CN103675156A - 用于分流混合液相色谱法的方法以及设备 - Google Patents

Abstract

一种用于色谱分离液体样品的分析物的方法，包括：(i)在一个管道中提供样品；(ii)对该样品提供一种溶剂；(iii)使该溶剂同时地流入该管道以便将该样品从该管道排出、并且流入且通过一个第二管道以便退出所述第二管道；(iv)同时将该排出的样品和该退出的溶剂提供到一个混合T形接头，使得该排出的样品和该退出的溶剂在此混合；(v)将该排出的样品和该退出的溶剂的混合物提供到一个色谱柱中，使得这些分析物被转移到该柱内，并且在其中在该溶剂、或一种不同的溶剂或溶剂的一种混合物的一个流动的影响下进行色谱分离。

Description

用于分流混合液相色谱法的方法以及设备

发明领域

本发明涉及高效液相色谱法（HPLC），并且更具体地涉及用于捕获注入HPLC柱的有机溶剂中的少量分析物的技术，特别是用于随后的检测和分析的目的。

发明背景

高效液相色谱法（HPLC）广泛用于分离液体样品中的分析物。典型的HPLC仪器使用高压泵来迫使一个合适的含有样品的流动相以一个恒定的流速通过一个或多个色谱分离柱。通过一种或多种机制在该分离柱内分离样品组分，这些机制包括吸附、尺寸排阻、离子交换或者与色谱填料的其他相互作用。然后通过任何常规的检测器，例如UV-可见光检测器、荧光检测器、红外检测器、质谱仪、拉曼检测器，或者测量折射率或电导率的检测器（只是几个实例）来检测样品组分。

已在范围广泛的应用中证明了通过HPLC分离的效用，这些应用包括从低分子量到高分子量的范围内的分子的分析和纯化。该分离过程依赖于这样的事实：通过颗粒的填充床（被称为固定相）渗滤的一种流体的流动流束中的许多组分溶质分子可以有效地彼此分离。总体上，液相色谱法中的分离是在一个柱中通过样品分子在固定相与流动相之间的选择性分布来实现。单独的样品组分被分离出来，因为每个组分对固定相具有不同的亲和力，导致每个组分有不同的迁移速率和每个组分从柱中出来的不同的退出时间。分离效率是由当溶质带穿过该床或柱时其扩散量来确定。

反相液相色谱法（RP-HPLC）广泛地用作高效液相色谱法（HPLC）中的一种分离模式。在RP-HPLC技术中，在流动相中使用的一种或多种溶剂相比固定相是更具极性的，而在RP-HPLC发展之前进行的常规的（正相）色谱法中情况是相反的。在反相液相色谱系统中典型地采用的流动相溶剂包括水和一种或多种与水可混溶的有机改性剂，例如乙腈或甲醇。所感兴趣的分析物物种典型地形成一种具有流动相的溶液。RP-HPLC固定相通常是高度疏水的或非极性的。化学物种对固定相的亲和力主要产生于该物种与存在于固定相上的化学基团的相互作用，这种亲和力会影响在流动的流动相中的特定物种通过该固定相的速率。这些化学基团可以通过使表面改性剂与基质（如硅石基质）反应而提供在固定相上。因此可以使用表面改性剂来将特定的化学基团吸附到该固定相上。常规反相液相色谱法使用3 μm-10 μm球形硅石珠，这些硅石珠已经通过包括4、8、或18个碳原子的烃链的共价附接进行了改性以提供一个非极性的表面。

在进行RP-HPLC分离时可能出现的一个困难是，当将有机溶剂中的大量分析物注入到色谱装置中时，注入体积可能超过柱体积从而导致分析物不能在反相HPLC固定相中保留。由于在色谱法领域有朝着更小（更低的体积）的柱发展的趋势，这一困难在最近几年已变得更为显著。当样品体积到达该柱时，为了减少通过该柱看到的流动相中总的有机溶剂的量，可以在到达该柱之前将样品体积与水性流动相溶剂混合。作为一个实例，图1示出了一个常规的HPLC系统，在该系统中混合是在将样品装填入色谱装置之前进行。图2-3（图1的讨论之后所讨论的）示出了常规的HPLC系统的实例，在这些系统中混合是在装填之后进行的。

如图1A中所示，有机溶剂中含有分析物的样品是从样品源11提供的并在混合装置19中与来自溶剂源12的水性溶剂混合。然后将该混合物在泵13a的推动下通过管件2a递送到多端口阀15的一个端口。在装填步骤或阶段过程中，多端口阀15被配置为将含有待分析的样品部分的混合物递送至环状管件2c。将任何过量的溶剂或样品通过管件2d递送至废弃物容器17，该管件是流体地连接到该多端口阀的一个端口。

图10是在根据本传授内容的系统内可以采用的多端口阀的一个实例的示意图。在图10中所示的多端口阀15以已知的方式包括其中具有多个孔或通道47的定子部分46，这些孔或通道47从一端到另一端穿过该定子部分，以及其中具有多个凹槽或槽48a-48c的转子部分45，这些凹槽或槽置于该转子部分45的面向定子部分46的一侧。如所示，该定子部分46包括六个孔或通道47，这些孔或通道相对应于例如如图1A中所示的阀15的端口p1-p6。该转子部分45可以旋转，如图10中的双头箭头所示，以保持转子部分和定子部分的面处于相互接触，并且使得凹槽或槽48a-48c可以被配置为使相邻的孔或通道47的交替的组流体互连。尽管示出的是一个旋转阀，但本发明并不旨在限制于此，因为该旋转阀只是一种可以使用的阀的一个实例。

