CN103635191A - 小分子rna酶抑制剂和使用方法 - Google Patents

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P.D.奥尔森
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Abstract

本文描述了细菌核糖核酸酶(例如RnpA)的小分子抑制剂以及它们的合成和使用方法。使用所述化合物的方法包括治疗和预防微生物感染以及抑制细菌核糖核酸酶。本文还描述了鉴别用于治疗或预防微生物感染的化合物的方法。

Description

小分子RNA酶抑制剂和使用方法
优先权申请的交叉引用
本申请要求2011年1月26日提交的美国临时申请号61/436,342的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。
领域
本文中公开的主题大体涉及细菌核糖核酸酶(RNA酶)的小分子抑制剂以及它们的制备方法。此外，本文中描述的主题大体涉及使用本文中描述的小分子抑制剂来治疗和预防微生物感染的方法。
背景
金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)感染往往会牵涉高的发病率和死亡率(参见Shorr等，Crit Care Med，34：2588-2595(2006))。实际上，有报道估计在2005年所述生物体导致美国人的死亡数比HIV/AIDS更多(参见Bancroft，E.A.，Jama，298：1803-1804(2007)；Klevens等，Jama，298：1763-1771(2007))。耐万古霉素(vancomycin-resistant)、耐甲氧西林(methicillin-resistant)、耐多种药物和超毒力菌株的出现进一步增强了对新型抗生素的需要(参见Appelbaum，P.C.，Int JAntimicrob Agents，30：398-408(2007)；Zetola等，Lancet Infect Dis，5：275-286(2005))。细菌RNA加工和降解是需要的细胞过程，它们可用于抗微生物药物的发现。
对细菌RNA降解的许多了解是来自大肠杆菌(Escherichia coli)的研究，其中大量mRNA衰变(bulk mRNA decay)被认为是由全酶复合物(RNA降解体)催化的，全酶复合物由四个亚单元组成：RNA酶E(rne)、RNA解旋酶(rhlB)、烯醇酶(eno)和PNPase(pnpA)(参见Carpousis，A.J.，Annu Rev Microbiol，61：71-87(2007))。RNA酶E是必需的核糖核酸酶并且是降解体复合物的关键组分。它充当RNA降解体的其它成员组装的支架并且在底物降解期间催化初始的内核糖核酸分解事件(endoribonucleolytic event)(参见Mackie，G.A.，Nature，395：720-723(1998)；Vanzo等，Genes Dev，12：2770-2781(1998))。从它的本质上讲，可以认为RNA酶E是抗生素药物发现的一个适当的靶标。然而，许多革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括金黄色葡萄球菌(S.aureus))缺少RNA酶E氨基酸直系同源基因(参见Condon，C.，Microbiol Mol Biol Rev，67：157-174(2003))。因此，它们的降解组分和mRNA衰变机制较少被了解。
最近的研究表明，至少两种核糖核酸酶(RNA酶J1和RNA酶Y)促进枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及推测的其它革兰氏阳性细菌内的大量mRNA降解。枯草杆菌核糖核酸酶J1是一种双功能的核糖核酸酶，它具有5′核酸外切酶和核酸内切酶活性，在体外介导mRNA降解(参见Even等，Nucleic Acids Res，33：2141-2152(2005)；Mathy等，Cell，129：681-692(2007))。还发现所述酶与烯醇酶(大肠杆菌RNA降解体的一种组分)相互作用，并且RNA酶J1耗尽的枯草杆菌菌株显示mRNA衰变适度减少，表明它可能是大肠杆菌RNA酶E的功能等效物(参见Even等，Nucleic Acids Res，33：2141-2152(2005)；Commichau等，Mol Cell Proteomics，8：1350-1360(2009)；Mader等，Mol Microbiol，70：183-196(2008))。然而，mRNA转换仍然在RNA酶J1减少的细胞中发生，并且含有5′强发夹结构的RNA物质不可被所述酶有效降解，表明其它因素可能促进枯草杆菌细胞RNA降解(参见Yao等，Rna，15：2331-2339(2009))。核糖核酸酶Y是最近鉴别出的核酸内切酶，它可能在表面上与RNA酶J1协同起作用来介导大量RNA衰变。RNA酶Y可以裂解含有高阶二级结构的mRNA分子并且全面影响细胞信使RNA转换(参见Shahbabian等，Embo J，28：3523-3533(2009))。RNA酶J1和RNA酶Y都是必需的酶，并且在那一方面，可被认为是抗微生物药物发现的靶标(参见Kobayashi等，Proc Natl Acad SciUSA，100：4678-4683(2003))。然而，有待观察RNA酶J1、RNA酶Y和/或先前未表征的核糖核酸酶是否调控金黄色葡萄球菌内的mRNA衰变。
概述
