CN103651103B

CN103651103B - 一种快速获得灯盏花三倍体的方法

Info

Publication number: CN103651103B
Application number: CN201310660757.9A
Authority: CN
Inventors: 董志渊; 李绍平; 杨丽英; 王馨; 李林玉; 杨斌; 马维思; 严世武
Original assignee: Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103651103A

Abstract

本发明公开了一种快速获得灯盏花三倍体的方法，采用细胞微管抑制剂氨磺灵（Oryzalin）的水溶液浸泡处理当年采收的饱满灯盏花饱种子，诱导胚芽生长点细胞染色体加倍；苗期、现蕾期连续二次进行叶片气孔鉴定，快速筛选获得四倍体变异植株；四倍体变异植株与二倍体植株杂交（染色体加倍的卵细胞与正常精细胞融合）获得倍性纯合的三倍体。该方法通过利用被子植物有性生殖受精过程中单细胞（卵细胞）与单细胞（精细胞）融合，同步实现了植株染色体倍性纯化和三倍体获得，免除了纯化四倍体变异植株倍性的大量烦琐工作，为创制丰富的灯盏花三倍体新种质和培育三倍体新品种提供了技术支持。

Description

一种快速获得灯盏花三倍体的方法

技术领域

本发明属于植物遗传育种领域，涉及培育植物三倍体的方法，尤其是一种快速获得灯盏花三倍体的培育方法。

背景技术

三倍体在植物育种中具有重要作用。利用三倍体细胞体积增大带来的巨大性、染色体组加倍带来的剂量效应和减数分裂异常带来的不孕性，可培育出产量、有效成分含量高，无籽或少籽的植物新品种。目前，在一些植物上都有三倍体优良品种的报道，如罗汉果(李锋,蒋向军,蒋水元,覃吉胜,黄夕洋,刘凤英.无籽（少籽）罗汉果培育成功（简报），广西植物,2008,28(6):27)、西瓜（李建吾,马长生,孙中伟,张洁.无籽西瓜新品种'豫艺菠萝蜜'.园艺学报,2005,32,(2):374）、枸杞（李健,王锦秀,王立英,黄占明.无籽枸杞新品种选育研究.西北植物学报,2001,21(3):446-450）、杨树（李风兰,张志毅,张民侠.白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(Ⅲ)-加倍体某些形态特征的观察.北京林业大学学报,1994,16(2):15-18）等。

灯盏花(Erigeron breviscapus(vant.)Hand.–Mazz.)，又名短葶飞蓬，为菊科飞蓬属多年生草本植物，以全草入药，是云南重要的药用植物和道地药材，其有效成分为灯盏乙素为代表的黄酮类化合物。灯盏花主要为二倍体（2n=2x=18），但在野生群体中也发现了三倍体自然变异植株（2n=3x=27）。通过三倍体表型特征研究发现，三倍体植株生长势强，植株高大粗壮，叶片数明显多于二倍体植株，叶形较大，结实率极低，植株抗性强，可作为灯盏花育种的优良种质（李鹏,党承林,黄瑞复.三倍体短葶飞蓬的发现及其在育种上的意义.云南植物研究,2007,29(1):38-42）。由于灯盏花三倍体自然发生频率较低，无法满足育种利用需要，因此有必要建立一套人工创制灯盏花三倍体的技术方法，为三倍体新品种选育培育提供丰富的、不同遗传背景的三倍体新种质。

发明内容

针对上述存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种快速获得灯盏花三倍体的方法。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

a、采用浓度60-90μmol/L的细胞微管抑制剂氨磺灵（Oryzalin）水溶液浸泡处理当年采收的饱满灯盏花种子，浸泡处理时间24-72h，每50mL氨磺灵（Oryzalin）水溶液处理900-1000粒灯盏花饱满种子，处理结束后蒸馏水清洗3次。

b、处理后的种子播种育苗，待长出4-6片真叶时，取第4-6片真叶的下表皮，进行气孔鉴定，选择气孔显著增加的植株作为四倍体变异初选植株进行盆栽；气孔鉴定中，以气孔周长代表气孔大小，同批次栽培二倍体植株作为对照，以极显著大于对照的植株鉴定为四倍体变异初选植株；

c、进入现蕾期，取四倍体变异初选植株花序基部叶片下表皮再次进行气孔鉴定，进一步筛选获得气孔保持显著增大的植株作为四倍体变异植株，气孔鉴定具体方法同步骤b；

d、以四倍体变异植株为母本，二倍体植株为父本，进行杂交；

e、收获杂交成熟种子，进行播种育苗，待植株长出4-6片真叶时，取植株根尖进行染色体倍性鉴定，染色体鉴定为三倍体的植株再进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得三倍体植株（2n=3x=27）。

作为进一步的技术方案：

步骤(b)所述的进行气孔鉴定具体如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每1植株测定30-50个气孔；采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为四倍体初选变异植株。

步骤(e)杂交后30-60d，采收成熟种子，挑选饱满种子进行播种育苗，60d后取植株根尖进行染色体倍性鉴定。

本发明提出的方法以人工栽培收获的灯盏花种子为材料，采用细胞微管抑制剂Oryzalin（氨磺灵）浸泡处理种子，诱导胚芽生长点细胞染色体加倍，产生四倍体变异植株，再通过四倍体变异植株与正常二倍体植株杂交，四倍体变异植株与二倍体植株杂交（染色体加倍的卵细胞与正常精细胞融合）获得倍性纯合的三倍体植株。该方法通过利用被子植物有性生殖受精过程中单细胞（卵细胞）与单细胞（精细胞）融合，同步实现了植株染色体倍性纯化和三倍体获得，有效免除了纯化四倍体变异植株倍性的大量烦琐工作，为创制丰富的灯盏花三倍体新种质和培育三倍体新品种提供了技术支持。由于灯盏花主要通过种子进行繁殖，种子较小，千粒重约为0.1g；本发明方法采取苗期和现蕾期连续2次气孔鉴定，可简便、快速获得大量诱变处理材料。

