CN103695530A - 酶-孔构建体 - Google Patents

酶-孔构建体 Download PDF

Info

Publication number
CN103695530A
CN103695530A CN201310435243.3A CN201310435243A CN103695530A CN 103695530 A CN103695530 A CN 103695530A CN 201310435243 A CN201310435243 A CN 201310435243A CN 103695530 A CN103695530 A CN 103695530A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hole
enzyme
subunit
nucleotide
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310435243.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103695530B (zh
Inventor
L·贾娅辛格
H·贝利
S·切里
B·麦基翁
J·怀特
J·克拉克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oxford Nanopore Technologies PLC
Original Assignee
Oxford Nanopore Technologies PLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxford Nanopore Technologies PLC filed Critical Oxford Nanopore Technologies PLC
Publication of CN103695530A publication Critical patent/CN103695530A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103695530B publication Critical patent/CN103695530B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体。所述孔亚基与所述酶共价结合，从而所述亚基与所述酶均保留其活性。所述构建体可用于产生其上结合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。这些孔特别可用于测序核酸。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通过随机传感来检测其组成核苷酸。

Description

酶-孔构建体
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年7月6日，申请号为200980134886.6（国际申请号为PCT/GB2009/001679），名称为“酶-孔构建体”。 
技术领域
本发明涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶（nucleic acid handling enzyme）的构建体。所述孔亚基与所述酶共价结合使得所述亚基与所述酶均保留其活性。所述构建体可用于产生结合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。这些孔特别可用于核酸测序。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通过随机传感来检测其每个组成核苷酸。 
背景技术
随机传感是一种依赖于对分析物分子与受体之间个体结合事件的观察结果的传感方法。随机传感器可通过如下方式形成：将纳米尺寸的单孔置入绝缘膜中，并且在存在分析物分子的情况下测量电压驱动的穿过所述孔的离子转运。电流波动的发生频率可揭示在所述孔中结合的分析物的浓度。分析物的种类通过其特征性的电流特征特别是电流阻断的持续时间和程度而示出(Braha,O.,Walker,B.,Cheley,S.,Kasianowicz,J.J.,Song,L.,Gouaux,J.E.,and Bayley,H.(1997)Chem.Biol.4,497-505;and Bayley,H.,and Cremer,P.S.(2001)Nature413,226-230)。 
形成细菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用于对许多类型的分子进行随机传感(Bayley,H.,and Cremer,P.S.(2001)Nature413,226-230;Shin,S.,H.,Luchian,T.,Cheley,S.,Braha,O.,and Bayley,H.(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41,3707-3709;Guan,X.,Gu,L.-Q.,Cheley,S.,Braha,O.,and Bayley,H.(2005)ChemBio Chem6,1875-1881)。在这些研究的过程中，已发现，试图将α-HL改造以直接结合小的有机分析物的尝试是很费力的，并且鲜有成功的实例 (Guan,X.,Gu,L.-Q.,Cheley,S.,Braha,O.,and Bayley,H.(2005)ChemBio Chem6,1875-1881)。幸运地是，人们发现了一种不同的策略，该策略利用了非共价结合的分子衔接体，特别是环糊精(Gu,L.-Q.,Braha,O.,Conlan,S.,Cheley,S.,and Bayley,H.(1999)Nature398,686-690)、环肽(Sanchez-Quesada,J.,Ghadiri,M.R.,Bayley,H.,and Braha,O.(2000)J.Am.Chem.Soc.122,11758-11766)和葫芦脲(Braha,O.,Webb,J.,Gu,L.-Q.,Kim,K.,and Bayley,H.(2005)ChemPhysChem6,889-892)。环糊精可短暂地进入所述α-HL孔中，并产生很大程度但不完全的通道阻断。有机分析物在环糊精的疏水内部发生结合，它们可加强这种阻断，使得可实现分析物检测(Gu,L.-Q.,Braha,O.,Conlan,S.,Cheley,S.,and Bayley,H.(1999)Nature398,686-690)。 
现在在大范围应用中需要快速且廉价的DNA或RNA测序技术。现有的技术速度慢且价格昂贵，这主要是由于其倚赖于扩增技术产生大量核酸并且需要大量专用的荧光化学物质进行信号检测。随机传感有可能通过减少所需核苷酸和试剂的量提供快速且廉价的DNA测序。 
发明内容
发明人出人意料地证明了跨膜蛋白孔亚基与核酸操作酶的共价结合，可产生既能形成孔又能操作核酸的构建体。发明人还出人意料地证明了所述构建体可用于产生一种既能操作核酸又能通过随机传感测序核酸的跨膜蛋白孔。所述酶与所述孔的固定性质与紧密接近是指靶核酸中的核苷酸的一部分会与所述孔相互作用并以特征性的方式影响流过所述孔的电流。因此，包含这种构建体的跨膜蛋白孔是用于随机传感特别是用于测序核酸的有用工具。 
因此，本发明提供了一种包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体，其中所述亚基与所述酶共价结合，其中所示亚基保留其形成孔的能力并且其中所述酶保留其操作核酸的能力。本发明还提供了： 
-一种编码本发明构建体的核酸序列； 
-一种用于测序核酸的改性孔，包含至少一种本发明构建体； 
-一种产生用于测序核酸的经改变的孔的试剂盒，包含： 
(a)至少一种本发明构建体；和 
(b)形成孔所需的任何其他亚基； 
-一种产生用于测序核酸的经改变的孔的试剂盒，包含： 
(a)至少一种本发明的多核苷酸；和 
(b)编码形成孔所需的任何其他亚基的多核苷酸序列； 
-一种产生本发明构建体的方法，包括： 
(a)使核酸操作酶与跨膜蛋白孔亚基共价结合；和 
(b)确定所得构建体是否能够形成孔和操作核酸； 
-一种产生本发明的经改变的孔的方法，包括： 
(a)使核酸操作酶与跨膜蛋白孔共价结合；和 
(b)确定所得孔是否能够操作核酸并检测核酸； 
-一种产生本发明的经改变的孔的方法，包括： 
(a)使至少一种本发明构建体与其他合适的亚基形成孔；和 
(b)确定所得孔是否能够操作核酸并检测核苷酸； 
-一种纯化包含至少一种本发明构建体的跨膜孔的方法，包括： 
(a)提供所述至少一种构建体与形成孔所需的其他亚基； 
(b)使所述至少一种构建体与其他亚基在合成脂质囊泡上寡聚体化；和 
(c)使所述囊泡与非离子表面活性剂接触；和 
(d)回收所述寡聚体化的孔； 
-一种测序靶核酸序列的方法，包括： 
(a)使所述靶序列与本发明的孔——其包含核酸外切酶——接触，从而使所述核酸外切酶从所述靶序列的一端消化单个核苷酸； 
(b)使所述核苷酸与所述孔接触从而使所述核苷酸与所述衔接体相互作用； 
(c)测量在相互作用过程中通过所述孔的电流并且从而确定所述核苷酸的种类；和 
(d)在靶序列的同一端重复步骤(a)到(c)从而确定所述靶序列的序列；以及 
-一种测序靶核酸序列的方法，包括： 
(a)使所述靶序列与本发明的孔接触从而使所述酶将所述靶序列推过或拉过所述孔，所述靶序列中核苷酸的一部分与所述孔相互作用；和 
(b)测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流并且从而确定所述靶序列的序列。 
附图说明
图1示出了核酸外切酶如何催化磷酸二酯键的水解。在所述核酸外切酶的活性位点内，水分子能够与多核苷酸(DNA)的3’末端的磷酸基反应。磷酸基与糖之间的键向5’端的断裂可释放出单磷酸（脱氧）核苷。 
图2示出了实施例中所用的核酸外切酶的晶体结构，对每种核酸外切酶均示出了N和C末端及活性位点：i)适应性修改形式的EcoExoIII；ii)EcoExoI；iii)TthRecJ-cd；和iv)Lambda exo。 
图3示出了装配有α-HL孔的核酸外切酶的示意图。核酸外切酶与所述七聚体的七个单体之一在基因上融合，其中连接臂足够长以使得核酸外切酶部分和α-HL部分可正确蛋白折叠。 
图4示出了所产生的蛋白构建体的通式图，其示出了在α-HL基因中的BspEI插入位点。由编码（丝氨酸/甘氨酸）×5重复物（显示为阴影）的两段DNA界定的连接物AfuExoIII可产生一个融合蛋白，其中在所示T7启动子的转录控制下会产生64.5kDa的蛋白。 
图5示出了α-HL环1融合构建体与野生型α-HL以不同蛋白比例的寡聚体化。i)HL-wt-EcoExoIII-L1-H6；ii)HL-RQC-EcoExoI-L1-H6；和iii)HL-RQC-TthRecJ-L1-H6。 
图6示出了通过不同单体比例控制同七聚体和异七聚体的产生。HL-RQ亚基以白色示出，融合亚基以黑色示出。增大融合亚基与野生型亚基的比例可增加2:5、1:6和0:7的异七聚体和同七聚体的产生。类似地，升高HL-RQ单体的浓度可增加6:1和5:2的异七聚体的产生。 
图7示出了含有刚性聚脯氨酸EcoExoIII C末端接头的 HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6融合蛋白的寡聚体化。在纯化的兔红细胞膜的存在下，IVTT表达以5:1的野生型与融合蛋白的比例混合的蛋白。i)HL-RQC-EcoExoIII-L1-{SG}5+{SG}5-H6；ii)HL-RQC-EcoExoIII-L1-{SG}5+5P-H6；iii)HL-RQC-EcoExoIII-L1-4SG+5P-H6;和iv)HL单体。 
图8示出了具有成熟七聚体的单α-溶血素亚基的环2区。亚基1以白色示出，亚基2-7以灰色示出，亚基1的环2区以黑色示出。 
图9示出了其他环2EcoExoIII融合蛋白的寡聚体化。i) 
HL-(RQ)7；ii)HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2a-H6)1；iii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2a-8P-H6)1；iv) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-H48Δ-H6)1；v) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D45Δ-H6)1；vi) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D45-K46Δ-H6)1；和vii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D45-N47Δ-H6)1。 
图10示出了其他环2EcoExoIII融合蛋白的寡聚体化。i) 
HL-(RQ)7；ii)HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2a-H6)1；iii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D45-N47Δ-H6)1；iv) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D46-K56Δ-H6)1；v) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D46Δ-H6)1；vi) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D46-N47Δ-H6)1；vii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-A1-S16Δ/D46-N47Δ-H6)1；viii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-F42-D46Δ-H6)1；和ix) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-I43-D46Δ-H6)1。 
图11示出了EcoExoIII C末端融合蛋白的寡聚体化。a)指示溶血素和酶融合蛋白单体均被放射性标记，b)指示仅融合蛋白单体被放射性标记。i)HL-(RQ)6(RQC-EcoExoI-Cter-{SG}8-H6)1;ii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoI-Cter-DG{SG}8-H6)1;iii) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoI-Cter-WPV{SG}8-H6)1;iv) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoI-Cter-DGS{P}12-H6)1;和v) 
HL-(RQ)6(RQC-EcoExoI-Cter-WPV{P}12-H6)1。 
图12示出了不同表面活性剂对EcoExoIII活性的效应。左图— 十二烷基硫酸钠(SDS)：a:0%；b:0.1%；c:0.5%。右图——正十二烷基-D-麦芽糖苷(DDM)：a:0%；b:0.1%；c:0.25%；d:0.5%。 
图13示出了大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLyS表达的α-溶血素单体的寡聚体化，用于优先形成和纯化6:1异七聚体。将His-标签纯化用于在异七聚体和野生型同七聚体之间进行选择，以得到大量过量的6:1异七聚体。 
图14示出了单体和异七聚体融合蛋白的核酸外切酶活性。左图——野生型和融合单体的活性：a,10-2稀释的 
HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6；b,10-4稀释的 
HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6；c,10-6稀释的 
HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6；d,10-2稀释的HL-RQ。右 
图——HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1的活性：a,DDM粗提取物；b,纯化的Ni-NTA；c,纯化的Ni-NTA和缓冲液置换。 
图15示出——HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1异七聚体的碱基检测。上迹线获自与am6-amPDP1-βCD衔接体分子共价结合的异七聚体。可观察到其他阻断事件，所述阻断事件是由进行碱基识别的单个单磷酸核苷造成的。下图表示出了上迹线的DNMP事件的相应直方图。从左到右，峰分别对应G、T、A和C。数据在400/400mM KCl、180mV和10μM dNMP下获取。 
序列表说明 
SEQ ID NO:1示出了编码野生型α-溶血素(α-HL)的一个亚基的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:2示出了野生型α-HL的一个亚基的氨基酸序列。氨基酸2-6、73-75、207-209、214-216和219-222构成α-螺旋。氨基酸22-30、35-44、52-62、67-71、76-91、98-103、112-123、137-148、154-159、165-172、229-235、243-261、266-271、285-286和291-293构成β-链。所有其他非末端氨基酸，即7-21、31-34、45-51、63-66、72、92-97、104-111、124-136、149-153、160-164、173-206、210-213、217、218、223-228、236-242、262-265、272-274和287-290构成环区。氨基酸1和294为末端氨基酸。 
SEQ ID NO:3示出了编码α-HL M113R/N139Q(HL-RQ)的一个亚基的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:4示出了α-HL M113R/N139Q(HL-RQ)的一个亚基的氨基酸序列。在野生型α-HL中构成α-螺旋、β-链和环区的相同氨基酸在此亚基中构成相应的区域。 
SEQ ID NO:5示出了pT7α-HL BspEI敲除的多核苷酸序列(pT7-SC1_BspEI-KO)。α-HL编码序列在核苷酸2709和3593之间。BspEI其余部分位于核苷酸3781和3782。 
SEQ ID NO:6示出了在位置1(L1)含有BspEI克隆位点的编码野生型α-溶血素的一个亚基的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:7示出了在位置2(L2a)含有BspEI克隆位点的编码野生型α-溶血素的一个亚基的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:8示出了在位置2(L2b)含有BspEI克隆位点的编码野生型α-溶血素的一个亚基的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:9示出了源于大肠杆菌的xthA基因的密码子优化的多核苷酸序列。其编码大肠杆菌的核酸外切酶III。 
SEQ ID NO:10示出了大肠杆菌的核酸外切酶III的氨基酸序列。此酶以3’到5’方向从双链DNA(dsDNA)的一条链持续消化5’单磷酸核苷。酶在链上的启动需要大约4个核苷酸的5’突出。氨基酸11-13、15-25、39-41、44-49、85-89、121-139、158-160、165-174、181-194、198-202、219-222、235-240和248-252构成α-螺旋。氨基酸2-7、29-33、53-57、65-70、75-78、91-98、101-109、146-151、195-197、229-234和241-246构成β-链。所有其他非末端氨基酸8-10、26-28、34-38、42、43、50-52、58-64、71-74、79-84、90、99、100、110-120、140-145、152-157、161-164、175-180、203-218、223-228、247和253-261构成环。氨基酸1和267和268为末端氨基酸。酶活性位点通过连接β1-α1、β3-β4、β5-β6、βIII-αI、βIV-αII和βV-βVI的环区（分别由氨基酸8-10、58-64、90、110-120、152-164、175-180、223-228和253-261构成）形成。单个二价金属离子结合于残基E34并通过D229和H259组氨酸-天门冬氨酸催化对辅助对磷酸二酯键的亲核攻击。 
SEQ ID NO:11示出了源于大肠杆菌的sbcB基因的密码子优化的 多核苷酸序列。其编码大肠杆菌的核酸外切酶I(EcoExoI)。 
SEQ ID NO:12示出了大肠杆菌的核酸外切酶I(EcoExoI)的氨基酸序列。此酶以3’到5’方向从单链DNA(ssDNA)持续消化5’单磷酸核苷。酶在链上的启动需要至少12个核苷酸。氨基酸60-68、70-78、80-93、107-119、124-128、137-148、165-172、182-211、213-221、234-241、268-286、313-324、326-352、362-370、373-391、401-454和457-475构成α-螺旋。氨基酸10-18、28-26、47-50、97-101、133-136、229-232、243-251、258-263、298-302和308-311构成β-链。所有其他非末端氨基酸19-27、37-46、51-59、69、79、94-96、102-106、120-123、129-132、149-164、173-181、212、222-228、233、242、252-257、264-267、287-297、303-307、312、325、353-361、371、372、392-400、455和456构成环。氨基酸1-9为末端氨基酸。所述酶的整体折叠使得三个区域联合以形成一个字母C外形的分子,但无序分布在所述晶体结构中的残基355-358有效地将此C形转化为类O形。氨基末端(1-206)可构成外切酶结构域并与DnaQ超家族具有同源性，如下残基（202-354）构成SH3样结构域并且羧基结构域(359-475)伸出外切酶结构域，以形成该分子的C形。EcoExoI的4个酸性残基与DnaQ超家族的活性位点残基是保守的（对应于D15、E17、D108和D186）。已经提出，单个金属离子被残基D15和108结合。DNA的水解似乎通过以活性水分子攻击易切断的磷酸基进行催化，以H181为催化残基并比对所述核苷酸底物。 
SEQ ID NO:13示出了源于嗜热栖热菌(T.thermophilus)的recJ基因的密码子优化的多核苷酸序列。其编码嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。 
SEQ ID NO:14示出了嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。此酶以5’到3’方向从单链DNA持续消化5’单磷酸核苷。酶在链上的启动需要至少4个核苷酸的链。氨基酸19-33、44-61、80-89、103-111、136-140、148-163、169-183、189-202、207-217、223-240、242-252、254-287、302-318、338-350和365-382形成α-螺旋。氨基酸36-40、64-68、93-96、116-120、133-135、294-297、321-325、328-332、352-355和359-363构成β-链。所有其他非末端氨基酸34、35、41-43、 62、63、69-79、90-92、97-102、112-115、121-132、141-147、164-168、184-188、203-206、218-222、241、253、288-293、298-301、319、320、326、327、333-337、351-358和364构成环。氨基酸1-18和383-425为末端氨基酸。仅对嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的RecJ的核心结构域（残基40-463）解析了晶体结构。为确保所述RecJ核心结构域的翻译和体内表达的启动，在其氨基末端添加一个甲硫氨酸残基，这不包含在晶体结构信息中。所解析的结构示出了由一个长α-螺旋(254-287)连接的两个结构域：氨基区（2-253）和羧基区（288-463）。催化残基（D46、D98、H122和D183）配位单二价金属离子用于对磷酸二酯键进行亲核攻击。D46和H120被认为是催化对；然而，大肠杆菌的RecJ中这些保守残基的任一个的突变均显示会完全破坏活性。 
SEQ ID NO:15示出了源于噬菌体λ的exo(redX)基因的密码子优化的多核苷酸序列。其编码噬菌体λ的核酸外切酶。 
SEQ ID NO:16示出噬菌体λ的核酸外切酶的氨基酸序列。该序列是装配为三聚体的三个相同亚基之一。该酶以3’到5’方向高度持续消化dsDNA的一条链的核苷酸。酶在链上的启动优选地需要大约4个具有5’磷酸基的核苷酸的5’突出。氨基酸3-10、14-16、22-26、34-40、52-67、75-95、135-149、152-165和193-216构成α-螺旋。氨基酸100-101、106-107、114-116、120-122、127-131、169-175和184-190构成β-链。所有其他非末端氨基酸11-13、17-21、27-33、41-51、68-74、96-99、102-105、108-113、117-119、123-126、132-134、150-151、166-168、176-183、191-192、217-222构成环。氨基酸1、2和226为末端氨基酸。λ外切酶是一个同三聚体，其形成具有通过中间的锥形通道的环状体，所述通道明显足够大以使dsDNA在一端进入，并且只有ssDNA在另一端出来。催化残基未确定，但单个二价金属离子似乎通过残基D119、E129和L130结合在每个亚基上。 
SEQ ID NO:17示出了编码实施例中所用的HL-wt-EcoExoIII-L1-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:18示出了实施例中所用的HL-wt-EcoExoIII-L1-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:19示出了编码实施例中所用的HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:20示出了实施例中所用的HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:21示出了编码实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-L1-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:22示出了实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-L1-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:23示出了编码实施例中所用的HL-RQC-TthRecJ-L1-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:24示出了实施例中所用的HL-RQC-TthRecJ-L1-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:25示出了编码实施例中所用的HL-RQC-EcoExoIII-L2-D45-N47Δ-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:26示出了实施例中所用的HL-RQC-EcoExoIII-L2-D45-N47Δ-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:27示出了编码实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-Cter-{SG}8-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:28示出了实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-Cter-{SG}8-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:29示出了编码实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-Cter-DG{SG}8-H6的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO:30示出了实施例中所用的HL-RQC-EcoExoI-Cter-DG{SG}8-H6的一个亚基的氨基酸序列。 