参照这个和其他附图，应当指出，以实线或短划线示出的管段由此表示为通过其发生流体流动的那些管段，而以点线示出的管段由此表示为处于未启用状态。使用了短划线（而不是实线）以便指示通过其发生混合溶剂流动的管段，该混合物包括由两个来源14a和14b所提供的溶剂。应该指出“未启用的”管件的名称仅涉及所讨论的特定实施例的讨论。取决于系统配置和操作，有可能关于所讨论的特定实施例示为“未启用”的一些管段实际上可以是结合一些其他功能或方法正在主动地输送流体。仅作为一个实例，在一些色谱系统中，取决于系统配置和运作模式，可以给样品环（管件2c）连续提供来自一个或多个来源的样品物质，即使在洗脱阶段（即图1C）在样品环管件根据本讨论被表示为处于“未启用”的过程中的时间段。应当进一步指出，虽然术语“管件”在本说明书中用来描述通过其来将流体从一个位置转移到另一个位置的装置，本领域普通技术人员将容易地认识到这种管件长度可能会由任何形式的管道（如蚀刻或机械加工进一个或多个基板的槽）所取代。因此，可以采用任何形式的管道来代替管件本身。还应当进一步指出，环状管件2c经常被称为“进样环”。如在此所用的和在本技术领域中的常见用法中的术语“环”并不是指必须暗示管件（或其他形式的管道）的任何特定的几何构型，而是指管件在其两个端部流体式连接到多端口阀的两个分离的端口。

收集含有待分析的样品部分的混合物的一部分后，将该阀如图1B所示重新配置以便将混合物的一部分递送至色谱柱18。在图1B所示的“进样”配置中，使一种由溶剂源14b所提供的水性流动相溶剂在泵13b的推动下流过梯度阀16和管件2b以便进入多端口阀15的一个端口，并且由此与先前在管件2c中收集的混合物部分混合并排出该混合物部分。被排出的样品和溶剂的混合物穿过管件2e进入色谱柱18。在这个进样阶段或步骤中，流动相溶剂被选择为使得该分析物或这些分析物被优先分配到固定相。用这种方法，该分析物或这些分析物优选“集中”在该固定相-换句话说，通过吸附在固定相上使分析物驻留在柱内的固定相的一个狭窄区域内。

在常规的系统10（图1C）的洗脱阶段或步骤过程中，梯度阀16被配置为用于提供来自两个溶剂源14a、14b的溶剂的混合物进入管件13b。该多端口阀可以被配置为用于将溶剂的混合物直接递送至管件2e并且然后递送至柱18。这些溶剂选择为使得该分析物或这些分析物对来自溶剂源14a的溶剂比来自溶剂源14b的溶剂具有更大的亲和力。使用RP-HPLC技术，这种情况总体上是通过选择来自源14a的溶剂以便比来自源14b的溶剂更具非极性或更少水性来实现。在洗脱过程中，该梯度阀可以被操作为使得渐进地增加来自溶剂源14a的溶剂的比例。用这种方法，可以将分析物以与它们结合到该固定相上的强度的相反顺序一个接一个从该柱中移除。由此分离出的分析物离开柱并被顺序递送至检测器9。

如上文所指出，在某些情况下，由于高的有机溶剂体积可能会出现其中有机物质的进样量超过柱体积的所不希望的情况。高有机物含量从而导致一种所不希望的情况，其中将不会有感兴趣的分析物吸附到固定相，即感兴趣的分析物没有保留在柱上。上面所讨论的图1示出了这个问题的一种常规的解决方案，其中将有机溶剂的体积在被装填入色谱系统之前使用一种水性流动相进行稀释。此解决方案受到一个可能的缺点影响，即，如果感兴趣的分析物最初在初始样品中以低浓度存在，那么使用水性溶剂的随后稀释可能会导致在装填步骤过程中在环形管件2c内保留的分析物物质不足。

图2代表第二种常规的色谱系统20，其中使用一种在线混合设备27进行与水性溶剂的混合。由于该混合是在样品装填之后进行，系统20不包括外部的混合设备，如在图1中所示的混合设备19。相反，来自样品源11的未稀释的样品在装填步骤过程中被递送至管件2a（图2A）。装填步骤的其他方面与参照图1中已讨论的那些是相似的。

在随后的进样步骤中（图2B），通过使用来自溶剂源14b的溶剂冲洗将所收集的样品从管件2c中排出并且进入管件2e如前面参照图1B所述。然而，对比图1B中所示的操作，管件2e不立即将样品引导到柱18。相反，将该样品流体穿过一个插入的在线混合设备27，在该设备内它与将它从管件2c中冲洗出并随它流出管件2c的水性溶剂混合并被其稀释，。样品与水性溶剂的混合稀释了被递送至柱的流动相内有机溶剂的浓度，使得感兴趣的分析物到固定相上的吸附可以发生。

不同类型的在线混合设备可用作该混合设备27。这些装置总体上合并了某种形式的内部流中断机构（如惰性颗粒、折流板或叶片、旋转的螺旋桨、离轴流体引入端口等）以便增加在其内分离地引入的流体能够混合的相互作用路径长度和相互作用体积。这类混合装置有不同尺寸可供使用。不同的这类装置还被称为“混合柱”。对于将样品与稀释液混合，该混合设备的内部体积通常基于引入的有机溶剂的百分比需要稀释到的程度进行选择，以便使感兴趣的分析物被柱保留。

作为一个实例，由溶剂源14b提供给混合设备27的水性溶剂的体积可被控制为大于从环状管件2c所提供的样品的体积的高达三倍、四倍等，从而以至少3、4等的系数稀释最初存在于样品源11中的所有样品和溶剂物种的浓度。样品和稀释液流入混合装置以便在被释放到柱18之前在其内部体积内填充并且混合。在线混合装置的操作的此特征增加了额外的系统空体积，并且可以增加额外的样品分析延迟。因此，例如，如果100 μL的样品被引入到该混合装置中并要求稀释至原浓度的20%，则通常会采用一个具有500 μl的内部体积的在线混合装置。然而，对于此进样量，通常的流速是恰好每分钟500 μL。因此，使用常规的设备将给每个样品分离增加至少一分钟。这种增加的时间在连续运行许多样品的自动化系统中（例如在临床实验室中）可能会变得显著。

