CN103645308A - 一种微载体二维编码方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种微载体的二维编码方法，特别是将表面凸起微柱阵列用于微载体的编码，首先在300纳米至100微米范围内选定基本编码单元尺寸，然后将微载体平面根据基本编码单元尺寸进行划分，则在微载体平面上得到划分的网格，取完整的网格为基本单元；对微载体平面上划分得到的网格依照从左至右对一行内的基本单元排序，然后再按照从上至下的顺序对不同行进行排序；该编码不但编码量大而且其凸形结构易于用图案扫描技术进行快速检测因此期盼该发明能够有效改善微载体在传感、分离、催化等领域的性能并拓展其应用范围。

Description

一种微载体二维编码方法

技术领域

本发明涉及一种微载体的二维编码方式及其应用，特别是通过平面二维凸起阵列作为编码与微载体结合从而推动微载体的应用。

背景技术

社会的发展催生了从医疗卫生到商品安全至环境保护的大量生物、化学检测需求的增长，由此促进了具有高通量的检测平台-生物芯片技术的快速发展。目前的生物芯片技术包括平面微阵列芯片及悬浮阵列芯片。其中悬浮阵列芯片由于具有通量高、检测柔性度好、反应速度快、可以避免交叉污染、信号质量高等优点而最先被美国FDA批准用于临床。悬浮阵列芯片利用具有唯一编码特征的微球作为反应单元进行检测、筛选和分离。其中成功的代表是美国的Luminex公司。他们推出Luminex100液态芯片检测仪，其检测体系由100种直径为5.6μm的染有荧光染料的聚苯乙烯微球(多为羧基末端微球)构成，该荧光微球通过共价键偶联氨基标记的核酸探针(或蛋白质探针)，将偶联有100种不同探针的微球与待检分子反应后，加入合适的报告分子，再用两束不同波长的光照射该体系，一束光用来激发荧光微球自身的荧光物质，根据探测到的荧光强度对探针分子进行定性测定；另一束光用来激发报告分子所携带的荧光物质，根据荧光强度值对待检生物分子进行定量测定。该公司技术已经成功地在包括生物芯片、药物筛选等领域获得广泛应用。到目前为止仅中国就购买了数以百台计的Luminex100液态芯片检测仪。

悬浮阵列芯片的微载体除了上述球状外还可以是片状、块状和杆状等其它形状，但以球状为主，这主要与其编码及检测方法相关。微载体由于在检测过程中位置不定因此需要标志易于识别的编码，然后在检测过程中通过解码而用于检测。为此人们发展了包括光学编码（荧光或者颜色）、化学编码（易于识别的核酸或者其它分子或者颗粒）、图形编码（条纹等图案）、电子编码（无线射频编码）和物理编码（颗粒尺寸等）。由国外公司开发的荧光光学编码及核酸化学编码微球微载体由于能够与流式细胞术结合进行高速、高通量检测目前已经得到商业应用，而其它大部分编码方式则还停留在试验阶段。更为重要的是由于上述编码方式往往需要昂贵的检测仪器进行解码，使得其成本难以下降，从而限制了微载体进一步的推广应用。而且与流式细胞术结合的分析方法也难以与平面微阵列芯片的分析速度抗衡。因此人们急需开发易于解码，与高通量或者大规模推广相兼容的微载体编码技术。

在人类文明的进程中，广泛使用信息的存储及传播媒介除了语言文字外就是18世纪诞生的以0和1表示的二进制信息编码方法并且已经广泛用于计算机、通信等领域。在悬浮阵列芯片中2007年Daniel C等人采用微孔点阵列图案进行编码，该方法编码量大-其所制备的90微米宽30微米厚180至270微米长的微颗粒编码数量可达百万级别、能够重复批量制备、检测灵敏且与流式细胞术兼容，从而首次提示图案编码在悬浮阵列芯片中的巨大潜力。然而微孔阵列图案编码虽然编码量大，但是其长条状结构使得其只能藉由流式细胞术低速检测其编码图案，因此其推广应用受到很大限制。为此本申请在国际上首次提出基于凸形微柱的图案编码技术，该技术将能够与我们前面开发的不倒翁微载体相结合，可以在组装后用平面微阵列芯片的快速图案扫描技术进行检测，所以我们期待该技术能够为悬浮阵列芯片的进一步发展和应用作出贡献。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种微载体的编码方法，将表面凸起微柱阵列用于微载体的编码，该编码不但编码量大而且其凸形结构易于用图案扫描技术进行快速检测因此有望为悬浮阵列芯片的进一步发展与推广服务。