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32示出了实施例的核酸外切酶测定中所用的寡核苷酸序列。 
具体实施方式
应理解，所公开的产物和方法的不同用途可根据本领域内的具体需要进行调整。还应理解，本文所用的术语只是为了描述本发明的具体实施方案，而非意图进行限制。 
此外，除非上下文另有清楚的指明，否则本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数指代物。因此，例如，提及“一个构建体”也包括“多个构建体”，提及“一个跨膜蛋白孔”包括两个或更多个这类孔，提及“一个分子衔接体”包括两个或多个所述衔接体，等等。 
本文中——无论在上文还是下文——引用的全部出版物、专利和专利申请均以引用的方式全文纳入本文。 
构建体
本发明提供了可用于测序核酸的构建体。所述构建体包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶。所述亚基与所述酶共价结合。本发明构建体是形成能够通过随机传感测序核酸的孔的有用工具。本发明构建体特别可用于产生既可操作靶核酸序列又可辨别靶序列中不同核苷酸的跨膜蛋白孔。如下文更详细描述的，所述酶操作靶核酸的方式使得所述孔可识别靶序列中的核苷酸并从而测序所述靶序列。 
所述亚基保留其形成孔的能力。构建体形成孔的能力可使用本领域任何已知方法测定。例如，可将所述构建体和其他合适的亚基一块插入膜中，并可确定其寡聚体化以形成孔的能力。将构建体和亚基插入膜例如脂质双层的方法为本领域所知。例如，可将构建体和亚基以纯化形式悬浮于含有脂质双层的溶液中，这样使其扩散至所述脂质双层，并且通过结合于所述脂质双层并装配为功能状态而插入。或者，可使用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请PCT/GB2006/001057(以WO2006/100484公开)记载的“拾取放置（pick and place）”法将构建体和亚基直接插入到所述膜中。构建体形成孔的能力通常可如实施例中所述进行测定。 
所述酶保留有其操作核酸的能力。这使得所述构建体可形成用于测序如下文所述核酸的孔。构建体操作核酸的能力可使用任何本领域已知的方法测定。例如，可测试构建体或由所述构建体形成的孔操作具体核酸序列的能力。构建体或孔操作核酸的能力通常可如实施例中所述进行测定。 
本发明的一种构建体可形成孔的一部分。或者，构建体可以是分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的。如果构建体完全不含 任何其他组分如脂质或其他孔单体，则该构建体是分离的或纯化的。如果构建体与不干扰其预计用途的载体或稀释剂混合，则该构建体是基本分离的。例如，如果构建体以包含小于10%、小于5%、小于2%或小于1%的其他组分如脂质或其他孔单体的形式存在，则该构建体是基本分离或基本纯化的。本发明的一种构建体可以以脂质双层的形式存在。 
结合 
所述亚基与所述酶共价结合。所述亚基可在不止一点例如两点或三点上与所述酶结合。使所述亚基与所述酶在不止一点上结合的方法可用于限制所述酶的可动性。例如，多点结合可用于限制所述酶转动或离开所述亚基的自由度。 
当所述亚基与所述酶结合时（表达后修饰），其可以是单体的形式。或者，当所述亚基与酶结合时（寡聚体化后修饰），其可以是寡聚孔的一部分。 
可使用任何本领域已知的方法使所述亚基与所述酶共价结合。所述亚基和酶可单独产生，然后结合在一起。所述两种组分可以以任意构型结合。例如，它们可通过其末端（即氨基末端或羧基末端）氨基酸结合。合适的构型包括但不限于所述酶的氨基末端结合于所述亚基的羧基末端，反之亦然。或者，所述两种组分可通过它们序列内部的氨基酸结合。例如，所述酶可结合于所述亚基的环区的一个或多个氨基酸。在一个优选实施方案中，所述酶的末端氨基酸结合于一个亚基的环区中的一个或多个氨基酸。末端氨基酸和环区如上文所讨论。 
在一个优选实施方案中，所述亚基与所述酶在基因上融合。如果整个构建体由单个多核苷酸序列表达，则亚基与酶在基因上融合。所述亚基和酶的编码序列可以以任何方式组合以形成编码所述构建体的单个多核苷酸序列。 
所述亚基和酶可以以任何构型在基因上融合。所述亚基和酶可以通过它们的末端氨基酸在基因上融合。例如，所述酶的氨基末端与所述亚基的羧基末端融合，反之亦然。优选将所述酶的氨基酸序列同框内加入所述亚基的氨基酸序列中。换言之，优选将所述酶插入所述亚基的序列内。在这些实施方案中，所述亚基和酶通常在两点上结合， 即经所述酶的氨基末端氨基酸和羧基末端氨基酸结合。如果将所述酶插入所述亚基的序列内，则优选使所述酶的氨基末端氨基酸与羧基末端氨基酸紧密接近，并且使每端均与所述亚基或其变体序列中的邻近氨基酸结合。在一个优选实施方案中，将所述酶插入所述亚基的环区中。 
在另一个优选实施方案中，所述亚基与所述酶在化学上融合。如果亚基与酶在化学上结合，例如通过一个接头分子结合，则这两部分在化学上融合。 
所述亚基可通过六-组氨酸标签或Ni-NTA短暂地与所述酶结合。还可对所述亚基和酶进行修饰从而使它们短暂地相互结合。 
所述构建体保留有所述亚基的形成孔的能力。所述亚基的形成孔的能力通常由其α-螺旋和β-链提供。β-桶状孔包含由β-链构成的桶状体或通道，而α-螺旋束状孔包含由α-螺旋构成的桶状体或通道。α-螺旋和β-链通常通过环区连接。为避免影响所述亚基的孔形成能力，优选使所述酶与所述亚基的环区在基因上融合，或插入所述亚基的环区中。下面更详细地讨论具体亚基的环区。 
类似地，所述构建体保留有所述核酸操作所述酶的能力，所述能力通常由其二级结构元件（α-螺旋和β-链）和三级结构元件提供。为避免影响所述酶的核酸操作能力，优选使所述酶与所述亚基在基因上融合，或经不影响其二级或三级结构的残基或区域插入所述亚基中。 
所述亚基可与所述酶直接结合。优选使用一个或多个例如两个或三个接头使所述亚基与所述酶结合。可设计一个或多个接头以限制所述酶的可动性。所述接头可与所述亚基和/或酶中的一个或多个反应性半胱氨酸残基、反应性赖氨酸残基或非天然氨基酸结合。合适的接头在本领域是公知的。合适的接头包括但不限于化学交联剂和肽接头。优选的接头是氨基酸序列（即肽接头）。通常对所述肽接头的长度、柔性和亲水性进行设计使其不扰乱所述亚基和酶的功能。优选的柔性肽接头为2-20个，例如4、6、8、10或16个丝氨酸和/或甘氨酸的片段。更优选的肽接头包括(SG)1、(SG)2、(SG)3、(SG)4、(SG)5和(SG)8，其中S为丝氨酸，G为甘氨酸。优选的刚性肽接头为2-30个，例如4、6、8、16或24个脯氨酸的片段。更优选刚性接头包括(P)12， 其中P为脯氨酸。 
接头可先与所述亚基结合再与所述酶结合，先与所述酶结合再与所述亚基结合，或者与所述酶和亚基同时结合。当所述接头与所述亚基结合时，其可为单体亚基、两个或多个单体的寡聚体的一部分或完整寡聚孔的一部分。所述接头优选在任何除去任何未结合接头的纯化步骤之前反应。 
使所述亚基与所述酶结合的一个优选方法是经半胱氨酸连接。这可通过双官能化学接头或通过末端具有半胱氨酸残基的多肽接头介导。α-HL(SEQ ID NO:2)无天然半胱氨酸残基，因此将半胱氨酸引入到SEQ ID NO:2的序列中可实现所述酶与所述亚基受控制的共价结合。可在多个位置引入半胱氨酸，例如SEQ ID NO:2的位置K8、T9或N17或在SEQ ID NO:2的羧基末端。可对任何双官能接头的长度、反应性、特异性、刚性和溶解度进行设计以确保所述酶相对所述亚基的位置正确并且所述亚基和所述酶的功能均得以保持。合适的接头包括双马来酰亚胺交联剂，例如1,4-双（马来酰亚胺）丁烷(BMB)或双（马来酰亚胺）己烷。双官能交联剂的一个缺点是需要酶不含其他表面可及的半胱氨酸残基，因为所述双官能接头与这些残基的结合不可控制并可影响底物结合或活性。如果所述酶含有几个可及的半胱氨酸残基，那么可能需要对所述酶进行修饰以除去这些残基同时确保所述修饰不影响所述酶的折叠或活性。在一个优选实施方案中，与所述酶在基因上结合的肽接头上存在一个反应性半胱氨酸。这意味着不需要其他修饰来从所述酶除去其他可及的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的反应性可通过修饰例如在肽接头上的邻近残基进行增强。例如，侧翼精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱性基团会将半胱氨酸硫醇基团的pKa改变为更大反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可被巯基保护基团例如dTNB所保护。这些保护基团可在接头结合之前与所述酶或亚基的作为单体或寡聚体的一部分的一个或多个半胱氨酸残基反应。 
亚基或酶与它们自身的交联可通过保持接头的浓度远过量于所述亚基和/或酶而防止。或者，可使用“锁匙”配置，其中使用了两种接头。每种接头只有一端可一起反应以形成更长的接头并且接头的另 一端各自与所述构建体（即亚基或单体）的不同部分反应。 
选择共价结合的位点以使得：当所述构建体用于形成孔时，所述酶操作靶核酸序列的方式使得靶序列中一部分核苷酸与所述孔相互作用。然后基于核苷酸在相互反应过程中影响流过所述孔的电流的不同方式来识别核苷酸。 
存在多种使用孔来测序核酸分子的方式。一种方式涉及使用核酸外切酶例如脱氧核糖核酸酶。在此方法中，所述核酸外切酶用于使核苷酸从靶核酸链上序贯分离。然后按核苷酸脱离的顺序通过孔检测并辨别所述核苷酸，从而读出原始链的序列。对于这一实施方案，优选使所述核酸外切酶与所述亚基结合从而使从靶核酸上脱离的一部分核苷酸能够进入一种包含所述构建体的孔的桶状体或通道并与其相互作用。优选使所述核酸外切酶与所述亚基在这样的位置结合，即与所述亚基中的某一部分紧密接近的位点，所述部分形成所述孔的桶状体或通道的开口。更优选地，所述核酸外切酶与所述亚基的结合使所述核酸外切酶的核苷酸离去轨线位点朝向所述亚基中的某一部分，所述部分形成所述孔的开口部分。 
测序核酸的另一种方式涉及使用将所述靶核酸链推过或拉过所述孔的酶。在此方法中，离子电流随着靶链中的核苷酸通过所述孔而波动。所述电流波动指示该链的序列。对于这一实施方案，优选地，所述酶与所述亚基的结合使所述酶能够将所述靶核酸推过或拉过包含所述构建体的孔的桶状体或通道，并且不干扰通过所述孔的离子电流的流动。优选使所述酶与所述亚基在这样的位点上结合，即与所述亚基中的某一部分紧密接近的位点上，所述部分形成所述孔的桶状体或通道的开口部分。更优选地，所述酶与所述亚基的结合使所述酶的活性位点朝向所述亚基中的某一部分，所述部分形成所述孔的开口部分。 
第三种测序核酸链的方法是检测与孔检测器紧密接近的聚合酶的副产物（bi-product）。在此方法中，对核苷磷酸（核苷酸）进行标记从而使磷酸标记物质在将聚合酶加至核苷酸链后释放，并且通过所述孔检测所述磷酸标记物质。所述磷酸物质含有对每种核苷酸特异的标记物。随着将核苷酸序贯加至所述核酸链，加入碱基的副产物被 检测。所述磷酸标记物质被检测的顺序可用于确定所述核酸链的序列。 
优选使所述酶与所述亚基的某一部分结合，所述部分形成包含所述构建体的孔的顺面(cis side)部分。在电生理学中，所述顺面为接地面。如果溶血素孔被正确插入电生理学装置中，那么帽区(Cap region)在所述顺面上。公知的是，在正电势下，核苷酸会从用于随机传感的孔的顺面迁移向反面(trans side)。将所述酶置于孔的顺面使得所述酶对靶核酸的操作可将所述序列中的一部分核苷酸进入所述孔的桶状体或通道并与其相互作用。优选地，所述序列中至少20%、至少40%、至少50%、至少80%或至少90%的核苷酸进入所述孔的桶状体或通道并与其相互作用。 
优选地，选择共价结合的位点和方法以使得所述酶的可动性受限。这可帮助确保所述酶以这样的方式操作所述靶核酸序列，即所述方式可以使所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用。例如，限制酶移动的能力意味着所述酶的活性位点可永远朝向所述亚基的某一部分，所述部分形成所述孔的桶状体或通道的开口部分。所述酶的可动性可通过增加所述酶与所述亚基结合的点的数量和/或使用具体的接头而限制。 
亚基 
本发明的构建体包含跨膜蛋白孔的一个亚基。跨膜蛋白孔是一个多肽或一系列多肽，所述多肽允许由外加电势驱动的离子从膜的一面流过。优选地，所述孔允许核苷酸沿外加电势从膜的一面流至另一面。优选地，所述孔可将核酸例如DNA或RNA推过或拉过所述孔。 
所述亚基是孔的一部分。所述孔可为单体或寡聚体。优选地，所述亚基可构成由几个重复亚基例如6、7或8个亚基构成的孔的一部分。更优选地，所述亚基可构成七聚体孔的一部分。所述亚基通常可构成其中可流过所述离子的桶状体或通道的一部分。所述孔的亚基通常环绕一个中心轴，并促进链进入β桶状体或通道或又跨者膜α-螺旋束状体或通道。当作为本发明构建体的一部分时，所述亚基可为单体或寡聚体孔的一部分。 
所述亚基通常构成孔的一部分，所述孔的桶状体或通道包含有助 于与核苷酸或核酸相互作用的氨基酸。优选地，这些氨基酸的位置靠近所述桶状体或通道的收缩区处。所述亚基通常包含一个或多个带正电的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。这些氨基酸通常通过与核苷酸或核酸中的磷酸基团相互作用或者通过与核苷酸或核酸中的碱基的π-阳离子相互作用而有助于所述孔与核苷酸或核酸之间的相互作用。衔接体可有助于所述核苷酸检测。 
适合用于本发明的亚基可源于β-桶状孔或α-螺旋束状孔。β-桶状孔包含由β-链构成的桶状体或通道。合适的β-桶状孔包括但不限于：β-毒素例如α-溶血素和杀白细胞素，细菌的外膜蛋白/孔蛋白例如外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷酸酯酶A和奈瑟球菌属(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束状孔包含由α-螺旋构成的桶状体或通道。合适的α-螺旋束状孔包括但不限于：内膜蛋白和α外膜蛋白例如WZA。 
优选地，所述亚基源于α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7个相同的单体或亚基构成（即，其是七聚体）。α-溶血素的一个野生型单体或亚基的序列示于SEQ ID NO:2。本发明构建体中的亚基优选地包含SEQ ID NO:2中所示的序列或其变体。SEQ ID NO:2的氨基酸1、7-21、31-34、45-51、63-66、72、92-97、104-111、124-136、149-153、160-164、173-206、210-213、217、218、223-228、236-242、262-265、272-274、287-290和294构成环区。优选地，所述酶与SEQ ID NO:2的氨基酸8、9、17、18、19、44、45、50和51中的一个或多个结合。更优选地，所述酶插入SEQ ID NO:2的氨基酸18与19、44与45或者50与51之间。 
SEQ ID NO:2的变体是具有从SEQ ID NO:2变化而来但保留有其孔形成能力的氨基酸序列的亚基。所述变体形成孔的能力可如上文所述进行测定。所述变体可包括有助于与所述核酸操作酶共价结合或与其相互作用的修改。优选地，所述变体包含有助于与所述酶结合的一个或多个反应性半胱氨酸残基。例如，所述变体可在SEQ ID NO:2的8、9、17、18、19、44、45、50和51位中的一个或多个和/或氨基或羧基末端上包括半胱氨酸残基。优选的变体包含对SEQ ID NO:2的位置8、9或17上的残基的半胱氨酸置换（K8C、T9C或N17C）。 
可修饰所述变体以有助于所述酶的基因融合。例如，可修饰例如缺失邻近插入位点的一个或多个残基以有助于所述酶和/或接头的插入。如果将所述酶插入SEQ ID NO:2的环2中，那么可缺失SEQ ID NO:2的残基D45、K46、N47、H48、N49和K50中的一个或多个。含有所述缺失的一个优选构建体包含SEQ ID NO:26中所示的序列或其变体。 
所述变体还可包括有助于与核苷酸的任何相互作用或有助于下文讨论的分子衔接体的取向的修饰。所述变体还可含有有助于分子衔接体的共价结合的修饰。 
所述亚基可以是要求美国专利申请61/078,687的优先权并与本申请同时提交的共同待决的国际专利申请[J A Kemp&Co Ref:N.104403A;Oxford Nanolabs Ref:ONL IP004]中记载的SEQ ID NO:2的变体中的任一种。该申请的所有教导均可同等地适用于本申请。具体地，所述变体优选地在SEQ ID NO:2的139位上具有谷氨酰胺。所述变体优选地在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸。所述变体优选地在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。在所述共同待决申请的SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14中所示的SEQ ID NO:2变体中的任一种均可用于形成本发明的构建体。 
所述亚基可以是由生物体例如葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌表达的天然变体。变体还可包括通过重组技术产生的非天然变体。在SEQ ID NO:2的整个氨基酸序列长度上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列至少50%同源。在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个序列上，基于氨基酸同一性，所述亚基多肽更优选地可以与该序列至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%并且更优选地至少95%、97%或99%同源。在200或更多个例如230、250、270或280或更多个连续氨基酸的片段上存在至少80%例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性（“硬同源性”）。 
除上面讨论的以外，还可对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如最多多至1、2、3、4、5、10、20或30个置换。保守性置换可例如根据下表1进行。 
表1.保守性置换 
第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可相互置换。 
Figure BDA0000385782940000191
还可从上文描述的多肽中额外缺失SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基。可以缺失最多达1、2、3、4、5、10、20或30个残基，或者更多个。 
变体可为SEQ ID NO:2的片段。这类片段保留了孔形成活性。片段长度可为至少50、100、200或250个氨基酸。片段优选地包含SEQ ID NO:2的孔形成结构域。片段通常包括SEQ ID NO:2的残基119、121、135、113和139。 
可将一个或多个氨基酸替代地或额外地加至上述的多肽上。在SEQ ID NO:2或其多肽变体或片段的氨基酸序列的氨基端或羧基端，可提供一段延长片段。所述延长片段可以非常短，例如长度为1–10个氨基酸。或者，所述延长物可以较长，例如最多达50或100个氨基酸。可将载体蛋白融合于亚基或变体。 
如上面所讨论的，SEQ ID NO:2的变体是是这样的亚基，即该亚基具有不同于SEQ ID NO:2序列的氨基酸序列且保留了其形成孔的能力。变体一般包含SEQ ID NO:2中负责孔形成的区域。包含β-桶状体的α-HL的孔形成能力由每个亚基的β-链提供。SEQ ID NO:2的变体一般包含SEQ ID NO:2中可形成β-链的区域。上文已讨论SEQID NO:2形成β-链的氨基酸。可对SEQ ID NO:2中可形成β-链的区域进行一个或多个修改，条件是所形成的变体保留其形成孔的能力。 可对SEQ ID NO:2的β-链区域进行的具体修改在上文中详述。 
SEQ ID NO:2的变体优选在其α-螺旋和/或环区中包括一个或多个修改，例如置换、添加或缺失。上面讨论了构成α-螺旋和/或环的氨基酸。 
可以用本领域的标准方法确定同源性。例如UWGCG软件包提供的BESTFIT程序可以用于计算同源性(例如使用它的默认设置)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research12,387-395)。例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所述，可以使用PILEUP和BLAST算法计算同源性或者对序列进行比对(例如鉴定等价残基或相应的序列(一般使用它们的默认设置))。 
进行BLAST分析的软件可以从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。所述算法涉及到首先鉴定高分值序列对(HSP)，这个步骤是通过如下方式实现：在查询序列中鉴定长度为W的短字长，所述短字长当与数据库序列中相同长度的字比对的时候匹配或者满足某个正值的阈值T。T是指邻近字值阈值(Altschul et al，见上文)。将这些初始邻近字长匹配作为种子启动检索，以发现包含它们的HSP。在每条序列的两个方向的每个方向进行字长匹配延伸，到达累积比对分值能够增加的极限。在每个方向上的字长匹配的延伸停止的条件是：所述累积比对分值从其所达到的最大值下降X量；由于一个或多个负得分残基比对的累计，所述累积分值降到0或小于0；或者达到任何一个序列的端点。所述BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。所述BLAST程序使用的默认字长(W)为11，BLOSUM62打分矩阵(见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)比对(B)为50，期望(E)为10，M=5，N=4，并且是进行双链比较。 
所述BLAST算法可进行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787。所述BLAST算法提供的一种相似性的量度是最小和概率(P(N))，所述最小和概率表示两个氨基酸序列之间随机出现匹配的概 率。例如，如果一个序列与另一个序列比较中的最小和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，那么第一序列被认为与第二序列相似。 
对所述变体的修改可通过以下方式进行，例如可通过添加组氨酸或天冬氨酸残基以帮助其鉴定或纯化，或者可通过在所述多肽天然地不含信号序列的情况下添加这类序列以促进其从细胞的分泌。 
可将所述亚基以显示标记物标记。所述显示标记物（revealing label）可以是使所述孔可被检测的任何合适标记物。合适的标记物包括但不限于荧光分子；放射性同位素例如125I、35S；酶；抗体；抗原；多核苷酸；以及配体例如生物素。 
此亚基可分离自产生孔的生物体例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，或者可通过合成或通过重组方式制备。例如，所述亚基可通过体外翻译和转录进行合成。所述亚基的氨基酸序列可被修改，以包括非天然氨基酸或者以增加所述亚基的稳定性。如果所述亚基通过合成方式产生，那么这类氨基酸可以在产生亚基的过程中引入。还可以在合成或重组产生后对所述亚基进行改变。 
所述亚基还可以使用D-氨基酸产生。例如，所述孔可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这类蛋白或肽的生产是本领域中常规的。 
所述亚基还可含有其他非特异性化学修改，只要这些修改不干扰所述亚基形成孔的能力。许多非特异性侧链修改是本领域中已知的，并且可对所述孔的侧链进行这些修改。例如，这类修改包括对氨基酸的还原烷基化（按照如下方式进行：首先与醛反应，然后以NaBH4进行还原）、以甲基乙酰亚胺进行脒基化或者以乙酸酸酐进行酰化。对所述亚基的修改可在所述亚基或构建体的表达之后或者已使用所述亚基形成孔之后进行。 
可以使用本领域中已知的标准方法产生所述亚基。可以使用本领域中的标准方法分离和复制编码亚基的多核苷酸序列。这类序列在下文有更详细的叙述。可以使用本领域中的标准技术将编码亚基的多核苷酸序列在细菌宿主细胞中表达。所述亚基可以通过在细胞中以重组表达载体原位表达所述多肽产生。所述表达载体任选地携带诱导型启动子以控制所述多肽的表达。 
亚基可通过如下方式大规模产生：从产生孔的生物体或者在如下文所述的重组表达后通过任一种蛋白质液相色谱体系进行纯化。一般的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad BioLogic系统和Gilson HPLC系统。 
核酸操作酶 
本发明的构建体包含核酸操作酶。核酸操作酶是能够与核酸相互作用并改变核酸的至少一种性质的多肽。所述酶可通过将核酸裂解以形成单个核苷酸或更短的核酸链例如二核苷酸或三核苷酸而修改所述核酸。所述酶可通过将核酸取向至具体位置或将其移动至具体位置而修改所述核酸。 
核酸是一种包含两个或更多个核苷酸的大分子。由所述酶操作的核酸可包含任何核苷酸的任意组合。所述核苷酸可为天然的或人工的。一个核苷酸通常含有一个核碱基、一个糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基通常是杂环。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具体是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸基、双磷酸基或三磷酸基。磷酸基可结合在核苷酸的5’或3’侧。 
核苷酸包括但不限于单磷酸腺苷（AMP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、单磷酸鸟苷酸（GMP）、二磷酸鸟苷（GDP）、三磷酸鸟苷（GTP）、单磷酸胸苷酸（TMP）、二磷酸胸苷（TDP）、三磷酸胸苷（TTP）、单磷酸尿苷（UMP）、二磷酸尿苷（UDP）、三磷酸尿苷（UTP）、单磷酸胞苷（CMP）、二磷酸胞苷（CDP）、三磷酸胞苷（CTP）、环单磷酸腺苷（cAMP）、环单磷酸鸟苷（cGMP）、单磷酸脱氧腺苷（dAMP）、二磷酸脱氧腺苷（dADP）、三磷酸脱氧腺苷（dATP）、单磷酸脱氧鸟苷（dGMP）、二磷酸脱氧鸟苷（dGDP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）、单磷酸脱氧胸苷（dTMP）、二磷酸脱氧胸苷（dTDP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）、单磷酸脱氧尿苷（dUMP）、二磷酸脱氧尿苷（dUDP）、三磷酸脱氧尿苷（dUTP）、单磷酸脱氧胞苷（dCMP）、二磷酸脱氧胞苷（dCDP）和三磷酸脱氧胞苷（dCTP）。所述核苷酸优选是AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP 或dCMP。 
由所述酶操作的核酸优选是双链的，例如DNA。由所述酶操作的核酸可以是单链的，例如cDNA或RNA。操作单链核酸的酶可用于测序双链DNA，只要该双链DNA在由该酶操作之前通过化学或加热方式离解为单链。 
知晓核酸操作酶的三级结构是优选的。知晓所述酶的三维结构使得可对酶进行修改以有助于其在本发明的构建体或孔中发挥功能。 
所述酶可为任意大小并可具有任何结构。例如，所述酶可为寡聚体，例如二聚体或三聚体。所述酶优选地为由一个单体构成的小的、球状的多肽。这种酶易于操作并且不太可能干扰所述亚基的孔形成能力，特别是在与所述亚基的序列融合或插入所述亚基的序列中时。 
