CN103667256B - 冰冻法提取油田污水中环境微生物总dna的方法 - Google Patents
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Abstract
<b>本发明涉及油田污水技术领域，是一种冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法；按下述步骤进行：第一步，样品的浓缩，取适量含油污水样品放置在温度为-80℃至-20℃下冷冻1小时至2小时后得到含油污冰块。本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法相对细菌DNA提取试剂盒法提取DNA而言，本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法提取的DNA的亮度明显高于采用细菌DNA提取试剂盒获得的DNA的亮度、获得的DNA的条带清晰、提取的DNA没有拖尾、提取效率提高了30%至50%，更能准确全面真实的反映环境样本中微生物的种类和数量，为后续的微生物群落和宏基因组分析奠定了依据。</b>
Description
技术领域
本发明涉及油田污水技术领域，是一种冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法。
背景技术
随着油田三次采油的后续工艺的开发，油田污水处理难度加大，尤其是微生物污水处理以及含油污水的深度处理的研究深入，科研工作者开始研究其中的微生物的组成分布以及规律，但研究微生物组成及其分布规律的一个重要前提是油田污水以及废水中微生物样本的提取。然而，由于目前对于油田污水中的微生物提取效率低下，而且提取效果不好，不能完全呈现出油田污水中的微生物的本来的组成和功能，成为从事该项环境微生物研究者十分头痛的问题。环境样本中微生物DNA的提取难度较大，尤其是以高盐和污水中成分复杂的环境样本DNA的提取更加困难。目前，含油污水和污泥中等DNA的制备方法多数为人工配置药品，采用溶菌酶，反复冻融结合CTAB法（溴化十六烷基三甲铵为主的DNA提取方法）或SDS法（十二烷基硫酸钠为主要溶液的DNA提取方法）提取样本中微生物的DNA，或用试剂盒制备，该法费用较高而且DNA提取效果不好，多为祢散的条带，或者得率低，无法进行PCR反应（聚合酶链式反应）；该法对于含有特殊的化学物质如油田污水会更加不容易提取，需要的时间较长，效果不好。目前现有的国内专利，并没有申请有关油田污水中微生物群落的微生物DNA的提取方法，同时对国内的专业期刊文献进行检索，国内参考文献：“包木太，闫广彬，陈庆国，杜春安，郭省学，李希明的水解酸化－好氧处理含油污水中微生物群落变化研究”中的含油污水中微生物DNA的提取方法“为常规的试剂盒提取方法-采用TakaRa的ReagentTaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer．2.0试剂盒，提取污泥中的脱氧核糖核酸(DNA)”。其他的参考文献中针对含油污水提取DNA的方法基本采用的也是试剂盒的方法和常规的SDS检测方法。实际在提取的方法上，如果样品不经过实际的预处理是很难达到好的提取效果的。油田污水中微生物DNA提取的更深层的重要意义是当环境样本用于微生物分子生态学和特定菌种的定量检测研究，DNA的损失率较大，较为关心的微生物由于提取不当，被损失掉，将无法进行后续的研究，这样的DNA用于微生物分子生态学的研究就不能够全面的反映种群的结构和种群演替情况，用于环境样本中微生物的定量检测则更加不准确。石油污水本身组成成分复杂，加上长期的石油开采中大量的化学物质的进入，使得石油中微生物DNA的提取难度较大。如何有效的解决这一问题，关键是石油样品中微生物富集回收和其中杂质的有效去除。油田污水中的环境微生物研究起来很困难，主要的原因是其中的微生物数量少，DNA的提取损失较大，分析出的结果代表性不强。如何有效的解决这一问题，关键是样品中微生物回收和水中杂质的有效的去除。可以说样品的预处理是关系DNA提取好坏的重要一环。
发明内容
本发明提供了一种冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有含油污水DNA提取没有进行预处理使DNA提取难度大和DNA得率低导致不能全面真实反映环境样本中微生物的种类和数量的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，按下述步骤进行：第一步，样品的浓缩，取适量含油污水样品放置在温度为-80℃至-20℃下冷冻1小时至2小时后得到含油污冰块，把含油污冰块放置在室温下融化，当融化至含油污冰块中的絮状物流出时，将絮状物移入离心管中，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第一固相；
第二步，盐类和无机盐类以及有机杂质的去除，取50毫克至100毫克的第一固相放入离心管中，在离心管中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第二固相，在第二固相中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心2分钟至5分钟，去除上清液，得到第三固相，在第三固相中加入0.1微升至0.2微升的清洗缓冲液并混合均匀得到混合液；
第三步，超声破碎，将混合液用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液；
第四步，将悬浮液用细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取后得到细菌的总DNA。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述清洗缓冲液按下述方法得到，按10gNa
2
HPO
4
配1gKH
2
HPO
4
、50gNaCl和1.5gKCl计，在Na
2
HPO
4
中加入KH
2
HPO
4
、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到贮存液，调节贮存液的pH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。