正如本文中体现和广泛描述的，根据所公开的物质、化合物、组合物、套件和方法的目的，所公开的主题涉及组合物、制备所述组合物的方法和使用所述组合物的方法。更具体来说，本文中提供适用作细菌核糖核酸酶(RNA酶)抑制剂的化合物和组合物。一类RNA酶抑制剂包括具有以下结构的化合物：
Figure BDA0000387472710000031
和其可药学上可接受的盐和前药。在这些化合物中，
Figure BDA0000387472710000032
是单键或双键；A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；并且R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基。R6和R7可以任选组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。在这类化合物中，如果
Figure BDA0000387472710000041
是双键，A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8和A10是CH，A3是-CCO2H，R4、R7和R8各自是氢，R5和R6是甲基，并且R3是氰基，那么A9不是-CBr。
本文中还提供包括一种或多种如上所述的化合物和可药学上可接受的载体的组合物。
本文中进一步提供治疗或预防受试者的微生物感染的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的具有以下结构的RNA酶抑制剂：
Figure BDA0000387472710000042
或其可药学上可接受的盐或前药。在这些化合物中，
Figure BDA0000387472710000043
是单键或双键；A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；并且R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基。任选地，R6和R7可以组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。在一些实例中，所述RNA酶抑制剂是
Figure BDA0000387472710000051
在一些实施方案中，微生物感染是细菌感染。细菌感染可以是例如革兰氏阳性细菌感染。任选地，细菌感染是葡萄球菌(Staphylococcus)感染，例如像金黄色葡萄球菌感染。金黄色葡萄球菌感染可以是耐药性金黄色葡萄球菌感染或生物膜相关的金黄色葡萄球菌感染。在一些实例中，RNA酶抑制剂是RnpA抑制剂。任选地，所述方法可以进一步包括向受试者施用第二化合物，其中所述第二化合物是抗菌化合物。
本文中还提供抑制细菌核糖核酸酶的方法，所述方法包括使所述细菌核糖核酸酶与有效量的RNA酶抑制剂接触。在一些实施方案中，所述RNA酶抑制剂是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0000387472710000052
或其可药学上可接受的盐或前药。在这些化合物中，
Figure BDA0000387472710000053
是单键或双键；A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；并且R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基。任选地，R6和R7组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。
任选地，细菌核糖核酸酶是金黄色葡萄球菌RNA酶P的蛋白质组分(例如，RnpA)。所述接触可以发生在例如体内或体外。
本文中进一步提供鉴别用于治疗或预防微生物感染的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：组合RNA、RnpA和荧光染料来形成混合物；使所述混合物与所述化合物接触；以及使用荧光监测细胞中RnpA介导的总细菌RNA降解，其中与对照相比，荧光减少指示RNA降解。在这种方法中，与对照相比，减少RnpA介导的总细菌RNA降解的化合物被鉴定为用于治疗或预防微生物感染的化合物。
其它优点将部分在随后的描述中阐述，并且部分根据所述描述将是显而易见的，或可以通过实践下面描述的方面知悉。借助于随附的权利要求书中特别指出的要素和组合，将认识和实现下面描述的优点。应理解，上述一般描述和以下详细描述都只是示例和说明，而不作限制。
附图简述
图1是示出以下的图：在指数期生长和/或静止期生长期间(X轴)具有≤2.5分钟、5分钟、15分钟、30分钟或>30分钟的半衰期的可检测mRNA物质的百分比(Y轴)。
图2显示金黄色葡萄球菌RnpA催化rRNA和mRNA消化。图A是纯化的重组型金黄色葡萄球菌RnpA的SDS-PAGE；示出分子标记(色带M)、2.5μg洗脱产物和25μg洗脱产物(分别是色带1和色带2)。图B描绘在不存在(-)或存在(+)50pmol的各种假定的核糖核酸酶(指定的)的1X反应缓冲液(2mM NaCl、2mM MgCl2、50mM Tris-HCl，pH6.0)中孵育60分钟之后，1μg总金黄色葡萄球菌RNA的凝胶迁移率。图C展示在不存在(0pmol)或存在指定量的RnpA蛋白的1X反应缓冲液中孵育60分钟之后，0.5pmol体外转录的spa mRNA的迁移率。示出了分子量标记(M)。图D示出在不存在(-)或存在(+)50pmol RnpA或RNA酶J1以及不存在(只有血清)或存在1μg、2.5μg、5μg、10μg或20μg RnpA多克隆抗体下，2μg体外转录的spamRNA的逆转录介导的PCR产物。图E示出在转录中止后0分钟(X轴)和10分钟(Y轴)在GeneChip上测量的所有mRNA物质的经过绘图的测量结果。灰色虚线指示各个样品的灵敏度下限。