技术方案：本申请首次将表面二维凸起微柱阵列用于微载体的编码以期为微载体的应用推广做出贡献。

本发明的微载体平面的编码方法通过下述方法实现：

首先在300纳米至100微米范围内选定基本编码单元尺寸，然后将微载体平面根据基本编码单元尺寸进行划分，则在微载体平面上得到划分的网格，取完整的网格为基本单元。为方便后续编码对微载体平面上划分得到的网格依照从左至右对一行内的基本单元排序，然后再按照从上至下的顺序对不同行进行排序。

设定凸起编码俯视形状并且设定其编码值为1，而其余编码编码值则为0。随后在微载体平面上划分的网格区域内划定二维编码读取顺序坐标体系XY轴，X轴与Y轴长度不同，在设定长或者短的为X轴的情况下，X轴或者Y轴由一条直线上的两个或者两个以上的凸起编码的基本单元组成且X轴与Y轴夹角为90度。此外为方便识别，设定当X轴与Y轴相邻时，X轴及Y轴其相邻基本单元编码均为0同时X轴基本单元与Y轴基本单元构成的方阵中除X轴及Y轴外其它基本单元的编码均为0；而当X轴与Y轴分离时，X轴及Y轴相邻基本单元编码均为0。X轴及Y轴可以选定在微载体平面的边缘或者中心。

其后在微载体平面的剩余区域内按照至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则，依据X轴由左至右，Y轴由上至下的方式进行编码最终得到二维微柱阵列编码的微载体。

所述凸起编码为相对于微载体平面基体凸出的微柱；

所述凸起编码俯视形状呈现规则几何结构，包括圆形、方形、菱形、上三角形，下三角形、五边形、六边形；

所述二维微柱阵列编码的微载体的解码过程为在获取微载体平面图像后首先确定X轴及Y轴，然后用编码时划分的网格与X轴及Y轴对齐并按照X轴从左至右及Y轴从上至下方式依次读取微载体平面的编码；

所述二维微柱阵列编码的微载体用于多目标生物或者化学信息检测。

有益效果：目前微载体的编码虽然已经发展了很多技术，但是一方面目前能够使用的编码技术往往需要昂贵的仪器设备，而另一方面其它包括图案编码在内的技术由于在可识别性、编码量等领域存在问题所导致的不成熟，使得编码微载体的使用受到很大限制。

为此，本发明将易于识别、易于制造、编码量大且易于推广的二维凸起微柱阵列用于微载体的编码，期盼能够有效改善微载体在传感、分离、催化等领域的性能并拓展其应用范围。

附图说明

图1为微载体二维编码流程图a为微载体平面基本单元网格的划分，其中a1微载体平面；a2划分的基本单元网格；b为二维编码XY坐标系的建立，其中b1为X轴，b2为Y轴；c为微载体平面二维编码的构建，其中c1为一个凸起的圆形编码。

图2为二维编码坐标系的构建方法I为长的X轴与短的Y轴相临位于微载体平面的边缘；II为短的X轴与长的Y轴分离且位于微载体平面的边缘；III为长的X轴与短的Y轴相邻且位于微载体平面的中心。

图3为凸起编码的几种规则几何形状a圆形，b方形，c正三角形，d菱形，e倒三角形

图4为二维编码微载体的俯视图I编码为6D1-5E1-9E1-7F1-4G1;II编码为2D1-6D1-9E1-7F1-4G1-7J1;III编码为8A1-5D1-2E1-9E1-4G1-8I1-6J1。

图5为二维编码微载体的解码流程图a获取二维编码微载体的俯视图像；b在确定微载体平面X轴及Y轴后用编码时划分用的网格与X轴及Y轴对齐；c按照X轴从左至右，Y轴从上至下的原则依次读取微载体二维编码信息。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行说明。

