基)甲基、三苯甲基、(对-甲氧基苯基)二苯甲基、二苯基-4-吡啶基甲基、间-2-(吡啶甲基)-N'-氧化物、5-二苯并环庚基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基等。羧基官能基的合适的保护基包括例如甲硅烷基和烷基、芳基或芳基烷基酯，更特别地为烷基酯比如甲基酯和叔丁基酯；烷氧基烷基比如甲氧基甲基；烷基硫代烷基酯，比如甲基、硫甲基酯；卤代烷基酯，比如2,2,2-三氯乙基酯和芳烷基酯，比如苄基酯、对-甲氧基苄基酯、对-硝基苄基酯、二苯甲基酯。羟基官能基的合适的保护基包括例如烷基酯、叔丁基、苄基或三苯甲基，包括甲基醚、取代的甲基醚(例如，MOM(甲氧基甲基醚)、MTM(甲基硫甲基醚)、BOM(苯甲氧基甲基醚)、PMBM或MPM(对-甲氧基苯甲氧基甲基醚))、取代的乙醚、取代的二苄醚、甲硅烷基醚(例如，TMS(三甲基甲硅烷基醚)、TES(三乙基甲硅烷基醚)、TIPS(三异丙基甲硅烷基醚)、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基醚)、三苄基甲硅烷基醚、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基醚))。本发明并不意味着限于这些保护基；更确切些，在本发明中可以容易地鉴定和使用多种另外的等效保护基。上述和其它保护基以及引入和除去它们的技术描述在"Protective Groups in Organic Synthesis"第3版，Greene,T.W.和Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley&Sons,New York:1999中，将其全部内容引入本文作为参考。

在更具体的实施方案中，本发明涉及式IIIa、IIIb、IIIc的化合物

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

R₁、R₂彼此独立地为H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR₅、-COR₅、-COOR₅、-NHR₅、-CONHR₅、-CONHR₅,其中R₅代表H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR′、-COR′、-COOR′或-NHR′，其中R′为H或C(1-8)烷基，

R₃、R₄彼此独立地为H、亚硝基、C(1-12)烷基、-OR'、-COR'或卤素取代的-COR′,其中R′代表H或C(1-8)烷基，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：CN、Hal、OH、NHR'、COOR'、NO₂，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基，

R₆、R₉为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

如本文使用的术语“杂环”(或“杂环的环”)指任何4-至7-元杂环环，其为饱和的、不饱和的或芳香族的，并且其包含1至3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，其中所述氮和硫杂原子可以任选地被氧化，所述氮杂原子可以任选地被季铵化。杂环可以包括，但不限于吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、乙内酰脲基（hydantoinyl）、戊内酸胺基（valerolactamyl）、环氧乙烷基（oxiranyl）、氧杂环丁烷基（oxetanyl）、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。用于本发明的优选的杂环为包含1至3个氮原子的氮杂杂环，优选五元氮杂杂环。如与L₁、L₁'和L₂、L₂′结合且优选地与L₁和L₂结合使用的术语“氮杂杂环”指环中包括至少一个氮原子的杂环基，并且可以是未取代的或取代的。所述氮杂杂环基也可以如本领域所认可的被取代，例如被C(1-6)烷基取代。对于本发明的化合物，五元氮杂杂环基是优选的，比如三唑基或四唑基，更优选下述结构的基团：

其中虚线表示与相邻基团的连接位点，R′′为H或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal或NO₂所取代。

因此，在优选的实施方案中，L₁、L₁′、L₂和L₂′且优选L₁和L₂彼此独立地为式(a)、(b)、(c)或(d)的基团：

其中

R′′为H或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal或NO₂所取代，

Sp为间隔基(连接Y₁和/或Y₂)，比如直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR′或-COOR′所取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基，而

q为0、1、2、3或4。

在优选的实施方案中，Sp为直链或支链的C(1-6)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR′或-COOR′所取代，其中R′为如上定义的。

因此，在某些实施方案中，本发明提供具有式IVa、IVb、IVc、IVd的式I的化合物：

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

R₁、R₂彼此独立地为H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR₅、-COR₅、-COOR₅、-NHR₅、-CONHR₅，其中R₅代表H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR′、-COR′、-COOR′或-NHR′，其中R′为H或C(1-8)烷基，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

Y₁为O、N或S，

B₁为H或保护基，

Sp为间隔基，比如直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR′或-COOR′所取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

L₂′为共价键或直链或支链的C(1-6)烷基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

q为0、1、2、3或4，

R₆为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在其它实施方案中，本发明提供具有式Va、Vb、Vc、Vd的式I的化合物

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

Y₂为O、N或S，

B₂为H或保护基，

L₁′为共价键或直链或支链的C(1-6)烷基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

q为0、1、2、3或4，

R₉为H或C(1-8)烷基，而

R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在另外其它实施方案中，本发明提供具有式VIa、VIb、VIc、VId的式I的化合物

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L₁′、L₂′彼此独立地为共价键或直链或支链的C(1-6)烷基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-,-O-CO-,-NR′-,-NR′-CO-,-CO-NR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

q为0、1、2、3或4，

R₆、R₉为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

本发明的化合物的一个具体实施方案包括例如下述化合物，其中：

(a)X₁至X₅为N，R₁为NY₃Y₄，R₂为O，R₄为Y₅，p为0或1，且q为1或3，或

(b)X₁至X₅为N，R₁为NY₃Y₄，R₂为NH₂，R₄为Y₅，p为0且q为1。

因此，在特定实施方案中，本发明的化合物包括式VIIa、VIIb、VIIc、VIId的化合物，

其中

Y₃、Y₄彼此独立地选自H、卤素、C(1-12)烷基、C(2-12)链烯基、C(2-12)炔基、-OR′、-COR′、-COOR′和-NHR′，其中R′为H或C(1-8)烷基，

