CN103667248A - 一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，包括以下步骤：（1）以红霉素生产菌为出发菌株，将红霉素生产菌在斜面培养基上预培养6-7天。（2）预培养后的红霉素生产菌进行紫外线诱变：用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下照射2分钟进行诱变，诱变后立即涂培养基平板。（3）诱变后活菌落进行离子束辐照诱变：诱变温度为25℃，诱变剂量为50Gy，诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，所得活菌落即为高产的突变红霉素生产菌。通过本方法，得到高产的突变红霉素生产菌，实验结果证明，诱变处理后的突变红霉素生产菌抗生素产量得到提高，100L发酵罐放罐效价达到15600u/ml，发酵液中A组分含量由原来的72%提高到85%，B组分含量由原来的2.7%降低到1.1%，为发酵液的后续处理带来了极大方便，产品质量和纯度得到提高，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，属于生物工程领域。
背景技术
红霉素属大环内酯类抗生素，具有广谱抗菌作用。对G+菌有强大抗菌作用，尤其对耐青霉素的金葡菌有效。对立克次体、支原体、螺旋体有较强的抑制作用。对阿米巴原虫、滴虫也有抑制作用。
红霉素是白色或类白色的结晶性粉末，微有吸湿性，味苦，易溶于醇类、丙酮、氯仿、酯类（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。红霉素在水中极微溶解，其溶解度随温度的升高而减小，以55℃时为最小。
红霉素是从红霉素链霉菌的培养液中分离出来的一种碱性抗生素，我国于1957年试制成功后并逐步投入生产。后来从发酵液中分离出来红霉素A、B、C、D、E等组分，其中以红霉素A为主要组分，抗菌活性强、且毒副作用较小；其它组分抗菌活性弱，而毒副作用又较A大。
红霉素B的理化性状与红霉素A很相似，溶点为198℃，紫外吸收峰在286nm（甲醇）处。比较难溶于水，极易溶于乙醚、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，并且和酸类结合成的盐易溶于水。
通常所称的红霉素即指红霉素A及其盐类。但是在红霉素生产中，发酵液中同时含有红霉素A、B、C、D、E等组分，这为后续的提纯处理增加了困难，而且红霉素B的含量控制是产品质量控制的重要指标。国内外抗生素工业发展历史证明，菌种的不断更新换代，是生产水平大幅度提高，是抗生素工业迅速发展的关键之一。由于新的高产菌株不断用于生产，所以青霉素、链霉素、土霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、头孢菌素C等产品的发酵单位，都比他们的原始菌种提高几十倍、几百倍、甚至几千倍，与此同时，菌种选育在提高产品质量、扩大品种、改善工艺条件等方面也发挥了重大作用。菌种选育是抗生素工业生产及科研工作的主要环节，既是关键又是基础。
根据诱发突变机理，利用物理或化学的因素处理微生物群体细胞，使其中部分细胞的遗传物质发生改变，从而引起微生物的性状变异。然后从群体中挑选出少数具有优良性状的菌株。经特性考察和复试用于生产，这个过程称为诱变育种。诱变育种的主要环节是：以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞（一般处理孢子悬液），在引起绝大多数细胞致死的同时，使变异率大大提高，然后通过有效的筛选方法淘汰负变菌株，留用变异幅度最大的正变菌株。目前诱变育种是提高菌种生产能力、提高产品质量、扩大品种和简化工艺的主要育种方法。
红霉素是红霉素生产菌在发酵过程中产生的一种次级代谢产物，随着发酵周期的延长，红霉素在发酵液中含量逐步增多，与此同时，其他次级代谢产物也在不断的积累，这些都使发酵液中的环境越来越不利于菌体产素，对产量的提高有着较大的制约。红霉素生产菌经过诱变后，利用含有红霉素的培养基筛选，筛选出的菌体对自身所产红霉素的耐受程度提高，从而使菌体的产素能力以及产量得到提高。诱变后的菌株用于生产，发酵液中A组分含量提高，B组分含量降低，为发酵液的后续处理带来了极大的方便，降低了杂质含量，使产品质量得到提高。
发明内容
目前，提高红霉素生产菌产红霉素的能力，仍以诱变育种为主要手段。针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法。
本发明的一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其包括以下步骤：
（1）将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养6-7天后获得新鲜成熟孢子；
（2）将红霉素生产菌新鲜成熟斜面制成孢子悬液，孢子量在1×106个/mL，取5mL孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射2分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板；
（3）挑取步骤（2）诱变后活菌落进行离子束辐照诱变：诱变温度为25℃，诱变剂量为50Gy，诱变后进行梯度稀释涂培养基平板初筛。挑单菌落至斜面培养基，34±1℃，培养6-7天，再经摇瓶发酵方法进行复筛，所得突变菌即为高产红霉素生产菌。
（4）步骤（1）或步骤（3）斜面养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。步骤（2）的平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