上述第三步中，将盛有混合液的离心管放置在冰上用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液。
上述超声破碎仪的频率为20千赫兹。
上述离心管为1.5毫升或者2毫升的离心管。
本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法相对细菌DNA提取试剂盒法提取DNA而言，本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法提取的DNA的亮度明显高于采用细菌DNA提取试剂盒获得的DNA的亮度、获得的DNA的条带清晰、提取的DNA没有拖尾、提取效率提高了30%至50%，更能准确全面真实的反映环境样本中微生物的种类和数量，为后续的微生物群落和宏基因组分析奠定了依据。
附图说明
附图1为本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法和细菌DNA提取试剂盒分别对含油污水提取后DNA的对照电泳图谱。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，该冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，按下述步骤进行：第一步，样品的浓缩，取适量含油污水样品放置在温度为-80℃至-20℃下冷冻1小时至2小时后得到含油污冰块，把含油污冰块放置在室温下融化，当融化至含油污冰块中的絮状物流出时，将絮状物移入离心管中，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第一固相；将得到的第一固相放在离心管中放置在冰上备用；
第二步，盐类和无机盐类以及有机杂质的去除，取50毫克至100毫克的第一固相放入离心管中，在离心管中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第二固相，在第二固相中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心2分钟至5分钟，去除上清液，得到第三固相，在第三固相中加入0.1微升至0.2微升的清洗缓冲液并混合均匀得到混合液；
第三步，超声破碎，将混合液用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液；
第四步，将悬浮液用细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取后得到细菌的总DNA。细菌DNA提取试剂盒为现有公知公用的设备；细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取和分析为现有公知公用的方法。细菌DNA提取试剂盒按照细菌基因组提取试剂盒(DP302)的方法操作（天根生化科技（北京）有限公司）进行提取和检测。
实施例2，该冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，按下述步骤进行：第一步，样品的浓缩，取适量含油污水样品放置在温度为-80℃或-20℃下冷冻1小时或2小时后得到含油污冰块，把含油污冰块放置在室温下融化，当融化至含油污冰块中的絮状物流出时，将絮状物移入离心管中，在转速为12000转/分钟或16000转/分钟的离心机中离心10分钟或15分钟，去除上清液，得到第一固相；将得到的第一固相放在离心管中放置在冰上备用；
第二步，盐类和无机盐类以及有机杂质的去除，取50毫克或100毫克的第一固相放入离心管中，在离心管中加入1毫升或1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟或16000转/分钟的离心机中离心10分钟或15分钟，去除上清液，得到第二固相，在第二固相中加入1毫升或1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟或16000转/分钟的离心机中离心2分钟或5分钟，去除上清液，得到第三固相，在第三固相中加入0.1微升或0.2微升的清洗缓冲液并混合均匀得到混合液；
第三步，超声破碎，将混合液用超声破碎仪超声破碎40秒或60秒得到悬浮液；
第四步，将悬浮液用细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取后得到细菌的总DNA。
实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3的清洗缓冲液按下述方法得到，按10gNa2HPO4配1gKH2HPO4、50gNaCl和1.5gKCl计，在Na2HPO4中加入KH2HPO4、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到贮存液，调节贮存液的pH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。
实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4的第三步中，将盛有混合液的离心管放置在冰上用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液。主要目的使菌团和包裹在在油中和水中的细菌物理溶出来，被充分的释放。
实施例5，作为上述实施例的优化，实施例5中超声破碎仪的频率为20千赫兹。
实施例6，作为上述实施例的优化，实施例6中离心管为1.5毫升或者2毫升的离心管。
下面是本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法和用细菌DNA提取试剂盒分别对油田污水进行DNA提取后的平均数据对比见表1所示。分别随机从新疆克拉玛依油田中的两口井中取出体积相同的两份油田污水样，将一份油田污水样平均分成体积相等的两份，标号为1#样和3#样；将另一份油田污水样也平均分成体积相等的两份，标号为2#样和4#样；1#样和2#样用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取，3#样和4#样用本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法进行DNA提取。