图3，图A示出代表性的筛选工作结果。图B示出基于琼脂糖凝胶的测定，它描绘在不存在(-)或存在(+)20pmol RnpA下的分子量标记spa mRNA的凝胶迁移率，以及在存在递增浓度的RNPA1000下的RnpA介导的spamRNA降解。图C示出RnpA抑制分子RNPA1000的结构。
图4，图A示出暴露于化合物溶剂(DMSO；阴性对照)、丝裂霉素C(Mitomycin C)(阳性对照)和指定量的RNPA1000的HepG2细胞的MTT细胞毒性测定结果。图B示出在无处理(实心菱形；阴性对照)、万古霉素处理(实心正方形；1mg/kg；阳性对照)或RNPA1000处理；64mg/kg(空心圆)；128mg/kg(空心正方形)，256mg/kg(空心三角形)之后的平均每天(X轴)存活动物百分比(Y轴)。图C示出在无抗微生物处理(未处理；UT)或暴露于5倍、10倍或20倍的RNPA1000的MIC之后1天、2天或3天的导管相关的金黄色葡萄球菌的数目。方框界定第25百分位和第75百分位之间的间隔。向上延伸的条形指示由比第75百分位高1.5倍的值界定的边界，而向下延伸的那些指示由第25百分位的1/1.5的值界定的边界。实心圆指示在这两个极限外部的单个值。
图5描绘在转录中止后0分钟和5分钟所有GeneChip检测的转录物水平的图。灰色虚线指示各个样品的灵敏度下限。图A示出DMSO处理的细胞的mRNA水平的比较(左图)和用亚抑制浓度的RnpA抑制剂激发的细胞的mRNA水平的比较(右图)。图B示出微量滴定板测定，它说明了在2.5μm CdCl2存在下生长时，指定浓度的RNPA1000(横越顶部(across top))针对金黄色葡萄球菌RN4220pRNPA-A.S.(RnpA耗尽的细胞；上图)、RN4220pRNPA(RnpA过表达细胞；中图)和RN4220pCN51(载体；下图)的体外抗微生物作用。所有菌株都评估两次；箭头指示MIC值。
图6，图A描绘含有载体(pCN51；菱形)、rnpA正义RNA(pRNPA-S；三角形)和rnpA反义RNA(pRNPA-A.S.；正方形)的金黄色葡萄球菌菌株RN4220当在10μm CdCl2存在下生长时的生长特征图(光学密度；Y轴)。图B示出在2.5μm CdCl2存在下生长的金黄色葡萄球菌菌株RN4220pCN51(载体)、RN4220pRNPA(过表达者)和RN4220pRNPA-A.S.(耗尽RnpA的)细胞的蛋白质印迹(Westernblotting)结果。
图7示出金黄色葡萄球菌时间杀灭测定(time-kill assay)结果。图A描绘用0.25倍、0.5倍、1倍、2倍或4倍RNPA1000的MIC处理的金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1细胞的指数期中期(mid-exponentialphase)。绘制的是对于各个测试的药物浓度(n=3)在添加RNPA1000后0小时、2小时、4小时、8小时和24小时的平均cfu/ml；示出标准偏差。图B示出指数期中期细胞被苯唑西林处理(0.25倍、0.5倍、2倍或4倍MIC；n=3)后2小时、4小时、8小时和24小时的平均cfu/ml。图C示出指数期中期细胞被0.5倍的RNPA1000的MIC、苯唑西林或两者(RNPA1000和苯唑西林)处理。示出的是处理(n=3)后2小时、4小时、8小时和24小时之后的指数期中期细胞的平均cfu/ml；示出标准偏差。
图8是示出使用具有默认参数的GramAlign对RnpA的氨基酸序列进行比对的表。保守的氨基酸加了方框。金黄色葡萄球菌的序列是SEQ ID NO.1；表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是SEQ ID NO.2；肺炎链球菌(S.pneumonia)是SEQ ID NO.3；化脓放线菌(S.pyogenes)是SEQID NO.4；粪肠球菌(E.faecalis)是SEQ ID NO.5；大肠杆菌是SEQ IDNO.6；以及鲍氏不动杆菌(A.baumannii)是SEQ ID NO.7。
详细描述
本文中提供细菌RnpA相关的核糖核酸酶(RNA酶)活性的小分子抑制剂、它们的制备方法以及它们在治疗和预防微生物感染中的使用方法。所述小分子抑制剂利用新型的治疗微生物感染(如金黄色葡萄球菌)的机制，其涉及必需的金黄色葡萄球菌蛋白、RnpA、催化rRNA和mRNA消化。这种机制在过去没有被知晓或开发。利用这种活性，采用高通量和次级筛选测定来鉴别RnpA介导的RNA降解的小分子抑制剂。这些药剂限制细胞mRNA降解并且针对一些微生物显示抗微生物活性，这些微生物包括遍及美国传播的优势的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)系、万古霉素中敏金黄色葡萄球菌(vancomycinintermediate susceptible S.aureus；VISA)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)和RnpA氨基酸高度保守的其它革兰氏阳性细菌病原体(参见McDougal等，J Clin Microbiol，41：5113-5120(2003))。如本文中提供的，RnpA抑制剂在全身性小鼠感染模型中限制疾病并且针对生物膜相关的金黄色葡萄球菌具有抗微生物活性。总而言之，这些发现表明RnpA在金黄色葡萄球菌RNA降解中发挥作用，证明高通量筛选可以用于鉴别mRNA转换抑制剂，并且为基于RNA分解代谢的抗微生物疗法提供原理证据。
