CN103667149B

CN103667149B - 一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN103667149B
Application number: CN201310680527.9A
Authority: CN
Inventors: 奚立民; 奚逢源; 薛长艳; 郝之奎
Original assignee: Taizhou Vocational and Technical College
Current assignee: Taizhou Kerui Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103667149A

Abstract

本发明涉及一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用，属于生物工程技术领域。为了解决现有的海源性具有抗菌活性的药物较少的问题，提供一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用，该筛选方法包括将采集的海底淤泥加入装有已灭菌的水和玻璃珠的锥形瓶中，室温振荡，然后再用无菌水进行稀释后取样涂布到含K₂CrO₇的高氏一号培养基平板上进行筛选培养观察，挑取单菌落在YMS培养基平板上进行划线转接筛选培养，获得单菌落纯培养物；将得到的单菌落纯培养物接种在含有指示菌的PDA培养基上进行培养，筛选，得到具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株。该菌株具有较好的抗菌活性。

Description

一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

抗菌药物是临床上应用最广泛且极为重要的一类药物。而现有的抗菌药物大多来源于陆源土壤放线菌的次生代谢产物，这些放线菌种类多、代谢复杂、功能各异，科研工作者已依此为基础开发出了种类繁多的抗生素，为人类的健康做出了巨大贡献。目前，已知能够产生抑菌活性物质的陆源性微生物包括以下属：莫拉菌属(Moraxella)、希瓦菌属(Shewanella)、红细菌属(Ruegeria)、小红卵菌属(Rhodvulum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)微球菌属(Micrococcus)、弧菌属(Vibrio)、着色菌属(Chromatium)、玫瑰杆菌属(Roseobacter)、节杆菌属(Arthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、短杆菌属(Brachybacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、拟诺卡菌属(Nocardiopsis)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)和交替单胞菌属(Alteromonas)等等，但是，经过多年的研究开发之后，目前已很难获得新的陆源抗菌活性微生物。然而，海洋生态因环境复杂多变，蕴藏着约20余万种微生物，复杂的海域环境和长期的非定向进化使海洋微生物常具备与陆源微生物不同的防御系统和代谢途径，这为寻找具有保健、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等活性的功能特异、结构新颖的化合物提供了广阔的空间，现代先进生物技术的广泛应用也为有效开发海源抗菌药物提供了有力支持。作为天然化合物宝库的海洋，已成为药物筛选研究领域的热点。近年来，有关海洋微生物所产的脂肪酸、丙烯酸、吲哚类及苯酚类等抗菌活性的化合物已得到分离并进行了深入的研究。但是目前很少有所道有海洋中开发出具有抗菌活性的微生物。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用，该菌株是从海底淤泥中筛选的一株新的菌株，具有抗菌活性的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一株具有抗菌活性的菌株，所述的菌株为Nocardia asteroides XI菌株，所述Nocardia asteroides XI菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2013551。

本发明的菌株是从海底淤泥中分离并筛选得到的微生物，具有较强的抗菌活性。本发明的菌株为Nocardia属的星状诺卡氏菌（Nocardia asteroides），命名为Nocardia asteroids XI，已于2013年11月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013551，保藏地点为中国武汉武汉大学。

本发明的Nocardia asteroids XI菌株的菌落不透明且有皱褶和隆起，表面粗糙呈灰白色，菌落轮廓清晰，菌体不易挑起，显微镜下菌丝呈无序纤维状。本发明的Nocardia asteroids XI菌株属于革兰氏阳性菌，在5℃～40℃温度之间能够生长，最适温度是26℃～30℃，(G+C)mol%含量为66.5mol%。

在上述的具有抗菌活性的菌株中，所述Nocardia asteroidesXI菌株的16S rRNA序列如SEQ.NO1所示。

在上述的具有抗菌活性的菌株中，所述Nocardia asteroidesXI菌株具有抗菌活性的能力。本发明的菌株具有较强的抗菌活性，尤其对Staphylococous、Bacillus和Candia Albicans菌具有较好的抑制效果，抗菌活性强。

本发明的目的之二是通过以下技术方案得以实现的，一种具有抗菌活性的菌株的筛选方法，所述的菌株为Nocardiaasteroides XI菌株，该方法包括以下步骤：

A、将采集的海底淤泥加入装有已灭菌的水和玻璃珠的锥形瓶中，室温振荡，然后再用无菌水进行稀释后取样涂布到含K₂CrO₇的高氏一号培养基平板上进行筛选培养观察，挑取单菌落在YMS培养基平板上进行划线转接筛选培养，获得单菌落纯培养物；