Y₅选自H、亚硝基、C(1-12)烷基、-OR′、-COR′或卤素取代的-COR′，其中R′为H或C(1-12)烷基，

m为1、2或3，

Y₁为O、N或S，

B₁为H或保护基，

Sp为间隔基，比如直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR′或-COOR′所取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基，而

q为0、1、2、3或4，

R₆为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在其它特定实施方案中，本发明的化合物包括式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId的化合物，

其中

m为1、2或3，

Y₂为O、N或S，

B₂为H或保护基，

q为0、1、2、3或4，

R₉为H或C(1-8)烷基，而

R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在其它特定实施方案中，本发明的化合物包括式IXa、IXb、IXc、IXd的化合物

其中

m为1、2或3，

Sp彼此独立地为间隔基，比如直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR'或-COOR'所取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

L₁′、L₂′彼此独立地为共价键或直链或支链的C(1-6)烷基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

q为0、1、2、3或4，

R₆、R₉彼此独立地为H或C(1-8)烷基，而

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

在进一步的方面，本发明还提供合成本发明的化合物的方法。合成优选地是基于模块方法(使用合适的衍生化的官能团，即叶酸基，糖基，等)，和基于本领域已知的各种标准偶联化学，包括酯化、酰胺化、和链接反应(也参见上文)。后者反应已经经证明是特别有用的，且基于在热条件下或在催化剂的存在下环加成中叠氮化物和炔基的偶联，以获得所选的最终化合物(Kolb和Sharpless,DrugDiscovery Today2003,8,1128;Kolb等人Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004;Rostovtsev,V.V.等人Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,2596;US2005/02222427;WO06/116629)。这些反应被称为Huisgen1,3-偶极环加成(热条件)和链接反应(催化条件)，本领域已经进行了描述(Kolb和Sharpless,Drug Discovery Today2003,8,1128;Kolb等人Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004;Rostovtsev等人Angew.Chem.Int.Ed.2002,41,2596;US2005/02222427;WO06/116629)。

更特别地，其中五元杂环为三唑的本发明的化合物可以通过叠氮化物R_a-N₃与炔R_b-C≡C-R_c的环加成获得，其中五元杂环为四唑的式I的化合物是通过叠氮化物R_a-N₃与氰化物R_b-C≡N的环加成获得。本文预期所有可能的组合，即R_a为叶酸衍生物，R_b为糖基(或其前体)，以及R_b为叶酸衍生物，R_a为糖基(或其前体)。因此，反应的模块化和多用途允许应用多种多样的连接基以将放射性同位素偶合至叶酸。

也应当理解在偶联至叶酸基之前或在偶联至叶酸基之后，糖基可以被¹⁸F同位素取代。

也应当理解两个偶联基团之一(即，炔或叠氮基)可以特别地直接或通过连接基连接至叶酸(folate)上的α-羧酸(在合适地保护γ-羧酸下)，获得纯形式的α-区域异构体。可选地，两个偶联基团之一(即炔基或叠氮基)可以特别地直接或通过连接基连接至叶酸上的γ-羧酸(在合适地保护α-羧酸下)，获得纯形式的γ-区域异构体。

对本领域技术人员显而易见的是选择用于多种偶联步骤的合适条件和选择合适的保护基PG(例如，参见Greene&Wuts,Eds.,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd Ed.,1991,JohnWiley&Sons,NY.)和离去基团LG(例如，卤素基、甲苯磺酸基、甲磺酸基、三氟甲磺酸基、碳酸酯基)，以获得期望的α-或γ-区域异构体。

在一个进一步的方面，本发明提供药物组合物，其包含诊断成像量或治疗有效量的至少一种本发明的化合物和其可药用载体。如本文使用的以合适量存在的可药用载体包括溶剂、分散介质、抗菌剂和抗真菌剂等渗剂等，其是生理学可接受的。使用这类介质和试剂是本领域熟知的。

在一个进一步的方面，本发明提供本发明的叶酸放射性药物(其包括本发明的化合物和药物组合物)方便且有效地施用至有此需要的受试者用于诊断成像的用途。

因此，本发明提供一种用于表达叶酸-受体的细胞或细胞群的诊断成像的方法，所述方法包括以诊断成像量施用至少一种本发明的叶酸放射性药物的步骤，以及获得所述细胞或细胞群的诊断图像的步骤。

这样的成像可以在体外或体内在表达叶酸-受体的细胞或细胞群上进行。

因此，本发明提供用于体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞的方法，其包括使所述组织样品与有效量的至少一种本发明的叶酸放射性药物接触并且达到足够的时间和条件，使结合发生并通过PET成像检测此结合。

在一个进一步的方面，本发明提供本发明的叶酸放射性药物的方便且有效地施用至需要的受试者用于诊断成像和/或监测癌症和炎症及自身免疫疾病的治疗的用途。

因此，本发明提供同时诊断和治疗的方法，其包括向有此需要的受试者施用诊断有效量的至少一种本发明的叶酸放射性药物与所选治疗活性剂的组合，以及获得所述组织的诊断图像以跟踪观察治疗过程。

本发明的方法的受试者优选地为哺乳动物，比如动物或人，优选人。

剂量(即，至少一种本发明的叶酸放射性药物的诊断有效量)取决于期望效果的性质(比如诊断形式)、诊断器械、制剂应用的形式、以及接受者的年龄、体重、营养和状态、同步治疗的种类(如果有的话)。

然而，最优选的剂量可以根据个体受试者量裁，这是本领域技术人员可以理解和确定的，而不需要过度的试验。这通常包括标准剂量的调整，例如如果患者有低体重则降低剂量。

在PET扫描仪上的成像操作发生在施用该放射性示踪剂之后的数分钟至2-4小时内。时间安排取决于成像靶标和放射性示踪剂的动力学以及希望的信息。

本发明的叶酸放射性药物的优选给药途径是通过静脉注射。

用于注射的合适形式包括本发明上述的叶酸放射性药物的无菌水溶液或分散液。通常，该放射性药物配制在生理缓冲溶液中。

叶酸放射性药物可以经过本领域认可的技术灭菌，所述技术包括但不限于，加入抗菌剂或抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。优选地，它们在给药之前经历无菌过滤以消除对额外灭菌剂的需求。

