CN103709013A - 一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法及应用 - Google Patents

一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法，其分子式是C6H6O2，通过乙醇超声提取，去除乙醇，水溶液经石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，减压蒸出乙酸乙酯，将得到的固体提取物超纯水中；将水溶液上样羟丙基葡聚糖凝胶树脂柱洗脱，收集洗脱液，蒸干，再用液相色谱分离纯化获得。本发明的方法可在杨树胶与蜂胶的真假鉴别中应用。通过与邻苯二酚标准品对照，根据是否检测到邻苯二酚，确定是否含有杨树胶，从而鉴别蜂胶和杨树胶，实现蜂胶质量的控制。

Description

一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法及应用
技术领域
本发明属于蜂胶质量控制方法，涉及一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法，并将其应用到蜂胶与杨树胶的鉴别。
背景技术
蜂胶是工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的一种粘稠物质。从基本组成的角度来看，蜂胶中主要包括大约50%的树酯和树香、30%的蜂蜡、10%的芳香挥发油、5%的花粉以及5%的杂质。其化学成分及其复杂，目前已从蜂胶中分离出包括类黄酮类、萜烯类、酚酸类等化合物600多种。研究表明，蜂胶的化学成分与其地理来源、植物来源、采集蜂种、采胶季节以及采胶方式都有着密切的关系。根据蜂胶的植物来源，已发现的蜂胶主要可以分为五种类型：杨属型、酒神菊属型、克鲁西属型、血桐属型和地中海东部地区型。
近年来随着其广泛的生物活性不断地被证实，蜂胶也被开发成各种保健药品用来预防和治疗类风湿、关节炎、心脏病、糖尿病以及口腔疾病等，受到了广大消费者的亲睐，也被誉为“紫色黄金”的美称。然而，蜂胶的生产受到蜂种、采胶方式以及胶源等多个因素的影响，其产量相对较低，一直处于供不应求的状况。在我国，一些不法商贩为了获取高额的利润，利用杨树芽提取物与杨树型蜂胶提取物在成分、颜色、气味上及其相似的特点，在蜂胶中掺入不同程度的杨树胶（杨树芽提取物），已达到以次充好的目的，从而严重的损害了广大消费者的权益，极大地扰乱了社会主义市场的经济秩序。现行蜂胶国家标准，主要应用类黄酮和酚酸两大类类化合物含量作为评价蜂胶质量好坏的标准，而这两类分化学成分同时存在于杨树芽提取物和杨树型蜂胶中，使得蜂胶的真假鉴别变得相当困难。本实验室前期开发的利用HPLC技术测定杨树芽中标记性成分-水杨苷来判断蜂胶的真假的方法，由于不法商贩利用不同的化学手段，将易被水解的水杨苷成分破坏，从而使得该方法失去了原有的效价。根据近期检测结果表明，利用该方法对市场上的蜂胶进行检测，其阳性率显著下降。因此，急需筛选一种新的标志成分用来区分蜂胶与杨树胶。
通过杨树胶和大量不同地理来源的杨属型蜂胶的化学组成进行检测分析，我们发现杨树胶中存在蜂胶中不含有的特征峰，对其进行分离纯化，鉴定该峰为邻苯二酚化合物，其分子式是C6H6O2。邻苯二酚也称儿茶酚是苯的两个邻位氢被取代后形成的化合物，在所研究的杨属植物的芽、叶、花、皮中均有分布。其物理性质极其稳定，可在甲醇、酸性、碱性以及中性介质中均能稳定存在。在存在多酚氧化酶的条件下，可被氧化为1，2-苯醌，但其所需的氧化酶应具有较强的特异性，即可以氧化具有邻位二羟基的多酚类化合物。根据相关研究表明，蜜蜂中存在可以氧化邻苯二酚化合物的多酚类氧化酶，因此我们推测蜜蜂在采集蜂胶以及蜂巢内传递蜂胶的过程中，蜜蜂自身腺体分泌的多酚氧化酶将邻苯二酚大量氧化，从使其在蜂胶中消失；此外，该酶还大量存在于植物组织中，在蜜蜂咀嚼加工蜂胶的过程中能将细胞壁破坏，从而释放多酚氧化酶，将领苯二酚物质酶解。而且邻苯二酚标准品易得，价格便宜。因此，本发明选取邻苯二酚为标志成分用于区分蜂胶与杨树胶。
邻苯二酚的化学结构式：
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发明内容
本发明目的是提供一种杨树胶中邻苯二酚的分离纯化方法，其分子式是C6H6O2。本发明的目的是通过以下方案实现：
（1）粗提物的准备：取一定量的杨树芽，加入100%的乙醇（料液比1：10）超声提取30min，提取两次，过滤合并滤液，向滤液中加入体积比为1：3的超纯水，过滤，旋转蒸发去除乙醇，仅留水溶液；
（2）石油醚萃取：将步骤（1）得到的粗提水溶液经过石油醚等体积萃取两次，上相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并下相溶液；
（3）氯仿萃取：将步骤（2）得到的提取液经氯仿溶液等体积萃取两次，下相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（4）乙酸乙酯萃取：将步骤（3）得到的提取液经乙酸乙酯溶液等体积萃取两次，下相合并后再经乙酸乙酯等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（5）将步骤（4）得到的提取液35℃减压蒸出溶液中的乙酸乙酯，将得到的固体提取物溶于一定体积的超纯水中（料液比1:10）；
（6）将步骤（5）得到的水溶液上样羟丙基葡聚糖凝胶树脂柱（Sephadex LH-20），上样后的羟丙基葡聚糖凝胶树脂用100%乙醇10BV（柱床体积）洗脱，流速3ml/min，将洗脱液分管收集，每管0.5BV，共收集20管，分别进行未知峰（出峰时间为12.5min左右）检测，将富含有未知峰（出峰时间为12.5min左右）的溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A粗提物；
（7）将步骤（6）得到的物质A粗提物溶于超纯水中（料液比1：3），采用流动相比例为乙腈：水=5：95等度洗脱的方式，在流速为8.0mL/min，检测波长为213nm，进样量为10μL，色谱柱为Shrmpack ODS-C18（20×250mm, 10μm）的液相色谱条件下，采用半制备型HPLC进行物质A的进一步分离纯化；将纯化得到的物质A溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A；
（8）将步骤（7）所得的物质A 经过核磁共振（NMR）、质谱（MS）鉴定化学结构以及通高效液相色谱（HPLC）对其进行验证，与文献报道进行核实，物质A为邻苯二酚。
本发明的另一个目的是提供所述方法在杨树胶与蜂胶的真假鉴别中的应用。通过与邻苯二酚标准品对照，如果在蜂胶样品中检测到邻苯二酚，则表明为杨树胶或者是掺有杨树胶的蜂胶，如果没有检测到邻苯二酚，则为蜂胶。通过该化合物的含量测定，可估计蜂胶中掺入杨树胶的比例。 
本发明所述的区分蜂胶与杨树胶的方法，是采用液相色谱、气相色谱、薄层色谱等现代分析分离技术，通过检测是否含有邻苯二酚，鉴定蜂胶和杨树胶。杨树胶样本中含邻苯二酚，而蜂胶样本中不含有。通过该化合物的含量测定，可估计蜂胶中掺入杨树胶的比例。