首先在200纳米至100微米范围内选定基本编码单元尺寸，例如设定基本单元尺寸为2微米并且微载体平面为圆形其直径约为25微米，然后将微载体平面根据基本编码单元尺寸进行划分，则在微载体平面上得到划分为尺寸为2微米*2微米的网格，取完整的网格为基本单元，如图1所示，其中a1为微载体平面，而a2为根据基本单元尺寸划分的网格。依照从左至右对一行内的基本单元排序，然后再按照从上至下的顺序对不同行进行排序。例如我们用阿拉伯数字123等对行内基本单元排序，而对不同行用英文字母ABC等排序，则图1中微载体平面第一个基本单元就在3A处，而最后一行的基本单元在7K处。

设定凸起编码俯视形状为圆形，其编码值为1，而其余编码即无凸起编码的基本单元其编码值则为0。随后在微载体平面上划分的区域内划定图案编码读取顺序坐标体系XY轴，X轴与Y轴长度不同，在设定长或者短的为X轴的情况下，X轴或者Y轴由一条直线上的两个或者两个以上的凸起编码的基本单元组成且X轴与Y轴夹角为90度。此外为方便识别设定当X轴与Y轴相邻时，X轴及Y轴其周围基本单元编码均为0同时X轴基本单元与Y轴基本单元构成的方阵中除X轴及Y轴外其它基本单元的编码均为0；如图1b所示，这里我们设定长的(图中b1)为X轴，由三个相连的基本单元组成，而短的(图中b2)为Y轴，由两个相连的基本单元组成。而当X轴与Y轴分离时，X轴及Y轴其周围基本单元编码均为0，如图2b所示。X轴及Y轴可以选定在微载体的平面的边缘或者中心，如图2所示。

其后在微载体平面的剩余区域内按照至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则依据X轴由左至右，Y轴由上至下的方式进行编码以供后续悬浮阵列芯片检测时解码，如图1c，其编码为6D1-5E1-9E1-7F1-4G1，其中6D、5E等为其X及Y坐标排序而1则表示其为凸起编码；这样该种微载体将可以有约2⁷⁶即7.5*10²²个编码。

所述凸起编码为相较与微载体平面基体凸出的微柱；

所述凸起编码俯视形状为规则几何形状结构，包括圆形、方形、菱形、上三角形，下三角形、五边形、六边形；

所述解码过程为在获取微载体平面图像后首先确定X轴及Y轴，然后用编码时划分的网格与X轴及Y轴对齐并按照X轴从左至右Y轴从上至下方式依次读取微载体平面的编码；

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一：

首先选定二维编码的基本单元尺寸为2微米。随后通过AUTOCAD软件绘制直径为25微米的圆形微载体平面并用间隔为2微米的网格对微载体平面进行划分。设定圆形凸起编码值为1，而无圆形凸起或者其余编码则为0。随后设定微载体平面边缘处X轴由一条线上的三个凸起编码基本单元组成及Y轴则由相邻且与X轴垂直的一条线上的两个凸起编码基本单元组成。将X轴及Y轴组成方块中基本单元除X轴及Y轴外设定编码值为0，其它X轴及Y轴相邻基本单元的编码值也为0。随后按照X轴从左至右，Y轴从上至下的方式根据需要及至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则对微载体平面上剩余区域进行编码，编码完成后移除划分网格得到某种二维凸起图案编码微载体的俯视图。通过AUTOCAD软件以6英寸硅片为标的，在其不同区域分别绘制间隔为100微米，直径为25微米不同编码微载体的模板阵列。然后通过微电子工艺制备为掩模板并进一步通过等离子刻蚀工艺将100面的6英寸原硅片制备为硅基模板，刻蚀深度设置为5微米。随后将道康宁SYLGARD184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，将其倒入含硅基模板的平底容器中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得凸起编码的PDMS模板。随后将上述PDMS模板于氧等离子中处理30秒后用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟，得到低表面能的PDMS模板。将该模板置于容器中并再次注入道康宁SYLGARD184硅橡胶溶液，其后通过真空除气泡及100摄氏度固化后，将新的PDMS模板与低表面能模板分离即获得由凹陷点阵列二维编码的PDMS模板。将该PDMS模板用氧等离子处理及氟代烷基硅烷处理后备用。另外配置含9.5%的丙烯酰胺，1%的甲叉双丙烯酰胺，5%的分子量为900的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），10%的甘油，直径为10纳米的四氧化三铁及1%的2-羟基-2-甲基苯丙酮的水溶液作为微载体反应液并将其储存在作为储液池的96孔板的孔中，然后通过37.5微米的点样针从储液池中取液后通过显微镜校正后分配在某种如6D1-5E1-9E1-7F1-4G1凹陷点阵列编码的PDMS模板上。重复该过程使得每一个模板上均分配有微载体反应液。然后将通过功率为100瓦的紫外光源进行照射约15秒以促使微载体反应液聚合固化以成为水凝胶。随后通过蒸馏水将不粘模板上的含有圆形微柱点阵列编码的半球型水凝胶微载体冲至收集池中清洗备用。将上述含有圆形微柱点阵列编码的半球型水凝胶微载体置于1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠（NaN₃）的1%BSA的PBS封闭液4℃冰箱封闭10h，37℃封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的6D1-5E1-9E1-7F1-4G1二维微柱编码的半球形微载体。