对于待注射的溶液而言，优选的单位剂量为约0.01mL至约10mL。在静脉给药之后，如果需要，体内器官或肿瘤的成像可以发生在放射标记试剂已被给药至受试者之后的数分钟至2-4小时内，使得足够量的给药剂量在所选靶区域累积。

本发明的叶酸放射性药物还可以用于取自受试者的组织活组织检查中的表达叶酸受体的细胞的体外检测。因此，在一个进一步的实施方案中，本发明提供用于组织样品中的表达叶酸受体的细胞例如肿瘤细胞的体外检测的方法，其包括使所述组织样品与有效量的本发明的叶酸放射性药物接触并且达到足够的时间和条件，使结合发生并通过成像技术检测此结合。

可以通过本领域技术人员已知的操作收集样品，例如通过收集组织活检物或者体液，通过抽吸气管或肺样品等。

待测定的组织样品包括含有动脉粥样硬化斑块的任何动脉和血管组织，其怀疑含有表达叶酸受体的身体组织或体液(例如血细胞)的单独细胞、细胞群、或细胞培养物，所述细胞例如肿瘤细胞、上皮细胞、肾、胃肠或肝胆管系统等。

所述组织可以在受试者内，或进行活组织检查或从受试者取出的。所述组织也可以是身体器官的整体或任何部分。所述组织可以是“新”的，其中该组织是从受试者新取出的而在切除和本发明的方法之间没有任何保存步骤。在应用本发明的方法之前，所述组织(样品)也可以由于这种标准组织制备技术保存，包括但不限于冷冻、快速冷冻、石蜡包埋和组织固定。可以采用例如切片机将样品切开，其有助于显微镜检查和观测。在与一种本发明叶酸放射性药物温育之前或者之后，还可以将样品用合适的固定剂固定，以改善样品组织的组织学品质。

足以使本发明的叶酸放射性药物与细胞上的叶酸受体结合的时间和条件包括标准组织培养条件，即样品可以在体外培养并且与本发明的化合物或组合物的一种在生理介质中温育。这些条件是本领域技术人员熟知的。另选地，可以将样品固定，然后与本发明叶酸放射性药物在等渗或生理缓冲溶液中温育。

为了所有的应用，方便的是在位于或接近它们使用的地方制备本发明的化合物。

根据本文公开内容，本文公开和要求保护的所有化合物和/或方法可以被制备并完成而不需要过度的试验。对于本领域技术人员显而易见的是，可以将各种改变用于本发明而不会偏离本发明的范围。本文提供的实施例将是说明性的并且不是穷尽的；因此，说明性的实施例将不会视为以任何方式限制本发明。

具体实施方案

材料和方法

红外光谱是在Jasco FT/IR-6200ATR-IR上记录的。核磁共振波谱是用Bruker400MHz或500MHz波谱仪以相应的溶剂信号作为内标记录的。化学位移是以相对于四甲基硅烷(0.00ppm)的百万分率(ppm)报告的。偶合常数值J是以赫兹(Hz)给出；下述缩写用于试验部分以用于描述¹H-NMR波谱：单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)、多重峰(m)、双二重峰(dd)。复杂多重峰的化学位移是以它们出现的范围给出的。低分辨率质谱(LR-MS)是用Micromass Quattro micro^TM API LC-ESI记录的，高分辨率质谱(HR-MS)是用Bruker FTMS4.7T BioAPEXII(ESI)记录的。

反应是用薄层色谱法(TLC，在EM Science0.25mm厚、预涂硅胶60F-254载玻片上进行)或HPLC监测。HPLC是在装有L-7400可调吸收检测器的Merck-Hitachi L-7000系统上进行的。分析HPLC是用Gemini柱(C18，5μm，4.6×150mm，Phenomenex)使用以下溶剂系统(1mL/min)进行的：50mM NH₄HCO₃溶液(溶剂A)、乙腈(溶剂B)；0-4min，100%A；4-5min100→93%A；5-15min93%A；15-25min93→30%A；25-30min30%A；半制备HPLC采用Gemini(C18,5μm,10x250mm,Phenomenex),3mL/min进行；溶剂系统和梯度如下:50mM NH₄HCO₃溶液(溶剂A)甲醇(溶剂B);0-3min100%A；3-28min100→40%A；28-30min40→30%A；30-35min30%A。

分析型放射HPLC是使用装有L-2450二极管阵列检测器和Berthold放射检测器的Merck-Hitachi L-2130系统进行的，使用上述柱和梯度进行分析HPLC。

对于体外稳定性研究，使用来自Waters的超高效液相色谱(UPLC^TM)系统，其具有Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)和连接的Berthold重合检波器（Flow Star LB513），使用下述梯度系统：50mM NH₄HCO₃溶液(溶剂A)，乙腈(溶剂B)，0.5ml/min；0-0.5min100%A；0.5-3.5min100→30%；3.5-3.9min30%A。

[¹⁸F]葡萄糖叶酸的半制备型放射HPLC纯化是在装有Merck-Hitachi L-6200A智能泵、Knauer可变-波长紫外线检测器和Eberline RM-14放射检测器的HPLC系统上进行的，使用Gemini柱(C18，5μm，250x10mm，Phenomenex)和50mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲溶液(调节至pH7.0)和5%乙醇的等浓度溶剂系统，流速3ml/min.所有化学品都是如以其它方式不同描述的那样使用。

n.c.a.[¹⁸F]氟化物的制备

N.c.a.[¹⁸F]氟化物是在Cyclone18/9回旋加速器(IBA)上通过照射富集的[¹⁸O]水经由¹⁸O(p，n)¹⁸F核反应制备的。[¹⁸F]氟化物固定在阴离子交换柱(QMA Light；Waters；用0.5M K₂CO₃-溶液和H₂O预处理)，并用在乙腈(1.4mL)和水(0.6mL)中的Kryptofix K₂₂₂(5mg)和K₂CO₃(1mg)溶液洗脱到10mL密封的反应容器中。通过共沸蒸馏在真空中110℃下的乙腈与氮气流干燥该氟化物。将该共沸干燥过程重复3次，每次1mL的乙腈。