所述酶的氨基和羧基末端优选紧密接近。所述酶的氨基和羧基末端更优选处于酶的同一面上。这种实施方案有助于所述酶插入到所述亚基的序列中。例如，如果所述酶的氨基和羧基末端紧密接近，那么每端均可通过与所述亚基序列中邻近氨基酸的基因融合而结合。 
知晓所述酶的活性位点的位置和功能也是优选的。这可避免对活性位点进行破坏所述酶活性的修改。这还使得所述酶可与所述亚基结合，从而使得所述酶以这样方式操作所述靶核酸序列，即所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用。有利地是，使所述酶的活性位点的位置与所述亚基的某一部分尽可能近，所述部分构成所述孔桶状体或通道的开口部分，而酶自身不呈现对电流流动的阻断。知晓酶以何种方式定向核酸还使得可设计出有效构建体。 
如在下文更详细讨论的，可能必需纯化本发明的构建体。优选地，所述酶能够承受用于纯化所述构建体的条件。 
本发明构建体可用于形成孔。这些孔可用于测序核酸。为使靶核苷酸中的大多数核苷酸为随机传感所正确识别，所述酶必需在与辨别核苷酸相适应的缓冲条件下操作所述核酸。所述酶优选地在远高于正常生理水平例如100mM-500mM的盐浓度下至少具有剩余活性。更优选地，对所述酶进行修改以提高其在高盐浓度下的活性。还可对所述酶进行修改以提高其持续操作能力、稳定性和保存期。 
合适的修改可通过对嗜极微生物例如嗜盐和中度嗜盐细菌、嗜热 和中度嗜热生物的核酸操作酶进行表征来确定，以及通过改变嗜温或嗜热核酸外切酶的耐盐性、稳定性和温度依赖性的直接进化方法确定。 
所述酶还优选在室温下至少保留有部分活性。这使得由所述构建体形成的孔可在室温下测序核酸。 
所述核酸操作酶优选溶核酶。所述核酸操作酶更优选是酶分类(EC)组3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31的任一组的成员。所述核酸操作酶更优选是以下酶的任一种： 
3.1.11.-  产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸外切酶。 
3.1.11.1  脱氧核糖核酸外切酶I。 
3.1.11.2  脱氧核糖核酸外切酶III。 
3.1.11.3  脱氧核糖核酸外切酶(λ诱导的)。 
3.1.11.4  脱氧核糖核酸外切酶(噬菌体SP3诱导的)。 
3.1.11.5  脱氧核糖核酸外切酶V。 
3.1.11.6  脱氧核糖核酸外切酶VII。 
3.1.13.-  产生5’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶。 
3.1.13.1  核糖核酸外切酶II。 
3.1.13.2  核糖核酸外切酶H。 
3.1.13.3  寡核苷酸酶。 
3.1.13.4  Poly(A)特异的核糖核酸酶。 
3.1.13.5  核糖核酸酶D。 
3.1.14.-  产生3’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶。 
3.1.14.1  酵母核糖核酸酶。 
3.1.15.-  对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有产生5’-磷酸单酯的活性的核酸外切酶。 
3.1.15.1  毒液核酸外切酶。 
3.1.16.-  对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有产生3’-磷酸单酯的活性的核酸外切酶。 
3.1.16.1  脾核酸外切酶。 
3.1.21.-  产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶。 
3.1.21.1  脱氧核糖核酸酶I。 
3.1.21.2  脱氧核糖核酸酶IV（噬菌体T(4)诱导的）。 
3.1.21.3  I型位点特异的脱氧核糖核酸酶。 
3.1.21.4  II型位点特异的脱氧核糖核酸酶。 
3.1.21.5  III型位点特异的脱氧核糖核酸酶。 
3.1.21.6  CC偏爱的脱氧核糖核酸内切酶。 
3.1.21.7  脱氧核糖核酸酶V。 
3.1.22.-  不产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶。 
3.1.22.1  脱氧核糖核酸酶II。 
3.1.22.2  曲霉(Aspergillus)脱氧核糖核酸酶K(1)。 
3.1.22.3  转至登记号：3.1.21.7。 
3.1.22.4  跨结(crossover junction)脱氧核糖核酸内切酶。 
3.1.22.5  脱氧核糖核酸酶X。 
3.1.25.-  对改变的碱基特异的位点特异性脱氧核糖核酸内切酶。 
3.1.25.1  脱氧核糖核酸酶(嘧啶二聚体)。 
3.1.25.2  转至登记号：4.2.99.18。 
3.1.26.-  产生5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶。 
3.1.26.1  多头绒泡菌(Physarum polycephalum)核糖核酸酶。 
3.1.26.2  核糖核酸酶α。 
3.1.26.3  核糖核酸酶III。 
3.1.26.4  核糖核酸酶H。 
3.1.26.5  核糖核酸酶P。 
3.1.26.6  核糖核酸酶IV。 
3.1.26.7  核糖核酸酶P4。 
3.1.26.8  核糖核酸酶M5。 
3.1.26.9  核糖核酸酶(poly(U)特异的)。 
3.1.26.10 核糖核酸酶IX。 
3.1.26.11 核糖核酸酶Z。 
3.1.27.-  不产生5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶。 
3.1.27.1  核糖核酸酶T(2)。 
3.1.27.2  枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)核糖核酸酶。 
3.1.27.3  核糖核酸酶T(1)。 
3.1.27.4  核糖核酸酶U(2)。 
3.1.27.5  胰腺核糖核酸酶。 
3.1.27.6  肠杆菌(Enterbacter)核糖核酸酶。 
3.1.27.7  核糖核酸酶F。 
3.1.27.8  核糖核酸酶V。 
3.1.27.9  tRNA-内含子核酸内切酶。 
3.1.27.10 rRNA核酸内切酶。 
3.1.30.-  对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有产生5’-磷酸单酯的活性的核糖核酸内切酶。 
3.1.30.1  曲霉核酸酶S(1)。 
3.1.30.2  粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶。 
3.1.31.-  对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有产生3’-磷酸单酯的活性的核糖核酸内切酶。 
3.1.31.1  微球菌(micrococcal)核酸酶。 
所述酶最优选核酸外切酶，例如脱氧核糖核酸酶，其裂解核酸以形成单个核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶的优点在于其对单链和双链 DNA均有活性并以5’-3'方向或3’-5’方向水解碱基。 
单个核苷酸是单核苷酸。单个核苷酸是不通过核苷酸键与另一个核苷酸或核酸结合的核苷酸。核苷酸键涉及一个核苷酸的磷酸基团之一结合于另一个核苷酸的糖基。单个核苷酸通常是不通过核苷酸键与另一个至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少200、至少500、至少1000或至少5000个核苷酸的核酸序列结合的核苷酸。 
优选的用于所述方法的酶包括大肠杆菌的核酸外切酶III(SEQ ID NO:10)、大肠杆菌的核酸外切酶I(SEQ ID NO:12)、嗜热栖热菌的RecJ(SEQ ID NO:14)和噬菌体λ核酸外切酶(SEQ ID NO:16)及其变体。所述核酸外切酶优选地包含SEQ ID NO:10、12、14和16所示的序列的任一个或其变体。SEQ ID NO:16的3个相同亚基相互作用以形成一种三聚体核酸外切酶。SEQ ID NO:10、12、14或16的变体是具有从SEQ ID NO:10、12、14或16变化而来但保留有其核酸操作能力的氨基酸序列的酶。所述酶可包括有助于操作核酸和/或有助于其在高盐浓度和/或室温下的活性的修改。所述酶可包括有助于与所述亚基共价结合或相互作用的修改。如上面所讨论的，可从所述酶中除去可及的半胱氨酸以避免与接头的非特异性反应。或者，可将一个或多个反应性半胱氨酸引入所述酶中——例如作为基因融合的肽接头的一部分——以有利于与所述亚基的结合。 
变体可与SEQ ID NO:10、12、14和16不同，所述不同程度与上面讨论的SEQ ID NO:2的变体与SEQ ID NO:2的不同程度相同。 
SEQ ID NO:10、12、14或16的变体保留有其核酸操作活性。变体通常包含SEQ ID NO:10、12、14或16中负责核酸操作活性的区域。上文讨论了SEQ ID NO:10、12、14和16的催化结构域。SEQ ID NO:10、12、14或16的变体优选地包含相关催化结构域。SEQ ID NO:10、12、14或16的变体通常在所述相关催化结构域之外包括一种或多种修改，例如置换、插入或缺失。 
优选的能够将所述靶核酸序列推过或拉过所述孔的酶包括聚合酶、核酸外切酶、解螺旋酶和拓扑异构酶例如促旋酶。所述聚合酶优选酶分类(EC)组2.7.7.6、2.7.7.7、2.7.7.19、2.7.7.48和2.7.7.49的任一组的成员。所述聚合酶优选依赖DNA的DNA聚合酶、依赖RNA 的DNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶或依赖RNA的RNA聚合酶。所述解螺旋酶优选酶分类(EC)组3.6.1.-和2.7.7.-的任一组的成员。所述解螺旋酶优选依赖ATP的DNA解螺旋酶（EC组3.6.1.8）、依赖ATP的RNA解螺旋酶（EC组3.6.1.8）或不依赖ATP的RNA解螺旋酶。所述拓扑异构酶优选酶分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3的任一组的成员。 
所述酶可被显示标记物所标记。所述显示标记物可为上文所述的显示标记物的任一种。 
此酶可从产生酶的生物体例如大肠杆菌、嗜热栖热菌或噬菌体分离，或者可通过合成或通过重组方式制备。例如，所述酶可通过上文和下文所述的体外翻译和转录合成。所述酶可在如上文所述的纯化后大规模产生。 
优选的构建体 
本发明的优选构建体包含SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28和30的任一项所示的序列或其变体。SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28或30的变体必须保留有其孔形成能力和核酸操作能力。变体可与SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28和30不同，所述不同的程度和方式可与上文讨论的SEQ ID NO:2的变体以及SEQ ID NO:10、12、14或16的变体相同。 
多核苷酸序列
本发明还提供编码一种构建体的多核苷酸序列，在所述构建体中所述酶与所述亚基基因融合或者插入所述亚基的序列中。容易想到使用标准技术来产生这种多核苷酸序列。编码所述酶的多核苷酸序列与编码所述亚基的多核苷酸序列融合或者插入编码所述亚基的多核苷酸序列中。所述融合或插入通常是框内（in frame）的。如果编码所述酶的多核苷酸序列插入编码所述亚基的多核苷酸序列中，那么编码所述酶的序列的两端通常侧接有限制性内切酶位点，例如为BspE1所识别的位点。其两端还可以侧接有编码接头的多核苷酸序列，例如每个均编码丝氨酸或甘氨酸的5-10个密码子。 
所述多核苷酸序列优选编码如下构建体，所述构建体包含与SEQ ID NO:2或其变体基因融合或者插入SEQ ID NO:2或其变体中的 SEQ ID NO:10、12、14或16或其变体。SEQ ID NO:2、10、12、14和16的变体可为上文所讨论的变体的任一种。SEQ ID NO:10、12、14或16或其变体可与上文所述的SEQ ID NO:2或其变体基因融合或者插入SEQ ID NO:2或其变体中。 
所述多核苷酸序列优选包含与SEQ ID NO:1或其变体基因融合或者插入SEQ ID NO:1或其变体中的SEQ ID NO:9、11、13或15或其变体。因此SEQ ID NO:9、11、13或15或其变体优选在SEQ ID NO:1的核苷酸2765与2766、2843与2844或者2861与2862之间插入SEQ ID NO:1或其变体中。所述多核苷酸更优选包含SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27或29所示的序列或其变体。 
基于核苷酸同一性，SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的变体的序列与SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的序列在全长上至少50%、60%、70%、80%、90%或95%同源。在600或更多个例如700、750、850或900或更多个连续核苷酸的片段上可有至少80%例如至少85%、90%或95%的核酸同一性（“硬同源性”）。同源性可按上文所述计算。所述多核苷酸序列可包含基于遗传密码的简并性不同于SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的序列。 
可使用本领域中的标准方法分离和复制多核苷酸序列。可从产生孔的生物例如金黄色葡萄球菌和/或产生酶的生物例如大肠杆菌、嗜热栖热菌或噬菌体提取染色体DNA。可以使用涉及特定引物的PCR来扩增编码所述亚基和酶的基因。然后，可以将所扩增的序列整合至可复制的重组载体例如克隆载体中。所述载体可以用于在相容宿主细胞中复制所述多核苷酸。因此，可以通过如下方式制备编码亚基和/或酶的多核苷酸序列：将编码亚基和/或酶的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在可使所述载体进行复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞回收所述载体。用于克隆多核苷酸的合适宿主细胞是本领域中已知的，并且将在下文中更详细地叙述。 
可以将所述多核苷酸克隆至合适的表达载体中。在表达载体中，编码构建体的多核苷酸一般有效连接于能够允许所述宿主细胞表达 所述编码序列的控制序列。这类表达载体可用于表达构建体。 
术语“有效连接”指一种并置关系，在该并置关系中，所描述的组件处于能使它们以预期的方式发挥功能的关系中。“有效连接”到编码序列的控制序列以这样的方式连接，即在与所述控制序列相适应的条件下可实现所述编码序列的表达。可以将多拷贝的相同或不同孔亚基序列引入至所述载体中。 
然后，可以将所述表达载体引入至合适的宿主细胞中。因此，可以通过如下方式产生构建体：将编码构建体的多核苷酸插入表达载体中，将所述载体引入相容的细菌宿主细胞中，并在可使编码所述构建体的多核苷酸进行表达的条件下培养所述宿主细胞。重组表达的构建体可以自组装至所述宿主细胞膜中的孔中。或者，可以将以该方式产生的所述构建体从所述宿主细胞分离并插入至另一膜中。当产生包含本发明构建体与至少一种不同亚基的寡聚体孔时，可以将所述构建体与不同亚基分别在上述不同宿主细胞中表达，从所述宿主细胞中移出并在另外的膜例如兔细胞膜中装配为孔。 
所述载体可以是例如具有复制起始点的质粒、病毒或噬菌体载体，任选地其具有所述多核苷酸表达所用的启动子，还任选地具有所述启动子的调控子。所述载体可以包含一种或多种筛选标记物基因，例如四环素抗性基因。可以选择启动子和其他表达调节信号，以使其与这样的宿主细胞相容，即所述表达载体是被设计用于该宿主细胞。一般可使用T7、trc、lac、ara或λL启动子。 
所述宿主细胞一般以高水平表达所述构建体。选择用编码构建体的多核苷酸转化的宿主细胞作为与用于转化所述细胞的表达载体相容的宿主细胞。所述宿主细胞一般是细菌并优选是大肠杆菌（Escherichia coli）。具有λDE3溶素原的任何细胞，例如C41（DE3)、BL21（DE3)、JM109（DE3)、B834（DE3)、TUNER、Origami和Origami B可以表达包含T7启动子的载体。 
修改的孔
本发明还提供用于测序核酸的改性孔。所述孔包含至少一个本发明构建体。所述孔可包含不止1个例如2、3或4个本发明构建体。 
本发明的孔可以是分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化 的。如果本发明的孔完全不含任何其他组分如脂质或其他孔，则该孔是分离的或纯化的。如果孔与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合，则所述孔是基本分离的。例如，如果孔以包含小于10%、小于5%、小于2%或小于1%的其他组分如脂质或其他孔的形式存在，则所述孔是基本分离或基本纯化的。或者，本发明的孔可以存在于脂质双层或表面活性剂胶束中。 
与所述构建体结合的酶以这样的方式操作靶核酸，即所述方式使得所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔、优选所述孔的桶状体或通道相互作用。然后基于其中核苷酸在相互反应过程中影响流过所述孔的电流的不同方式来识别核苷酸。 
所述酶的固有性质是指所述孔以特定的方式操作靶核酸序列。例如，每个核苷酸可以以持续的方式被从所述靶序列的一端消化，或者所述靶序列可被推过或拉过所述孔。这确保所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用并被识别。在测序核酸时，信号中无任何中断是重要的。此外，所述酶和所述孔的固有性质是指它们可一起保存，从而可产生即用型传感器。 
在一个优选实施方案中，核酸外切酶例如脱氧核糖核酸酶与所述孔结合，从而使一部分核苷酸从靶核酸上释放并与所述孔的桶状体或通道相互作用。在另一个优选实施方案中，能够将所述靶核酸序列推过或拉过所述孔的酶与所述孔结合，从而将所述靶核酸序列推过或拉过所述孔的桶状体或通道并且所述靶序列的一部分核苷酸与所述桶状体或通道相互作用。在此实施方案中，所述核苷酸可在不止1个例如2、3或4个区块或组中与孔相互作用。合适的酶包括但不限于聚合酶、核酸外切酶、解螺旋酶和拓扑异构酶例如促旋酶。在每个实施方案中，均优选使所述酶在这样一个位点与所述孔结合，即所述位点与所述孔的桶状体或通道的开口紧密接近。更优选地，所述酶与所述孔的结合使所述酶的活性位点朝向所述孔的桶状体或通道的开口。这意味着所述靶核酸序列的一部分核苷酸进入所述桶状体或通道中。优选地，所述酶与所述孔的顺面结合。 
所述修改的孔可基于上文详述的跨膜蛋白孔的任一种，包括β-桶状孔和α-螺旋束状孔。 
对于包含SEQ ID NO:2所示序列或其变体的构建体，所述孔通常包含合适数量的包含SEQ ID NO:2所示序列或其变体的其他亚基。本发明一种优选的孔包含，1个包含SEQ ID NO:2所示序列或其变体的构建体，以及6个包含SEQ ID NO:2所示序列或其变体的亚基。所述孔可包含一个或多个包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的亚基。SEQ ID NO:4示出了SEQ ID NO:2的序列，不同之处在于其在113位具有精氨酸(M113R)以及在139位具有谷氨酰胺(N139Q)。SEQ ID NO:4的变体可与SEQ ID NO:4不同，所述不同的方式和程度可与上文对SEQ ID NO:2的讨论相同。本发明一种优选的孔包含1个包含SEQ ID NO:2所示序列或其变体的构建体，以及6个包含SEQ ID NO:4所示序列或其变体的亚基。 
所述孔可包含有助于所述孔与所述核苷酸或所述靶核酸序列之间相互作用的分子衔接体。所述衔接体的存在可改善所述孔与核苷酸的主客体化学（host-guest chemistry），所述核苷酸是从所述靶核酸序列释放的或所述靶核酸序列中存在的。本领域公知主客体化学的原理。所述衔接体对所述孔的物理或化学性质具有提高所述孔与核苷酸相互作用的效应。所述衔接体通常改变所述孔的桶状体或通道的电荷；或特异地与核苷酸相互作用或结合，从而有利于所述核苷酸与所述孔的相互作用。 
所述衔接体可介导核苷酸与所述孔的相互作用，所述核苷酸是从所述靶核酸序列释放的或所述靶核酸序列中存在的。优选地，所述核苷酸经由所述衔接体或以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔。最优选地，所述核苷酸在穿过跨膜的孔时，经由所述衔接体或者以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔。所述核苷酸还可在穿过跨膜的孔时，经由所述衔接体或者以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔的桶状体或通道。所述衔接体优选使所述桶状体或通道紧缩，使得它可以与所述核苷酸相互作用。 
所述衔接体通常为环状。优选地，所述衔接体具有与所述孔相同的对称性。如果所述孔为七聚体（例如具有有利于14条链进入跨膜β桶状体的环绕中心轴的七个亚基），那么通常使用具有七倍对称的衔接体。同样地，如果所述孔为六聚体（例如具有有利于12条链进 入跨膜β桶状体的环绕中心轴的六个亚基，或者为12-链β桶状体），那么通常使用具有六倍对称的衔接体。可使用任何有助于所述孔与所述核苷酸之间相互作用的衔接体。合适的衔接体包括但不限于环糊精、环肽和葫芦脲。所述衔接体优选环糊精或其衍生物。所述衔接体更优选七-6-氨基-β-环糊精(am7-βCD)、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精(am1-βCD)或七-(6-脱氧-6-胍基)-环糊精(gu7-βCD)。下表2示出了孔与衔接体的优选组合。 
表2-孔与衔接体的合适组合 
Figure BDA0000385782940000341
优选地，所述衔接体与所述孔共价结合。可使用任何本领域已知的方法使所述衔接体与所述孔共价结合。所述衔接体可与所述孔直接结合。优选地，使用双官能交联剂使所述衔接体与所述孔结合。本领域公知合适的交联剂。优选的交联剂包括2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(吡啶-2-基二硫)丙酸酯（2,5-dioxopyrrolidin-1-yl3-(pyridine-2-yldisulfanyl)propanoate）、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫)丁酸酯和2,5-二氧代吡咯烷-1-基8-(吡啶-2-基二硫)辛酸酯。最优选的交联剂是琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)。通常，所述衔接体先与所述双官能交联剂共价结合，然后所述衔接体/交联剂复合物再与所述孔共价结合；但也有可能所述双官能交联剂先与所述孔共价结合，然后所述双官能交联剂/孔复合物再与所述衔接体结合。 
选择共价结合的位点，使得所述衔接体有助于核苷酸（其是从靶核酸序列释放的核苷酸或靶核酸序列中存在的）与所述孔相互作用并从而可进行核苷酸的检测。这可按照要求美国专利申请61/078,687的优先权并与本申请同时提交的共同待决的国际专利申请[J A Kemp&Co Ref:N.104403A;Oxford Nanolabs Ref:ONL IP004]中的说明进行。 
对于基于α-HL的孔，如要求美国专利申请61/078,687的优先权并与本申请同时提交的共同待决的国际专利申请[J A Kemp&Co Ref:N.104403A;Oxford Nanolabs Ref:ONL IP004]中所述，帮助所述衔接体在所述孔的桶状体或通道内的正确取向以及衔接体与所述孔的共价结合。在所述共同待决申请中公开的对SEQ ID NO:2的具体修改的任一种同样适用于本发明的孔。具体地，所述孔的每个亚基——包括所述构建体——优选地在SEQ ID NO:2的139位上具有谷氨酰胺。所述孔的一个或多个亚基——包括构建体——可在SEQ ID  NO:2的113位上具有精氨酸。所述孔的一个或多个亚基——包括所述构建体——可在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。示于所述共同待决申请的SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14中的SEQ ID NO:2变体的任一种均可用于形成本发明的修改的孔。 
本发明优选的修改的孔包括： 
(a)一个包含示于SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28或30的序列或其变体的构建体，以及六个示于SEQ ID NO:4的α-HL M113R/N139Q亚基； 
(b)一个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的本发明构建体，五个示于SEQ ID NO:4的α-HL M113R/N139Q亚基或其变体以及一个示于所述共同待决申请的SEQ ID NO:10的α-HL M113R/N139Q/G119C-D8亚基； 
(c)一个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的本发明构建体，五个示于SEQ ID NO:4的α-HL M113R/N139Q亚基或其变体以及一个示于所述共同待决申请的SEQ ID NO:12的α-HL M113R/N139Q/N121C-D8亚基；或者 
(d)一个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的本发明构建体，五个示于SEQ ID NO:4的α-HL M113R/N139Q亚基或其变体以及一个示于所述共同待决申请的SEQ ID NO:14的α-HL M113R/N139Q/L135C-D8亚基。 
产生本发明构建体的方法
本发明还提供了产生本发明构建体的方法。所述方法包括使核酸操作酶与跨膜蛋白孔亚基共价结合。上文讨论的亚基和酶的任一种均可用于所述方法。可根据上文的讨论选择共价结合的位点和方法。 
所述方法还包括确定所述构建体是否能够形成孔并操作核酸。上文描述了实现这一点的测定法。如果可形成孔并可操作核酸，那么所述亚基和酶就已正确结合并已产生本发明构建体。如果不能形成孔或者不能操作核酸，那么尚未产生本发明构建体。 
产生修改的孔的方法
本发明还提供了产生本发明的改性孔的方法。可通过使至少一个本发明构建体与其他合适亚基形成孔或者通过使酶与寡聚体孔中的 亚基共价结合而形成所述修改的孔。上文讨论的构建体、亚基、酶或孔的任一种均可用于所述方法。可根据上文的讨论选择共价结合的位点和方法。 
所述方法还包括确定所述孔是否能够操作核酸并检测核苷酸。可评估所述孔检测单个核苷酸或短核苷酸链例如二核苷酸或三核苷酸的能力。上文和下文描述了实现这一点的测定法。如果所述孔能够操作核酸并检测核苷酸，那么所述亚基和酶就已正确结合并已产生本发明的孔。如果孔不能操作核酸并检测核苷酸，那么尚未产生本发明的孔。 
在一个优选实施方案中，包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体并在合适位置含有一个半胱氨酸的七个亚基的七聚体与双官能交联剂反应。所述孔可在通常通过SDS PAGE纯化之前或之后与所述接头反应。然后使所述孔/接头构建体例如在基因融合的肽接头上与含有至少一个反应性半胱氨酸的酶反应。在所述偶联反应之后，将本发明的修改的孔与任何未反应的酶或孔/接头构建体分离。 
纯化孔的方法
本发明还提供了纯化本发明的修改的孔的方法。所述方法可纯化包含至少一种本发明构建体的孔。所述方法不使用阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，从而避免了对所述构建体的酶部分的任何破坏效应。所述方法特别有利于纯化包含其中所述亚基和酶已基因融合的本发明构建体的孔。 
所述方法包括提供至少一种本发明构建体以及形成本发明的孔所需的任何其他亚基。可使用上文讨论的构建体和亚基的任一种。将所述构建体和其他亚基插入合成脂质囊泡中并使它们寡聚体化。本领域公知将所述构建体和其他亚基插入合成囊泡中的方法。 