通过同样方法分别批量制备以2D1-6D1-9E1-7F1-4G1-7J1二维圆形微柱编码的乙型肝炎检测微载体及以8A1-5D1-2E1-9E1-4G1-8I1-6J1二维圆形微柱编码的丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的二维圆形微柱编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应1h并清洗，随后在荧光显微镜下摄取不同二维编码微载体的自然光照片及荧光照片。将自然光照片用编码时划分的网格与X轴及Y轴对齐并按照X轴从左至右Y轴从上至下方式依次读取微载体平面的编码以解码。这样结合荧光照片就可以基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。

实施例二：

首先选定二维编码的基本单元尺寸为300纳米。随后通过AUTOCAD软件绘制直径为30微米的圆形微载体平面并用间隔为1微米的网格对微载体平面进行划分。设定方形凸起编码值为1，而无方形凸起或者其余编码则为0。随后在微载体平面中心设定X轴由一条线上的6个凸起编码基本单元组成而Y轴则由相邻垂直的一条线上的三个凸起编码基本单元组成。设定X轴及Y轴相邻基本单元的编码值为0且X轴与Y轴组成的长方块中除X轴及Y轴外其它基本单元编码值均为0。随后按照X轴从左至右，Y轴从上至下的方式根据需要及至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则对微载体平面上剩余区域进行编码，编码完成后移除划分网格得到某种二维凸起图案编码微载体的俯视图。通过AUTOCAD软件在5英寸范围内不同区域分别绘制间隔为100微米，微载体直径为30微米，凸起编码高度为500纳米的不同编码微载体的模板阵列。然后利用德国Nanoscibe公司的三维激光真写系统将该模板阵列在5英寸硅片上将IP-L光刻胶制备为三维模板。随后将该模板置于平底烧杯中，并在将道康宁SYLGARD184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合注入含模板的平底烧杯中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得凸起编码的PDMS模板。随后将上述PDMS模板于氧等离子中处理30秒后用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟，得到低表面能的PDMS模板。将该模板置于平底烧杯中并再次注入道康宁SYLGARD184硅橡胶溶液，其后通过真空除气泡及100摄氏度固化后，将新的PDMS模板与低表面能模板分离即获得由凹陷点阵列二维编码的PDMS模板。将该PDMS模板用氧等离子处理及氟代烷基硅烷处理后备用。

另外选择14417氧化低密度脂蛋白受体1（OLR-1）的基因多态性选为寡核苷酸多态性SNP基因分型分析的目标以检测其中5’-TGC TGT GA G TG A ACCTGC TGT GTT GA-3’。然后据此设计聚合性的探针：

I：5’-TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3’

II：5’-TCA ACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3’

III：5’-TCA ACA CAG CAC GAT CAC TCA CAG CA-3’

IV：5’-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3’

其中I与目标序列完全匹配，而II，III，和IV分别在序列中间与检测器1有一个，两个和三个错配碱基。

然后以2mM的探针I至IV溶液浓度分别准备丙烯酰胺修饰寡核苷酸的溶液，含有3％的丙烯酰胺单体（29:1，丙烯酰胺：双丙烯酰胺），30％的甘油和1％的APS。这些溶液以A1对应探针I、A2对应探针II、A3对应探针III、A4对应探针IV、A5对应空白同浓度丙烯酰胺凝胶使用37.5微米的点样针在氟代烷基硅烷处理过的选择的5种不同凹陷点阵列二维编码的PDMS模板上点样。