实施例1:γ-叶酸炔前体的合成(根据图1A)

(a)2-((S)-4-((叔丁氧基羰基)-氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基(pentananamido))戊-4-炔酸(S)-甲基酯的合成(步骤a)

将市售的BocGluOMe(402mg，1.54mmol)溶于无水DMF(4mL)中，加入Et₃N(428μL，2eq.)。在0℃下，加入HBTU(700mg,1.85mmol)，并搅拌该混合物半小时。在0℃下，将活化酸的溶液转移到H-Pra-OMe·HCl(205mg，1.62mmol)在含有Et₃N(856μL，4eq.)的无水DMF(4mL)中。将该混合物在0℃下搅拌1h，温热至室温，并搅拌过夜。用柠檬酸(1M)和乙酸乙酯萃取产物。将有机相用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。通过采用CH₂Cl₂/MeOH(50:1)的快速硅胶色谱获得纯化，得到呈白色固体的产物(467mg，82%)。¹H-NMR(DMSO-d6)δ/ppm8.40(d,1H,J=7.3Hz),7.27(d,1H,J=7.7Hz),4.45(q,1H,J=7.3Hz),4.00(m,1H),3.68(s,3H),3.66(s,3H),2.92(t,1H,J=2.5Hz),2.62(m,2H),2.26(t,2H,J=7.6Hz),2.04-1.71(m,2H),1.42(s,9H);¹³C-NMR(DMSO-d6)δ/ppm173.8,172.4,171.8,156.4,80.9,79.1,74.1,53.9,53.0,52.6,51.9,32.2,29.1,27.5,21.9;C₁₇H₂₇N₂O₇的HR-MS(ES⁺)理论值:371.1813；实测值：371.1816

(b)2-((S)-4-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯的合成(步骤b)

将2-((S)-4-((叔丁氧基羰基)-氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯（460mg,1.24mmol）溶于CH₂Cl₂(4.5mL)中，加入三氟乙酸(TFA；0.5mL)。将该混合物在室温下静置5h，然后在减压下浓缩，得到呈黄色油状物的胺的TFA盐(332mg，定量)。¹H-NMR(DMSO-d6)δ/ppm8.56(d,1H,J=7.3Hz),8.48(bs,1H),4.46(q,1H,J=7.3Hz),4.10(bs,1H),3.79(s,3H),3.68(s,3H),2.95(t,1H,J=2.6Hz),2.64(m,2H),2.38(m,2H),2.04(m,2H);¹³C-NMR(DMSO-d6)δ/ppm171.9,171.7,170.6,81.0,74.3,53.8,53.0,52.5,52.0,31.1,26.8,21.9;C₁₂H₁₉N₂O₅的HR-MS(ES⁺)理论值:271.1288；实测值：271.1298

(c)γ-叶酸炔的合成(步骤c和d)

将N²-N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基蝶酸（pteoric acid）(246mg，0.62mmol)悬浮在无水DMF(2mL)中，并加入Et₃N(165μL，2eq.)。在0℃下，加入HBTU(314mg，0.83mmol)，并将该悬浮液搅拌5min，直到出现澄清的橙色溶液。在0℃下，将得到的溶液加入到2-((S)-4-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯(TFA盐；160mg，0.59mmol)在包含Et₃N(165μL,2eq.)的无水DMF(3mL)中的溶液中。在0℃下搅拌该澄清黄色溶液4小时，然后使其温热至室温，并搅拌2小时。在减压下除去挥发性组分，并通过采用CH₂Cl₂/MeOH(10:1)的快速硅胶色谱纯化残余物，得到呈黄色固体的保护的γ-叶酸炔(238mg，62%)。C₃₀H₃₃N₉O₈的LR-MS(ES⁺)理论值:647.25；实测值：647.83

NMR和HPLC指示产物部分脱保护，因此将化合物脱保护，直接得到γ-叶酸炔前体(参见下文)。

将保护的γ-叶酸炔(203mg，0.35mmol)溶于1M NaOH(6mL)中，并在室温下搅拌过夜。用少量乙酸乙酯(3×1ml)萃取该水溶液，然后用2M HCl调节pH至8。将该溶液分成两部分，并通过两个反相柱(Sep-PakC18,12cc,2g；Waters；用MeOH和H₂O预处理)获得纯化。首先，用3ml H₂O冲洗该柱，然后用12ml的H₂O洗脱产物。在合并两个产物级分和冷冻干燥之后，获得呈黄色粉末的γ-叶酸炔(121mg,63%,根据HPLC的纯度>95%)。¹H-NMR(D₂O/NaOD)δ/ppm8.62(s,1H),7.69(d,2H,J=8.8Hz),6.86(d,2H,J=8.8Hz),4.63(s,2H),4.37(q,1H,J=4.5Hz),4.24(t,1H,J=5.7Hz),2.56(m,2H),2.44(m,2H),2.29(m,1H),2.07(m,1H);C₂₄H₂₅N₈O₇的HR-MS(ES⁺)理论值:537.1841；实测值537.1834

实施例2:γ-[ ¹⁹ F]-葡萄糖叶酸参照物的合成(根据图2A)