所述合成囊泡应具有与兔细胞膜相似的性质，但应无兔细胞膜蛋白。所述囊泡可包含任何组分并通常由脂质混合物构成。本领域公知合适的脂质。所述合成囊泡优选地包含30%胆固醇、30%磷脂酰胆碱(PC)、20%磷脂酰乙醇胺(PE)、10%鞘磷脂(SM)和10%磷脂酰丝氨酸(PS)。 
然后将所述囊泡与一种非离子表面活性剂或非离子表面活性剂 的混合物接触。所述非离子表面活性剂优选辛基葡糖苷(OG)或十二烷基麦芽糖苷(DDM)去污剂。然后例如通过使用基于组氨酸标签或Ni-NTA的亲和纯化对所述寡聚体孔进行纯化。 
测序核酸的方法
本发明还提供了测序靶核酸的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)使所述靶序列与本发明的孔——其包含核酸外切酶——接触，从而使所述核酸外切酶从所述靶序列的一端消化单个核苷酸；(b)使所述核苷酸与所述孔接触，从而所述核苷酸与所述衔接体相互作用；(c)测量在所述相互作用中通过所述孔的电流，从而确定所述核苷酸的类型；以及(d)在所述靶序列的同一端重复步骤(a)-(c)，从而确定所述靶序列的序列。因此，所述方法包括以连续方式对靶核酸序列中一部分核苷酸进行随机传感，以测序所述靶序列。上文描述了单个核苷酸。 
在另一个实施方案中，所述方法包括(a)使所述靶序列与本发明的孔接触，从而使所述靶序列被推过或拉过所述孔并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，以及(b)测量在每次相互作用中通过所述孔的电流，从而确定所述靶序列的序列。因此，所述方法包括以连续方式在所述核苷酸通过所述桶状体或通道时对靶核酸序列中一部分核苷酸进行随机传感，以测序所述靶序列。 
包含本发明的构建体的孔特别适合这些方法。为有效测序所述核酸，重要的是确保以连续方式识别所述核酸中一部分核苷酸。所述酶的固有性质意味着所述靶序列中一部分核苷酸影响流过所述孔的电流。 
可使用此方法测序全部靶核酸序列或只测序全靶核酸序列的一部分。所述核酸序列可为任意长度。例如，所述核酸序列的长度可为至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸。所述核酸序列可为天然或人工的。例如，所述方法可用于验证制备的寡核苷酸的序列。所述方法通常在体外进行。 
所述方法可使用其中包含本发明构建体的孔插入膜中的任何合适的膜/孔系统进行。所述方法通常使用以下膜进行：(i)包含孔的人 工膜，所述孔包含本发明的构建体；(ii)包含孔的分离的天然膜，所述孔包含本发明的构建体；或者(iii)表达孔的细胞，所述孔包含本发明的构建体。所述方法优选使用人工膜进行。除本发明的孔之外，所述膜还可包含其他跨膜蛋白和/或膜内蛋白以及其他分子。 
所述膜可形成离子流、核苷酸和核酸的障碍物。所述膜优选是脂质双层。适合依照本发明使用的脂质双层可使用本领域已知的方法制备。例如，脂质双层可使用Montal和Mueller(1972)的方法形成。脂质双层还可使用国际专利申请PCT/GB08/000563描述的方法形成。 
本发明的方法可使用由任何膜脂质构成的脂质双层进行，所述膜脂质包括但不限于磷脂、糖脂、胆固醇及其混合物。可使用国际专利申请PCT/GB08/000563中描述的任一种脂质。 
将孔插入膜例如脂质双层的方法为本领域所知。上文讨论了这些方法中的一些。 
所述孔与核苷酸之间的相互作用 
可以将所述核苷酸或核酸在所述膜的任一侧与所述孔接触。可以将所述核苷酸或核酸在所述膜的任一侧引入所述孔。所述核苷酸或核酸通常与所述膜的一面接触（其中所述酶与所述孔在该面上结合）。这使得所述酶可在所述方法的过程中操作所述核酸。 
所述靶核酸序列的一部分核苷酸在通过所述孔的桶状体或通道横穿所述膜时与所述孔和/或衔接体相互作用。或者，如果所述靶序列为核酸外切酶所消化，那么核苷酸可经由所述衔接体或者以与所述衔接体连接的方式与所述孔相互作用，从所述孔解离下来并且仍留在所述膜的同一侧上。所述方法可包括使用其中所述衔接体的取向被固定的孔。在这些实施方案中，优选使所述核苷酸与所述孔中所述衔接体取向的一端接触。最优选地，所述核苷酸与所述孔的这样一段接触，即所述衔接体与所述核苷酸相互作用的部分取向该端。 
所述核苷酸可以以任何方式并在任何位点与所述孔相互作用。如上文讨论的，所述核苷酸优选经由所述衔接体或者以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔。最优选地，当所述核苷酸在穿过跨膜的孔时，它们经由所述衔接体或者以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔。当所述核苷酸穿过跨膜的孔时，它还可经由所述衔接 体或者以与所述衔接体连接的方式可逆地结合于所述孔的桶状体或通道。 
在核苷酸和所述孔之间发生相互作用过程中，所述核苷酸以对该核苷酸特异的方式影响流过所述孔的电流。例如，某种核苷酸将降低流经所述孔的电流，这一降低持续某一具体的平均时长并且达到某一具体的程度。换言之，流过所述孔的电流对于某种核苷酸而言是特征性的。可进行对照实验，以确定某种核苷酸对流过所述孔的电流的影响。然后，可以将对测试样品实施本发明的方法所获得的结果与源自这类对照实验的结果进行比较，以识别具体的核苷酸。 
装置 
可以使用适合用于研究其中在膜中插入有包含本发明构建体的孔的膜/孔体系的任何装置进行所述方法。可以使用适合用于进行随机传感的任何装置进行所述方法。例如，所述装置包含含有水溶液的槽和将所述槽分隔成两区室的隔离物。所述隔离物具有一种孔隙，所述孔隙中形成有包含上述孔的膜。通过将核酸引入至所述槽中，可以使所述核苷酸或核酸与所述孔相接触。可以将所述核酸引入至所述槽的两个区室的任一个中，但优选引入所述槽的含有酶的区室中。 
可以使用国际申请PCT/GB08/000562中记载的装置进行所述方法。 
本发明的方法涉及在与所述核苷酸相互作用过程中测量通过所述孔的电流。因此，所述装置还包含能够施加电压并测量通过所述膜和孔的电信号的电路。还可以使用膜片钳和电压钳进行所述方法。所述方法优选涉及使用电压钳。 
条件 
本发明的方法涉及测量在与靶核酸序列中的核苷酸相互作用过程中通过所述孔的电流。合适于测量通过跨膜蛋白质孔的离子电流的条件是本领域中已知的，并被公开于实施例中。通过跨所述膜和孔施加电压进行所述方法。所用的电压一般是–400mV至+400mV。所用的电压优选是在具有选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV的下限以及独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV 的上限的区间内。所用的电压更优选在120mV至170mV的区间内。通过升高施加的电压，可以加强本发明的孔对不同核苷酸的分辨。 
所述方法可在存在任一碱土金属盐酸盐的条件下进行。在上文详述的示例性装置中，所述盐存在于所述槽的水溶液中。一般使用氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）或氯化铯（CsCl）。优选KCl。所述盐的浓度一般是0.1-2.5M、0.3-1.9M、0.5-1.8M、0.7-1.7M、0.9-1.6M或1M-1.4M。高的盐浓度可提供高的信噪比，使得电流可以在正常的电流波动背景的基础上指示待鉴定核苷酸的存在情况。然而，优选使用更低的盐浓度从而使所述酶能够工作。所述盐的浓度优选是150-500mM。通过在高于室温的温度下例如30℃-40℃进行所述方法可在这些低盐浓度下实现良好的核苷酸分辨。 
所述方法一般在存在缓冲物的条件下进行。在上文详述的示例性装置中，所述缓冲物存在于所述槽的水溶液中。任何缓冲物可用于所述方法中。一种合适的缓冲物是Tris-HCl缓冲液。所述方法一般在4.0-10.0、4.5-9.5、5.0-9.0、5.5-8.8、6.0-8.7，或者7.0-8.8或7.5-8.5的pH下进行。所用的pH优选是约7.5。 
所述方法一般在0℃-100℃、15℃-95℃、16℃-90℃、17℃-85℃、18℃-80℃,19℃-70℃或20℃-60℃下进行。所述方法可以在室温下进行。所述方法优选在支持酶功能的温度例如约37℃下进行。如果升高温度，那么可以在低盐浓度下达到良好的核苷酸分辨。 
除了升高所述溶液温度外，还有许多其他策略可以用于以增加所述溶液的电导，并保持适合于酶活性的条件。一种这类策略是使用脂质双层以将两种不同浓度的盐溶液分开：在酶的一侧是低盐浓度，在对侧是较高浓度。该方法的一个实例是在所述膜顺侧（cis side）使用200mM的KCl和在反室（trans chamber）中使用500mM KCl。在这些条件下，通过所述孔的电导预计相当于在正常条件下的大致400mM KCl，并且如果将所述酶放置于所述顺侧它仅处于200mM中。使用不对称盐条件的另一可能的益处是诱导跨过所述孔的渗透梯度。这种单纯的水流可能用于将核苷酸牵拉进入所述孔以用于检测。使用中性渗透物例如蔗糖、甘油或PEG可以达到类似效应。另一可能的方法是使用KCl水平相对低的溶液，并依赖于对酶活性破坏较小的 其他带电物质。 
基于核酸外切酶的方法 
在一个实施方案中，测序靶核酸序列的方法涉及使所述靶序列与其上结合有核酸外切酶(例如脱氧核糖核酸酶)的孔接触。上文讨论了制备这些孔所需的构建体。上文讨论的核酸外切酶的任一种均可用于所述方法。所述核酸外切酶从所述靶序列的一端释放单个核苷酸。核酸外切酶是一种这样的酶，即所述酶通常抓附于核酸序列的一端，并从该端以每次一个核苷酸的方式消化所述序列。所述核酸外切酶可以以5′-3′方向或3′-5′方向消化所述核酸。核酸外切酶结合的所述核酸的末端通常通过选择所用的酶和/或使用本领域已知的方法来确定。在所述核酸序列任一端的羟基基团或帽结构通常可用于阻碍或促进所述核酸外切酶与所述核酸序列的具体一端的结合。 
如上文所述，所述方法涉及使所述核酸序列与所述核酸外切酶接触，使得所述核苷酸以使得核苷酸的部分可被鉴定的速率从所述核酸的末端被消化下来。用于进行这一点的方法是本领域中公知的。例如，爱德曼（Edman）降解法用于从多肽末端连续消化单个氨基酸，使得它们可以使用高效液相色谱（HPLC）来进行鉴定。本发明可使用类似的方法。 
所述核酸外切酶发挥功能的速率一般比野生型核酸外切酶的最适速率慢。所述核酸外切酶在测序方法中的合适的活性速率是每秒消化0.5–1000个核苷酸、每秒0.6–500个核苷酸、每秒0.7–200个核苷酸、每秒0.8–100个核苷酸、每秒0.9–50个核苷酸或每秒1-20或10个核苷酸。所述速率优选每秒1、10、100、500或1000个核苷酸。合适的核酸外切酶活性速率可以以多种方式实现。例如，最适活性速率降低的变体核酸外切酶可用于本发明中。 
将DNA推过或拉过所述孔 
链测序包括核酸聚合物受控地和逐步地移位（translocation）通过孔。大部分DNA操作酶均适用于此用途，只要它们水解、聚合或加工单链DNA或RNA。优选的酶为聚合酶、核酸外切酶、解螺旋酶和拓扑异构酶例如促旋酶。所述酶基团不需位于接近所述孔腔的位置，因为对于单个核苷酸测序，核苷酸到达所述孔的传感基团的顺序 不可能被打乱。 
单链DNA测序的两种方法是DNA顺着或逆着外加电势从顺侧到反侧以及从反侧到顺侧移位通过纳米孔。链测序的最有利的机制是以外加电势控制单链DNA移位通过纳米孔。前进性或持续地作用于双链DNA的核酸外切酶可用在所述孔的顺侧以使剩余单链在外加电势下被送入，或者在反向电势下用于反侧。同样，解链双链DNA的解螺旋酶也可以以类似的方式使用。对于测序应用，还有可能需要逆着外加电势的链移位，但在相反的电势下或在没有电势的条件下所述酶必须首先“捕获”DNA。通过施加电势再在结合后切换回来，所述链可由顺侧到反侧通过所述孔并以利用电流保持一个延伸的构型。所述单链DNA外切酶或依赖单链DNA的聚合酶可用作分子马达，逆着外加电压从反侧到顺侧，以一种受控的逐步方式将最近移位的单链拉回所述孔。 
试剂盒
本发明还提供了产生用于测序核酸的修改的孔的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含至少一种本发明的构建体以及形成孔所需的任何其他亚基。所述试剂盒可包含足以形成完整孔（即同寡聚体）的本发明构建体。所述试剂盒可包含上文讨论的构建体和亚基的任一种。一种优选的试剂盒包含(i)一个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的构建体，以及(ii)六个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的亚基。一种更优选的试剂盒包含(i)一个包含示于SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28或30的序列或其变体的构建体，以及(ii)六个包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的亚基。 
在另一个实施方案中，所述试剂盒包含至少一种本发明多核苷酸序列以及编码形成孔所需的任何其他亚基的多核苷酸序列。所述试剂盒可包含足以编码完整孔（即同寡聚体）的本发明多核苷酸。所述试剂盒可包含上述多核苷酸的任一种。一种优选的试剂盒包含(i)编码包含如下亚基的构建体的多核苷酸序列，所述亚基包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体，以及(ii)六个多核苷酸序列，其中每个均编码包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的亚基。一种更优选的试剂盒包含(i)编码包含示于SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28或30 的序列或其变体的构建体的多核苷酸序列，以及(ii)六个多核苷酸序列，其中每个均编码包含示于SEQ ID NO:2的序列或其变体的亚基。 
本发明的试剂盒还可包含一种或多种可使上述实施方案的任一个得以进行的其他试剂或器具。这些试剂或器具包括以下的一种或多种：合适的缓冲剂（水溶液）、从受试者获得样品的工具（例如包含针头的容器或器具）、扩增和/或表达多核苷酸的工具、上文定义的膜或者电压钳或膜片钳装置。试剂可以以干态存在于试剂盒中从而液体样品可重悬浮所述试剂。所述试剂盒还可任选地包含使所述试剂盒可用于本发明方法的说明书或者关于所述方法可用于哪些患者的详细资料。所述试剂盒可任选地包含核苷酸。 
如下的实施例对本发明进行举例说明： 
实施例 
1材料和方法
1.1细菌菌株和生长条件 
此工作中使用的菌株为大肠杆菌株XL-10Gold和BL21DE3pLysS(Stratagene)。将大肠杆菌株在Luria-Bertani肉汤(LB)培养基、Terrific肉汤培养基（225rpm）、Luria-Bertani琼脂糖(LA)培养基或胰蛋白胨-酵母提取物(TY)培养基（Bertani,G.(1951).Studies on lysogenesis.I.The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.Journal of Bacteriology.62,293-300;Beringer,J.(1974).R factor transfer in Rhizobium leguminosarum.Journal of General Microbiology.84,188-98;和Tartoff,K.and Hobbs,C.(1987).Improved media for growing plasmid and cosmid clones.Bethesda Research Labs Focus.9,12）中于37℃下培养。使用以下浓度的抗生素：氨苄青霉素100μg ml-1；氯霉素30μg ml-1。 
1.2基因操作
所有常规DNA克隆均按照之前记载的适应性修改的方法进行(Sambrook,J.and Russell,D.(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。DNA聚合酶、限制性内切酶、核酸 外切酶、连接酶和磷酸酶均来自New England Biolab。核酸外切酶基因由GenScript Corporation生产，收到的是通过BspEI或NdeI/HindIII克隆到pT7-SC1中的片段。全部突变和融合构建体均在表达载体pT7-SC1中装配（Cheley,S.,Malghani,M.,Song,L.,Hobaugh,M.,Gouaux,E.,Yang,J.and Bayley,H.(1997).Spontaneous oligomerization of a staphylococcal alpha-hemolysin conformationally constrained by removal of residues that form the transmembrane beta-barrel.Protein Engineering.10,1433-43)，并通过使用T7正向或反向引物EcoExoIII_seq和EcoExoI_seq进行测序来验证。 
αHL基因的定点突变通过对PCR产物的体内同源重组进行(Jones,D.(1995)PCR mutagenesis and recombination in vivo.In PCR primer:a laboratory manual.In:Dveksler,C.(ed).Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。用互补的引物对扩增靶质粒的两个等分部分产生序列在5’端和3’端均互补的两种PCR产物。将所述两种产物均转化到化学感受态大肠杆菌中实现体内同源重组。对于所有突变，均使用SC46作为扩增产物1的反义引物，使用SC47作为扩增产物2的正义引物。这些互补引物结合位点位于pT7-SC1的β-内酰胺酶基因内。因此，在含有100ngμl-1氨苄青霉素的LA上回收的克隆指示同源重组成功。 
使用1单位PhusionTM DNA聚合酶、0.2mM dNTP、1μM引物和4ng BamHI/HindIII或NdeI/EcoNI消化的质粒DNA在50μl的反应体系中进行PCR。反应循环如下：98℃2分钟，1个循环；98℃15秒、57℃30秒和72℃45秒，30个循环；以及72℃最后延伸5分钟。将2.5μl的每对PCR产物混合，用于转化化学感受态大肠杆菌(XL-10Gold)。 
1.3快速体外转录翻译
使用用于环形DNA的大肠杆菌T7-S30提取系统(Promega)，通过偶联的体外转录和翻译(IVTT)产生[35S]L-甲硫氨酸标记的蛋白。将试剂盒内提供的不含半胱氨酸的完全氨基酸混合物(1mM)和不含甲硫氨酸的完全氨基酸混合物(1mM)等体积混合，以获得产生高浓度的 所述蛋白所需的氨基酸工作溶液。反应基于以下50μl反应体积放大或缩小：20μl S30Premix溶液；5μl氨基酸混合物；1μl[35S]L-甲硫氨酸(MP Biomedicals,1175Ci mmol-1,10mCi ml-1)、1μl利福平(0.8mg ml-1)、8μl质粒DNA(400ngμl-1)和15μl T7S30提取物。合成在37℃下进行1.5小时以产生50μl放射性标记的IVTT蛋白。对于偶联的转录、翻译和寡聚体化，不同的蛋白也在一个反应中共表达。所述反应组分不变，除了根据编码每种蛋白的每种质粒相应地确定DNA浓度。将蛋白样品以14000rpm离心10分钟以分离IVTT反应中的不溶性碎片。 
1.4体内蛋白表达
将野生型α-溶血素和融合构建体克隆到表达载体pT7-SC1中的诱导型T7启动子的控制下，并作为可溶性蛋白在大肠杆菌(BL21DE3pLysS,Stratagene)中表达。培养物在Terrific肉汤培养基（100μgμl-1氨苄青霉素和30μgμl-1氯霉素）中于37℃和240rpm下生长至高OD600（约1.5-2）。将温度降低至18℃并将培养物静置30分钟以平衡。通过向培养基中加入IPTG(0.2mM)诱导靶蛋白的过表达。在18小时后，在4℃下将细胞以10000rpm沉淀30分钟。通过加入补充有核酸酶、不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)和加至50mM的MgCl2的BugBuster(Novagen)将细胞重悬浮并裂解。通过在4℃下以10000rpm离心30分钟使细胞碎片成片状沉淀，向上清液中加入聚乙烯亚胺(PEI)。在4℃下将回收的上清液孵育30分钟，之后通过在4℃下以10000rpm离心30分钟除去沉淀物。将澄清的溶解产物过滤并调节至pH8.0、500mM NaCl、10mM咪唑。 
按照标准做法通过Ni-NTA亲和色谱法和凝胶过滤纯化带有组氨酸标签的蛋白。按照标准做法通过阳离子交换和随后的凝胶过滤纯化不带有标签物的α-溶血素亚基。 
1.4.1亲和纯化（组氨酸标签） 
将澄清的溶解产物过滤并调节至pH8.0、500mM NaCl、10mM咪唑，然后上样到His-Trap Crude柱(GE Healthcare)，并用300mM咪唑洗脱。将含有目的蛋白的级分合并，并加到用10mM TRIS(pH8.0)、100mM NaCl、1mM DTT平衡的凝胶过滤柱上。通过SDS PAGE 评估洗脱的蛋白。 
1.4.2离子交换 
将澄清的溶解产物过滤并用10mM MES调节至pH6.0，然后上样到阳离子交换柱(GE Healthcare)上并用0-500mM NaCl洗脱。将含有目的蛋白的级分合并，并加到凝胶过滤柱上。通过SDS PAGE评估洗脱的蛋白。 
为保持α-溶血素衍生物中改造的半胱氨酸的活性（需要作为进行化学修饰的位点），使用相同但补充1mM DTT的缓冲液纯化蛋白。使用相同但补充1mM MgCl2的缓冲液纯化核酸外切酶或核酸酶融合蛋白。 
1.5红细胞膜上的寡聚体化 
以不同摩尔比例混合α-溶血素单体并使其在室温、30℃、37℃或42℃下在兔红细胞膜（2.5mg蛋白ml-1）上寡聚体化1小时。孵育后，将反应混合物以14000rpm离心10分钟并丢弃上清液。通过重悬浮于200μl MBSA（10mM MOPS、150mM NaCl，pH7.4，含有1mg ml-1牛血清白蛋白）并以14000rpm再离心10分钟来洗涤膜片状沉淀物。丢弃上清液后，将膜的片状沉淀物溶解于75μl加有β-巯基乙醇的1X Laemmli样品缓冲液中。将所述全部样品加入5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的单个孔中并且在50V下电泳约18小时，其中电泳缓冲液中含有0.01mM硫代乙醇酸钠。将凝胶在Whatman的3mm滤纸上于50℃下真空干燥约3小时，然后暴露于X射线胶片(Kodak)过夜。使用放射自显影照片作为模板从所述凝胶上切下寡聚物条带，并将该凝胶切片在含有2mM DTT的300μl TE缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)中再水化。在除去Whatman滤纸片后，使用无菌研棒压碎凝胶片。通过使用0.2UM乙酸纤维素微过滤管(Rainin)以14000rpm离心30分钟从凝胶碎片中分离寡聚物蛋白。将滤液分成等份保存在-80℃下。 
1.6合成脂质囊泡上的寡聚体化 
通过在室温下浴槽式声处理15分钟，制备了由30%胆固醇；30%磷脂酰胆碱(PC)；20%磷脂酰乙醇胺(PE)；10%鞘磷脂(SM)；10%磷脂酰丝氨酸(PS)构成的合成脂质囊泡。通过轻柔的氮气流蒸发有机溶 剂，直至获得干的膜。加入去离子水以生成所需的2.5mg ml-1的浓度并将混合物再进行浴槽式声处理15分钟。以不同摩尔比例混合野生型α-溶血素和融合单体并使其于室温、30℃、37℃或42℃和350rpm下在合成脂质囊泡上（对于每1mgα-溶血素单体，2.5mg ml-1）寡聚体化1小时。为沉淀脂质结合蛋白，将样品以14000rpm离心10分钟。将片状沉淀物在MBSA（10mM MOPS、150mM NaCl，pH7.4，含有1mg ml-1牛血清白蛋白）中洗涤一次，并通过在4℃或室温下加入0.1-1%正十二烷基-D-麦芽糖苷(DDM)将脂质溶解1小时。为将所述融合同七聚体和异七聚体从野生型同七聚体中纯化出来，加入300μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，并在4℃和350rpm下放置过夜。通过以14000rpm离心10分钟沉淀亲和结合的七聚体和Ni-NTA琼脂糖。将Ni-NTA琼脂糖珠在500μl洗涤缓冲液(10mM Tris,10mM咪唑,500mM NaCl,pH8.0)中洗涤两次，每次10分钟，并通过离心回收。在4℃下用500μl洗脱缓冲液(10mM Tris,250mM咪唑,pH8.0)将纯化的异七聚体洗脱1小时。通过离心去除所述Ni-NTA琼脂糖，移出含有所洗脱的纯化的融合七聚体的上清液。通过流过用10mM Tris pH8.0平衡的缓冲液交换柱(NAP-5,GE Healthcare)而使洗脱的七聚体脱盐。 
1.7核酸外切酶荧光测定 
重组大肠杆菌核酸外切酶III购自New England Biolabs（100单位μl-1)。在正义链上用5’荧光团(5HEX)标记并且在反义链上用3’black hole quencher(BHQ-2a-Q)标记的双链DNA模板从Operon获得。 
下面给出所述寡核苷酸序列以及各自的荧光团和猝灭对： 
5’[5HEX]GCAACAGAGCTGATGGATCAAATGCATTAGGTA AACATGTTACGTCGTAA3’(SEQ ID NO:31) 
5’CGATCTTACGACGTAACATGTTTACCTAATGCATTTGA TCCATCAGCTCTGTTGC[BHQ2a]3’(SEQ ID NO:32) 
所述底物dsDNA在反义链的5’末端具有5bp的突出（overhang），使得核酸外切酶III可在正义链的3’末端上起始。 
荧光测量使用Cary Eclipse(Varian)进行，激发和发射波长分别 为535和554nm，激发和发射狭缝为5nm。每4秒进行测量，持续60分钟。除非另有指明，否则在37℃下进行40μl体系的反应，并由以下构成：200nm底物dsDNA；25mM Tris pH7.5；1mM MgCl2；100mM KCl；0.001单位Exo III。 
1.8平面双分子层记录 
全部双分子层均由横跨聚四氟乙烯膜（厚度为25μm，来自Goodfellow,Malvern,PA）上直径为60-150μm的孔洞的1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Avanti Polar Lipids)的两个单分子层的并置形成，所述聚四氟乙烯膜将槽分为两个缓冲液隔室（顺隔室和反隔室），每个隔室的容积为1ml。通过连续升高每个隔室中的缓冲液水平直至观察到高阻封接(≥10GΩ)，形成横跨所述孔洞的双分子层。除非另有指明，否则将融合七聚体以及DNA或dNMP加至接地的所述顺隔室。如果需要，将所述衔接体分子am7βCD或am6-amPDP1-βCD加入连接至放大器的探头（head-stage）的所述反隔室。除非另有指明，否则实验在25mM Tris.HCl,400mM KCl pH8.0中于22℃下进行。 
1.9核酸外切酶
核酸外切酶例如脱氧核糖核酸酶是EC3.1酶的亚组。它们可催化DNA链中相邻碱基之间磷酸二酯键的水解，以释放单个5’单磷酸核苷（图1）。如图所示,有吸引力的活性催化此键的断裂（通过活化水分子对磷的亲核攻击）。 