通过参考公开主题的特定方面的以下详细描述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本文中描述的物质、化合物、组合物、物品和方法。
在公开和描述本发明的物质、化合物、组合物、套件和方法之前，应理解下面描述的方面不限于特定的合成方法或特定的试剂，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体的方面而不希望进行限制。
此外，贯穿本说明书参考了多种出版物。为了更充分地描述所公开之物的所属领域的现状，将这些出版物的公开内容以引用的方式整体并入本申请。由于在参考文献所依赖的句子中讨论的包含于这些参考文献中的物质，公开的参考文献也单独地并且特定地以引用的方式并入本文。
一般定义
在本说明书和随后的权利要求书中，将会提及若干术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
贯穿本说明书的描述和权利要求书，词语“包含(comprise)”和所述词语的其它形式，如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”表示包括但不限于并且不希望排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。
除非上下文另外明确规定，否则在描述和随附的权利要求书中使用的单数形式“一个(种)”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种这些组合物的混合物，提及“所述化合物”包括两种或更多种这些化合物的混合物，等。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。
在本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表示这样一个范围时，另一个方面包括从一个具体值和/或至其它具体值。类似地，当值通过使用先行词“约”被表示为近似值时，应理解所述具体值形成另一方面。应进一步理解，每个范围的端点相对于其它端点都是有意义的，并且独立于其它端点。还应理解，本文中公开了若干值，并且除了所述值本身之外，每个值还在本文中公开为“约”那个具体值。例如，如果公开值“10”，那么还公开“约10”。还应理解，当一个值被公开时，那么还公开了“小于或等于”所述值、“大于或等于所述值”和介于值之间的可能范围，本领域技术人员可恰当地理解这一点。例如，如果公开了值“10”，那么还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，贯穿本申请，数据是以若干不同形式提供的，并且这数据表示端点和起点以及所述数据点的任何组合的范围。例如，如果公开具体数据点“10”和具体数据点“15”，应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15，以及公开了10和15之间。还应理解，还公开了介于两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么还公开了11、12、13和14。
本文中使用的“受试者”表示个体。因此，“受试者”可以包括驯化动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和禽类。“受试者”还可以包括哺乳动物，如灵长类动物或人。
“减少(reduce)”或所述词语的其它形式，如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”表示事件或特征(例如，细菌感染)的降低。应理解，这通常是相对于一些标准或预期值，换句话说，它是相对的，但是它对于待提及的标准或相对值来说并不总是必需的。例如，“减少细菌感染”表示相对于标准或对照减少细菌感染的传播。
“预防(prevent)”或所述词语的其它形式，如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”表示终止具体的事件或特征，稳定或延迟具体事件或特征的发展或进展，或使具体事件或特征发生的机会最小化。预防不需要与对照比较，因为它通常比例如减少更绝对。如本文中使用的，某事可以被减少但不可预防，但是被减少的某事也可以得到预防。同样地，某事可以被预防但是不可减少，但是被预防的某事也可以得到减少。应理解，使用减少或预防时，除非特别指出，否则也明确地公开其它词语的使用。
“治疗(treat)”或所述词语的其它形式，如“经过治疗的(treated)”或“治疗(treatment)”表示为了减少、预防、抑制或消除具体的特征或事件(例如，细菌感染)而施用某组合物或执行方法。术语“控制”可与术语“治疗”同义使用。
“抗微生物”表示以任何浓度治疗或控制(例如，减少、预防、抑制或消除)微生物生长的能力。类似地，术语“抗菌”是指以任何浓度治疗或控制细胞细菌生长的能力。
应理解，贯穿本说明书，使用标识符“第一”和“第二”仅仅是为了帮助区分公开的主题的各种组分和步骤。标识符“第一”和“第二”不希望暗含由这些术语修饰的组分或步骤的任何具体的顺序、量、优先性或重要性。
化学定义