根据文献方法(例如Maschauer and Prante,Carbohydr.Res.2009)进行2-脱氧-2-氟吡喃葡萄糖基叠氮化物的合成

将γ-叶酸炔(10mg，19μmol)溶于在Eppendorf管中叔丁醇/H₂O(1:1,1mL)中，加入2-脱氧-2-氟吡喃葡萄糖基叠氮化物(11.6mg，56μmol)、0.1M Cu(OAc)₂溶液(0.1eq.19μL)和0.1M抗坏血酸钠溶液(0.2eq.38μL)。将该溶液在室温和500rpm下振荡1小时，直到完全转化(经由HPLC分析)。对于产物分离，将混合物进行半制备HPLC。收集期望的级分，并冻干，得到呈黄色粉末的产物(7.2mg，52%，根据HPLC的纯度>98%)。¹H-NMR(D₂O/NaOD)δ/ppm8.74(s,1H),7.98(s,1H),7.61(d,2H,J=8.8Hz),6.76(d,2H,J=8.8Hz),5.89(dd,1H,J₁=2.6Hz,J₂=9.0Hz),4.91(t,1H,J=9.0Hz),4.61(s,2H),4.44(q,1H,J=4.7Hz),4.35(q,1H,J=4.3Hz),4.02-3.86(m,2H),3.79-3.62(m,2H),3.20(dd,1H,J₁=4.7Hz,J₂=14.8Hz),3.04(dd,1H,J₁=8.4Hz,J₂=14.8Hz),2.37(m,2H),2.17(m,1H),2.01(m,1H);C₃₀H₃₅FN₁₁O₁₁的HR-MS(ES⁺)理论值:744.2496;实测值：744.2508

实施例3:γ-[ ¹⁸ F]-葡萄糖叶酸的合成(根据图2A)

根据文献方法(例如Maschauer and Prante,Carbohydr.Res.2009,753;Takatani et al Carbohydr.Res.2003,1073)获得用于经由链接反应将¹⁸F-取代的葡萄糖偶联至叶酸的3,4,6-三-O-乙酰基-2-O-三氟甲烷磺酰基-β-D-吡喃甘露糖基叠氮化物前体。

(b)2-[¹⁸F]氟吡喃葡萄糖基叠氮化物的放射合成

向无水¹⁸F-氟化物-穴状化合物复合物中，加入在0.30mL的无水乙睛中的前体3,4,6-三-O-乙酰基-2-O-三氟甲烷磺酰基-β-D-吡喃甘露糖基叠氮化物(3.0mg，6.5μmol)。将该混合物在80℃下搅拌5分钟，得到根据放射-UPLC分析最大75%的¹⁸F-结合。在冷却5min和加入8mL水之后，使该混合物通过反相柱(Sep-Pak C18Plus;Waters;用MeOH和H₂O预处理)。用5mL的水洗涤所述柱。用2.0mL的乙腈将¹⁸F-标记保护的中间体3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-[¹⁸F]氟吡喃葡萄糖基叠氮化物洗脱到另一10mL的密封反应容器中，并在80℃下于减压和氮气下干燥。对于水解，加入0.25mL的60mM氢氧化钠溶液，并将该混合物加热至65℃5分钟，以完成脱乙酰化。在冷却之后，用0.25mL的60mM氯化氢溶液中和该混合物，并直接用于链接反应而无需进一步纯化。

(c)偶联至γ-叶酸炔前体

将在步骤(b)中获得的脱保护的2-脱氧-2-[¹⁸F]氟吡喃葡萄糖基叠氮化物转移到另一个包含γ-叶酸炔的反应容器中，接着加入0.3mL的乙醇、10μL的0.1M Cu(OAc)₂溶液和20μL的0.1M抗坏血酸钠溶液。在50℃下搅拌该反应混合物15min。在加入3mL的0.15M磷酸盐缓冲液之后，将该混合物加入半制备型放射HPLC系统。使产物级分γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸通过无菌过滤器，并收集到无菌无热原的小瓶中，而无需进一步配制。在总共合成3h时间之后，分离产物的总衰变-校正产率达到25%，放射化学纯度一直大于95%。γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的比活性达到120GBq/μmol。

实施例4:α-叶酸炔前体的合成(根据图1B)

(a)2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)-氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯的合成

类似于实施例1，使用BocGluOMe-OH·DCH作为起始原料制备该炔。步骤a的产物呈澄清油状物(326mg,80%)。¹H-NMR(DMSO-d6)δ/ppm8.34(d,1H,J=7.8Hz),6.97(d,1H,J=8.4Hz),4.46(m,1H),4.05(m,1H),3.68(s,3H),3.62(s,3H),2.94(t,1H,J=2.6Hz),2.66(dd,2H,J₁=2.6Hz,J₂=6.8Hz),2.38(m,2H),2.00-1.71(m,2H),1.42(s,9H);¹³C-NMR(DMSO-d6)δ/ppm173.8,172.7,171.6,156.1,80.7,79.1,74.4,54.1,53.1,52.3,51.8,30.7,29.1,28.2,21.8;C₁₇H₂₆N₂NaO₇的HR-MS(ES⁺)理论值：:393.1632;实测值：393.1641

(b)2-((S)-2-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯的合成(步骤b)

将2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)-氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯(270mg，0.73mmol)溶于CH₂Cl₂(4.5mL)中，并加入三氟乙酸(TFA；0.5mL)。将该混合物静置在室温下5小时，然后在减压下浓缩，得到呈黄色油状物的胺的TFA盐(198mg，定量)。¹H-NMR(DMSO-d6)δ/ppm9.12(d,1H,J=7.4Hz),8.28(bs,2H),4.54(m,1H),3.99(m,1H),3.70(s,3H),3.65(s,3H),3.04(t,1H,J=2.7Hz),2.72(m,2H),2.49(m,2H),2.05(m,2H);¹³C-NMR(DMSO-d6)δ/ppm173.2,171.1,169.4,80.5,74.8,53.3,52.5,52.2,52.1,29.4,27.2,21.6;C₁₂H₁₉N₂O₅的HR-MS(ES⁺)理论值:271.1288;实测值：271.1291