点样后，硅片被放置到事先放有TEMED潮湿的密封腔室中。密封腔中的压力降低至约1000帕斯卡（Pa），并在室温下保持0.5小时。在这种压力下，TEMED被气化并扩散到载玻片表面上以诱发丙烯酰胺和丙烯酰氧基之间的共聚得到含有探针I-探针IV的聚丙烯酰胺凝胶微颗粒。随后模板PDMS就在在室温Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液（TBE）中以20V/cm的电场电泳30分钟的以去除杂质。电泳在北京六一电泳仪器厂的40厘米长水平腔的DYCP-33A电泳槽中进行。模板硅片在电场中的位置是固定的，距离阴极约为5厘米。载玻片浸入深度为0.2厘米。电泳完成后，模板PDMS用水漂洗，然后用去离子水将这些微颗粒从模板PDMS上冲洗下来成为5种不同凸起微柱二维编码的微载体备用。

将上述5种不同编码的微颗粒与cy5修饰的已知基因型的三个样品的基因片断进行室温杂交2小时，随后用TBE缓冲液清洗并用德国zeiss激光共聚焦显微镜获取不同编码微颗粒的自然光照片和荧光照片。将自然光照片用编码时划分的网格与X轴及Y轴对齐并按照X轴从左至右Y轴从上至下方式依次读取微载体平面的编码以解码。这样结合荧光照片就可以基于不同凸起微柱二维编码微载体上有无cy5荧光而了解三个样品的氧化低密度脂蛋白受体1（OLR-1）的基因多态性。

实施例三

首先选定二维编码的基本单元尺寸为100微米。随后通过AUTOCAD软件绘制直径为600微米的圆形微载体平面并用间隔为100微米的网格对微载体平面进行划分。设定上三角形凸起编码值为1，而无上三角形凸起或者其余编码则为0。随后设定微载体平面上边缘处X轴由一条线上的两个个凸起编码基本单元组成及微载体平面侧边缘处Y轴则由与X轴垂直的一条线上的三个凸起编码基本单元组成。将X轴及Y轴组成方块中基本单元除X轴及Y轴外设定编码值为0，其它X轴及Y轴相邻基本单元的编码值也为0。随后按照X轴从左至右，Y轴从上至下的方式根据需要及至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则对微载体平面上剩余区域进行编码，编码完成后移除划分网格得到某种二维凸起图案编码微载体的俯视图。通过AUTOCAD软件在6英寸范围不同区域分别绘制间隔为500微米，直径为600微米不同编码微载体的模板阵列。然后通过喷墨打印机在投影片基上制备为模板。随后将道康宁SYLGARD184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，将其倒入含投影片基模板的平底烧杯中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得凹陷二维点编码的PDMS模板。随后将上述PDMS模板于氧等离子中处理30秒后用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟，得到低表面能的PDMS模板。另外配置含9.5%的丙烯酰胺，1%的甲叉双丙烯酰胺，5%的分子量为900的PEGDA，10%的甘油，直径为10纳米的四氧化三铁及1%的2-羟基-2-甲基苯丙酮的水溶液作为微载体反应液。其后使用博奥生物芯片公司的微阵列仪（中国）中的压电喷头喷墨点至凹陷点阵列编码的PDMS模板上。重复该过程使得每一个模板上均分配有微载体反应液。然后将通过功率为100瓦的紫外光源进行照射约15秒以促使微载体反应液聚合固化以成为水凝胶。随后通过蒸馏水将不粘模板上的含有上三角形形微柱点阵列编码的半球型水凝胶微载体冲至收集池中清洗备用。将上述含有上三角形微柱点阵列编码的半球型水凝胶微载体置于1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠（NaN₃）的1%BSA的PBS封闭液4℃冰箱封闭10h，37℃封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的二维微柱编码的半球形微载体。

通过同样方法分别批量制备不同二维上三角形微柱编码的乙型肝炎检测微载体及丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的二维上三角形微柱编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应1h并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。