（5）步骤（3）平板培养基配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
（6）步骤（3）的摇瓶发酵是将红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基。
（7）步骤（3）种子培养基配方为：玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g，硝酸铵1.2g，氯化钠3g，玉米浆7.5g，分析纯碳酸钙6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。种子液培养条件为：34±1℃，220转/分，振荡培养42-46h。
（8）摇瓶发酵培养基配方为：玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸钙6g，豆油4ml，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
（9）按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL，放入500mL带挡板的三角瓶中。
（10）将培养成熟的红霉素生产菌种子液5mL接入发酵摇瓶中，34±1℃，260转/分，振荡培养7天左右，得红霉素，利用HPLC测定效价。
（11）发酵罐培养基配方为：玉米淀粉1.5kg，糊精0.25kg，中温黄豆饼粉1.29kg，硫酸铵0.1kg，氯化钠0.15kg，玉米浆0.85kg，轻质碳酸钙0.3kg，豆油350ml，加水定容至60L，调pH值至7.0。
（12）将培养成熟的红霉素生产菌种子液按照10% （V/V）的接种量接入100L发酵罐中，34±1℃，培养7天左右，得红霉素，利用HPLC测定效价。
本发明的优点：
本发明通过两种诱变、两次筛选，得到对较高浓度红霉素充分耐受的突变红霉素生产菌。提高了红霉素生产菌对自身所产抗生素的耐受性，使菌体稳定产素期延长，从而使菌体的产素能力以及产量得到提高。诱变后的菌株用于生产，发酵液中A组分提高，B组分降低，为发酵液的后续处理带来了极大的方便，更重要的是降低了杂质含量，使产品质量得到提高，100L发酵罐放罐效价达到15600 u/ml，发酵液中A组分含量由原来的72%提高到85%，B组分含量由原来的2.7%降低到1.1%，为发酵液的后续处理带来了极大方便，产品质量和纯度得到提高，降低了生产成本。
具体实施方式
普通红霉素生产菌在发酵过程中，随着发酵周期的延长，次级代谢产物不断的积累，发酵液中的环境变得不利于红霉素生产菌的生长和产素，稳定产素的时间相对较短。将红霉素生产菌诱变后会形成表型各异的红霉素生产菌突变库，其中很可能含有少量对自身所产抗生素耐受者，关键是将这部分在突变库中占极少比例的自身所产抗生素耐受型突变红霉素生产菌从大量无义突变中筛选出来，如果自身所产抗生素耐受型突变红霉素生产菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度红霉素培养基后，自身所产抗生素耐受型突变红霉素生产菌就会生长，而大量无义突变红霉素生产菌则死亡，从而通过诱变及筛选得到自身所产抗生素耐受型突变红霉素生产菌。
以下通过实施例进一步对本发明进行描述：
实施例1：
第一次诱变与筛选：将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养6-7天后获得新鲜成熟孢子；利用红霉素生产菌新鲜成熟斜面制10ml孢子悬液，孢子量在1×106个/mL，分成两份。
取一份（作为对照）涂平板培养基，平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。培养6-7天，显示红霉素生产菌未生长。
另取一份（作为诱变份）孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射2分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板，平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。在平板上生长的菌落即为初次诱变成功的能耐受1.5%红霉素的突变红霉素生产菌。
第二次诱变与筛选：对第一次诱变成功的能耐受1.5%红霉素的初次突变红霉素生产菌进行离子束辐照诱变。将初次突变红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养6-7天后获得新鲜成熟孢子；利用初次突变红霉素生产菌新鲜成熟斜面制10ml孢子悬液，孢子量在1×106个/mL，分成两份。取一份（作为对照）涂平板培养基，平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。培养6-7天，显示红霉素生产菌未生长。一份（作为诱变份）进行离子束辐照诱变，诱变温度为25℃，诱变剂量为50Gy。诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板，平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。在平板上生长的菌落即为再次诱变成功的能耐受2.0%红霉素的突变红霉素生产菌。将第二次筛选出的耐自身所产抗生素的红霉素生产菌进行遗传稳定性试验，共转接10代，证明其是否是遗传稳定的耐自身所产抗生素的突变红霉素生产菌。将第二次筛选出的耐自身所产抗生素的红霉素生产菌和初次突变红霉素生产菌分别接入种子瓶培养基，种子培养基配方为：玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g，硝酸铵1.2g，氯化钠3g，玉米浆7.5g，分析纯碳酸钙6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。