(c)α-叶酸炔的合成

将N²-N,N-二甲基氨基亚甲基-10-甲酰基蝶酸（pteoric acid）(246mg，0.62mmol)悬浮在无水DMF(2mL)中，加入Et₃N(165μL，2eq.)。在0℃下，加入HBTU(314mg，0.83mmol)，并搅拌该悬浮液5min，直到出现澄清的橙色溶液。在0℃下，将得到的溶液加入到根据实施例1(b)获得的2-((S)-2-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酰氨基)戊-4-炔酸(S)-甲基酯(TFA盐；160mg，0.59mmol)在包含Et₃N(165μL,2eq.)的无水DMF(3mL)中的溶液中。

在0℃下，搅拌该澄清黄色溶液4小时，然后使其温热至室温，并搅拌过夜。在减压下除去挥发性组分，并通过用CH₂Cl₂/MeOH(10:1)的快速硅胶色谱纯化该残余物，得到呈黄色固体的保护的α-叶酸炔。LR-MS[M+H]⁺:648.12。

NMR和HPLC指示产物部分脱保护，因此，使用如下所述方法将该化合物直接脱保护，得到α-叶酸炔。

将保护的α-叶酸炔溶于1M NaOH(6mL)中，并在室温下搅拌过夜。用少量的乙酸乙酯(3×1mL)萃取该水溶液，然后用2M HCl(30μL)将pH调节至8。将该溶液用50mM NH₄HCO₃溶液(5ml)稀释，并加入到制备型HPLC。收集期望的级分并冻干，得到呈黄色粉末的产物α-叶酸炔(84mg，经2步骤26%，根据HPLC的纯度>98%)。¹H-NMR(D₂O/NaOD)δ/ppm8.58(s,1H),7.67(d,2H,J=8.5Hz),6.81(d,2H,J=9.8Hz),4.58(s,2H),4.46(q,1H,J=4.8Hz),4.31(t,1H,J=5.9Hz),2.68(m,2H),2.33(t,2H,J=7.7Hz),2.16(m,1H),2.05(m,1H);C₂₄H₂₄N₈NaO₇的HR-MS(ES⁺)理论值:559.1660;实测值：559.1659.

实施例5:α-[ ¹⁹ F]-葡萄糖叶酸参照物的合成(根据图2B)

根据文献方法(例如Maschauer and Prante,Carbohydr.Res.2009)进行2-脱氧-2-氟吡喃葡萄糖基叠氮化物的合成。将α-叶酸炔(10mg，19μmol)溶于在Eppendorf管中的叔丁醇/H₂O(1:1,1mL)中，加入2-脱氧-2-氟吡喃葡萄糖基叠氮化物(11.6mg，56μmol)、0.1MCu(OAc)₂溶液(0.1eq.，19μL)和0.1M抗坏血酸钠溶液(0.2eq.，38μL)。将该溶液在室温和500rpm下振荡1小时，直到完全转化(经由HPLC分析)。对于产物的分离，将该混合物加入到半制备型HPLC。收集期望的级分并冻干，得到呈黄色粉末的产物(7.2mg，52%，根据HPLC的纯度>98%)。¹H-NMR(D₂O/NaOD)δ/ppm8.74(s,1H),7.98(s,1H),7.61(d,2H,J=8.8Hz),6.76(d,2H,J=8.8Hz),5.89(dd,1H,J₁=2.6Hz,J₂=9.0Hz),4.91(t,1H,J=9.0Hz),4.61(s,2H),4.44(q,1H,J=4.7Hz),4.35(q,1H,J=4.3Hz),4.02-3.86(m,2H),3.79-3.62(m,2H),3.20(dd,1H,J₁=4.7Hz,J₂=14.8Hz),3.04(dd,1H,J₁=8.4Hz,J₂=14.8Hz),2.37(m,2H),2.17(m,1H),2.01(m,1H);C₃₀H₃₅FN₁₁O₁₁的HR-MS(ES⁺)理论值:744.2496;实测值：744.2508

实施例6:α-[ ¹⁸ F]-葡萄糖叶酸的合成(根据图2B)

与γ-区域异构体的放射合成相同的方式进行α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的放射合成。在总共合成3h时间之后，分离产物的总衰变-校正产率为3-10%，放射化学纯度一直大于95%。[¹⁸F]-葡萄糖α-叶酸的比活性达到110±30GBq/μmol。

实施例7:体外结合亲和力测定

采用其中叶酸受体过表达的来源于人宫颈癌的KB细胞进行结合亲和力测定。在37℃下，在湿润气氛(7.5%CO₂)中，将细胞呈单层培养在75cm²烧瓶中。使细胞保持在特定叶酸-缺乏的RPMI1640培养基(FFRPMI1640；Cell Culture Technologies)中，该培养基补充有热灭活的胎牛血清(10%)、L-谷氨酰胺、青霉素(100IU/mL)和链霉素(100mg/mL)。胎牛血清为培养基中叶酸的唯一来源，其被报道提供约3nmol/mL的最终叶酸浓度，这是人的生理血清浓度的低端。

将在纯FFRPMI1640培养基中的细胞悬液(无添加物，冰冷的)加入到1.5mL小瓶(7000个细胞，240μl)。在4℃下，将该细胞用³H-叶酸(0.82nM)和递增浓度的非放射性参照化合物葡萄糖叶酸3(5.0×10^-7至5.0×10^-12M)温育30分钟，一式三份。在过量叶酸(10^-3M)的存在下，测定非特异性结合。在培养之后，将悬浮液在3500rpm和4℃下离心5分钟，并除去上清液。通过加入0.5mL的1N NaOH，同时将细胞沉淀物再悬浮并溶解。在涡旋搅拌机中搅拌该溶解细胞，并转移到包含4mL的闪烁混合液(Ultima Gold；Perkin Elmer)的闪烁管中。使用β-计数器(LS6500；Beckman)测量放射性，并使用Graph PadPrism4.0软件由置换曲线测定50%的抑制浓度。

