CN103651262A - 一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及冬虫夏草栽培领域，特别涉及一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法。该方法通过将获得取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、0～7℃的避光条件下放置6～20h后继续饲养，使得取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率高达80%以上，甚至达90%以上，同时能够实现同一幼虫多次取样，为了解中国被毛孢对寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫是否已成功侵染以及感菌后的幼虫体内中国被毛孢真菌的演变过程的研究奠定了基础。
Description
本申请要求于2012年09月20日提交中国专利局、申请号为201210356685.4、发明名称为“一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及冬虫夏草栽培领域，特别涉及一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法。
背景技术
冬虫夏草是中国的一种名贵中药材，与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
冬虫夏草是一种特殊的虫和真菌共生的生物体，是冬虫夏草真菌（中国被毛孢）的菌丝体通过各种方式感染蝙蝠蛾（鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫）的幼虫，以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳，从而形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。
冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500～5200m局部高寒山区草甸地带，天然资源十分有限，近年来采挖过渡造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。
人工栽培冬虫夏草，通过冬虫夏草菌（中国被毛孢）侵染寄主昆虫（蝙蝠蛾幼虫），进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。其中，关键步骤是中国被毛孢能否侵染蝙蝠蛾幼虫。因此，了解中国被毛孢对蝙蝠蛾幼虫的侵染机理及菌体在虫体内的演变过程具有重要意义。
在研究冬虫夏草菌中国被毛孢对寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫的侵染效果时，需了解幼虫是否已感染上真菌以及感菌后的幼虫体内真菌的演变过程，常采用的办法是取幼虫体液进行显微镜观察。但是目前的取样技术，取体液后即把幼虫放回饲养盒中，虫体易受细菌感染死亡或体液流失过多死亡，有时甚至直接将取体液后的虫体丢弃，同一条虫很难进行第二次或更多次取样，虫体死亡率较高。此外，由于对幼虫体内真菌的演变过程不清楚，无法及时调整工艺，降低了蝙蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染后长成冬虫夏草的几率，造成资源浪费。因此，提供一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法具有现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法。该方法通过将获得取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、0～7℃的条件下放置6～20h后继续饲养，使得取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率提高至80%以上，甚至达90%以上，同时能够实现同一幼虫多次取样，为了解中国被毛孢对寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫是否已感染成功以及感菌后的幼虫体内真菌的演变过程的研究奠定了基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法，包括如下步骤：
步骤1：获得取体液后的蝙蝠蛾幼虫；
步骤2：将取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、0～7℃的避光条件下放置6～20h；
步骤3：继续饲养。
一般认为，蝙蝠蛾幼虫合适的培养温度为8～18℃，湿度为40～50%的环境中，但取样后的蝙蝠蛾幼虫，放回原有的环境中，往往发生较高的死亡率。但是本发明提供的方法发现，在避光条件下，经适当湿度、适当低温处理后的取体液后的蝙蝠蛾幼虫能够保持较好的抵抗能力，存活率极显著提高，对于中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫进而生长为冬虫夏草具有重要意义。
具体的，本发明提供的方法为将取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、0～7℃的条件下避光放置6～20h后，按照常规条件、常规方法继续饲养，同时能够多次取样，对研究中国被毛孢对寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫是否已感染成功以及感菌后的幼虫体内真菌的演变过程提供了基础。
作为优选，步骤2中取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～90%的条件下放置。
作为优选，步骤2中取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为82～87%的条件下放置。
作为优选，步骤2中取体液后的蝙蝠蛾幼虫于温度为2～6℃的条件下放置。
作为优选，步骤2中取体液后的蝙蝠蛾幼虫于温度为3～5℃的条件下放置。
作为优选，步骤2中取体液后的蝙蝠蛾幼虫放置时间为9～12h。
作为优选，步骤1中取体液后的蝙蝠蛾幼虫为已被中国被毛孢侵染的蝙蝠蛾幼虫或未被中国被毛孢侵染的蝙蝠蛾幼虫。
作为优选，步骤3中饲养的温度为15～17℃。
作为优选，步骤3中饲养的温度为16℃。
作为优选，步骤3中饲养的时间为5～30d。
作为优选，步骤3中饲养的时间为5～10d。
作为优选，步骤1中体液的体积为少于20μL。
取体液时，用手轻按虫体腹部，使虫无法活动；用消毒后的细针轻刺虫体。取样部位——离虫尾端3-5mm处，虫体侧面，避开背血管，避免虫子的重要组织及器官受损。只要虫体有微量（3～20μL）体液流出来，将液体沾在或用移液器吸取后滴在干净的载破片上，直接观察。一般取体液3～15μL，优选的为5～10μL。
本发明提供一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法。该方法通过将获得取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、0～7℃的避光条件下放置6～20h后继续饲养，使得取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率高达80%以上，甚至达90%以上，同时能够实现同一幼虫多次取样，为了解中国被毛孢对寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫是否已成功侵染以及感菌后的幼虫体内中国被毛孢真菌的演变过程的研究奠定了基础。
