CN103728401A

CN103728401A - 一种双三氟虫脲残留量的测定方法

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Publication number: CN103728401A
Application number: CN201410007694.1A
Authority: CN
Inventors: 崔淑华; 赵晗; 衣维贤; 于晓云; 王静; 王兴华
Original assignee: Individual
Current assignee: Qingdao Customs Technology Center
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2034-01-07
Also published as: CN103728401B

Abstract

本发明公开了一种双三氟虫脲残留量的测定方法，用乙腈或1%乙酸乙腈均质提取样品中残留的双三氟虫脲，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷键合相（C₁₈）基质分散净化，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用空白基质溶液稀释标准建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为88.7%～92.5%，平均相对标准偏差（RSD）为2.7%～4.6%，检出限低于0.52μg/kg，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足韩国、日本等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种双三氟虫脲残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种双三氟虫脲残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量测定蔬菜、水果和茶叶中残留的双三氟虫脲含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

鳞翅目害虫是我国大部分地区蔬菜和水果生产中的重要害虫，危害严重的害虫有小菜蛾、菜青虫、甜菜夜蛾，斜纹夜蛾、苹果蠹蛾和潜叶蛾等。近年来，鳞翅目害虫发生频率不断增长，危害程度不断加重，时常有爆发成灾的报道。而农药的大量不合理使用使害虫对多种常规农药产生了高水平的抗药性，为控制害虫爆发危害，国内外研究者开发了一些高效、超高效、低毒新型农药品种来防治鳞翅目害虫的危害。

双三氟虫脲(Bistrifluron)是韩国东宝化学公司从2000多个苯甲酰脲衍生物中筛选出的高活性昆虫生长调节剂，属于新型2-氯-3，5-双(三氟甲基)苯基苯甲酰基脲衍生物，结构新颖，作用机制独特且生物活性高。双三氟虫脲对昆虫具有显著的生长发育抑制作用，该化合物抑制昆虫几丁质形成，影响内表皮生成，使昆虫不能顺利蜕皮而死亡，能有效防治蔬菜、茶叶、棉花等多种植物的大多数鳞翅目害虫，对白粉虱有特效，对抗性害虫普遍有效，且对作物、天敌、人畜和环境高度安全，其制剂10%SC、10%EC正在韩国使用，主要用于蔬菜、果树防治鳞翅目害虫。双三氟虫脲是应用前景很好的防治鳞翅目害虫的杀虫剂。

随着双三氟虫脲的登记、推广和使用，作为我国蔬菜和水果主要出口市场的韩国和日本对其制定了残留限量标准。韩国规定双三氟虫脲在黄瓜、大葱、白菜、辣椒、甜椒等蔬菜中的最大允许残留量为0.2～2.0mg/kg、在西瓜、苹果、桃子、梨等水果中的最大允许残留量为0.2～1.0mg/kg；日本规定双三氟虫脲在蔬菜、水果和茶叶等食品中实行0.01mg/L的“一律标准”。

国外有三篇关于果蔬中双三氟虫脲残留量检测方法的报道，其中有两种方法采用液相色谱-紫外检测器进行分析，另一种方法采用ELISA方法进行检测。这三种检测方法均存在前处理操作步骤繁琐，不能对其进行准确定性的缺点。因此，建立简便、快速、能准确定性和定量分析蔬菜、水果和茶叶中双三氟虫脲残留量检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔬菜、水果和茶叶中双三氟虫脲残留量的测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种双三氟虫脲残留量的测定方法，包括如下步骤：

（1）提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在0.5～200μg/L范围内，配制至少5个浓度的双三氟虫脲系列浓度标准工作液。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中双三氟虫脲的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中双三氟虫脲含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中双三氟虫脲残留量。若上机溶液中双三氟虫脲残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

步骤（1）中样品若为脱水果蔬或茶叶，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。

步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。

步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	50-80	20-50
2	1.0	4-10	90-96
				3	5.0	4-10	90-96
4	5.1	50-80	20-50
				5	11.0	50-80	20-50

A和B的%是体积比例。

步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱（ESI）检测，电喷雾电压为-3500至-4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）负离子扫描模式，双三氟虫脲的母离子444.8～445.2，子离子分别为261.9～262.3和388.9～389.3。