葡萄糖叶酸的50%的平均抑制浓度(IC₅₀值)是从三个独立实验获得的，发现对于γ-区域异构体为1.6±0.1nM(K_i=0.8±0.1nM)，对于α-区域异构体为1.4±0.2nM(K_i=0.7±0.2nM)，与之比较的叶酸，其显示0.8±0.2nM的值(K_i=0.4±0.1nM)。将一个实验的置换曲线绘制在图3中(正方形指示γ-葡萄糖叶酸，菱形指示α-葡萄糖叶酸，三角形指示叶酸)。

实施例8∶体外稳定性研究

在37℃下，研究在不同培养时间(0-120min)人血浆中γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的稳定性。在培养之后，用冰冷的甲醇沉淀血浆蛋白，并以13500rpm和20℃离心10分钟。用相同体积的甲醇稀释PBS对照。通过分析型放射-UPLC分析上清液和PBS对照。直到120分钟，[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的两种区域异构体都没有显示出在人血浆中有任何降解产物。

实施例9∶分配系数的测定

通过摇瓶法测定分布系数(log D_7.4)。简而言之，将γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸溶于20℃下的磷酸盐缓冲液(500μl，pH7.4)和正-辛醇(500mL)的混合物中。使该样品在顶置式(over-head)搅拌器中平衡15min。通过离心(3min,5000rpm)分离两相，从各层取50μl等分试样，在γ-计数器中进行放射性计数。分配系数表示为辛醇相中的放射性(cpm)与PBS相中的放射性的比例，以八次测量的平均值±标准偏差表示。测得[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的两种区域异构体的logD_7.4值，γ-区域异构体为-4.21±0.14，α-区域异构体为-4.20±0.06(显示化合物的亲水性增加)。

实施例10∶生物分布研究

雌性CD-1裸鼠购自Charles River(Germany)，保持叶酸-缺乏的啮齿类动物饮食以使其血清叶酸浓度降低至与人血清水平相当的水平。在3-4天的适应期之后，将0.1mL KB肿瘤细胞悬浮液(5×10⁶个细胞)皮下接种到每只小鼠的两个腋下。在接种12天后，进行动物试验。经由尾侧静脉，给动物注射～5MBq(每次注射的最大体积100μL)的γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸。采用溶于PBS(100μg/100μl)中的过量叶酸进行阻断研究(n=2)，将所述叶酸(folate)静脉内注射，10min之后注射放射性示踪剂。在注射放射性示踪剂之后的三个不同时间点(30min、60min、90min)处死动物。将器官和组织解剖，并在γ-计数器(Wizard,PerkinElmer)中测量。掺入的放射性表示为每克组织的注射剂量的百分数(%ID)。将不同时间点采集的生物分布数据概括在表1([¹⁸F]-葡萄糖叶酸的γ-区域异构体)和表2([¹⁸F]-葡萄糖叶酸的α-区域异构体)中。在阻滞组(表的最后一列)中，在注射放射性示踪剂之前10分钟，每只动物接受在PBS中的100μg/100μL的叶酸。图4A图解了在60分钟p.i.，不同组织中γ-和α-区域异构体之间的生物分布的比较(条纹柱：γ-区域异构体，空心柱∶γ-区域异构体阻滞组，填充柱∶α-区域异构体，虚线柱∶α-区域异构体阻滞组)。图4B图解在90分钟p.i.，不同组织中γ-和α-区域异构体之间的生物分布的比较(虚线灰色柱：γ-区域异构体，填充黑色柱∶α-区域异构体)。

表1:在不同时间点，负载KB肿瘤异种移植物的裸鼠中采用γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的离体生物分布研究

表2:在不同时间点，负载KB肿瘤异种移植物的裸鼠中采用α-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的离体生物分布研究

实施例11∶PET成像研究

采用Explore VISTA PET/CT断层摄影(GE)进行PET实验，其得到小于0.9mm的超高分辨率。

将动物轻轻束缚，经由尾侧静脉注射10-14MBq的γ-[¹⁸F]-葡萄糖叶酸(每次注射100-150μL)。对于阻滞研究，在注射放射性示踪剂之前10min，经由静脉注射使动物接受溶于PBS中的过量的叶酸(100μg/100μL)。用在空气/氧气混合物中的异氟烷将动物麻醉。在注射后75-105分钟获取bThe PET扫描。采用Amira(版本4)后处理软件，分析PET和CT的融合数据集。

使用[¹⁸F]-葡萄糖叶酸的γ-和α-区域异构体的PET研究得到良好的两个肩部上KB肿瘤异种移植物的图像。而且，吸收是高度特异性的，且被天然叶酸所阻断。图5A,B显示在时间点75-105min p.i.两个异构体的PET图像。图5B为阻滞组的PET图像。符号显示下述器官/组织∶(a)∶肿瘤，(b)∶肝脏，(c)∶胆囊，(d)∶肾脏，(e)∶肠/粪便。

Claims

1.式I的化合物，

其中

Z为蝶酸酯基或其衍生物，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，和

Q₁,Q₂彼此独立地为H、保护基或下式的基团

-L-A-L′-¹⁸F,

其中

L、L′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，和

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂中的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。.