附图说明
图1示实施例5中试验组第一次取体液后镜检结果；
图2示实施例5中试验组第二次取体液后镜检结果；
图3示实施例5中试验组第三次取体液后镜检结果。
具体实施方式
本发明公开了一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
随机挑取1.5cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.1g，分成对照组和试验组2组，每组各10条。
对照组幼虫取体液5μL后不经冷处理，直接放回饲养盒中15℃和湿度为40%饲养。
试验组幼虫取体液后置于湿度为82%、4℃冰箱中避光放置10个小时，再转入饲养盒中与对照组同条件饲养。取体液的体积与对照组相同，为5μL。
5天后观察存活幼虫数，见表1。
表1 幼虫存活率
试验数据表明，对照组存活2条，试验组存活9条，本发明提供的取样方法极显著提高了幼虫存活率（P≤0.01）。
实施例2
随机挑取1.5cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.08g，分成两组，每组各10条。组1作为对照组，不取体液；组2作为试验组取体液10μL后置于湿度为90%、4℃冰箱中避光放置6个小时，再转入饲养盒中15℃饲养。30天后观测存活虫数及虫体长。组1存活9条，平均虫体长2.6cm；组2存活9条，平均虫体长2.4cm。本发明提供的取样方法对幼虫的生长基本无影响。
实施例3
随机挑取1.8cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.13g，分成两组，每组各10条。组1作为对照组，不取体液；组2作为试验组取体液15μL后置于湿度为80%、2℃冰箱中避光放置12个小时，再转入饲养盒中15℃饲养。30天后观测存活虫数及虫体长。组1存活9条，平均虫体长2.9cm；组2存活8条，平均虫体长2.7cm。本发明提供的方法对幼虫的生长基本无影响。
实施例4
随机挑取1.8cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.15g，分成对照组和试验组2组，每组各10条。
对照组幼虫取体液10μL后不经冷处理，直接放回饲养盒中16℃和湿度为40%饲养。
试验组幼虫取体液10μL后置于湿度为87%、5℃冰箱中避光放置9个小时，再转入饲养盒中与对照组同条件饲养。
5天后观察存活幼虫数，见表2。
表2 幼虫存活率
试验数据表明，对照组存活1条，试验组存活9条，本发明提供的取样方法极显著提高了幼虫存活率（P≤0.01）。
实施例5
随机挑取1.5cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.11g，分成对照组和试验组2组，每组各10条。
对照组幼虫取体液3μL后不经冷处理，直接放回饲养盒中16℃和湿度为45%饲养。
试验组第一次取体液3μL后置于湿度为82%、3℃冰箱中避光放置11个小时，再转入饲养盒中与对照组同条件饲养。30天后，10条蝙蝠蛾幼虫均存活，对存活虫进行第二次取样镜检（方法与第一次相同），取体液3μL。60天后，10条蝙蝠蛾幼虫均存活，对存活虫进行第三次取样镜检（方法与第一次相同），取体液3μL。镜检结果见图1至图3（放大倍数：16×40）。
图中棒状物（单个或两个相连）为蝙蝠蛾幼虫体内的中国被毛孢菌体，即该蝙蝠蛾幼虫已被中国被毛孢侵染，经本发明提供的方法，存活率较高，存活状态较好。
比较三次取样镜检结果，可发现随着饲养时间的增加，菌体的数量及形状都发生了变化，符合正常培养规律。
30天后，取对照组的饲养盒中存活的2条蝙蝠蛾幼虫镜检。结果表明，对照组中一条未感染被毛孢菌体，另一条虫感染了被毛孢菌体。与试验组结果比较，虫体内菌体状况相近，说明本发明提供的方法对取样无影响。
实施例6
随机挑取1.8cm蝙蝠蛾幼虫40条，每条约重0.13g，分成对照组和试验组2组，每组各20条。
对照组幼虫取体液8μL后不经冷处理，直接放回饲养盒中17℃和湿度为40%饲养。
试验组幼虫取体液8μL后置于湿度为85%、0℃冰箱中避光放置10个小时，再转入饲养盒中与对照组同条件饲养。
5天后观察存活幼虫数，见表3。
表3 幼虫存活率
试验数据表明，对照组存活5条，试验组存活19条，本发明提供的取样方法极显著提高了幼虫存活率（P≤0.01）。
实施例7
随机挑取1.5cm蝙蝠蛾幼虫20条，每条约重0.1g，分成对照组和试验组2组，每组各10条。
对照组幼虫取体液5μL后不经冷处理，直接放回饲养盒中17℃和湿度为50%饲养。
试验组幼虫取体液后5μL置于湿度为95%、7℃冰箱中避光放置20个小时，再转入饲养盒中与对照组同条件饲养。
5天后观察存活幼虫数，见表4。
表4 幼虫存活率
试验数据表明，对照组存活1条，试验组存活9条，本发明提供的取样方法极显著提高了幼虫存活率（P≤0.01）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种提高取体液后的蝙蝠蛾幼虫的存活率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得取体液后的蝙蝠蛾幼虫；
步骤2：取所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～95%、温度为0～7℃的避光条件下放置6～20h；
步骤3：继续饲养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为80～90%的条件下放置。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫于湿度为82～87%的条件下放置。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫于温度为2～6℃的条件下放置。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫于温度为3～5℃的条件下放置。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫放置时间为9～12h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述取体液后的蝙蝠蛾幼虫为已被中国被毛孢侵染的蝙蝠蛾幼虫或未被中国被毛孢侵染的蝙蝠蛾幼虫。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述饲养的温度为15～17℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述饲养的时间为5～30d。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述饲养的时间为5～10d。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述体液的体积为少于20μL。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤1中所述体液的体积为5～10μL。
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