图3示出了第三种常规的色谱系统29。类似于系统20（图2）的操作，在色谱系统29内，在样品装填之后并且在多端口阀15的下游，进行样品与水性溶剂的混合。然而，不是采用在线混合设备，该系统使用了一个辅助梯度阀29结合一台辅助泵23以及水性溶剂的辅助源21。管件2f以选定的流速递送一种来自该辅助溶剂源21的水性溶剂流，以便连续地混合并稀释通过管件2e提供到辅助梯度阀15的样品。可替代地，该水性溶剂可以从溶剂源14b中提取。

而系统20（图2）的在线混合设备27进行样品的整个体积与溶剂的整个所选体积一起的混合，系统29（图3）的辅助梯度阀进行分别由管段2e和2f提供的样品流和溶剂流的连续混合。作为一个实例，由溶剂源21所提供的水性溶剂的流动速率可被控制为大于通过管件2e的样品的流动的高达三倍、四倍等，从而以至少3、4等的系数稀释最初存在于样品源11中的所有样品和溶剂物种的浓度。在样品的流速与溶剂的流速之间的比率可由辅助梯度阀25控制。

尽管在系统20（图2）或系统29（图3）中对样品进行了稀释，将所有或大部分分析物物种保留以用于随后的检测，因为它们通过柱18的流动通过吸附到柱内的固定相而被捕获。与此相反，由于在环状管件2c中收集的稀释后的样品的有限体积，图1中所示的预稀释技术可能会降低可用于检测的分析物的总量。在洗脱阶段（图3C）中，辅助泵23被关闭或者辅助阀25被配置为阻止来自辅助溶剂源21的水性溶剂的流动。在系统20或系统29的操作中，洗脱阶段基本上如之前参照图1C所描述的进行，其中将来自两种溶剂源14a、14b的溶剂的混合物供应给柱18。也可以采用递送到柱中的两种溶剂的相对比例的一个程序化的时间变化，以便从柱中顺序移出分析物物种，以便每一个依次被检测器9检测到。

虽然可以并且已经成功地使用图1-3中所示的和上面讨论的常规的色谱技术，它们各自还有一些缺点。例如，图1中所示的常规的预稀释技术要求一个额外的样品制备步骤并且，如上所述，可能减少可用于检测的分析物的总量。图2中所示的常规的在线混合技术将额外的“死体积”引入到如上所指出的流体路径中。该额外的死体积可能会降低色谱分离以及由此产生的数据质量，并且还引入了额外的时间延迟。图3中所示的系统29要求色谱系统包括一个额外的泵以及一个额外的阀，从而增加了系统成本和尺寸。

鉴于以上考虑，在现有技术中对于可在过量有机溶剂的存在下成功地捕获并检测小水平的有机分析物物种而无需额外的泵以及混合设备并且不会对谱质量或分析速度产生不良影响的色谱分析方法和设备存在需要。

发明内容

根据本传授内容的第一方面，提供了一种用于色谱分离液体样品分析物的方法，其中该方法包括：(i) 在一个管道中提供该样品；(ii) 对该样品提供一种溶剂；(iii) 提供一个流体泵；(iv) 操作该流体泵以便同时使该溶剂流入该管道以便将该样品从该管道中排出，并且使该溶剂流入并通过一个第二管道以便退出所述第二管道；(iv) 同时将该排出的样品和该退出的溶剂提供到一个混合T形接头，使得该排出的样品和该退出的溶剂在此混合；(v) 将该排出的样品和退出的溶剂的混合物提供到一个色谱柱中，使得这些分析物被转移到该柱内，并且在其中在该溶剂、一种不同的溶剂或多种溶剂的混合物的流的影响下进行色谱分离。在不同的实施例中，这些分析物在该色谱柱内被吸附到固定相，并且在这样的实施例中，该方法可以包括一个额外步骤 (vi)：将一种包含第二溶剂的流体提供到该色谱柱使得这些吸附的分析物依次从该固定相解吸并从该色谱柱中排出。在等度洗脱的例子中，包含该第二溶剂的流体的组成不随时间变化；在梯度洗脱的例子中，该流体的组成是随时间变化的。

对该样品提供一种溶剂的步骤 (ii) 可以包括以如下方式提供该溶剂使得，当在该混合T形接头处与该样品混合时，该溶剂造成该样品的总有机溶剂含量的稀释。在不同的实施例中，步骤 (iii) 可以包括使该溶剂的一个流通过一个分流T形接头，以便在此被分流成流入该管道的一个第一流动部分和流入并通过该第二管道的一个第二流动部分。在不同的其他实施例中，步骤 (iii) 可以包括使该溶剂的一个流通过一个三端口阀，以便在此被分流成流入该管道的一个第一流动部分和流入并通过该第二管道的一个第二流动部分，所述三端口阀具有一个可操作的流动调节机构用于控制第一流部分的流速与第二流动部分的流速之间的比率。该流动调节机构可以手动或自动控制。此外，在不同的实施例中，步骤 (iii) 可以包含将该溶剂的一个流分流成通过一个多端口阀流入该管道的一个第一流动部分和绕过该多端口阀的一个第二流动部分。该第一流动部分的流速与该第二流动部分的流速之间的比率可通过选择该第二管道的长度或内径来控制。

在一些实施例中，将一种包含第二溶剂的流体提供到色谱柱的步骤 (vi) 可包含随时间改变该流体的组成，其中对所述时间变化进行校准，以便补偿该第一和第二流动部分的流速的差异。在不同的其他实施例中，步骤 (vi) 可包括配置一种流动调节机构使得流体不流过该第二管道。

根据本传授内容的第二个方面，提供了一个色谱系统，该系统包括：(a) 一个多端口阀，该多端口阀包括流体性地连接到样品源的第一端口；以及至少一个第二端口、第三端口、第四端口和第五端口，其中该多端口阀包括一种第一配置，其中该第三和第五端口流体性地连接并且该第二和第四端口流体性地连接；(b) 一个流体性地连接到该第二和第三端口的进样环管道；(c) 流体性地连接到该第四端口的样品的至少一个溶剂源，以便将一种或多种溶剂提供到该第四端口；(d) 一个在溶剂源与该第四端口之间流体性地连接的流体泵，该流体泵是可操作的以使一种或多种溶剂流过该系统；(e) 一个在该流体泵与该第四端口之间流体性地连接的第一T形接头；(f) 一个流体性地连接到该第五端口的色谱柱，以便从其接收液体样品；(g) 一个在该色谱柱和该第五端口之间流体性地连接的第二T形接头；以及 (h) 一个在该第一与第二T形接头之间流体性连接的旁路管道，其中该旁路管道或该第一和第二T形接头之一被配置为使得，当该多端口阀是在其第一种配置时，在该泵的运行下由该至少一个溶剂源提供的该一种或多种溶剂被分流成一个提供到该进样环管道的第一流动部分和一个提供到该旁路管道的第二、更大的流动部分。

一些实施例可进一步包含：(i) 一个第二多端口阀，该第二多端口阀包括：一个第二阀第一端口，可操作用于将该一种或多种溶剂提供到该第一T形接头；一个第二阀第二端口，可操作用于接收来自该流体泵的一种或多种溶剂；一个第二阀第三端口，可操作用于将该液体样品或一种或多种溶剂提供到该色谱柱；以及一个第二阀第四端口，可操作用于接收来自该第二T形接头的该第一流动部分和该第二流动部分的一个组合，其中该第二多端口阀包含一种第一配置，其中该第一和第二端口是流体性地连接的并且该第三和第四端口是流体性地连接的，以及一种第二配置，其中该第二和第三端口是流体性连接的。

附图说明

从下面仅以举例方式并且参照未按比例绘制的附图所给出的说明中，本发明的以上指出的和各种其他方面将变得清楚，在附图中：

图1A-1C分别是根据第一种常规色谱系统和方法的色谱装填、进样和洗脱阶段的示意图；

图2A-2C分别是根据第二种常规色谱系统和方法的色谱装填、进样和洗脱阶段的示意图；

图3A-3B分别是根据第三种常规色谱系统和方法的色谱装填和进样阶段的示意图；

图4A-4C分别是根据本传授内容的第一种色谱系统和方法的色谱装填、进样和洗脱阶段的示意图；

图5是根据本传授内容的第二种色谱系统和方法的洗脱阶段的示意图；

图6A-6C分别是根据本传授内容的第三种色谱系统和方法的色谱装填、进样和洗脱阶段的示意图；

图7是根据本传授内容的另一个色谱系统和方法的色谱进样阶段的示意图，并且代表在图6中示出的系统和方法的修改后的版本；

图8是根据本传授内容的另一个色谱系统的洗脱步骤的示意图；

图9是一组睾酮在甲醇中的2 μg/mL溶液的100 μL进样的色谱图，一个色谱图是使用常规的配置获得的而另一个色谱图是使用根据本发明的系统获得的；

图10是可以在根据本传授内容的设备内用作多端口阀的一个示例性的旋转阀组件的示意图；

图11是一个示例性T形接头的示意图；并且

图12是一个根据本传授内容的色谱方法的流程图。

具体实施方式

以下说明的提出是为了使本领域的任何技术人员能够进行和使用本发明，并且是在特定的应用及其要求的背景下提供的。对于本领域技术人员来说，对所描述的实施例的各种修改将是显而易见的，并且在此的一般原则可以应用到其他实施例。因此，本发明并非旨在局限于所示出的实施例和实例，而是要根据所示出和所描述的特征和原则而给予可能的最宽范围。参照附图1-12结合以下说明，本发明的具体特征和优点将变得更加清楚。

本发明可以结合采用梯度洗脱或等度洗脱之一的色谱方法和系统来实施。梯度洗脱是最常见的类型，在图4-7以及在与这些图有关的下面的讨论中详细示出。涉及等度洗脱的一些变体示于图8以及与该图有关的下面的讨论中。

图4A-4C分别是根据本传授内容的一种第一色谱系统的色谱装填、进样和洗脱阶段的示意图。在图4中所示的系统30包含许多相同的部件，这些部件与色谱系统10（图1）、20（图2）和29（图3）中的部件在功能和布置上相似。这些相同或相似的部件通过它们相对于图1-3的类似的参考号进行分辨，并且读者可以参考上述讨论的背景部分中这些部件和它们的功能的说明。为了便于参考，多端口阀15的第一、第二、第三、第四、第五和第六端口在图4A中分别被标记为端口p1、p2、p3、p4、p5和p6。这种端口标记方案应理解为适用于整个说明书；然而，端口的编号是任意的。虽然在附图中多端口阀15被示出为确切地包含圆形地安排的六个端口，应当理解还可以使用具有一些其他总端口数或具有一些不同的几何配置的端口的阀，前提是这样的阀能够将在此所示出和描述的不同端口流体性地互连。

类似于系统29（图3）的工作方式，对系统30（图4）进行操作使稀释液水性溶剂与样品流体在流体地介于进样环形管件2c和色谱柱18之间的位置混合。然而，对比系统20，系统30既不包括辅助溶剂源、辅助泵、辅助阀，也不包括在线混合设备。相反，在系统30中，在进样阶段（图4B）过程中由溶剂源14a、14b所提供的该溶剂或这些溶剂的一部分通过一个分流T形接头31a转移入一个旁路管件2g，该分流T形接头被流体性地布置在多端口阀15的上游。该溶剂或这些溶剂的剩余部分（也就是，未分流到旁路管件26的部分）在进样阶段过程中继续流入管件2b，从该管件中它进行如上所述的与在进样环形管件2c中的样品混合并且从该管件中排出该样品。该溶剂或这些溶剂的转移部分与样品流体在进样阶段过程中在混合T形接头31b处恰好在样品和溶剂进入柱18之前进行混合。

每个分流T形接头31a和混合T形接头31b可以是处于图11中示意性地示出的一个简单的流体管件连接装置31的形式。为说明的清楚起见，在这里指出，“T形接头”（或者可替代地，“T接头”）总体上是一个装置，该装置可以是大致成形（或近似成形）为字母符号“T”的形式并且用于互连流体管件的三个分离的长度。例如，图4中所示的T形接头31包括一个整体的装置，该装置包括具有孔34的一个第一管状部分32以及具有孔35的一个相交的第二管状部分33。在操作中，三个对应的流体管件长度流体性地连接到孔34的两个端部和孔35的端部。总体而言，一种从孔34的第一端部进入装置31的流体流动将分流成两个流动部分，使得一个流动部分通过孔34的相对端部退出，并且使得另一个流动部分通过孔35退出。此外，该装置31可用于将两个进入的流体流动部分混合成为退出该装置的一个单一的混合的流体流动。虽然在图11中第二管状部分33被示为与第一管状部分32成直角，应当理解，实际上，这些管状部分可以彼此布置成任何锐角或斜角。例如，一些T形接头可以被配置为字母“Y”的形式，或成形为类似一个箭头，以便帮助流体会聚或发散。因此，术语“T形接头”，如在此所用，是指包含所有这样的变型。

图4B与图2B或者图3B的对比显示该混合T形接头31b实现了使用水性溶剂稀释该样品流体的功能，类似于通过系统20的在线混合设备27或系统29的泵23与梯度阀25的组合进行的功能。然而，在该新型系统30中，去除了辅助泵，因为将稀释液水性溶剂在泵13b的推动下从旁路管件2g提供给混合T形接头31b。常规使用的辅助泵的去除减少了系统的成本、尺寸和复杂性。在分流T形接头31a处，在旁路管件2g和管件2b之间的溶剂流动的相对比例可以由两个流体路径（该流动被分流在其间）之间的相对流体阻力所控制或确定。例如，如果沿着旁路管件2g在T形接头之间的流体性路径的长度保持为与可替代的流体性路径的总长度相等，该总长度包括管件2b、管件2c和管件2e以及通过多端口阀15的总的流体路径，那么相对流速可以通过各路径最收缩的部分的内径比率来确定。因此，在本实例中，该相对比例可以通过选择具有一定内径的旁路管件2g来设置。在图4以及在随后的附图中，将旁路管件2g示意性地示出为比其他管段更厚，以便运送更大的流动比例。可替代地，旁路管件2g内对流体流动的阻力可以通过选择管件的长度、通过选择管件的长度和内径、或通过选择管件或其连接的某些其他特性或某些特性组合来控制。

此外，在系统30中，常规使用的在线混合设备27被去除，替代为简单的混合T形接头31b，从而降低成本并且消除与在线混合装置27相关的附加死体积和时间延迟。因为分离的流体流动的仅有一个汇合，所以基本上没有通过使用T形接头31b引入额外的死体积。因此，在该新系统中去除了这种额外的死体积的任何不利影响。

系统30的柱进样阶段的操作已经参照图4B在上述段落中进行了描述。装填阶段的操作（图4A）类似于参照图1-3已经描述的操作，并且这样的描述在这里不再重复。系统30的洗脱阶段的操作在图4C中示出。如前所述，在洗脱阶段过程中，从溶剂源14a、14b提供的两种溶剂的相对比例在洗脱过程（梯度洗脱）中可能会随时间而变化，以便产生一系列具有不同组成的的溶剂混合物。由于该简单的分流T形接头31a可能不具有关闭能力，所有这样的混合物的流动可能会在两个路径之间分流，如图4C所示。

流动相在两个路径之间（在T形接头31a处）的分流可能会导致流动相的组成在进行梯度洗脱的过程中随时间的变化与在没有旁路管件2g进行梯度洗脱的转移过程中可能的情况不同。例如，旁路管件的流体阻力和长度可以是使得具有某种组成的、被转移进入旁路管件2g的流动相的一部分比具有相同组成的、流经阀15的部分稍微更早（或更晚）到达混合T形接头31b。在这种情况下，在任何给定的时间内退出混合T形接头31b的流动相的组成可以是不同于使用常规的系统（即没有旁路管件2g和T形接头31a、31b）将会预测的组成。此影响可以通过校准程序进行补偿，该程序确定由梯度阀16确定的流动相溶剂的比例应如何及时进行调整，以便考虑非同步的到达时间。所得到的校准（包括梯度阀的定时调整）然后可以合并到任何现有的色谱法中。

可替代地，也可以采用在图5中所示的配置以控制流动相溶剂的流动的分流。在图5所示的替代系统40中，分流T形接头由具有流动调节机构42（例如像一个针阀机构）的三端口阀41替换，该阀可以将转移入管件2g的流的比例从0%改变到某个正的百分比，可能高达100%。以这种方式，可以控制洗脱溶剂的路径。另外，在柱进样阶段过程中还可以采用流动调节机构42，以便控制水性溶剂在管件2b与旁路管件2g之间的相对比例，从而在混合T形接头31b处控制或选择稀释系数。因此可以采用调节机构42的控制（无论是手动控制或自动控制）来可变地配置稀释系数用于优化使用各种不同的样品、不同的溶剂、或不同的分析方法中的每一种。自动控制可以由电子连接到该调节机构的计算机或其他可编程控制器装置（未示出）提供。

图6A-6C分别是根据本传授内容的依据第三色谱系统50的色谱装填，进样和洗脱阶段的示意性描绘。在图6所示的系统50包括许多与之前参考图4描述的系统30的相同的部件。这些相同的部件包括：样品源11；第一泵13a；多端口阀15；废弃物容器17；溶剂源14a、14b；梯度阀16；第二泵13b；管段2a、2b、2c、2d、2e和2g以及T形接头31a和31b。这些相同部件的功能在系统30与系统50之间是相同的或基本上相似的。系统50进一步包括一个第二多端口阀15b，其是流体性地夹在：(a) 该第二泵13b与该第一多端口阀15之间；(b) 该第二泵13b与该柱18之间；(c) 该第二泵13b与该分流T形接头31a之间；(d) 该柱18与该混合T形接头31b之间；以及任选地，(e) 该分流T形接头31a与该第一多端口阀15之间。如所示，在图6A中该第二多端口阀15b可以包含六个端口，这些被标记为第二阀端口q1、q2、q3、q4、q5和q6。该第二多端口阀15b的提供需要包括额外的管段，如图6中所示的管段2h、2j和2k以及2m。

系统50（图6A）的装填阶段的操作类似于系统30（图4A）的装填阶段的操作。同样地，进样阶段（图6B）是类似于系统30的进样阶段的操作（图4B），因为来自溶剂供应14b的水性溶剂的流动在分流T形接头31a处分流成 (a) 流经阀15b、15并且流经样品环管件2c以便将样品流体冲洗出样品环形管件2c并进入柱18的第一部分，以及 (b) 转移入旁路管件2g并且用于在混合T形接头31b处稀释该样品的第二、更大的部分。相对于系统30，在此进样阶段过程中的主要区别是流体流动通过该第二多端口阀15b。

在系统50的洗脱阶段的操作过程中（图6C），该第二多端口阀15b被配置为使得从溶剂供应14a、14b提供的溶剂混合物的流动不通过导向T形接头31a、31b的管件的区段，而是直接从第二阀流入色谱柱18。此配置排除洗脱溶剂混合物在分流T形接头31a处被不必要地分流成两部分的可能性，并且最小化在第二泵13b与柱18之间的流体路径的总长度。相对于系统30，此配置因此提高了系统50的性能效率。

图7示出了另一种色谱系统55，其中仅示出了该进样配置。在图7中所示的系统55是在图6中所示的系统50的修改版本，其被配置为使得从溶剂供应14a、14b提供的一种或多种溶剂的流一次仅通过该第二多端口阀15b。在图7中所示的配置释放了六端口阀15b的两个端口。释放的端口因此可以被用于其他目的或流体连接。可替代地，可以将在图7中所示的六端口阀15b替换为一个更便宜的四端口阀。

图8示出了色谱系统37的洗脱步骤，该系统是在图4中所示的系统30的一种变体。系统37被设置为用于等度洗脱。因此，系统30的梯度阀16被去除并且两种溶剂供应14a、14b被一个单一的溶剂供应14c所替换，该溶剂供应可能包含多种溶剂的预混合的混合物，这些溶剂对于在洗脱步骤过程中用作流动相而进行了优化。可以选择溶剂混合物以便在混合T形接头31b处的混合过程中是足够极性或水性的来充分稀释该样品的有机含量，又是足够非极性的使得样品中的分析物在流动相的流动的影响下迁移通过该柱。还进一步地，可以将分离的柱进样和洗脱步骤替换为一个单一的“流过”步骤，类似于常规的色谱法，其中在特定选择的溶剂组成的连续流动下分析物既被引入柱内又在柱内分离。

使用许多其他变体或配置也可以实现等度洗脱。例如，可以保留系统30的基本结构，但修改成使得溶剂供应14a包含对于在等度洗脱步骤过程中使用而优化的溶剂的预混合的混合物。在这样的配置中，在进样步骤过程中，可以操作阀16以便从溶剂供应14b中吸取溶剂，如前面所述。然而，在洗脱步骤过程中，将会操作阀16以便仅从含有溶剂混合物的溶剂供应14a（而不是从两个溶剂供应）中吸取溶剂。在这种情况下，梯度阀16可以由一个更简单的的三端口切换阀替换，该切换阀仅从这些溶剂供应的所选择的一个中吸取溶剂，但不从两者中吸取溶剂。本领域普通技术人员将容易地认识到如何修改用于等度洗脱的在附图中示出的其他实施例。

图9是使用常规的色谱配置与使用根据本发明的配置获得的色谱图之间的比较。色谱图91以及色谱图93分别代表通过常规的色谱系统和一个根据本发明的系统处理后的睾酮的实验检测。在每个例子中，样品是睾酮在甲醇中的2 μg/mL的溶液的100 μL进样。

因为高的有机溶剂（甲醇）浓度，使用常规的配置得到的色谱图91在检测到退出色谱柱的第一化合物时在初始溶剂前沿表现出一个大的伪峰92。该伪峰92由保留在色谱柱中的流动相的溶液中的睾酮的检出造成，因为在色谱柱进样过程中其不能完全吸附到色谱柱固定相。该色谱图91还表现出了一个小峰94，该小峰可归因于在约1.75分钟的预计保留时间时观察到的睾酮。虽然该峰94代表吸附到固定相的睾酮的一小部分的检出，其强度严重不足以代表样品中睾酮的浓度，因为显著比例的睾酮在洗脱开始时退出该色谱柱，并且因为在进样步骤过程中未知量的睾酮被冲洗通过该色谱柱。该峰94还表现出差的形状，如由该峰值的前区域95所示。

相比之下，使用根据本发明的色谱系统获得的色谱图93在睾酮保留时间仅表现出一个单一的良好形状的峰96。峰96的强度和在峰下的面积大于峰94的对应的特征并且代表睾酮浓度，因为基本上所有的这种分析物在进样过程中保留在色谱柱固定相上，如由在洗脱开始时没有任何伪峰存在所证明。

图12是一个根据本传授内容的色谱方法的流程图。在方法100（图12）的第一步骤，步骤102中，在一个管道中提供包含感兴趣的分析物的一个样品。例如，进样环（也就是说，在几个附图中所示的样品环管2c）可用作一个在其中提供该样品的合适的管道。在下一个步骤，步骤104中，提供了一种用于该样品的溶剂。可以可替换地提供多种溶剂的一种混合物。

在方法100（图12）的下一个步骤，步骤106中，使该溶剂或这些溶剂同时流入该管道中以从该管道排出该样品并且流入以及通过一个第二管道以从该第二管道中退出。到该第一管道的路径可以包括通过一个阀门的一个路径，该第一管道流体性地连接到该阀门并且该第二管道可以是一个绕过该阀门的旁路管件。同时流动通过该两个路径可能是由以下情况引起：通过一个分流接头（如一个分流T形接头）或通过一个可（手动或自动）配置为在这两个路径之间提供可变的分流比的三端口阀，将来自一个溶剂源的该溶剂（或这些溶剂）的总流动在这两个路径之间分流。该分流比还可以通过两条路径之间对流体流阻力的差异来确定。具有最小流体阻力的路径将接收到该流动的较大部分，反之亦然。流体阻力（以及因此的流动分流比）可以由各路径内的内径或路径的长度之间的差异来选择或固定。

下一步，在方法100（图12）的步骤108中，将排出的样品与通过并且退出该第二管道的该溶剂或这些溶剂在一个混合接头（例如一个混合T形接头）处混合。在步骤110中，将混合物提供到一个色谱柱中。如果使用“流过”等度洗脱，使得没有分离的色谱柱进样和洗脱步骤，则该方法100可在步骤110之后终止。在这样的情况下，使用一种单一组成的流体（可能包括一种溶剂混合物）不仅用来输送样品分析物进入该色谱柱，并且还由于在色谱柱内分析物在移动相与固定相之间的分配而促进这些分析物通过该色谱柱的差别性迁移。分析物到固定相的分配可通过在混合T形接头处的早先的混合而得以促进（在前面的步骤108中），以便稀释样品中有机溶剂的浓度。在一些实施例中，由此分离出的分析物可能会被递送到一个检测器用于随后的检测。

在步骤110中，如果采用梯度洗脱，则将该混合物提供到该柱，使得分析物在色谱柱内吸附到固定相。该吸附可通过在混合T形接头处的混合来促进（在前面的步骤108中），以便稀释样品中有机溶剂的浓度。在梯度洗脱的情况下，然后执行步骤112，其中将一个包括第二溶剂并具有随时间变化的组成的移动相流体提供到色谱柱，使得所吸附的分析物从该固定相顺序地解吸并从色谱柱排出。在某些等度洗脱的情况下也可以执行步骤112。在这种情况下，流动相组成在洗脱过程中是不随时间变化的。在一些实施例中，从柱中退出的分离出的分析物可能会被递送到一个用于随后检测的检测器。

本申请中所包括的论述内容旨在用作基本的说明。虽然已经根据示出和描述的不同实施例描述了本发明，读者应该了解具体的讨论可能没有明确地描述所有可能的实施例。在本技术领域的普通技术人员将容易认识到，许多替代选择是隐式的并且所描述的实施例可以有许多变型。例如，本领域普通技术人员将容易地认识到，根据通用程序，在所示的色谱系统的变型中可以采用一个额外的多端口阀。例如，这样的一个额外的阀可以被流体性地置于该混合T形接头31b与柱18之间，并且可以包含为了冲洗管线、将分析物以向前方向或相反的方向冲洗出柱等等的目的而流体性地连接到额外的废弃物容器或溶剂源的端口和管段。此外，本领域普通技术人员将容易地认识到，根据通用程序，可以在各个所示的色谱系统中采用一个额外的柱。例如，许多色谱系统采用两个柱 -一个包括保护柱或净化柱的第一柱以及包括一个分析柱第二柱。

还进一步地，虽然关于本发明的上述讨论中的大多数涉及反相高效液相色谱法（RP-HPLC），应当指出，本发明还适用于任何HPLC系统，其中进样的样品是在一种溶液中，在到达HPLC柱之前需要用流动相对该溶液进行改性。例如，如果采用一个亲水相互作用的液相色谱（HILIC）柱来代替一个RP-HPLC柱，则在正常情况下，亲水性分析物的柱进样通常采用富含有机物的流动相。但是，如果样品本身包含丰富的水（使得不是所有的分析物都被吸附到HILIC柱的固定相），则可以采用所描述的上述传授内容（连同轻微的显而易见的改变）以便使用有机流体来稀释水的浓度。如果采用正相柱，第一有机相可以使用（例如）具有不同疏水性的不同有机相来稀释，但本发明将仍然能够适用。因此，在不脱离本发明的范围和本质的情况下，本领域普通技术人员可以做出许多改变。说明书和术语都不旨在限制本发明的范围-本发明仅由权利要求所限定。在此所提及的任何专利、专利申请、专利公开或技术公开都通过引用明确地结合在此。

Claims (15)

1.一种用于色谱分离液体样品的分析物的方法，该方法包括：

(i) 在一个管道中提供该样品；

(ii) 对该样品提供一种溶剂；

(iii) 使该溶剂同时地流入该管道以便将该样品从该管道排出、并且流入且通过一个第二管道以便退出所述第二管道；

(iv) 同时地将该排出的样品和该退出的溶剂提供到一个混合T形接头，使得该排出的样品和该退出的溶剂在此混合；

(v) 将该排出的样品和该退出的溶剂的混合物提供到一个色谱柱中，使得这些分析物被转移到该柱内，并且在其中在该溶剂、或一种不同的溶剂或多种溶剂的一种混合物的一个流动的影响下进行色谱分离。

2.如权利要求1所述的一种方法，其中对该样品提供一种溶剂的步骤 (ii) 包括提供该溶剂使得，当在混合T形接头处与该样品混合时，该溶剂造成该样品的总有机物浓度的稀释。

3.如权利要求1所述的一种方法，其中对该样品提供一种溶剂的步骤 (ii) 包括提供该溶剂使得，当在混合T形接头处与该样品混合时，该溶剂造成该样品的总水浓度的稀释。

4.如权利要求1所述的一种方法，其中步骤 (iii) 包括使该溶剂的一个流动通过一个分流T形接头，以便在此被分流成一个流入该管道的第一流动部分和一个流入并通过该第二管道的第二流动部分。

5.如权利要求1所述的一种方法，其中步骤 (iii) 包括使该溶剂的一个流通过一个三端口阀，以便在此被分流成一个流入该管道的第一流动部分和一个流入并通过该第二管道的第二流动部分，所述三端口阀具有一个流动调节机构可操作用于控制该第一与第二流动部分的流速之间的比率。

6.如权利要求1所述的一种方法，其中步骤 (iii) 包括将该溶剂的一个流动分流成一个通过一个多端口阀流入该管道的第一流动部分和一个绕过该多端口阀的第二流动部分。

7.如权利要求6所述的一种方法，其中步骤 (iii) 进一步包括通过选择该第二管道的长度或内径来设置在该第一流动部分的流速与该第二流动部分的流速之间的比率。

8.如权利要求4所述的一种方法，其中将一种包含第二溶剂的流体提供到该色谱柱的步骤 (vi) 包含随时间改变该流体的组成，其中对所述随时间变化进行校准，以便补偿该第一和第二流动部分的流速上的差异。

9.如权利要求5所述的一种方法，其中将一种包含第二溶剂的流体提供到该色谱柱的步骤 (vi) 包括配置该流动调节机构使得该流体不流过该第二管道。

10.如权利要求1所述的一种方法，其中将该排出的样品和该退出的溶剂的混合物提供到一个色谱柱的步骤 (v) 是使得这些分析物在该色谱柱内被吸附到一个固定相，并且其中该方法进一步包括：

(vi) 将一种包含该不同溶剂或该溶剂混合物的流体提供到该色谱柱，使得这些吸附的分析物顺序地从该固定相解吸并从该色谱柱排出。

11.一种用于色谱分离从样品源提供的液体样品的分析物的色谱系统，该系统包括：

一个多端口阀，该多端口阀包括：

         一个流体性地连接到该样品源的第一端口；以及

         至少一个第二端口、第三端口、第四端口和第五端口，其中该多端口阀包括一种第一配置，其中该第三和第五端口流体性地连接并且该第二和第四端口流体性地连接；

         一个流体性地连接到该第二和第三端口的进样环管道；

         流体性地连接到该第四端口的、用于该样品的至少一个溶剂源，以便将一种或多种溶剂提供到该第四端口；

         一种在该溶剂源与该第四端口之间流体性地连接的流体泵，该流体泵可操作用于使该一种或多种溶剂流过该系统；

         一个在该流体泵与该第四端口之间流体性地连接的第一T形接头；

         一个流体性地连接到该第五端口以便从其接收该液体样品的色谱柱；

         一个在该色谱柱与该第五端口之间流体性地连接的第二T形接头；以及

         一个在该第一和第二T形接头之间流体性地连接的旁路管道，

         其中该旁路管道或该第一和第二T形接头之一被配置为使得，当该多端口阀是在它的第一配置时，在该泵的运行下由该至少一个溶剂源提供的该一种或多种溶剂被分流成一个提供到该进样环管道的第一流动部分和一个提供到该旁路管道的第二的、更大的流动部分。

12.如权利要求11所述的一种色谱系统，其中第一T形接头包含一个流动调节机构，该流动调节机构可操作用于控制该第一流动部分与该第二流动部分之间的比率。

13.如权利要求12所述的一种色谱系统，其中将该流动调节机构电子地连接到一个控制器，该控制器可操作以便通过控制该流动调节机构来控制该比率。

14.如权利要求11所述的一种色谱系统，其中该至少一个溶剂源包含一个具有第一溶剂的第一溶剂源以及一个具有第二溶剂的第二溶剂源，并且进一步包括：

         一个在该流体泵与该第一和第二溶剂源之间流体性地连接的梯度阀，该梯度阀可操作使得在该流体泵的运行下该第一和第二溶剂的一种混合物从该第一和第二溶剂源被抽出。

15.如权利要求11所述的一种液相色谱系统，进一步包括：

         一个第二多端口阀，该第二多端口阀包括：

                 一个第二阀第一端口，该第一端口可操作用于将该一种或多种溶剂提供到该第一T形接头；

                 一个第二阀第二端口，该第二端口可操作用于接收来自该流体泵的该一种或多种溶剂；

                 一个第二阀第三端口，该第三端口可操作用于将该液体样品或该一种或多种溶剂提供到该色谱柱；以及

                 一个第二阀第四端口，该第四端口可操作用于接收来自该第二T形接头的该第一流动部分和该第二流动部分的一种组合，

         其中该第二多端口阀包含一种第一配置，其中该第一和第二端口是流体性地连接的并且该第三和第四端口是流体性地连接的，以及一种第二配置，其中该第二和第三端口是流体性地连接的。

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