本文中使用的术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在一个广泛的方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支链和非支链、碳环和杂环以及芳族和非芳族取代基。说明性的取代基包括例如下面描述的取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个以及相同或不同的。为了本公开的目的，如氮的杂原子可以具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文中描述的有机化合物的任何可允许的取代基。本公开不希望以任何方式受有化合物的可允许的取代基的限制。此外，术语“取代”或“被...取代”包括隐含条件，即这种取代符合被取代原子和取代基的允许化合价，并且取代产生稳定化合物，例如不会自发地如通过重排、环化、消除等进行转化的化合物。
“Z1”、“Z2”、“Z3”和“Z4”在本文中用作表示多种特定取代基的通用符号。这些符号可以是任何取代基，不局限于本文中公开的那些，并且当它们在一种情况下被定义为某些取代基时，在另一种情况下，它们可以被定义为一些其它取代基。
本文中使用的术语“脂肪基”是指非芳族烃基并且包括支链和非支链的烷基、烯基或炔基。
本文中使用的术语“烷基”是具有1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基也可以是取代的或未取代的。烷基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代(sulfo-oxo)、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。
贯穿本说明书，“烷基”通常用于指未取代的烷基和取代的烷基；然而，在本文中取代的烷基也通过鉴别在所述烷基上的特定取代基来特定地提及。例如，术语“卤代烷基”特定地指被一个或多个卤素(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”特定地指被一个或多个如下所述的烷氧基取代的烷基。术语“烷氨基”特定地指被一个或多个如下所述的氨基取代的烷基，等。当在一种情况下使用“烷基”并且在另一种情况下使用如“烷基醇”的特定术语时，它不意味着暗示术语“烷基”不也是指如“烷基醇”等的特定术语。
这一惯例也适用于本文中描述的其它基团。也就是说，虽然如“环烷基”的术语同时指未取代的和取代的环烷基部分，但是取代的部分可以此外在本文中被特定地鉴别；例如，具体的取代的环烷基可被称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可被特定地称为例如“卤代烷氧基”，具体的取代的烯基可被称为例如“烯基醇”等。此外，使用一般术语(如“环烷基”)和特定术语(如“烷基环烷基”)这一惯例不意味着暗示一般术语不会也包括特定术语。
本文中使用的术语“烷氧基”是通过单个末端醚键结合的烷基；也就是说，“烷氧基”可被定义为-OZ1，其中Z1是如上定义的烷基。
本文中使用的术语“烯基”是具有2至24个碳原子的结构式含有至少一个碳碳双键的烃基。如(Z1Z2)C=C(Z3Z4)的不对称结构意图同时包括E异构体和Z异构体。这可以在存在不对称烯烃的本文结构式中推测出，或它可以通过键符号C=C明确指示。烯基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。
本文中使用的术语“炔基”是具有2至24个碳原子的结构式含有至少一个碳碳三键的烃基。炔基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。
本文中使用的术语“芳基(aryl)”是含有任何基于碳的芳基(aromatic group)的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯氧基苯等。术语“杂芳基”定义为含有具有至少一个并入芳基环内的杂原子的芳基的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。术语“非杂芳基”包括在术语“芳基”中，它定义含有不含杂原子的芳基的基团。芳基或杂芳基可以是取代的或未取代的。芳基或杂芳基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。术语“联芳基”是一种特定类型的芳基，并且包括在芳基的定义中。联芳基是指通过稠环结构(如在萘中)结合在一起或通过一个或多个碳碳键连接(如在联苯基中)的两个芳基。
本文中使用的术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的基于非芳族碳的环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基，其中环的至少一个碳原子被杂原子(如但不限于氮、氧、硫或磷)取代。环烷基和杂环烷基可以是取代的或未取代的。环烷基和杂环烷基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。
本文中使用的术语“环烯基”是由至少三个碳原子组成并且含有至少一个双键(即，C=C)的基于非芳族碳的环。环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语“杂环烯基”是一类如上定义的环烯基，并且包括在术语“环烯基”的含义内，其中所述环的至少一个碳原子被杂原子(如但不限于氮、氧、硫或磷)取代。环烯基和杂环烯基可以是取代的或未取代的。环烯基和杂环烯基可以被一个或多个基团取代，这些基团包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基，如下所述。