34±1℃，220转/分，振荡培养42-46h。按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL，放入500mL带挡板的三角瓶中。将第二次筛选出的耐自身所产抗生素的红霉素生产菌和初次突变红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基，摇瓶发酵培养基配方为：玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸钙6g，豆油4ml，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。34±1℃，260转/分，振荡培养5天左右，显示初次突变红霉素生产菌未能生长，菌丝断裂严重，自溶，第二次筛选出的耐自身所产抗生素红霉素生产菌生长。
实施例2：
将第二次筛选出的耐自身所产抗生素的红霉素生产菌的种子液，接入发酵摇瓶培养基中，34±1℃，260转/分，振荡培养7天左右，红霉素含量达到8200u/ml。
普通的红霉素生产菌用此方法，红霉素含量只达到5600u/ml。
实施例3：
将第二次筛选出的耐自身所产抗生素的红霉素生产菌的种子液，接入含100L发酵罐中培养，34±1℃，7天左右，放罐效价可达到15600u/ml，发酵液中A组分含量由原来的72%提高到85%，B组分含量由原来的2.7%降低到1.1%。
普通的红霉素生产菌用此方法，红霉素含量只达到8900u/ml。
最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征依次包括以下步骤：
（1）将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，34±1℃，培养6-7天后获得新鲜成熟孢子；
（2）将红霉素生产菌新鲜成熟斜面制成孢子悬液，孢子量在1×106个/mL，取5mL孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射2分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板；
（3）挑取步骤（2）诱变后活菌落进行离子束辐照诱变：诱变温度为25℃，诱变剂量为50Gy，诱变后进行梯度稀释涂培养基平板初筛；挑单菌落至斜面培养基，34±1℃，培养6-7天，再经摇瓶发酵方法进行复筛，所得突变菌即为高产的红霉素生产菌。
2.根据权利要求1所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（3）斜面养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g；步骤（2）的平板培养基的配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品15g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
3.根据权利要求1所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：步骤（3）是将步骤（2）诱变后的活菌落在斜面培养基上培养6-7天后制成孢子悬液，进行离子束辐照诱变。
4.根据权利要求1所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：步骤（3）平板培养基配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g；摇瓶发酵培养基配方为：玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸钙6g，豆油4ml，红霉素标准品20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
5.根据权利要求3所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：其所用培养基配方为：可溶性淀粉6g，玉米浆7.2g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
6.根据权利要求1所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：步骤（3）的摇瓶发酵是将红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基。
7.根据权利要求6所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：种子培养基配方为：玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g，硝酸铵1.2g，氯化钠3g，玉米浆7.5g，分析纯碳酸钙6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.0；种子液培养条件为：34±1℃，220转/分，振荡培养42-46h。
8.根据权利要求6所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL，放入500mL带挡板的三角瓶中。
9.根据权利要求6所述的通过红霉素生产菌诱变提高抗生素产量的方法，其特征在于：将培养成熟的红霉素生产菌种子液5mL接入发酵摇瓶中，34±1℃，260转/分，振荡培养7天左右，得红霉素，测定效价。
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