步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜、水果和茶叶中双三氟虫脲定性确证和定量检测，平均回收率为88.7%～92.5%，平均相对标准偏差（RSD）为2.7%～4.6%，检出限低于0.52μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足韩国、日本等国家对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为浓度为5.0ng/mL的双三氟虫脲多反应监测色谱图。

图2为白菜空白样品的多反应监测色谱图。

图3为茶叶空白样品的多反应监测色谱图。

图4为以白菜为基质配制的双三氟虫脲标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器（IKA，Germany）；5810R离心机（Eppendorf，Germany）；MS3基本型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附剂（40～60μm）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）净化剂（40～60μm）均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂：乙腈（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；

无水硫酸镁和氯化钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度≥98.0%，购自Sigma公司。

实施例1：白菜中双三氟虫脲残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的白菜10.0g于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，5000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mg C₁₈和50mg PSA的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。取上清液过0.22μm滤膜后，待测定。

（2）标准工作溶液的配制

准确称取25±0.1mg标准品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；称取10g白菜空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行双三氟虫脲含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中双三氟虫脲的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中双三氟虫脲含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中双三氟虫脲残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，Eclipse plus C₁₈，2.1mm×100mm，粒径3.5μm；

流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵）；（B）乙腈；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	60	40
2	1.0	5	95
				3	5.0	5	95
4	5.1	60	40
				5	11.0	60	40

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描，负离子模式；

电喷雾电压：-4000V；

雾化气压力：275.9kPa；

干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM负离子检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3白菜空白基质中双三氟虫脲的标准曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				双三氟虫脲	4.97	Y=1892.5X+5.318	1.0000

加标回收率和重复性：

在不含双三氟虫脲的白菜中加入10、20、200和2000μg/kg4个浓度水平的双三氟虫脲标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，2000μg/kg添加浓度的样品待测液用乙腈稀释10倍后再用LC-MS/MS测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在4个加标水平上，双三氟虫脲的平均回收率为88.7%～92.5%，平均相对标准偏差（RSD）为3.0%～4.6%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4双三氟虫脲的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的双三氟虫脲基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（白菜的浓缩倍数为0.5倍）计算检出限，双三氟虫脲的检出限为0.064μg/kg。

实施例2：茶叶中双三氟虫脲残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的茶叶2.0g于50mL离心管中，加入5mL水复苏30min后，准确加入20mL1%乙酸乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁、2g乙酸钠和3mL水，涡旋1min后，5000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mg C₁₈和50mg PSA的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min，将上清液过0.22μm滤膜于棕色进样小瓶，待LC-MS/MS测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取2g茶叶空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，用其稀释配制0.5、1、2、5、10、20、50、100ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

操作步骤、色谱和质谱条件、定性鉴定等同上述白菜样品的操作和条件。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为Y=1793.8X-1815.6，相关系数为0.9998。

加标回收率和重复性：

在不含双三氟虫脲的茶叶中加入20、40、200和1000μg/kg4个浓度水平的双三氟虫脲标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在4个加标水平上，双三氟虫脲的平均回收率为88.9%～91.1%，平均相对标准偏差（RSD）为2.7%～4.4%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表5双三氟虫脲的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的双三氟虫脲基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（茶叶的浓缩倍数为0.1倍）计算检出限，双三氟虫脲的检出限为0.52μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠，剧烈涡旋1min后离心；

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜；

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在0.5～200μg/L范围内，配制至少5个浓度的双三氟虫脲系列浓度标准工作液；

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中双三氟虫脲的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中双三氟虫脲含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中双三氟虫脲残留量；若上机溶液中双三氟虫脲残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

2.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中样品若为脱水果蔬或茶叶，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

4.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。

5.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈。

6.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

序号时间（min） A（%） B（%） 1 0 50-80 20-50

2 1.0 4-10 90-96 3 5.0 4-10 90-96 4 5.1 50-80 20-50 5 11.0 50-80 20-50

7.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈。

8.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为-3500至-4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

9.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）负离子扫描模式，双三氟虫脲的母离子为444.8～445.2，子离子分别为261.9～262.3和388.9～389.3。

10.根据权利要求1所述的一种双三氟虫脲残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中检测样液和基质标准工作溶液时，若样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。