2.根据权利要求1的化合物，具有式Ia、Ib、Ic，

Ic

其中

Z为蝶酸酯基或其衍生物，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

A₁、A₂彼此独立地为糖基，和

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基。

3.根据权利要求1的化合物，具有式II

II

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

Q₁、Q₂彼此独立地为H、保护基或下式的基团

-L-A-L′-¹⁸F,

其中

L、L′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-50)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，和

A为糖基，

条件是Q₁和Q₂中的至少一个为式-L-A-L′-¹⁸F的基团。

4.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式IIa、IIb、IIc

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，,

p为0或1，

A₁、A₂彼此独立地为糖基，和

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基。

5.根据任一项前述权利要求的化合物，其中所述糖基为基于吡喃糖苷的环状单糖或环状寡糖，优选地选自阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖，或基于呋喃糖苷的环状单糖或环状寡糖，优选地选自核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。

6.根据任一项前述权利要求的化合物，其中所述糖基为选自葡萄糖和半乳糖的环状单糖。

7.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式IIIa、IIIb、IIIc，

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

Y₁、Y₂彼此独立地为O、N或S，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

L₁、L₁′、L₂、L₂′彼此独立地为连接基，比如共价键或直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：CN、Hal、OH、NH₂、CO₂H、NO₂，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′-、-NR′-CO-O-、-O-CO-NR′-、-NR′-CO-NR′-、-CH=CH-、-C≡C-、-O-CO-O-、-S-R′-、-SO₃R′-、或五-或六-元杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基，

B₁、B₂彼此独立地为H或保护基，

R₆、R₉为H或C(1-8)烷基，和

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

8.根据权利要求2至7中任一项的化合物，其中L₁和L₂彼此独立地为直链或支链的C(1-24)烷基，其为未取代的或被至少一个选自下述的基团取代：Hal、OH、NHR′、CO₂R′，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′、或五-或六-元杂环，优选五元氮杂杂环，其中R′代表H或C(1-8)烷基。

9.根据权利要求2至8中任一项的化合物，其中L₁和L₂彼此独立地为式(a)、(b)、(c)或(d)的基团，

其中

R″为H或直链或直链的C(1-8)烷基，其为未取代的或被至少一个CN、Hal或NO₂所取代，

Sp为间隔基(连接至Y₁和/或Y₂)，比如直链或支链的C(1-8)烷基，其为未取代的或其中至少一个-CH₂-基团被-OH、-NHR′或-COOR′所取代，其中R′代表H或C(1-8)烷基，和

q为0、1、2、3或4。

10.根据权利要求2至9中任一项的化合物，其中L1′和L2′优选地为共价键或直链或支链的C(1-24)烷基，更优选C(1-12)烷基，最优选C(1-6)烷基，其为未取代的或被至少一个选自Hal、OH、NHR′、CO₂R′的基团所取代，并且其中一个或多个不相邻的CH₂基团可以独立地被选自下述的基团替代：-O-、-CO-O-、-O-CO-、-NR′-、-NR′-CO-、-CO-NR′，其中R′代表H或C(1-8)烷基。

11.根据任一项前述权利要求的化合物，其中Y₁和/或Y₂为N，B₂为甲酰胺保护基。

12.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式IVa、IVb、IVc、IVd

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

Y₁为O、N或S，

B₁为H或保护基，

q为0、1、2、3或4，

R₆为H或C(1-8)烷基，和

R₇、R₈彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

13.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式Va、Vb、Vc、Vd

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

Y₂为O、N或S，

B₂为H或保护基，

q为0、1、2、3或4，

R₉为H或C(1-8)烷基，和

R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

14.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式VIa、VIb、VIc、VId

其中

X₁至X₅彼此独立地为C、N或O，优选N或O，

m为1、2或3，

r具有1至7的值，

p为0或1，

q为0、1、2、3或4，

R₆、R₉为H或C(1-8)烷基，和

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

15.根据任一项前述权利要求的化合物，其中m为2。

16.根据权利要求9至15中任一项的化合物，其中q为0。

17.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式VIIa、VIIb、VIIc、VIId

其中

Y₅选自H、亚硝基、C(1-12)烷基、-OR′、-COR′和卤素取代的-COR′，其中R′为H或C(1-12)烷基，

m为1、2或3，

Y₁为O、N或S，

B₁为H或保护基，

q为0、1、2、3或4，

R₆为H或C(1-8)烷基，和

R₇、R₈彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

18.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId

其中

m为1、2或3，

Y₂为O、N或S，

B₂为H或保护基，

q为0、1、2、3或4，

R₉为H或C(1-8)烷基，和

R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

19.根据任一项前述权利要求的化合物，具有式IXa、IXb、IXc、IXd

其中

m为1、2或3，

q为0、1、2、3或4，

R₆、R₉彼此独立地为H或C(1-8)烷基，和

R₇、R₈、R₁₀、R₁₁彼此独立地为H、-OH或-OC(1-8)烷基。

20.药物组合物，包含至少一种根据任一项前述权利要求的化合物。

21.根据权利要求1至19的化合物或根据权利要求20的药物组合物在体外或体内用于表达叶酸-受体的细胞或细胞群的诊断成像的用途。

22.根据权利要求1至19的化合物或根据权利要求20的药物组合物方便有效地给药至需要的受试者用于诊断成像的用途。

23.用于表达叶酸-受体的细胞或细胞群的诊断成像的方法，所述方法包括以诊断成像量施用至少一种根据权利要求1至19的化合物的步骤，以及获得所述细胞或细胞群的诊断图像的步骤。

24.根据权利要求23的方法，其中体外或体内对表达叶酸-受体的细胞或细胞群进行诊断成像。

25.用于体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞的方法，其包括使所述组织样品与有效量的根据权利要求1至19的化合物接触并且达到足够的时间和条件，使结合发生并通过PET成像检测此结合。

26.诊断成像和/或监测受试者的方法，包括步骤：(i)施用诊断成像量的至少一种根据权利要求1到19的化合物，(ii)使用PET通过检测来自所述至少一种化合物的信号进行诊断成像。

27.监测受试者中癌症治疗的方法，包括步骤：(i)向有此需要的受试者施用诊断成像量的至少一种根据权利要求1至19的化合物与所选治疗活性化合物的组合，和(ii)使用PET通过检测来自所述至少一种化合物的信号进行诊断成像，以跟踪观察癌症治疗过程。

28.权利要求26或27方法，与癌症诊断或治疗的任一种其它方法组合使用。