本发明采用液相色谱、气相色谱、薄层色谱等现代分析分离技术区分蜂胶与杨树胶。本发明经对采自不同地区的杨属型蜂胶样本、桉树型蜂胶样本、酒神菊属型蜂胶样本、地中海型蜂胶样品以及市场购得的杨树胶样本进行反复验证，证明该特征性物质作为鉴别蜂胶与杨树胶具有一定的可行性，而且准确率较高。因此，邻苯二酚可用于区别蜂胶与杨树胶。本发明方法是将分离纯化方法应用到蜂胶真假鉴别中，从而有利于蜂胶质量的控制。
附图说明
图1为本发明特征性物质分离纯化工艺流程图。
图2 为乙酸乙酯萃取后所得物质的HPLC色谱图。
图3 为Sephadex LH-20凝胶柱纯化所得样品的HPLC色谱图，A为特征性未知物。
图4 为半制备型HPLC进一步纯化得到样品的HPLC色谱图。
图5 为特征性物质核磁共振H谱图。
图6为特征性未知物A核磁共振C谱图。 
图7 为特征性未知物A的ESI质谱（负离子）信号图谱。 
    图8为实例1邻苯二酚标准品、杨属型蜂胶及杨树胶的高效液相色谱图，峰A为邻苯二酚。
图9为实例2 邻苯二分标准品、桉树型蜂胶及杨树胶的高效液相色谱图，峰A为邻苯二酚。
图10为实例3邻苯二酚标准品、酒神菊属型蜂胶及杨树胶的高效液相色谱图，峰A为邻苯二酚。
图11为实例4邻苯二酚标准品、地中海型蜂胶及杨树胶的高效液相色谱图，峰A为邻苯二酚。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1   一种杨树胶中特有成分的分离纯化方法
参见图1-图7，本发明通过以下方案实现：
（1）粗提物的准备：取一定量的杨树芽，加入100%的乙醇（料液比1：10）超声提取30min，提取两次，过滤合并滤液，向滤液中加入体积比为1：3的超纯水，过滤，旋转蒸发去除乙醇，仅留水溶液；
（2）石油醚萃取：将步骤（1）得到的粗提水溶液经过石油醚等体积萃取两次，上相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并下相溶液；
（3）氯仿萃取：将步骤（2）得到的提取液经氯仿溶液等体积萃取两次，下相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（4）乙酸乙酯萃取：将步骤（3）得到的提取液经乙酸乙酯溶液等体积萃取两次，下相合并后再经乙酸乙酯等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（5）将步骤（4）得到的提取液35℃减压蒸出溶液中的乙酸乙酯，将得到的固体提取物溶于一定体积的超纯水中（料液比1:10）；
（6）将步骤（5）得到的水溶液上样羟丙基葡聚糖凝胶树脂柱（Sephadex LH-20），上样后的羟丙基葡聚糖凝胶树脂用100%乙醇10BV（柱床体积）洗脱，流速3ml/min，将洗脱液分管收集，每管0.5BV，共收集20管，分别进行未知峰（出峰时间为12.5min左右）检测，将富含有未知峰（出峰时间为12.5min左右）的溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A粗提物；
（7）将步骤（6）得到的物质A粗提物溶于超纯水中（料液比1：3），采用流动相比例为乙腈：水=5：95等度洗脱的方式，在流速为8.0mL/min，检测波长为213nm，进样量为10μL，色谱柱为Shrmpack ODS-C18（20×250mm, 10μm）的液相色谱条件下，采用半制备型HPLC进行物质A的进一步分离纯化；将纯化得到的物质A溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A；
（8）将步骤（7）所得的物质A 经过核磁共振（NMR）、质谱（MS）鉴定化学结构以及通高效液相色谱（HPLC）对其进行验证，与文献报道进行核实，物质A为邻苯二酚。
实施例2
准确称取5.0 mg 邻苯二酚，用甲醇定容到100 ml。过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸 =5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图8。
取杨属型蜂胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨属型蜂胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图8。
取杨树胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图8。
实施例2
准确称取5.0 mg 邻苯二酚，用甲醇定容到100 ml。过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图9。
取桉树型蜂胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨属型蜂胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图9。
取杨树胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图9。
实施例3
准确称取5.0 mg 邻苯二酚，用甲醇定容到100 ml。过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213 nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图10。
取酒神菊属型蜂胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨属型蜂胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图10。
取杨树胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图10。
实施例4
准确称取5.0 mg 邻苯二酚，用甲醇定容到100 ml。过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图11。
取地中海型蜂胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨属型蜂胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图11。
取杨树胶0.25g，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至25 ml，过0.45 μm滤膜，用HPLC分析。采用Sepax HP-C18（4.6×150mm, 5μm）的色谱柱，流动相为乙腈: 0.5%磷酸=5: 95，流速调整至1.0 mL/min，检测波长213nm，柱温30℃，进样量5 μL。参见图11。
根据上述高效液相色谱法，分别测定了邻苯二酚标准品、杨属型蜂胶、桉树属型蜂胶、酒神菊属型蜂胶、地中海型蜂胶及杨树胶的高效液相色谱图谱，其中邻苯二酚均未在各类型蜂胶样本中检出，而在杨树胶中峰面积较大，含量较高。