B、将得到的单菌落纯培养物接种在含有指示菌的PDA培养基上进行培养，筛选，得到具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，作为优选，所述的高氏一号培养基、YMS培养基和PDA培养基均采用海水配制。采用海水配置培养基因渗透压没有发生变化，从而保证了海源微生物菌株在筛选中不会丢失。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，作为优选，步骤A中所述K₂CrO₇的含量为0.1mmol/L～0.5mmol/L。作为更进一步的优选，步骤A中所述K₂CrO₇的含量为0.2mmol/L～0.3mmol/L。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，所述的高氏一号培养基采用常规的高氏一号培养基即可。作为优选，所述高氏一号培养基采用海水配制，且所述高氏一号培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

可溶性淀粉：15～25；K₂HPO₄：0.2～0.7；KNO₃：0.5～1.5；MgSO₄：0.2～0.7；NaCl：0.2～0.7；FeSO₄：0.005～0.015；琼脂：10～20；PH：7.2～7.4。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，步骤A中所述YMS培养基采用本领域常规的原料配比即可。作为优选，所述的YMS培养基采用海水配制，且所述YMS培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

酵母粉：3.0～5.0；麦芽提取物：8～10；葡萄糖：3.0～5.0；琼脂：13～17。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，步骤B中所述的PDA培养基是马铃署葡萄糖琼脂培养基的简称。作为优选，所述的PDA培养基采用海水配制而成，且马铃署葡萄糖琼脂的重量配比为40g/L。

在上述的具有抗菌活性的菌株的筛选方法中，作为优选，步骤B中所述指示菌选自Staphylococous（表皮葡萄球菌）、Bacillus（枯草芽孢杆菌）和Candia Albicans（白色念珠菌）中的一种。

本发明的目的之三是通过以下技术方案得以实现的，一种具有抗菌活性的菌株的应用，所述的菌株为Nocardia asteroidesXI菌株，所述Nocardia asteroides XI菌株用于制备抗菌药物。由于Nocardia asteroides XI菌株具有较强的抗菌活性。因此，可以用于制备相应的抗菌药物。

综上所述，本发明与现有技术相比，本发明的具有抗菌活性的菌株，是本发明人从海底淤泥中筛选的一株新的菌株，该菌株为Nocardia asteroides XI菌株，具有较强的抗菌活性，提供了一种新的具有抗菌活性的海源微生物，解决了现有的大多是采用具有抗菌活性的陆源微生物，为抗菌药物的研究开辟了一条新的途径。且本发明的筛选采用常规的方法即可，但本发明的通过对筛选的方法进行改进，通过采用海水作为培养基的配制溶液，强化了优势菌株的筛选，提高筛选的准确性和选择性。

附图说明

图1是本发明Nocardia asteroids XI菌株的菌落形态图。

图2是本发明的Nocardia asteroids XI菌株的显微（400×）照片图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

实施例1

本实施例中所用的海底淤泥采集自浙江省台州市剑门港海区（28°1′57″N,121°36′38″E）海底淤泥；

本实施例中所用的高氏一号培养基、YMS培养基和PDA培养基采用海水配制；

本实施例中所用的高氏一号培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

可溶性淀粉：20；K₂HPO₄：0.5；KNO₃：1.0；MgSO₄：0.5；NaCl：0.5；FeSO₄：0.01；琼脂：15；PH：7.2～7.4。

本实施例中所用的YMS培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

酵母粉：4.0；麦芽提取物：10；葡萄糖：4.0；琼脂：15。

本实施例中所述的指示菌选自Staphylococous（表皮葡萄球菌）、Bacillus（枯草芽孢杆菌）和Candia Albicans（白色念珠菌）中的一种。

本实施例的Nocardia asteroides XI菌株的筛选方法：

取采集的海底淤泥样品10g加入装有90mL已灭菌的水和适量玻璃珠的锥形瓶中，在室温、220rpm条件下振荡30分钟，然后再用无菌水稀释到10^-2～10^-5倍，取稀释到10^-3、10^-4和10^-5的三个稀释倍数的样品各100μL分别涂布到含有0.1mmol/L K₂CrO₇的高氏一号培养基平板上在28℃的条件下进行筛选培养5天后观察，挑取单菌落在YMS筛选培养基平板上划线转接3～5次进行筛选培养，直至获得单菌落纯培养物；