将核酸降解为其组成部分的不同酶活性的数量是有限的，但在不同生物体中存在大量同系物（例如核酸外切酶III）。根据详细的文献搜索，两种持续性最大的核酸外切酶是由大肠杆菌的sbcB基因编码的核酸外切酶I和由噬菌体λ的exo基因编码的λ-核酸外切酶（Thomas,K.and Olivera,B.(1978)Processivity of DNA exonucleases.Journal of Biological Chemistry.253,424-429;和Zagursky,R.and Hays,J.(1983).Expression of the phage lambda recombination genes exo and bet under lacPO control on a multi-copy plasmid.Gene.23,277-292）。此外，核酸外切酶I在高盐浓度下的活性已被证明(Hornblower,B.,Coombs,A.,Whitaker,R., Kolomeisky,A.,Picone,S.,Meller,A.Akeson,M.(2007).Single-molecule analysis of DNA-protein complexes using nanopores.Nature Methods.4,315-317)。由于λ核酸外切酶是三聚体，功能性核酸外切酶的结合更困难，因此单体酶核酸外切酶III也被包括进来，因为尽管其持续较短，但它也能降解dsDNA的一条链以产生5’单磷酸核苷。同时Exo I以3’-5’方向降解ssDNA，RecJ以5’-3’方向起作用，因此它们也被包括在此研究中(Lovett,S.and Kolodner,R.(1989).Identification and purification of a single-stranded-DNA-specific exonuclease encoded by the recJ gene of Escherichia coli.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.86,2627-2631)。ssDNA核酸外切酶已被证明可与单链结合蛋白相互作用并协同地起作用（Genschel,J.,Curth,U.and Urbanke,C.(2000)Interaction of E.coli single-stranded DNA binding protein(SSB)with exonuclease I.The carboxy terminus of SSB is the recognition site for the nuclease.Biological Chemistry.381,183-192;和Han,E.,Cooper,D.,Persky,N.,Sutera,V.,Whitaker,R.,Montello,M.and Lovett,S.(2006).RecJ exonuclease:substrates,products and interaction with SSB.Nucleic Acids Research.34,1084-1091）。可能需要使用这些蛋白来防止ssDNA底物形成二级结构，所述二级结构可能抑制酶引发或在高盐浓度下的持续性。 
在此实施例中使用四种核酸外切酶： 
1.来自大肠杆菌的Exo III，单体，dsDNA，3’-5’（SEQ ID NO:9和10） 
2.来自大肠杆菌的Exo I，单体，dsDNA，3’-5’（SEQ ID NO:11和12） 
3.来自嗜热栖热菌（T.thermophilus）的RecJ，单体，ssDNA，5’-3’（SEQ ID NO:13和14） 
4.来自λ噬菌体的λExo，三聚体，dsDNA，5’-3’（一个单体的序列示于SEQ ID NO:15和16）。 
可获得的所有这些酶的高分辨率晶体结构（Mol,C.,Kuo,C.,Thayer,M.,Cunningham,R.and Tainer,J.(1995)Structure and  function of the multifunctional DNA-repair enzyme exonuclease III.Nature.374,381-386;Kovall,R.and Matthews,B.(1997).Toroidal structure of lambda-exonuclease.Science.277,1824-1827;和Busam,R.(2008).Structure of Escherichia coli exonuclease I in complex with thymidine5'-monophosphate.Acta Crystallographica.64,206-210），并示于图2。TthRecJ是由Yamagata等人确定的酶核心结构域(Yamagata,A.,Masui,R.,Kakuta,Y.,Kuramitsu,S.and Fukuyama,K.(2001))。 
1.10基因结合
利用上文详细描述的核酸外切酶的特性，通过生成假设模型来指导这里所述的工作，在所述模型中αHL七聚体7个亚基中仅一个被修改而带有所述核酸外切酶活性。图3表示装配到异七聚体中的融合构建体，其中所述融合构建体具有与所述蛋白的顺侧上的环结合的核酸外切酶。此模型满足其他额外所需的特性。在正电势下融合在αHL七聚体的顺侧上的核酸外切酶会释放单磷酸核苷或ssDNA，所述单磷酸核苷或ssDNA会从所述孔的顺侧迁移到反侧。此迁移方向在大量纳米孔传感的公开文献中是标准的。核酸外切酶在环区内的基因结合（genetic attachment）也始终意味着可设计N和C末端接头来限制和约束所述核酸外切酶相对所述孔腔的移动性。 
为了形成α-HL与所述核酸外切酶蛋白的基因融合，对已有的带有野生型α-HL基因的表达质粒pT7-SC1进行了基因操作(SEQ ID NO:3)。此质粒带有编码野生型α-HL(SEQ ID NO:1)的基因，不含已被证明可增强所述孔检测和辨别单磷酸核苷的能力的任何突变。将唯一的BspEI限制性内切酶位点分别设计改造到α-HL基因中的三个具体位置上，以实现核酸外切酶基因的插入，如下文所详述。因此产生三种质粒，每种仅带有单个用于核酸外切酶基因融合的BspEI位点。 
第一个插入位点L1位于α-溶血素蛋白的第一环区(N6-V20)的残基T18和T19之间(SEQ ID NO:6)。第二个插入位点L2位于α-溶血素蛋白的第二环区(D44-K50)起始处的残基D44和D45之间(SEQ ID NO:7)。第三个插入位点L2b位于α-溶血素蛋白的第二环区(D44-K50)终止处的残基K50和K51之间(SEQ ID NO:8)。 
为在大肠杆菌中表达，将核酸外切酶基因进行密码子优化，并通过GenScript Coporation合成（SEQ ID NO:10、12、15和16)。基因侧翼是编码重复丝氨酸-甘氨酸的10个残基的区域。这一蛋白序列被认为基本上没有确定的二级或三级结构。所述接头的末端还被定义为限制性内切酶BspEI的识别序列，因为此序列也编码构成所述接头一部分的丝氨酸和甘氨酸。类似地将此酶的识别位点(TCCGGA)设计改造到αHL基因内的三个具体位置，以提供在这些限定位置上框内插入核酸外切酶的途径。 
所述重组基因可编码由以下构成的融合蛋白：αHL的一部分；10丝氨酸-甘氨酸接头区；核酸外切酶；10丝氨酸-甘氨酸接头区；和αHL的其余部分。一旦被制备，就将所述嵌合基因构建体测序并验证，如图4所示。 
α-溶血素的N末端和C末端均适合与酶进行基因融合。已经证明17个N末端残基——其构成氨基闩（amino latch）——对于七聚体形成不是必需的。尽管不可能从C末端缺失多于3个残基而不影响寡聚体化，然而其已经作为位于帽结构域背面的可能的结合点被容易地呈现(Walker,B.and Bayley,H.(1995).Key residues for membrane binding,oligomerization and pore-forming activity of Staphylococcalα-hemolysin identified by cysteine scanning mutagenesis and targeted chemical modification.The Journal of Biological Chemistry.270,23065-23071)。 
酶在α-溶血素的N和C末端处的结合以与上述类似的方式进行。再次通过富含丝氨酸-甘氨酸的接头来介导所述酶和α-溶血素结构域，以确保正确折叠所必需的物理分开以及每个蛋白结构域的空间分开。然而，结合的精确细节在下一节详述。 
开始时使用溶血素单体作为野生型单体(wt)，然而我们已经证明HL-M113R/N139Q单体呈现更好的碱基辨别，因此将基线变为此背景。进一步的工作表明当衔接体分子与L135C位结合时获得碱基最佳分辨，这在后面的构建体中被加至溶血素-核酸外切酶融合物中。 
在所述构建体的命名中，单体HL-M113R/N139Q缩写为HL-RQ，单体HL-M113R/N139Q/L135C缩写为HL-RQC。因此融合构建体 HL-(M113R/N139Q)6(M113R/N139Q/L135C-EcoExoIII-L1-H6)1缩写为HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1。 
2结果 
2.1环1融合蛋白的寡聚体化
水溶性α-溶血素单体可与脂质膜结合并在脂质膜上自装配，以经中间体七聚体前孔形成具有确定结构的跨膜孔(Walker,B.and Bayley,H.(1995).Key residues for membrane binding,oligomerization and pore-forming activity of Staphylococcal α-hemolysin identified by cysteine scanning mutagenesis and targeted chemical modification.The Journal of Biological Chemistry.270,23065-23071)。然后完全装配的孔可通过SDS PAGE分离并回收，用于生物物理表征。通过体外转录翻译(IVTT)产生并在纯化的兔红细胞膜上寡聚体化的放射性标记的α-溶血素单体使得，可使用放射自显影照片作为模板从凝胶回收七聚体。被修改的单体也可以以任何数量并在所述亚基的任何位置(1-7)整合入所述七聚体。被修改的亚基还通常带有多天冬氨酸尾巴以使得同或异七聚体在SDS PAGE上迁移率不同，从而易于纯化每种变体(Braha,O.,Walker,B.,Cheley,S.,Kasianowicz,J.,Song,L.,Gouaux,J.and Bayley,H.(1997).Designed protein pores as components for biosensors.Chemistry and Biology.4,497-505)。由于核酸外切酶蛋白的大小，预期所述融合单体不需要多天冬氨酸尾巴，因为仅核酸外切酶就会导致电泳移动率的显著改变，以实现对各个异七聚体与野生型同七聚体的辨别。 
为确定HL-RQ与融合单体的混合物是否能够形成异七聚体，将[35S]L甲硫氨酸标记的HL-RQ以及融合蛋白HL-wt-EcoExoIII-L1-H6(SEQ ID NO:18)、HL-RQC-EcoExoIII-L1-H6(SEQ ID NO:20)、HL-RQC-EcoExoI-L1-H6(SEQ ID NO:22)和HL-RQC-TthRecJ-L1-H6(SEQ ID NO:24)通过IVTT进行表达并在纯化的兔红细胞膜上寡聚体化。对于全部所有酶融合物，凝胶的放射自显影照片识别出几个具有不同大小的推定的七聚体条带（图5）。 
为表征这些七聚体条带并确定每条带内亚基的比例，从凝胶切下蛋白。在95℃下将七聚体加热10分钟会将蛋白分解成其构成单体，然后所述单体可在SDS PAGE上通过光密度分析法显示，以确定七聚体亚基的组成。然后，可将不同表征的七聚体条带鉴定为同七聚体或者由不同比例的野生型与融合α-HL单体构成的异七聚体。对使用HL-wt-EcoExoIII-L1-H6和HL-RQC-EcoExoI-L1-H6融合蛋白产生的推定七聚体条带进行这种表征。 
测序应用的一个要点是优选地只存在一个核酸外切酶基团，确保在任何时间只从被加工的单条DNA链上释放碱基。HL-单体：HL-核酸外切酶为6:1的物质的电泳迁移率不同于其他寡聚体，因此是合乎容易的纯化所需要的。令人惊奇的是，HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1七聚体在凝胶上向下迁移至稍低于HL-(RQ)7的位置，尽管所述亚基之一上存在约36kDa的核酸外切酶。此条带还呈现“双重线”，这可能是由所述融合亚基氨基酸闩的不正确整合导致的，所述不正确整合的原因是核酸外切酶在环1的下游插入或在两点处起始翻译（在溶血素M1处以及在ExoIII的第一个甲硫氨酸处的融合蛋白起始）产生融合蛋白混合物导致的。EcoExoIII融合蛋白形成全部理论异七聚体变体以及野生型和融合蛋白同七聚体。作为显著更小（约36kDa）并且N末端和C末端共定位的蛋白，EcoExoIII作为适合插入环区以获得良好的异七聚体形成的核酸外切酶的表现优于EcoExoI或TthRecJ也许不令人惊奇。尽管融合单体亚基的数量有限，EcoExoI和TthRecJ融合蛋白仍然均显示形成异七聚体，但与EcoExoIII的6:1异七聚体相反，这些6:1异七聚体迁移至与HL-(RQ)7相同的位置。 
一个重要的考虑是通过改变野生型与融合单体的比例，观察到了对应于不同的同七聚体和异七聚体的不同条带。这使得可基于不同单体亚基的摩尔比控制同七聚体或异七聚体的形成，所述摩尔比对于HL-(RQ)6(RQ-Exonuclease-H6)1的优先产生是重要的（图6）。 
通过改变单体蛋白的比例使HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1异七聚体形成的条件优化。优选的100:1的比例占优势地形成一种异七聚体HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1,以及野生型同七聚体 HL-(RQ)7。然后，利用所述融合亚基的6组氨酸标签的亲和纯化可将异七聚体与HL-RQ同七聚体分离。 
从凝胶上切下HL-(wt-EcoExoIII-L1-H6)7同七聚体和HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1异七聚体条带并通过所述凝胶切片的再水化和浸渍回收所述蛋白孔。这些分离的七聚体均能够插入平面脂质双层以产生单通道记录。然而，所述HL-(wt-EcoExoIII-L1-H6)7同七聚体的单通道迹线在≥80mV下表现出许多阻断事件。这可归因于围绕帽结构域的七个变性核酸外切酶肽链的存在，因为使用HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1异七聚体时这些事件显著更弱。HL-(RQ)6(wt-EcoExoIII-L1-H6)1异七聚体产生约160pA的开放孔电流，而包含对碱基识别必需的突变的异七聚体HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1显示出β-环糊精衔接体分子的共价结合，其特征在于约90pA的持续电流阻断。 
融合蛋白的构建涉及通过肽接头连接两个蛋白或蛋白结构域。为了不干扰所述结构域的功能，接头序列的长度、柔性和亲水性很重要。首先将环1融合构建体的接头区设计为具有足够长度，以使所述融合蛋白的核酸外切酶和α-溶血素均可正确折叠。然而，为在靠近孔腔的位置释放单磷酸核苷，重要的是所述接头区的长度和构象。然而，在某一点上，所述接头太短从而无法连接以无张力的其天然构象形式存在的亚基，这对核酸外切酶活性以及很可能对寡聚体化特别不利。因此将接头的长度缩短到(SG)4、(SG)2和(SG)1来确定对寡聚体化效率的影响。对于寡聚体化，缩短的(SG)4和(SG)2接头对异七聚体形成的效率没有不利影响。没有测定这些缩短的接头对酶活的影响，但(SG)4融合蛋白表现出可溶性蛋白的表达的增加，这是正确折叠的蛋白的一个指示。 
这些接头的构象柔性也会在任何给定时间对核酸外切酶相对于孔腔的位置具有影响。尽管在N末端和C末端接头接合点可能需要构象柔性，然而接头其余部分过大的柔性可能不利于核酸外切酶活性位点到孔腔的共定位。甘氨酸中无β-碳使得多肽骨架可进入其他氨基酸不能进入的二面角。脯氨酸作为环状亚氨基酸不含用于在氢键合提供的酰胺氢，因此不能融入α-螺旋和β-片层二级结构。因此多脯氨 酸区是刚性的，无二级结构。通过PCR产物的体内同源重组，用5个脯氨酸残基替换10丝氨酸-甘氨酸接头。对于环1EcoExoIII构建体，确定使用刚性聚脯氨酸“分子标尺”作为所述核酸外切酶的C末端与α-溶血素的N末端之间的接头（图7）。 
异七聚体形成并未被废止，表明使用脯氨酸作为融合蛋白的EcoExoIII的C末端与α-溶血素T19之间的接头的可能性。尽管两种融合蛋白均在融合蛋白占优势时表现出异七聚体的低产量，然而特别是HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1的形成不受影响。 
已经证明了可使用不同长度的柔性接头和可选刚性接头来优化核酸外切酶相对所述孔腔的位置和构象自由度，以及一种用于优化6:1异七聚体的优先形成的方法。 
2.2环2融合蛋白的诱变和寡聚体化
对环1中的EcoExoIII，由IVTT蛋白产生的异七聚体的高产量为将EcoExoIII插入其他环区特别是环2内的两个位置提供了信心（图8）。由于此环区连接两条完整的β片层，因此似乎不具有共定位的N末端和C末端的任何酶均会限制破坏α-溶血素结构域，使得此原体（protomer）丧失寡聚体化的能力。只有非常长的接头区可在这些位置上实现EcoExoI或TthRecJ的基因结合，因为其N末端和C末端定位到位于各自的酶远端的结构域。 
HL-RQC-EcoExoIII-L2a-H6和HL-RQC-EcoExoIII-L2b-H6融合蛋白的寡聚体化很差，并且只观察到电泳迁移率类似于HL-(RQ)7和HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L1-H6)1的七聚体。由于HL-RQC-EcoExoIII-L2a-H6的寡聚体化相对HL-RQC-EcoExoIII-L2b-H6融合蛋白稍有增加，因此进行修饰以增加异七聚体的形成。在一项尝试中，缺失了插入位点周围的残基以容纳末端接头残基。此外，环2中的某些残基对于七聚体自装配可能很重要。α-溶血素单体与其他β-孔形成毒素单体LukS和LukF的序列比对表明，环2是一个高度保守的区域，特别是残基D45，其是紧接核酸外切酶接头接合点的残基。α-溶血素七聚体的晶体结构也表明，H48对于在T22和D24位置结合邻接亚基的氨基闩很重要(Song,L.,Hohaugh,M.,Shustak,C.,Cheley,S.,Bayley,H.and Gouaux,E. (1996).Structure of Staphylococcalα-hemolysin,a heptameric transmembrane pore.Science.274,1859-1865)。因此，尝试了对所述插入位点进行修改，以适合和表征这些可能的重要相互作用。 
在环2a的EcoExoIII插入位点(D44-D45)周围，通过PCR产物的体内同源重组连续缺失了残基D45、K46和N47。为确定H48的重要性，还将所述插入位点变为位于N47-N49之间，完全缺失H48。如前所述，接头的柔性可对融合蛋白内的结构域的相互作用具有重要作用。因此在一项尝试中，用刚性的8脯氨酸接头替换柔性10丝氨酸-甘氨酸接头，以使结构域分离更大。每种环2融合构建体均通过IVTT表达并在纯化的兔红细胞膜的存在下以2.5:1的比例与野生型混合物。通过放射自显影照片的光密度分析确定了寡聚体化的增加（图9）。 
当将所述柔性接头改变为更刚性的多脯氨酸接头时，完全消除了L2融合蛋白的寡聚体化。此外，H48的缺失以及将核酸外切酶插入定位至N47和N49之间完全消除了异七聚体的形成。似乎只有从D44-D45插入位点周围缺失残基才能增加所述融合蛋白的寡聚体化。为确定这是否可被进一步提高，将残基D45加回到所述环2缺失融合蛋白中毗邻D44且在EcoExoIII插入位点之前的位置（图10）。 
异七聚体形成不受残基D45位置的影响，并且实际上将此残基加回所有融合蛋白均对寡聚体化不利，可能是因为其将为容纳核酸外切酶而缺失的残基的数量减少了一个。因此，容纳核酸外切酶是增加所述环2融合蛋白（如SEQ ID NO:26中所示）的寡聚体化的关键。在一项尝试中，进一步改变了插入位点以确定所述插入位点可多么靠近β2链。所述环区内的位置对EcoExoIII活性位点相对于孔腔的相对定位是重要的，并且预测与β2越接近，切下的单磷酸核苷的呈递越好。在每种融合构建体中，不仅改变了插入位点，而且缺失了α-溶血素在EcoExoIII的C末端后面的三个残基以容纳所述核酸外切酶。其他环2融合蛋白HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-D45-N47Δ-H6)1、HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-F42-D46Δ-H6)1和HL-(RQ)6(RQC-EcoExoIII-L2-I43-D46Δ-H6)1的寡聚体化确定了所述插入位点可位于所述环区内的任何位置，但是一旦它破坏了二级结构 区，全部寡聚体化都会被完全消除（图10）。 
正如由刚性脯氨酸接头不能取代的这一事实所确定的，当所述环2融合蛋白中的接头需要某种程度的柔性时，其长度可缩短。对于所述环1EcoExoIII融合蛋白，将接头区的长度缩短到(SG)4、(SG)3、(SG)2和(SG)1来确定对寡聚体化效率的影响。对于寡聚体化，缩短的(SG)4、(SG)3和(SG)2接头对异七聚体形成的效率没有不利影响。然而，未确定这些缩短的接头对酶活的效应。 
2.3在α-溶血素的N末端和C末端的基因结合
两种蛋白——通常是一种酶与一种蛋白——的基因结合以前聚焦于一种蛋白的C末端与另一蛋白的N末端通过肽接头的融合。如前人所述，DNA操作酶与α-溶血素的C或N末端的结合的策略被考虑，特别是EcoExoI与Klenow片段的结合。用5种不同的接头介导了EcoExoI在C末端的结合，以确定对于寡聚体化的最佳融合蛋白。当所述C末端位于α-溶血素帽结构域的背面时，需要约180°的转角。为引发此转角，将Gly-Asp或Trp-Pro-Val基序加在所述接头肽的起始处。还使用了两种接头肽，柔性16丝氨酸-甘氨酸或者12多脯氨酸。由于EcoExoI环1融合蛋白的早期结果表明，6:1异七聚体具有与野生型同七聚体相同的电泳迁移率，因此使用放射性标记与非放射性标记的IVTT单体的混合物进行寡聚体化。将单体以1:1的比例混合并在纯化的兔红细胞膜上寡聚体化（图11）。 
尽管产生的融合蛋白主要是6:1异七聚体，然而这种异七聚体与HL-(RQ)7同七聚体迁移至相同位置。因此，从SDS纯化了对应于HL-(RQ)5(RQC-EcoExoI-Cter-{SG}8-H6)2、HL-(RQ)5(RQC-EcoExoI-Cter-DG{SG}8-H6)2异七聚体的蛋白以及来自更早实验的HL-(RQ)5(RQC-EcoExoI-L1-H6)2异七聚体的蛋白，并测定了插入平面脂质双层的能力。所有异七聚体均能够插入所述脂质双层以产生单通道记录。 
由(SG)8和DG(SG)8肽接头介导的EcoExoI在α-溶血素的C末端的融合的成功，提供了用于通过基因融合在后结合其他DNA操作酶例如Klenow片段（SEQ ID NO:28和30）的方法。Klenow片段的优点是这样的事实，即其提供用于链测序的分子马达，并且还显示出对 SDS PAGE的某种抗性(Akeson,Personal Communication)。 
2.4七聚体的非SDS PAGE纯化
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种使蛋白高度变性的阴离子表面活性剂，这是因为其具有破坏非共价键并与肽链结合的能力。由于现有的七聚体纯化技术倚赖SDS PAGE的使用，因此通过基于荧光的活性测定法测定了此去污剂对EcoExoIII的效应（图12，左图）。 
对于天然酶，即使低浓度的SDS也会完全破坏EcoExoIII活性，使得常规SDS PAGE纯化的七聚体（即融合蛋白异七聚体的核酸外切酶部分）变性。因此，建立了另一种使用另外去污剂正十二烷基-D-麦芽糖苷(DDM)的纯化方法。此表面活性剂对EcoExoIII的效应被测定，并且发现不变性所述天然酶（图12，右图）。在兔红细胞膜上寡聚体化后，不通过SDS PAGE纯化七聚体，而是通过加入0.1%DDM将所述脂质膜溶解15分钟。然后通过对所述融合蛋白C末端的六-组氨酸标记的亲和纯化将异七聚体从野生型同七聚体中纯化出来。缓冲液置换进一步除去任何表面活性剂，然后使用七聚体进行单通道记录。此方法不能完全区分异七聚体，因此通过优化混合单体的比例来限制5:2异七聚体的形成。 
经DDM提取的纯化产生的七聚体在单通道记录中显示出阻断事件数量的增加以及对所述脂质双层上的表面活性剂特征。尽管这种不稳定性的原因尚未确定，然而其似乎是因为由从所述兔红细胞膜释放的其他膜蛋白，直接作用于所述脂质双层或者增加蛋白结合的表面活性剂残留。通常在纯化的兔红细胞膜或脱氧胆酸胶束上促进α-溶血素单体的寡聚体化。在这种情况下，用脱氧胆酸的七聚体的产率太差以至于不能使用，并且如前文所述，使用纯化的兔红细胞膜会导致脂质双层的不稳定。作为替代方案，基于兔红细胞膜的脂质组成建立了合成脂质囊泡，其不含兔红细胞膜的其他膜蛋白。所述脂质囊泡由30%胆固醇、30%磷脂酰胆碱(PC)、20%磷脂酰乙醇胺(PE)、10%鞘磷脂(SM)和10%磷脂酰丝氨酸(PS)构成。此处建立的合成脂质囊泡得到的七聚体化效率与用兔红细胞膜所观察到的大致相同。通过DDM提取从这些合成脂质囊泡纯化到的七聚体还表现出脂质双层不稳定性的出现的极大减少。 
还对大肠杆菌表达的蛋白进行了七聚体的寡聚体化和DDM纯化的测定。野生型和融合单体在大肠杆菌中的表达得到足以进行酶孔的大规模生产的浓度，通常分别为3mg ml-1和1mg ml-1。使单体在合成脂质囊泡上以100:1（野生型：融合物）的比例寡聚体化并按照之前详述进行纯化（图13）。 
可在合成脂质囊泡上寡聚体化的单体的高水平大肠杆菌表达得以实现。6:1异七聚体的纯化在不使酶变性的条件下得以实现，确保所述孔核酸外切酶部分的活性。 
2.5融合蛋白七聚体的酶活
由于所述酶的末端在构型上被限制在α-溶血素单体的环区内，因此活性必需的所述核酸外切酶结构域的动态运动可能受到影响。所述天然酶(Exonuclease III,NEB)能够从所述dsDNA底物上切下核苷酸，直至正义链的长度不足以与反义链（约8bp）杂交的点。在所述DNA链离解时，位于正义链5’末端的荧光团与位于反义链3’末端的其淬灭剂配对物分开足够的空间距离，产生与酶活相应的荧光增加。还在一个盐浓度范围内(0-1M KCl)测定了所述天然酶的活性。所述天然酶的活性在≤300mM KCl的浓度下被证实，该浓度处在单通道记录和碱基识别所需的实验条件之内。为确定所述融合蛋白上EcoExoIII部分在基因结合和寡聚体化后是否仍保留核酸外切酶活性，在该相同的基于荧光的DNA降解测定法中测定了EcoExoIII部分的活性（图14）。 
所述EcoExoIII融合蛋白被证明保留有核酸外切酶活性，但至今这仍是定性指示而非定量指示，因为融合蛋白的量未确定。因此，EcoExoIII与α-溶血素单体的基因融合对核酸外切酶活性的速率的效应至今尚不能确定。 
在纯化的所有阶段均检测了所述融合蛋白的核酸外切酶活性并发现一直保留有活性。在寡聚体化和DDM纯化之后，还检查了完全形成的孔的活性，并发现显示出一定的核酸外切酶活性。这证明了使酶与蛋白孔基因偶联并在表达和寡聚体化为完全装配的孔之后仍保留酶活的能力。 
2.6融合蛋白七聚体的孔形成活性
如前文所述，已经证明了多种不同酶孔构建体插入脂质双层以进 行单通道记录的能力。我们已经证明，对α-溶血素蛋白的β-桶状体的改变可使得衔接体分子共价键合并稳定，以进行连续碱基检测。为此，所述孔优选地需要6个具有M113R/N139Q突变的亚基和1个具有M113R/N139Q/L135C突变的亚基。为确定所述融合蛋白在环区内的核酸外切酶结构域是否影响所述孔识别碱基的能力，在所述融合构建体中制造了M113R/N139Q/L135C突变。由于碱基识别优选地需要只具有一个带有L135C突变的亚基的异七聚体并且所述酶孔优选一个亚基为融合蛋白，因此在所述融合蛋白中制造了L135C突变。使用来自之前工作的野生型M113R和N139Q构建体用于其他亚基，使大肠杆菌表达的HL-RQ和HL-RQC-EcoExoIII-L2-D46-N47Δ-H6在合成脂质囊泡上寡聚体化（以100:1的比例）并通过DDM提取纯化。测定了完全形成的孔的核酸外切酶活性，并表明核酸外切酶部分的正确折叠。还将所述蛋白用于电生理研究以确定（一）孔的功能性和（二）是否可进行碱基识别（图15）。 
所述6:1异七聚体可插入脂质双层并形成稳定的跨膜电流。此电流可通过引入β-环糊精进行调节，并通过加入单磷酸核苷而进一步降低。所述核酸外切酶结构域的存在似乎对电流或孔的碱基识别无不利影响。尽管所示的工作是对于整合有融合蛋白的异七聚体（其在环2位置上有EcoExoIII的插入物），然而对于环1异七聚体也获得了相似的数据。 
序列表
Figure BDA0000385782940000611
Figure BDA0000385782940000621
Figure BDA0000385782940000631
Figure BDA0000385782940000641
Figure BDA0000385782940000651
Figure BDA0000385782940000661
Figure BDA0000385782940000671
Figure BDA0000385782940000691