Claims (3)

1.一种杨树胶中邻苯二酚的分离纯化方法，邻苯二酚分子式是C6H6O2，其特征在于， 通过以下步骤实现：
（1）粗提物准备：取杨树芽，加入100%的乙醇，料液比1：10，超声提取30min，提取两次，过滤合并滤液，向滤液中加入体积比为1：3的超纯水，过滤，旋转蒸发去除乙醇，仅留水溶液；
（2）石油醚萃取：将步骤（1）得到的粗提水溶液经过石油醚等体积萃取两次，上相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并下相溶液；
（3）氯仿萃取：将步骤（2）得到的提取液经氯仿溶液等体积萃取两次，下相合并后再经超纯水等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（4）乙酸乙酯萃取：将步骤（3）得到的提取液经乙酸乙酯溶液等体积萃取两次，下相合并后再经乙酸乙酯等体积萃取一次后，合并上相溶液；
（5）将步骤（4）得到的提取液35℃减压蒸出溶液中的乙酸乙酯，将得到的固体提取物溶于超纯水中，料液比1:10；
（6）将步骤（5）得到的水溶液上样羟丙基葡聚糖凝胶树脂柱，上样后的羟丙基葡聚糖凝胶树脂用100%乙醇10BV洗脱，流速3ml/min，将洗脱液分管收集，每管0.5BV，共收集20管，分别进行未知峰检测，将富含有未知峰的溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A粗提物；未知峰的出峰时间为12.5min左右；
（7）将步骤（6）得到的物质A粗提物溶于超纯水中，料液比1：3，采用流动相比例为乙腈：水=5：95等度洗脱的方式，在流速为8.0mL/min，检测波长为213nm，进样量为10μL，色谱柱为Shrmpack ODS-C18，色谱条件：20×250mm, 10μm，采用半制备型HPLC进行物质A的进一步分离纯化；将纯化得到的物质A溶液合并，在旋转蒸发仪上45℃蒸干得物质A；
（8）将步骤（7）所得的物质A 经过核磁共振、质谱鉴定化学结构以及通高效液相色谱对其进行验证，与文献报道进行核实，物质A为邻苯二酚。
2.根据权利要求1所述的一种杨树胶中邻苯二酚的分离纯化方法在杨树胶与蜂胶的真假鉴别中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别是通过与邻苯二酚标准品对照，如果在蜂胶样品中检测到邻苯二酚，则表明为杨树胶或者是掺有杨树胶的蜂胶，如果没有检测到邻苯二酚，则为蜂胶。
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王向平等: "气相色谱-质谱法分析蜂胶与杨树胶化学组分及鉴别研究", 《湖北农业科学》 *

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