附图说明

图1不同倍性植株气孔大小，其中的第1幅图反映对照用的二倍体植株气孔;第2幅图反映本发明得到的四倍体变异植株气孔。

图2不同倍性灯盏花植株及其倍性鉴定，其中的1为二倍体植株;2为二倍体染色体数目(2n=2x=18);3为二倍体核DNA流式细胞光度分析;4为四倍体植株;5为四倍体变异植株染色体加倍数目(2n=4x=36);6为四倍体变异植株核DNA流式细胞光度分析;7为三倍体植株;8为三倍体染色体数目(2n=3x=27);9为三倍体核DNA流式细胞光度分析。

具体实施方式

以下实施例中Oryzalin水溶液按照如下方法事先配制：首先采用少量二甲基亚砜(DMSO)溶解所需质量的Oryzalin药剂，然后将DMSO溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，液体为黄色，DMSO用量按体积重量比例为最终配制Oryzalin水溶液的1%。

实施例1

<1>挑选当年采收的灯盏花饱满种子1000粒。

<2>加入适量蒸馏水进行预培养16h后，采用50mL浓度60μmol/L的氨磺灵（Oryzalin）水溶液浸泡24h，处理结束后，用自来水清洗3次。

<3>将处理后的种子与河沙混匀，进行撒播，覆盖厚约2mm的细土，喷水湿润后，进行正常的育苗管理。

<4>种子出苗具4-6片真叶时，撕取第4片真叶下表皮进行气孔鉴定。方法具体如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每1植株测定30-50个气孔。采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为初选变异植株,变异率达到16.25%。

<5>待初选四倍体变异植株现蕾时，取花序基部叶片下表皮再次进行气孔鉴定（方法同上），以气孔极显著大于对照的植株为四倍体变异植株(占初选变异植株数目的40%)。

<6>待四倍体变异植株进入开花期，硫酸纸袋进行套袋，取对照二倍体植株花粉进行人工授粉。

<7>收获成熟种子，播种育苗，具4-6片真叶时，取根尖进行染色体鉴定。具体方法如下：于晴天上午10点，取植株生长旺盛的根尖，放入0.002M的8-羟基喹啉溶液中预处理6h，转入卡诺氏固定液Ⅰ（无水酒精：冰醋酸=3：1）固定16h，1NHCl水解60℃水解7min，卡宝品红染液染色2min，压片，显微镜下染色体计数。染色体鉴定为三倍体的植株取幼嫩叶片放入培养皿里，加入1000μl WPS提取缓冲液；用刀片切碎叶片，过滤后加入150μl PI染色液，PARTEC流式细胞分析仪上样检测。

实施例2

<1>挑选当年采收的灯盏花饱满种子1000粒。

<2>加入适量蒸馏水进行预培养16h后，采用50mL浓度90μmol/L的氨磺灵（Oryzalin）水溶液浸泡72h，处理结束后，用自来水清洗3次。

<3>将种子与河沙混匀，进行撒播，覆盖厚约2mm的细土，喷水湿润后，进行正常的育苗管理。

<4>种子出苗具4-6片真叶时，撕取第4片真叶下表皮进行气孔鉴定。方法具体如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每1植株测定30-50个气孔。采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为初选变异植株，变异率达到24.62%。

<5>待初选四倍体变异植株现蕾时，取花序基部叶片下表皮进行气孔鉴定（方法同上），以气孔极显著大于对照的植株为四倍体变异植株，占初选变异植株数目的45%。

<6>四倍体变异植株进入开花期，硫酸纸袋进行套袋，取对照二倍体植株花粉进行人工授粉。

Claims

1.一种快速获得灯盏花三倍体的方法，其特征在于，步骤如下：

a、采用浓度60-90μmol/L 的细胞微管抑制剂氨磺灵水溶液浸泡处理当年采收的饱满灯盏花种子，浸泡处理时间24-72h，每50mL氨磺灵水溶液处理900-1000粒灯盏花饱满种子，处理结束后蒸馏水清洗3次；

e、收获杂交成熟种子，进行播种育苗，待植株长出4-6片真叶时，取植株根尖进行染色体倍性鉴定，染色体鉴定为三倍体的植株再进行核DNA含量流式细胞光度分析，最终确认获得三倍体植株及三倍体染色体数目2n=3x=27。

2.根据权利要求1所述的快速获得灯盏花三倍体的方法，其特征在于：步骤b所述的进行气孔鉴定具体如下：显微镜下测定气孔的长和宽，并依据椭圆周长公式，计算气孔的周长，每1植株测定30-50个气孔；采用统计学T检验方法测定该植株气孔周长与对照植株气孔是否存在差异，其中气孔极显著大于对照的植株为四倍体初选变异植株。

3.根据权利要求1所述的快速获得灯盏花三倍体的方法，其特征在于：步骤e杂交后30-60d，采收成熟种子，挑选饱满种子进行播种育苗，60d后取植株根尖进行染色体倍性鉴定。