Claims (15)

1.一种用于检测核苷酸向核酸链的添加的方法，包括
(a)在存在孔的情况下，使所述核酸链与(i)聚合酶和(ii)经标记的核苷酸接触，从而使得当核苷酸添加至所述核酸链时，磷酸标记物质依次释放，其中所述磷酸物质含有对每种核苷酸特异的标记物；和
(b)使用所述孔检测所述磷酸标记物质，并从而检测所述核苷酸向所述核酸链的添加。
2.权利要求1所述的方法，其中所述孔结合至所述聚合酶。
3.权利要求2所述的方法，其中所述孔共价结合至所述聚合酶。
4.权利要求2所述的方法，其中所述孔在紧密接近所述孔的桶状体或通道的开口的位点处结合至所述聚合酶，并且/或者其中所述聚合酶结合至所述孔从而使得所述酶的活性位点朝向所述孔的开口。
5.权利要求1所述的方法，其中所述磷酸标记物质是通过以下方式检测：使所述物质与所述孔接触从而使得所述物质依次与所述孔反应，并且测量每次反应期间通过所述孔的电流。
6.权利要求1所述的方法，其中所述方法用于测序所述核酸链，并且所述方法还包括(c)使用所述核酸标记物质的顺序来确定所述核酸链的序列。
7.权利要求1所述的方法，其中所述孔来源自α-溶血素。
8.权利要求7所述的方法，其中所述孔包括七个亚基，基于氨基酸同一性，每个亚基与SEQ ID NO:2在其整个序列上具有至少55%的同源性。
9.权利要求8所述的方法，其中至少一个亚基在SEQ ID NO:2的139位上具有谷氨酰胺，在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸或者在SEQ ID NO:2的119、121或135位上具有半胱氨酸。
10.权利要求9所述的方法，其中(a)全部7个亚基均在SEQ IDNO:2的139位上具有谷氨酰胺并且所述亚基之一在135位上具有半胱氨酸，并且/或者(b)全部7个亚基均在SEQ ID NO:2的113位上具有精氨酸。
11.权利要求1所述的方法，其中所述孔包括有利于所述孔与所述标记物质之间的相互作用的分子衔接体。
12.权利要求11所述的方法，其中所述分子衔接体为环糊精或其衍生物，七-6-氨基-β-环糊精(am7-βCD)、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精(am1-βCD)或七-(6-脱氧-6-胍基)-环糊精(gu7-βCD)。
13.权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶为(a)酶分类(EC)组2.7.7.6、2.7.7.7、2.7.7.19、2.7.7.48和2.7.7.49的任一组的成员，或(b)依赖DNA的DNA聚合酶、依赖RNA的DNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶或依赖RNA的RNA聚合酶。
14.权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸用荧光分子、放射性同位素、酶、抗体、抗原、多核苷酸或配体标记。
15.一种用于检测核苷酸向核酸链的添加的试剂盒，包括孔、聚合酶和经标记的核苷酸。
CN201310435243.3A 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体 Active CN103695530B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7869508P 2008-07-07 2008-07-07
US61/078,695 2008-07-07
CN2009801348866A CN102245760A (zh) 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801348866A Division CN102245760A (zh) 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103695530A true CN103695530A (zh) 2014-04-02
CN103695530B CN103695530B (zh) 2016-05-25