将得到的单菌落纯培养物接种在含有指示菌的PDA培养基上，在30℃的条件下进行倒置筛选培养24～48小时，得到具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株。该菌株已于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2013551，保藏地点为中国武汉大学。

实施例2

本实施例具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株的筛选方法基本同实施例1一致，区别仅在于：

本实施例中所用高氏一号培养基为含有0.5mmol/L K₂CrO₇的高氏一号培养基，且所述高氏一号培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

可溶性淀粉：15；K₂HPO₄：0.7；KNO₃：0.5；MgSO₄：0.7；NaCl：0.2；FeSO₄：0.015；琼脂：20；PH：7.2～7.4。

酵母粉：5.0；麦芽提取物：8；葡萄糖：5.0；琼脂：17。

其它具体操作步骤同实施例1一致，这里不再赘述。

实施例3

本实施例中所用高氏一号培养基为含有0.3mmol/LK₂CrO₇的高氏一号培养基，且所述高氏一号培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

可溶性淀粉：25；K₂HPO₄：0.2；KNO₃：1.5；MgSO₄：0.2；NaCl：0.7；FeSO₄：0.005；琼脂：10；PH：7.2～7.4。

酵母粉：3.0；麦芽提取物：9.0；葡萄糖：3.0；琼脂：13。

其它同实施例1一致，这里不再赘述。

选取上述实施例得到的本发明具有抗菌活性的Nocardiaasteroides XI菌株进行鉴定和分析，具体鉴定和分析方法以及相应的鉴定结果如下所示。

本发明具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株的鉴定：

采用上述实施例的方法筛选得到的具有抗菌活性的Nocardia asteroides XI菌株接种到PDA培养基平板上，在30℃条件下倒置培养7天，观察其菌落生长状态，菌株形态及生理生化实验可以参照工业微生物实验生物（诸葛健、王正祥，工业微生物实验技术手册[M]，中国轻工业出版社，1994年）和伯杰氏细菌鉴定手册（R.E.布坎南，N.E.吉本斯，伯杰细菌鉴定手册[M]，科学出版社，北京，1984年），在恒温培养箱中观察其在5℃～40℃（间隔5℃）的生长情况。

上述Nocardia asteroides XI菌株形态学及生理生化特征的鉴定结果表明：

结合图1所示，如图1A所示，本发明的Nocardia asteroidesXI菌株的菌落不透明且有皱褶和隆起，表面粗糙呈灰白色，菌落轮廓清晰，菌体不易挑起，如图2B所示，显微镜下（400×）菌丝呈无序纤维状。另外，本发明的Nocardia asteroids XI菌株属于革兰氏阳性菌，在5℃～40℃温度之间能够生长，最适温度是26℃～30℃。

采用常规的高效液相法测定相应的（G+C）mol%含量，具体测定方法可以参照现有文献中（Kmpfer P,Young CC,Sridhar K,etal.Transfer of[Flexibacter]sancti,[Flexibacter]filiformis,[Flexibacter]japonensis and[Cytophaga]arvensicola to the genus Chitinophaga and description ofChitinophaga skermanii sp.nov[J].Int J Syst Evol Micr,2006,56(9):2223-2228）的相应方法，测定结果表明本发明的Nocardia asteroids XI菌株中（G+C）mol%含量为66.5%，属于Nocardia属的范围内。

本发明的Nocardia asteroids XI菌株的分子生物学研究，即本发明的Nocardia asteroids XI菌株的16S rRNA的PCR扩增采用本领域常规的方法即可。更具体的说，本发明的PCR扩增中DNA提取采用上海赛百盛基因技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒，具体的提取方法按照试剂盒的方法进行，扩增采用的引物为通用引物，由上海赛百盛基因技术有限公司合成，引物为：

5’-ACAAGCCCTGGAAACGGGGT-3；

5’-CACCAGGAATTCCGATCT-3’；

PCR扩增反应的条件为：94℃预变性4min，进入循环，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min后保存4℃状态。PCR产物用UltraClean PCR Clean-up kit纯化得到。并由上海生物工程有限公司完成测序，测序结果如SEQNO.1所示。将本发明的Nocardia asteroids XI菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析，确定该菌株为诺氏菌属的星状诺卡氏菌。选择与本发明的菌株同源性较高的相关菌株，用BioEit(V7.01)和MEGA（V5.1）采用邻位相连法（neighbor-joining）,NJ)构建系统发育树进行验证，系统发育树同样表明本发明的XI菌株与Nocardia asteroids（X53205.1）及Nocardiacyriacigeorgical（AF162772.2）等遗传距离较近。