表1
| 标号 | A260 | A280 | A230 | A260/A280 | A260/A230 | DNA浓度（ug/uL） |
| 1#样（细菌DNA提取试剂盒获得DNA） | 0.390 | 0.365 | 0.343 | 1.06 | 1.13 | 0.202 |
| 2#样（细菌DNA提取试剂盒获得DNA） | 0.459 | 0.365 | 0.354 | 1.25 | 1.29 | 0.245 |
| 3#样（本发明方法获得DNA） | 0.512 | 0.311 | 0.263 | 1.64 | 1.94 | 0.435 |
| 4#样（本发明方法获得DNA） | 0.532 | 0.263 | 0.242 | 1.98 | 2.19 | 0.487 |
由表1对比可以看出，1#样提取后A260/A280、A260/A230和DNA浓度的平均值分别为1.06、1.13和0.202ug/uL；2#样提取后A260/A280、A260/A230和DNA浓度的平均值分别为1.25、1.29和0.245ug/uL；3#样提取后A260/A280、A260/A230和DNA浓度的平均值分别为1.64、1.94和0.435ug/uL；4#样提取后A260/A280、A260/A230和DNA浓度的平均值分别为1.98、2.19和0.487ug/uL；3#样和4#样用本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法获得的DNA浓度明显高于1#样和2#样用细菌DNA提取试剂盒获得的DNA浓度，说明本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法较细菌DNA提取试剂盒得到的DNA浓度更高，更易从含油污水中提取DNA，提取效率更高，提取效率提高了30%至50%，更能准确全面真实的反映环境样本中微生物的种类和数量。
如图1可以看出，用本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法获得DNA的3#样和4#的亮度明显高于采用细菌DNA提取试剂盒获得的DNA的1#样和2#样；本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法获得的DNA的条带清晰，提取的DNA没有拖尾；本发明上述实施例冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法获得DNA的A260/A280平均值为1.64至1.98，A260/A230大于1.9，表明本发明冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法获得DNA的浓度和纯度较高，实现了高质量的DNA提取。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (5)
1.一种冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，样品的浓缩，取适量含油污水样品放置在温度为-80℃至-20℃下冷冻1小时至2小时后得到含油污冰块，把含油污冰块放置在室温下融化，当融化至含油污冰块中的絮状物流出时，将絮状物移入离心管中，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第一固相；
第二步，盐类以及有机杂质的去除，取50毫克至100毫克的第一固相放入离心管中，在离心管中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心10分钟至15分钟，去除上清液，得到第二固相，在第二固相中加入1毫升至1.5毫升的清洗缓冲液震荡并混合均匀，在转速为12000转/分钟至16000转/分钟的离心机中离心2分钟至5分钟，去除上清液，得到第三固相，在第三固相中加入0.1毫升至0.2毫升的清洗缓冲液并混合均匀得到混合液；
第三步，超声破碎，将混合液用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液；
第四步，将悬浮液用细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取后得到细菌的总DNA；其中：清洗缓冲液按下述方法得到，按10gNa2HPO4配1gKH2PO4、50gNaCl和1.5gKCl计，在Na2HPO4中加入KH2PO4、NaCl和KCl配成溶液，在溶液中加入十二烷基硫酸钠混合均匀得到质量体积比为百分之一的贮存液，调节贮存液的pH为7.5，然后加入贮存液10倍体积的蒸馏水混合均匀，得到清洗缓冲液。
2.根据权利要求1所述的冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，其特征在于第三步中，将盛有混合液的离心管放置在冰上用超声破碎仪超声破碎40秒至60秒得到悬浮液。
3.根据权利要求1或2所述的冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，其特征在于超声破碎仪的频率为20千赫兹。
4.根据权利要求1或2所述的冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，其特征在于离心管为1.5毫升或者2毫升的离心管。
5.根据权利要求3所述的冰冻法提取油田污水中环境微生物总DNA的方法，其特征在于离心管为1.5毫升或者2毫升的离心管。
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| 大庆油田油藏微生物基因组DNA的提取与分析;任国领等;《大庆石油学院学报》;20100831;第34卷(第4期);89-93 * |
| 适用变性梯度凝胶电泳分析的石油污染土壤微生物DNA模板制备的研究;韦超英等;《安徽农业科学》;20111231;第39卷(第16期);9676-9679,9722 * |
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