Family

ID=41161355

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310435243.3A Active CN103695530B (zh) 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体
CN2009801348866A Pending CN102245760A (zh) 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801348866A Pending CN102245760A (zh) 2008-07-07 2009-07-06 酶-孔构建体

Country Status (4)

Country Link
US (7) US20110229877A1 (zh)
EP (2) EP2307540B1 (zh)
CN (2) CN103695530B (zh)
WO (1) WO2010004265A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106414773A (zh) * 2014-04-04 2017-02-15 牛津纳米孔技术公司 利用分子孔表征目标分子的方法
CN106460061A (zh) * 2014-04-04 2017-02-22 牛津纳米孔技术公司 在双链核酸分子的两端使用纳米孔和锚分子来表征所述双链核酸的方法
CN106459159A (zh) * 2014-05-02 2017-02-22 牛津纳米孔技术公司 突变孔
WO2018100370A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Oxford Nanopore Technologies Limited Methods and systems for characterizing analytes using nanopores
US11041194B2 (en) 2011-05-27 2021-06-22 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Coupling method
US11603562B2 (en) 2018-05-22 2023-03-14 Axbio Inc. Methods, systems, and compositions for nucleic acid sequencing
US11613771B2 (en) 2014-10-17 2023-03-28 Oxford Nanopore Technologies Plc Methods for delivering an analyte to transmembrane pores
US11789014B2 (en) 2017-05-04 2023-10-17 Oxford Nanopore Technologies Plc Method of determining the presence or absence of a target analyte comprising using a reporter polynucleotide and a transmembrane pore
US11920193B2 (en) 2018-06-06 2024-03-05 Oxford Nanopore Technologies Plc Method of characterizing a polynucleotide