实施例四

首先选定二维编码的基本单元尺寸为300纳米。随后通过AUTOCAD软件绘制直径为30微米的方形微载体平面并用间隔为1微米的网格对微载体平面进行划分。设定方形凸起编码值为1，而无方形凸起或者其余编码则为0。随后在微载体平面中心设定X轴由一条线上的3个凸起编码基本单元组成而Y轴则由相邻垂直的一条线上的2个凸起编码基本单元组成。设定X轴及Y轴相邻基本单元的编码值为0且X轴与Y轴组成的长方块中除X轴及Y轴外其它基本单元编码值均为0。随后按照X轴从左至右，Y轴从上至下的方式根据需要及至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则对微载体平面上剩余区域进行编码，编码完成后移除划分网格得到某种二维凸起图案编码微载体的俯视图。通过AUTOCAD软件在5英寸范围内不同区域分别绘制间隔为100微米，微载体直径为30微米，凸起编码高度为500纳米的不同编码微载体的模板阵列。然后将5英寸硅片在氧等离子处理30秒后浸入含1%的2-甲氧基聚乙二醇丙基三甲氧基硅烷（PEG硅烷偶联剂）的甲苯溶液中室温反应12小时后依次用甲苯、丙酮、乙醇、去离子水清洗后于氮气中干燥备用。随后将SU-8胶以3000转/分的速度涂布在PEG硅烷偶联剂处理过的硅片上，然后先在50摄氏度处理4分钟，再在90摄氏度处理10分钟。随后用德国Nanoscibe公司的三维激光真写系统导入AUTOCAD软件绘制的不同方形凸起微柱二维编码微载体的模板图并进一步利用其在涂布有SU-8胶的硅片上制备出基于绘制编码图案由交联SU-8胶构成的三维结构。随后将该硅片浸入SU-8胶显影液中处理得到由交联SU-8胶构成的有方形微柱二维编码的方形片状微颗粒。将该微颗粒通过丙酮、乙醇、去离子水依次清洗后用氮气干燥后备用。随后将某种二维编码的方形片状微颗粒用氨等离子处理30秒后通过1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升大肠杆菌O157抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠（NaN₃）的1%BSA的PBS封闭液4℃冰箱封闭10h，37℃封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测大肠杆菌O157的二维方形微柱编码的方形片状微载体。

通过同样方法分别批量制备不同二维方形微柱编码的金黄色葡萄球菌检测微载体、链球菌检测微载体及结核菌检测微载体。分别取7-8个连接了大肠杆菌O157抗体、金黄色葡萄球菌抗体、链球菌抗体及结核菌抗体的二维方形微柱编码交联SU-8胶方形片状微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的大肠杆菌O157抗体、金黄色葡萄球菌抗体、链球菌抗体及结核菌抗体溶液反应1h并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人是否受到大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、链球菌及结核菌的感染。

实施例五

首先选定二维编码的基本单元尺寸为2微米。随后通过AUTOCAD软件绘制直径为25微米的圆形微载体平面并用间隔为2微米的网格对微载体平面进行划分。设定圆形凸起编码值为1，而无圆形凸起或者其余编码则为0。随后设定微载体平面边缘处X轴由一条线上的三个凸起编码基本单元组成及Y轴则由相邻且与X轴垂直的一条线上的两个凸起编码基本单元组成。将X轴及Y轴组成方块中基本单元除X轴及Y轴外设定编码值为0，其它X轴及Y轴相邻基本单元的编码值也为0。随后按照X轴从左至右，Y轴从上至下的方式根据需要及至少存在一个周围均为0编码的凸起点编码的原则对微载体平面上剩余区域进行编码，编码完成后移除划分网格得到某种二维凸起图案编码微载体的俯视图。通过AUTOCAD软件以6英寸硅片为标的，在其不同区域分别绘制间隔为100微米，直径为25微米不同编码微载体的模板阵列。然后通过微电子工艺制备为掩模板并进一步通过等离子刻蚀工艺将100面的6英寸原硅片制备为硅基模板，刻蚀深度设置为5微米。随后将道康宁SYLGARD184硅橡胶的基本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，将其倒入含硅基模板的平底容器中，抽真空至无气泡，并于100℃条件下固化1.5h，冷却、脱模即得凸起编码的PDMS模板。随后将上述PDMS模板于氧等离子中处理30秒后用氟代烷基硅烷蒸汽处理30分钟，得到低表面能的PDMS模板。将该模板置于容器中并再次注入道康宁SYLGARD184硅橡胶溶液，其后通过真空除气泡及100摄氏度固化后，将新的PDMS模板与低表面能模板分离即获得由凹陷点阵列二维编码的PDMS模板。将该PDMS模板用氧等离子处理及氟代烷基硅烷处理后备用。随后将PMMA预聚液即含1%偶氮二异丁腈的甲基丙烯酸甲酯利用37.5微米的点样针从石英储液池中取液后通过显微镜校正后分配在某种如6D1-5E1-9E1-7F1-4G1凹陷点阵列编码的PDMS模板上。重复该过程使得每一个模板上均分配有微载体反应液。然后将通过功率为100瓦的紫外光源进行照射约30秒以促使微载体反应液聚合固化以成为PMMA。待PMMA固化后通过乙醇将不粘模板上的含有圆形微柱点阵列编码的圆形PMMA微载体冲至收集池中清洗备用。随后用氨等离子处理PMMA微载体30秒后将上述含有圆形微柱点阵列编码的微载体置于1%的戊二醛PBS溶液中室温处理6小时清洗后用含60微克/毫升甲型肝炎抗体的PBS缓冲液37摄氏度处理5小时并用PBS缓冲液清洗随后用含20mM叠氮化钠（NaN₃）的1%BSA的PBS封闭液4℃冰箱封闭10h，37℃封闭2h后用PBST溶液清洗得到能够检测甲型肝炎的6D1-5E1-9E1-7F1-4G1二维微柱编码的半球形微载体。