本发明的Nocardia asteroids XI菌株的抑菌活性的研究，采用琼脂扩散对峙法研究本发明的Nocardia asteroids XI菌株对Staphylococous、Bacillus和Candia Albicans菌的抑制作用。所述琼脂扩散对峙法可以采用现有的方法（Wang H X,NG T B.Isolation and characterization of an antifungal peptidewith antiproliferative activity from seeds of Phaseolusvulgaris ev”Spotted Bean”[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2007,14(1)：125-130），具体的说：

所述琼脂扩散对峙法中所用的指示菌培养皿的制备如下：

对于指示菌（Staphylococous和Bacillus培养皿的制备如下：

分别取指示菌（Staphylococous和Bacillus）300ul加入到已灭菌且温度在48℃的300mL MYG固态培养基中，摇匀后倾倒培养皿，凝固后倒置备用；所述MYG固态培养基包括以下成分的重量配比（g/L）：

酵母粉：4.0；麦芽提取物：10.0；葡萄糖：4.0；琼脂：15.0。

对于指示菌Candia Albicans培养皿的制备如下：

将指示菌Candia Albicans300μL加入到已灭菌的且温度在48℃的300mLPDA培养基中，摇匀后倾倒培养皿，凝固后倒置备用。

抑菌滤纸片的制备及抑菌谱实验：

其中所述的抑菌滤纸片打孔成直径为5mm的圆片状备用。

取筛选得到的Nocardia asteroids XI菌株分别接种于不同的发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡72小时，取5mL发酵培养液离民取上清液，作为胞外抑菌活性物质的样本。将筛选得到的Nocardia asteroids XI菌株的菌体加入1mL甲醇，浸泡3小时后作为胞内抑菌活性物质的样本。

上述所述的不同发酵培养基选自以下的发酵培养基：

所述发酵培养基Ⅰ包括以下成分的重量配比(g/L)：

酵母抽提物：2.0，可溶性淀粉：5.0，葡萄糖：20.0，蛋白胨：2.0，热炸黄豆饼粉：5.0，NaCl：4.0,K₂HPO₄：0.5，MgSO₄·7H₂O：0.5，CaCO₃：3.0，pH：7.8。

所述发酵培养基Ⅱ包括以下成分的重量配比(g/L)：

麦芽抽提物：10.0，葡萄糖：20.0，可溶性淀粉：4.0，微液（ISP₃/ISP₄）：1.0mL/L,CaCO₃：2.0，pH：7.2-7.4。

所述发酵培养基Ⅲ包括以下成分的重量配比(g/L)：

酵母粉：4.0，麦芽提取物：10.0，葡萄糖：10.0，可溶性淀粉：40.0，微量元素：1.0mL/L，CaCO₃：2.0，pH：7.2-7.4。

所述发酵培养基Ⅳ包括以下成分的重量配比(g/L)：

酵母粉：4.0，葡萄糖：10.0，热炸黄豆饼粉：10.0，可溶性淀粉：40.0，微量元素：1.0mL/L，CaCO₃：2.0，pH：7.2-7.4。

取上述预先制备的抑菌滤纸圆片分别浸泡胞外和胞内样本后置于制好的指示菌培养基中，28℃条件下培养48～72小时后观察并用游标卡尺测量抑菌圈的直径（mm），每个样品重复3个，数据取平均值，测试结果如下表1所示：

表1：

从上述表1中可知，本发明的Nocardia asteroids XI菌株具有较强的抑菌活性，对指示菌Staphylococous的抑制最强，且胞内的抗菌活性物质略强于胞外，这可能与抗菌活性物质的浓度有关，与本发明的方法筛选得到的菌株的抑菌圈基本一致。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.一株具有抗菌活性的菌株，其特征在于，所述的菌株为星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)XI菌株，所述菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2013551。

2.根据权利要求1所述具有抗菌活性的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ.NO 1所示。

3.一种具有抗菌活性的菌株的应用，其特征在于，所述的菌株为星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)XI菌株，所述菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2013551，所述菌株用于制备抗表皮葡萄球菌药物、抗枯草芽孢杆菌药物或抗白色念珠菌药物。