Families Citing this family (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0523282D0 (en) 2005-11-15 2005-12-21 Isis Innovation Methods using pores
CA2684801C (en) 2007-04-04 2017-10-10 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
GB2453377A (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Isis Innovation Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore.
US7888127B2 (en) 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
CN103695530B (zh) 2008-07-07 2016-05-25 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
JP2011527191A (ja) 2008-07-07 2011-10-27 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド 塩基検出細孔
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
AU2010209528B2 (en) 2009-01-30 2015-10-01 Oxford Nanopore Technologies Limited Adaptors for nucleic acid constructs in transmembrane sequencing
JP2012516145A (ja) * 2009-01-30 2012-07-19 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド ハイブリダイゼーションリンカー
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
US9017937B1 (en) 2009-04-10 2015-04-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using ratiometric impedance
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
DK2516680T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Sequenom Inc Method and kits to identify aneuploidy
US9605307B2 (en) 2010-02-08 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
US8652779B2 (en) 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
CN103392008B (zh) 2010-09-07 2017-10-20 加利福尼亚大学董事会 通过持续性酶以一个核苷酸的精度控制dna在纳米孔中的移动
US9593370B2 (en) 2010-10-01 2017-03-14 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Biochemical analysis apparatus and rotary valve
GB201021499D0 (en) 2010-12-20 2011-02-02 Loxbridge Res Llp Detection of quantative genetic differnces
GB201100516D0 (en) 2011-01-12 2011-02-23 Isis Innovation Method using fluorinated amphiphiles
US9751915B2 (en) 2011-02-11 2017-09-05 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant pores
US9347929B2 (en) 2011-03-01 2016-05-24 The Regents Of The University Of Michigan Controlling translocation through nanopores with fluid wall
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
GB2492955A (en) 2011-07-13 2013-01-23 Oxford Nanopore Tech Ltd One way valve
AU2012288629B2 (en) 2011-07-25 2017-02-02 Oxford Nanopore Technologies Limited Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores
WO2013038163A2 (en) 2011-09-15 2013-03-21 Oxford Nanopore Technologies Limited Pump
JP6073902B2 (ja) 2011-10-06 2017-02-01 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝的変異の非侵襲的評価のための方法およびプロセス
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013052907A2 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2766496B1 (en) 2011-10-11 2017-03-08 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9758823B2 (en) 2011-10-21 2017-09-12 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme method
US10385382B2 (en) 2011-12-29 2019-08-20 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Enzyme method
EP2798083B1 (en) * 2011-12-29 2017-08-09 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for characterising a polynucelotide by using a xpd helicase
ES2929923T3 (es) 2012-01-20 2022-12-02 Sequenom Inc Procesos de diagnóstico que condicionan las condiciones experimentales
CA2864035C (en) 2012-02-15 2021-05-18 Oxford Nanopore Technologies Limited A method for determining the presence of an analyte using an aptamer
BR112014020211A2 (pt) 2012-02-16 2017-07-04 Oxford Nanopore Tech Ltd métodos para analisar uma série ordenada por tempo de medições de um polímero, para estimar a presença, ausência ou quantidade de um polímero alvo, e para determinar uma alteração em um polímero, programa de computador, e, dispositivos de análise e de diagnóstico
EP2820129A1 (en) 2012-03-02 2015-01-07 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013154999A2 (en) * 2012-04-09 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
WO2013153359A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant lysenin pores
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013191793A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2014011928A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
EP2875128B8 (en) 2012-07-19 2020-06-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
EP2875154B1 (en) 2012-07-19 2017-08-23 Oxford Nanopore Technologies Limited SSB method for characterising a nucleic acid
EP2875152B1 (en) * 2012-07-19 2019-10-09 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme construct
WO2014041337A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Oxford Nanopore Technologies Limited Sample preparation method
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2904534B1 (en) 2012-10-04 2021-12-15 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2889664C (en) 2012-10-26 2020-12-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Droplet interfaces
EP2917366B1 (en) 2012-11-06 2017-08-02 Oxford Nanopore Technologies Limited Quadruplex method
US9605309B2 (en) 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
GB201222928D0 (en) 2012-12-19 2013-01-30 Oxford Nanopore Tech Ltd Analysis of a polynucleotide
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2953524B1 (en) 2013-02-06 2018-08-01 Freenome Holdings Inc. Systems and methods for early disease detection and real-time disease monitoring
US9557292B2 (en) 2013-02-25 2017-01-31 The Regents Of The University Of Michigan Nanopore-based determination of protein charge, shape, volume, rotational diffusion coefficient, and dipole moment
JP6408494B2 (ja) 2013-03-08 2018-10-17 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 酵素停止法
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201318465D0 (en) 2013-10-18 2013-12-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US20130189684A1 (en) 2013-03-12 2013-07-25 Sequenom, Inc. Quantification of cell-specific nucleic acid markers
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
GB201313477D0 (en) 2013-07-29 2013-09-11 Univ Leuven Kath Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids
HUE061261T2 (hu) 2013-04-03 2023-05-28 Sequenom Inc Eljárások és folyamatok genetikai variánsok nem invazív értékelésére
WO2014182726A2 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Sequenom, Inc. Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
CA2907423A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Illumina Cambridge Limited Pyrophosphorolytic sequencing
WO2014190286A2 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
LT3011051T (lt) 2013-06-21 2019-05-10 Sequenom, Inc. Genetinių variacijų neinvazinis vertinimo būdas
GB201316849D0 (en) 2013-09-23 2013-11-06 Isis Innovation Method
KR102514024B1 (ko) 2013-10-04 2023-03-23 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
WO2015054080A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of chromosome alterations
CN117947149A (zh) 2013-10-18 2024-04-30 牛津纳米孔科技公开有限公司 经修饰的酶
GB201406151D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
ES2958715T3 (es) * 2013-11-26 2024-02-13 Illumina Inc Composiciones y métodos para la secuenciación de polinucleótidos
AU2015208919B9 (en) 2014-01-22 2021-04-01 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for attaching one or more polynucleotide binding proteins to a target polynucleotide
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
MA39774A (fr) 2014-03-24 2021-05-12 Roche Sequencing Solutions Inc Procédés chimiques pour produire des nucléotides étiquetés
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
AU2015271824B2 (en) 2014-06-03 2020-12-03 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores
WO2016019042A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3175237B1 (en) 2014-07-31 2020-03-04 Illumina, Inc. Hybrid nanopore sensors
WO2016034591A2 (en) * 2014-09-01 2016-03-10 Vib Vzw Mutant pores
WO2016055778A1 (en) 2014-10-07 2016-04-14 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant pores
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US10689697B2 (en) 2014-10-16 2020-06-23 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Analysis of a polymer
JP6824881B2 (ja) 2014-10-17 2021-02-03 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド ナノ細孔ｒｎａを特徴付けるための方法
GB201502809D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Mutant pore
GB201502810D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2016166232A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Katholieke Universiteit Leuven Nanopores with internal protein adaptors
IL255758B (en) 2015-06-03 2022-07-01 Illumina Inc Compositions, systems and methods for sequencing polynucleotides using tethers anchored to polymerases attached to nanopores
WO2017004504A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 The University Of Massachusetts Membrane and droplet-interface bilayer systems and methods
WO2017049180A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Agena Bioscience, Inc. Methods and compositions for the quantitation of mitochondrial nucleic acid
CA3000561C (en) 2015-09-24 2022-03-22 F. Hoffman-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants
JP7237586B2 (ja) 2015-12-08 2023-03-13 カトリック ユニヴェルシテット ルーヴェン カーユー ルーヴェン リサーチ アンド ディベロップメント 修飾ナノポア、それを含む組成物およびその使用
EP4019542A1 (en) 2016-03-02 2022-06-29 Oxford Nanopore Technologies plc Mutant pores
CN109069662B (zh) 2016-03-24 2022-02-11 吉尼亚科技公司 可用于纳米孔系统的位点特异性生物缀合方法和组合物
US11104709B2 (en) 2016-04-06 2021-08-31 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant pore
CN109563140B (zh) 2016-04-21 2022-10-28 豪夫迈·罗氏有限公司 α-溶血素变体及其用途
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US11200963B2 (en) 2016-07-27 2021-12-14 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
GB2557654A (en) * 2016-12-14 2018-06-27 Uea Enterprises Ltd Method for nucleic acid depletion
CA3207879A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
JP7383480B2 (ja) 2017-02-10 2023-11-20 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ ピーエルシー 修飾ナノポア、それを含む組成物、およびそれらの使用
GB201707122D0 (en) 2017-05-04 2017-06-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Pore
US11035847B2 (en) 2017-06-29 2021-06-15 President And Fellows Of Harvard College Deterministic stepping of polymers through a nanopore
CN110914290A (zh) 2017-06-30 2020-03-24 弗拉芒区生物技术研究所 新颖蛋白孔
SG11201903333SA (en) 2017-12-29 2019-08-27 Clear Labs Inc Automated priming and library loading services
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP3877547A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Oxford Nanopore Technologies Limited Pore
GB201818216D0 (en) 2018-11-08 2018-12-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Pore
GB201821155D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CA3131682A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Improved alignment using homopolymer-collapsed sequencing reads
US11926819B2 (en) 2019-05-28 2024-03-12 The Regents Of The University Of California Methods of adding polymers to ribonucleic acids
AU2020389020A1 (en) 2019-11-19 2022-06-09 Rijksuniversiteit Groningen Artificial nanopores and uses and methods relating thereto
EP4222742A1 (en) 2020-09-29 2023-08-09 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Systems and methods for digital information decoding and data storage in hybrid macromolecules
GB202112235D0 (en) 2021-08-26 2021-10-13 Oxford Nanopore Tech Ltd Nanopore
GB202118939D0 (en) 2021-12-23 2022-02-09 Oxford Nanopore Tech Plc Pore
GB202205617D0 (en) 2022-04-14 2022-06-01 Oxford Nanopore Tech Plc Novel modified protein pores and enzymes
GB202211607D0 (en) 2022-08-09 2022-09-21 Oxford Nanopore Tech Plc Novel pore monomers and pores
WO2024033447A1 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Oxford Nanopore Technologies Plc De novo pores
GB202211602D0 (en) 2022-08-09 2022-09-21 Oxford Nanopore Tech Plc Novel pore monomers and pores
WO2024033443A1 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Oxford Nanopore Technologies Plc Novel pore monomers and pores
WO2024064900A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Systems and methods for tandem repeat mapping
WO2024089270A2 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Oxford Nanopore Technologies Plc Pore monomers and pores
EP4362028A1 (en) 2022-10-31 2024-05-01 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Mutant aerolysin and uses thereof
GB202216905D0 (en) 2022-11-11 2022-12-28 Oxford Nanopore Tech Plc Novel pore monomers and pores

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007057668A1 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Isis Innovation Limited Methods using pores

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH344883A (fr) 1957-08-14 1960-02-29 Renault Clapet comprenant une garniture en matière élastique
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4712583A (en) 1986-05-27 1987-12-15 Pacesetter Infusion, Ltd. Precision passive flat-top valve for medication infusion system
US5777078A (en) * 1993-04-28 1998-07-07 Worcester Foundation For Experimental Biology Triggered pore-forming agents
WO1994025616A1 (en) * 1993-04-28 1994-11-10 Worcester Foundation For Experimental Biology Cell-targeted lytic pore-forming agents
DE4320201A1 (de) 1993-06-18 1995-01-12 Asta Medica Ag Verwendung von Cetrorelix und weiteren Nona- und Dekapeptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Aids und zur Wachstumsstimulation
US5561043A (en) 1994-01-31 1996-10-01 Trustees Of Boston University Self-assembling multimeric nucleic acid constructs
US7569341B2 (en) 1994-01-31 2009-08-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid directed immobilization arrays and methods of assembly
US5496009A (en) 1994-10-07 1996-03-05 Bayer Corporation Valve
JPH08174860A (ja) 1994-10-26 1996-07-09 Seiko Epson Corp インクジェットプリンタ用インクカートリッジ
US5795782A (en) * 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6362002B1 (en) * 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
DE19545421C2 (de) 1995-12-06 2001-05-10 Filtertek Bv Rückschlagventil, insbesondere für die Medizintechnik
WO1999005167A1 (en) * 1997-07-25 1999-02-04 University Of Massachusetts Designed protein pores as components for biosensors
US6087099A (en) 1997-09-08 2000-07-11 Myriad Genetics, Inc. Method for sequencing both strands of a double stranded DNA in a single sequencing reaction
US6127166A (en) * 1997-11-03 2000-10-03 Bayley; Hagan Molluscan ligament polypeptides and genes encoding them
JPH11137260A (ja) 1997-11-06 1999-05-25 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗インフルエンザウイルス環状ダンベル型ｒｎａ−ｄｎａキメラ化合物及び抗インフルエンザウイルス剤
US6123819A (en) * 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
IL123227A0 (en) 1998-02-08 1998-09-24 3By Ltd Check valve
DE19826758C1 (de) * 1998-06-15 1999-10-21 Soft Gene Gmbh Darstellung von linearen kovalent geschlossenen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
US6267872B1 (en) 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
US6426231B1 (en) * 1998-11-18 2002-07-30 The Texas A&M University System Analyte sensing mediated by adapter/carrier molecules
NO986133D0 (no) * 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
AU5631200A (en) * 1999-06-22 2001-01-09 President And Fellows Of Harvard College Control of solid state dimensional features
CA2376650C (en) * 1999-06-29 2008-01-15 University Health Network Peptide conjugates for the stabilization of membrane proteins and interactions with biological membranes
US6619308B2 (en) 1999-07-09 2003-09-16 I-Flow Corporation Pressure regulator
CA2360342A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Molecular Staging Inc. Generation of single-strand circular dna from linear self-annealing segments
AU2001241474A1 (en) 2000-02-11 2001-08-20 The Texas A And M University System Biosensor compositions and methods of use
EP1290005A4 (en) 2000-03-21 2005-04-20 Curagen Corp VEGF MODULATED GENES AND METHODS OF USE
US20020098540A1 (en) 2000-03-22 2002-07-25 Diane Pennica Novel polypeptides, and nucleic acids encoding the same
US6596488B2 (en) 2000-03-30 2003-07-22 City Of Hope Tumor suppressor gene
US7001792B2 (en) * 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
WO2002042496A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 The Regents Of The University Of California Methods and devices for characterizing duplex nucleic acid molecules
AU2002227156A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020197618A1 (en) 2001-01-20 2002-12-26 Sampson Jeffrey R. Synthesis and amplification of unstructured nucleic acids for rapid sequencing
US20030087232A1 (en) 2001-01-25 2003-05-08 Fred Christians Methods for screening polypeptides
US7807408B2 (en) * 2001-03-19 2010-10-05 President & Fellows Of Harvard College Directed evolution of proteins
US6863833B1 (en) * 2001-06-29 2005-03-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microfabricated apertures for supporting bilayer lipid membranes
CA2452716C (en) 2001-07-03 2012-06-26 The Regents Of The University Of California Mammalian sweet and amino acid heterodimeric taste receptors
EP1419274A4 (en) 2001-07-31 2006-02-08 Phylos Inc MODULAR CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACID PROTEIN FUSION MULTIMERS
US6852492B2 (en) 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
EP1487978B1 (en) 2002-03-15 2008-11-19 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
US20030215881A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Hagan Bayley Stochastic sensing through covalent interactions
JP4657919B2 (ja) 2002-08-19 2011-03-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 進化する新しい分子機能
WO2004065582A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Amplification of dna in a hairpin structure, and applications
US7163658B2 (en) * 2003-04-23 2007-01-16 Rouvain Bension Rapid sequencing of polymers
US7344882B2 (en) 2003-05-12 2008-03-18 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding variants of the TRP channel family member, LTRPC3
WO2005056750A2 (en) 2003-12-11 2005-06-23 Quark Biotech, Inc. Inversion-duplication of nucleic acids and libraries prepared thereby
US7238485B2 (en) 2004-03-23 2007-07-03 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
WO2005124888A1 (en) 2004-06-08 2005-12-29 President And Fellows Of Harvard College Suspended carbon nanotube field effect transistor
US7264934B2 (en) 2004-06-10 2007-09-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Rapid parallel nucleic acid analysis
DE202004009831U1 (de) 2004-06-22 2004-08-26 Filtertek B.V. Rückschlagventil
WO2006020775A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 Harvard University An ultra high-throughput opti-nanopore dna readout platform
US20070048748A1 (en) 2004-09-24 2007-03-01 Li-Cor, Inc. Mutant polymerases for sequencing and genotyping
JP4757804B2 (ja) 2004-10-27 2011-08-24 株式会社カネカ 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
WO2007084103A2 (en) 2004-12-21 2007-07-26 The Texas A & M University System High temperature ion channels and pores
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
WO2007024997A2 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Fermalogic, Inc. Methods of increasing production of secondary metabolites
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
DE102005043623A1 (de) 2005-09-13 2007-03-15 Schott Ag Herstellung hochhomogener spannungsarmer Einkristalle durch Ziehen, eine Vorrichtung hierfür sowie die Verwendung solcher Kristalle
AU2006331512B2 (en) 2005-12-22 2012-02-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Active surface coupled polymerases
US7932029B1 (en) 2006-01-04 2011-04-26 Si Lok Methods for nucleic acid mapping and identification of fine-structural-variations in nucleic acids and utilities
US8889348B2 (en) * 2006-06-07 2014-11-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by nanopore using modified nucleotides
WO2008008974A2 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Filtertek Inc. Valve apparatus, combination filter valve assemblies, and devices, systems, and methods including the same
AU2007292295B2 (en) 2006-09-06 2013-06-06 Immunoforge Co., Ltd. Fusion peptide therapeutic compositions
US20100311602A1 (en) 2006-10-13 2010-12-09 J. Craig Venter Institute, Inc. Sequencing method
GB2443260C (en) 2006-10-26 2017-11-29 Cellnovo Ltd Micro-valve
ITTO20070023A1 (it) 2007-01-17 2008-07-18 Borla Ind Valvola unidirezionale per linee medicali di infusione e simili
EP2122344B8 (en) 2007-02-20 2019-08-21 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor system
CA2684801C (en) 2007-04-04 2017-10-10 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
DE202007012680U1 (de) 2007-08-13 2008-01-03 Filtertek B.V., Newcastle West Rückschlagventil, insbesondere für medizinische Anwendungen
US8698481B2 (en) 2007-09-12 2014-04-15 President And Fellows Of Harvard College High-resolution molecular sensor
US7960116B2 (en) 2007-09-28 2011-06-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
GB2453377A (en) 2007-10-05 2009-04-08 Isis Innovation Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore.
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
EP2232233B1 (en) 2007-12-31 2014-03-12 Fujirebio Inc. Clusters of microresonators for cavity mode optical sensing
US8231969B2 (en) 2008-03-26 2012-07-31 University Of Utah Research Foundation Asymmetrically functionalized nanoparticles
US8628940B2 (en) 2008-09-24 2014-01-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
BRPI0909212A2 (pt) 2008-03-28 2015-08-18 Pacific Biosciences California Composições e método para sequeciamento de ácido nucléico
CN103695530B (zh) 2008-07-07 2016-05-25 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
JP2011527191A (ja) 2008-07-07 2011-10-27 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド 塩基検出細孔
EP3029467B1 (en) 2008-09-22 2020-01-08 University of Washington Msp nanopores and related methods
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
AU2010209528B2 (en) 2009-01-30 2015-10-01 Oxford Nanopore Technologies Limited Adaptors for nucleic acid constructs in transmembrane sequencing
JP2012516145A (ja) * 2009-01-30 2012-07-19 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド ハイブリダイゼーションリンカー
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
EP2422198B1 (en) 2009-04-20 2013-09-25 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor array
GB2474073A (en) 2009-10-05 2011-04-06 Gm Global Tech Operations Inc Valve
JP5873023B2 (ja) 2009-12-01 2016-03-01 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 生化学分析機器
FR2955773B1 (fr) 2010-02-01 2017-05-26 Commissariat A L'energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
US8652779B2 (en) * 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
US9593370B2 (en) 2010-10-01 2017-03-14 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Biochemical analysis apparatus and rotary valve
CN107083421A (zh) 2010-12-17 2017-08-22 纽约哥伦比亚大学理事会 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序
WO2013191793A1 (en) * 2012-06-20 2013-12-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
TWI655213B (zh) 2012-07-13 2019-04-01 目立康股份有限公司 自我組織化肽衍生物的製造方法
US9605309B2 (en) * 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
US20140206842A1 (en) 2013-01-22 2014-07-24 Muhammed Majeed Peptides Modified with Triterpenoids and Small Organic Molecules: Synthesis and use in Cosmeceutical

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007057668A1 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Isis Innovation Limited Methods using pores

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN MIN ET AL.: "outer membrane protein G: Engineering a quiet pore for biosensing", 《PROCEEDING OF THE NATIONAL ACADEMY OF AMERICA》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11041194B2 (en) 2011-05-27 2021-06-22 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Coupling method
US11959135B2 (en) 2011-05-27 2024-04-16 Oxford Nanopore Technologies Plc Coupling method
US11946102B2 (en) 2011-05-27 2024-04-02 Oxford Nanopore Technologies Plc Coupling method
US11136623B2 (en) 2011-05-27 2021-10-05 Oxford Nanopore Technologies Limited Coupling method
US11649490B2 (en) 2014-04-04 2023-05-16 Oxford Nanopore Technologies Plc Method of target molecule characterisation using a molecular pore
CN116334198A (zh) * 2014-04-04 2023-06-27 牛津纳米孔科技公开有限公司 分析物的测定和表征方法及试剂盒
CN106460061B (zh) * 2014-04-04 2020-03-06 牛津纳米孔技术公司 在双链核酸分子的两端使用纳米孔和锚分子来表征所述双链核酸的方法
CN106460061A (zh) * 2014-04-04 2017-02-22 牛津纳米孔技术公司 在双链核酸分子的两端使用纳米孔和锚分子来表征所述双链核酸的方法
US11236385B2 (en) 2014-04-04 2022-02-01 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid
US10774378B2 (en) 2014-04-04 2020-09-15 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method of target molecule characterisation using a molecular pore
CN106414773A (zh) * 2014-04-04 2017-02-15 牛津纳米孔技术公司 利用分子孔表征目标分子的方法
CN106459159B (zh) * 2014-05-02 2021-11-30 牛津纳米孔技术公司 突变孔
CN106459159A (zh) * 2014-05-02 2017-02-22 牛津纳米孔技术公司 突变孔
US11613771B2 (en) 2014-10-17 2023-03-28 Oxford Nanopore Technologies Plc Methods for delivering an analyte to transmembrane pores
WO2018100370A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Oxford Nanopore Technologies Limited Methods and systems for characterizing analytes using nanopores
US11789014B2 (en) 2017-05-04 2023-10-17 Oxford Nanopore Technologies Plc Method of determining the presence or absence of a target analyte comprising using a reporter polynucleotide and a transmembrane pore
US11603562B2 (en) 2018-05-22 2023-03-14 Axbio Inc. Methods, systems, and compositions for nucleic acid sequencing
US11920193B2 (en) 2018-06-06 2024-03-05 Oxford Nanopore Technologies Plc Method of characterizing a polynucleotide

Also Published As

Publication number Publication date
US20220064722A1 (en) 2022-03-03
CN102245760A (zh) 2011-11-16
US11078530B2 (en) 2021-08-03
EP2307540B1 (en) 2017-04-19
US11859247B2 (en) 2024-01-02
US20150031020A1 (en) 2015-01-29
US9885078B2 (en) 2018-02-06
EP2307540A1 (en) 2011-04-13
US10077471B2 (en) 2018-09-18
CN103695530B (zh) 2016-05-25
EP2682460B1 (en) 2017-04-26
US20170335384A1 (en) 2017-11-23
US20110229877A1 (en) 2011-09-22
US20190002972A1 (en) 2019-01-03
EP2682460A1 (en) 2014-01-08
WO2010004265A1 (en) 2010-01-14
US20160076092A1 (en) 2016-03-17
US20140051069A1 (en) 2014-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103695530B (zh) 酶-孔构建体
US20220145383A1 (en) Ssb method
CN102365371B (zh) 对杂聚靶核酸序列测序的方法
US20220283141A1 (en) Method
CN102482330A (zh) 酶突变体
CN106459159B (zh) 突变孔
CN102369298B (zh) 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体
EP2875152B1 (en) Enzyme construct
CN102144037A (zh) 检测碱基的孔
CN117965707A (zh) 经修饰的酶
CN109071618A (zh) 突变体孔
US20110086406A1 (en) Chimeric Polymerases
JP2003274962A (ja) 新規な耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及び該ｄｎａポリメラーゼの生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant