CN103667511A - 一种副鸡嗜血杆菌pcr检测试剂盒 - Google Patents

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马景霞
吴洪才
杨平
郭显坡
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Abstract

本发明涉及一种试剂盒，更具体的讲是一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括20μL的PCR缓冲液、25μL超纯水、5μLMarkerDL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，3μL溴酚蓝，15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照，本发明的有益效果是：本发明拥有PCR检测技术的检测快的优点，而且本试剂盒造价低、采用了特殊的引物，可以满足最低为0.00953ng基因片段PCR产物的检测，检测灵敏性高。

Description

一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，更具体的讲是一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒。
背景技术
鸡传染性鼻炎(Infectious coryza，IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum，HPG)引起的一种上呼吸道疾病，最明显的症状是鼻道和鼻窦有浆液性或黏液性分泌物流出、面部水肿和结膜炎，肉垂出现明显肿胀[1]。该菌有A、B、C 3个血清型，主要引起育成鸡生长不良，产蛋鸡产蛋率下降，给养鸡业造成很大的经济损失[2]。目前诊断鸡传染性鼻炎的方法主要用传统的细菌培养和生化鉴定副鸡嗜血杆菌，由于副鸡嗜血杆菌对营养要求高，不易培养，而且该菌常常与其它细菌混合感染，无法快速鉴别诊断，因此应用特异、快速、敏感的聚合酶链反应(PCR)检测副鸡嗜血杆菌技术就显得非常重要，但是目前市场上并没有用于检测副鸡嗜血杆菌的试剂盒，这是现有技术中的不足。
发明内容
本发明的发明目的在于针对现有技术中的不足，提供一种快速、准确、简便的副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括20μL的PCR缓冲液、25μL超纯水、5μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，3μL 溴酚蓝， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。
上述PCR缓冲液由25 mmol/L MgCl2 2μL，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPx2μL。
上述上引物的序列号为5′-CCGCATAGAARRRRAAGA-3′，下引物的序列号为5′-CCAACCTTCCTCACCACC-3′。
上述阴性对照为非副鸡嗜血杆菌的DNA片段。
上述阳性对照为标准副鸡嗜血杆菌的PCR产物。
上述上引物中R为简并引物。
反应步骤：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1 min，52℃1 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环
取5μL上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker DL2000作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果;
回收目的条带，16℃ 1.5 h连接至PMD19-T Easy Vector，转化感受态DH5α，均匀涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板，37℃培养16h,挑取白色菌落小量培养，提取质粒作PCR扩增鉴定,将阳性菌液测序，并采用非副鸡嗜血杆菌DNA片段作为阴性对照，标准副鸡嗜血杆菌DNA片段作为阳性对照。
本发明的有益效果是：本发明拥有PCR检测技术的检测快的优点，而且本试剂盒造价低、采用了特殊的引物，可以满足最低为0.00953ng基因片段PCR产物的检测，检测灵敏性高。
附图说明
图1为本发明敏感性实验结果图；
1-95.3ng基因片段PCR产物，2-9.53 ng基因片段PCR产物，3-0.953ng基因片段PCR产物，4-0.0953ng基因片段PCR产物，5-0.00953ng基因片段PCR产物。
图2为本发明电泳实验结果图
1-      Marker DL2000，2-PCR产物（650bp），3-标准菌株PCR产物（650bp），4-阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括20μL的PCR缓冲液、25μL超纯水、5μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，3μL 溴酚蓝， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。
上述PCR缓冲液由25 mmol/L MgCl2 2μL，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPx2μL。
上述上引物的序列号为5′-CCGCATAGAARRRRAAGA-3′，下引物的序列号为5′-CCAACCTTCCTCACCACC-3′。
上述阴性对照为非副鸡嗜血杆菌的DNA片段。
上述阳性对照为标准副鸡嗜血杆菌的PCR产物。
上述上引物中R为简并引物。

Claims (6)

1.一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括20μL的PCR缓冲液、25μL超纯水、5μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，3μL 溴酚蓝， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。
2.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液由25 mmol/L MgCl2 2μL，10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTPx2μL。
3.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述上引物的序列号为5′-CCGCATAGAARRRRAAGA-3′，下引物的序列号为5′-CCAACCTTCCTCACCACC-3′。
4.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为非副鸡嗜血杆菌的DNA片段。
5.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为标准副鸡嗜血杆菌的PCR产物。
6.根据权利要求1所述的一种副鸡嗜血杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述上引物中R为简并引物。
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