通过同样方法分别批量制备以2D1-6D1-9E1-7F1-4G1-7J1二维圆形微柱编码的乙型肝炎检测微载体及以8A1-5D1-2E1-9E1-4G1-8I1-6J1二维圆形微柱编码的丙型肝炎微载体。分别取7-8个连接了甲肝抗体、乙肝抗体及丙肝抗体的二维圆形微柱编码聚丙烯酰胺不倒翁微载体与人的血清样在37摄氏度混合反应2h后，用PBS缓冲液清洗，再与CY3荧光标记的甲肝抗体、乙肝抗体、丙肝抗体溶液反应1h并清洗，随后在荧光显微镜下即可基于不同编码微载体上荧光的有无判断该人血清是否含有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒。

Claims (5)

1.一种微载体二维编码方法，其特征在于该编码通过下述方法实现：

首先在300纳米至100微米范围内选定基本编码单元尺寸，然后将微载体平面根据基本编码单元尺寸进行划分，则在微载体平面上得到划分的网格，取完整的网格为基本单元；对微载体平面上划分得到的网格依照从左至右对一行内的基本单元排序，然后再按照从上至下的顺序对不同行进行排序；

设定凸起编码俯视形状并且设定其编码值为1，而其余编码值则为0，随后在微载体平面上划分的网格区域内划定二维编码读取顺序坐标体系XY轴，X轴与Y轴长度不同，在设定长或者短的为X轴的情况下，X轴或者Y轴由一条直线上的两个或者两个以上的凸起编码的基本单元组成且X轴与Y轴夹角为90度；此外为方便识别，设定当X轴与Y轴相邻时，X轴及Y轴其相邻基本单元编码均为0同时X轴基本单元与Y轴基本单元构成的方阵中除X轴及Y轴外，其它基本单元的编码均为0；而当X轴与Y轴分离时，X轴及Y轴其相邻基本单元编码均为0，X轴及Y轴选定在微载体平面的边缘或者中心；

其后在微载体平面的剩余区域内按照至少存在一个周围相邻基本单元编码值均为0编码的凸起点编码的原则依据X轴由左至右，Y轴由上至下的方式进行编码最终得到二维微柱阵列编码的微载体。

2.根据权利要求1所述的微载体二维编码方法，其特征在于所述凸起编码为相对于微载体平面凸出的微柱。

3.根据权利要求1所述的微载体二维编码方法，其特征在于所述凸起编码俯视形状呈现的规则几何结构包括：圆形、方形、菱形、上三角形，下三角形、五边形、六边形。

4.根据权利要求1所述的微载体二维编码方法，其特征在于所述二维微柱阵列编码的微载体，其解码过程为在获取微载体平面图像后首先确定X轴及Y轴，然后用编码时划分的网格与X轴及Y轴对齐并按照X轴从左至右及Y轴从上至下方式依次读取微载体平面的编码。

5.根据权利要求1所述的微载体二维编码方法，其特征在于所述二维微柱阵列编码的微载体用于多目标生物、化学信息检测。

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