本文中使用的术语“环基”是指芳基、非芳基(即，环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)或两者。环基具有一个或多个可以被取代的或未取代的环系统。环基可以含有一个或多个芳基、一个或多个非芳基，或一个或多个芳基和一个或多个非芳基。
本文中使用的术语“醛”由式-C(O)H表示。贯穿本说明书“C(O)”或“CO”是C=O的速记符号。
本文中使用的术语“胺”或“氨基”由式-NZ1Z2表示，其中Z1和Z2可以各自是本文中描述的取代基团，如上述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“羧酸”由式-C(O)OH表示。本文中使用的“羧酸根”或“羧基”由式-C(O)O-表示。
本文中使用的术语“酯”由式-OC(O)Z1或-C(O)OZ1表示，其中Z1可以是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“醚”由式A1OA2表示，其中A1和A2可以独立地是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“酮”由式Z1C(O)Z2表示，其中Z1和Z2可以独立地是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“羟基”由式-OH表示。
本文中使用的术语“硝基”由式-NO2表示。
本文中使用的术语“硅烷基”由式-SiZ1Z2Z3表示，其中Z1、Z2和Z3可以独立地是上述的氢、烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“磺酰基”是指由式-S(O)2Z1表示的磺基-氧代基团，其中Z1可以是上述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
本文中使用的术语“磺酰氨基”或“磺酰胺”由式-S(O)2NH-表示。
本文中使用的术语“巯基”由式-SH表示。
本文中使用的术语“硫基”由式-S-表示。
本文中使用的“R1”、“R2”、“R3”、“Rn”等，其中n是某个整数，可以独立地具有一个或多个上文列出的基团。例如，如果R1是直链烷基，那么所述烷基的氢原子之一可以任选被羟基、烷氧基、胺基、烷基、卤化物等取代。取决于所选择的基团，可以将第一基团并入第二基团，或者第一基团可以悬挂(即，连接)在第二基团上。例如，对于短语“包含氨基的烷基”，所述氨基可以被并入烷基骨架内。或者，可以将氨基连接至烷基的骨架。所选择的基团的性质将决定第一基团是否被嵌入或连接至第二基团。
除非相反规定，否则化学键只以实线示出而不是以楔形或虚线示出的化学式涵盖各种可能的异构体，例如各对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物，以及异构体的混合物，如外消旋或部分消旋(scalemic)的混合物。
现将详细参考公开的物质、化合物、组合物、物品和方法的特定方面，其实例在随附的实施例中说明。
化合物
本文中描述的细菌核糖核酸酶(RNA酶)的小分子抑制剂包括由式I表示的化合物：
Figure BDA0000387472710000181
和其可药学上可接受的盐和前药。
在式I中，
Figure BDA0000387472710000182
是单键或双键。
同样在式I中，A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1。每个R1可以独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基。任选地，A1、A2、A3、A4和A5中的一个或多个是CH。在一些实施方案中，A3是-CCO2H。
此外在式I中，A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2。每个R2可以独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基。任选地，A6、A7、A8、A9和A10中的一个或多个是CH。在一些实施方案中，A9是CBr。在一些实施方案中，A8是CBr。
同样在式I中，R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基。任选地，R3是氰基。在一些实施方案中，R5和R6是甲基。
此外在式I中，R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基。
在式I中，相邻的R基团(例如，R6和R7)可以组合形成取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的环炔基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的杂环烯基或取代的或未取代的杂环炔基。例如，R6可以是取代的或未取代的亚乙基并且R7可以是取代的或未取代的亚丙基，它们组合形成取代的或未取代的苯基。在这些实例中，R6和R7组合形成结构I-A，即，吲哚实施方案：
任选地，结构I-A中的吲哚的苯基环可以被R9取代。在结构I-A中，R9选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基。
在式I的一些实例中，A1、A2、A3、A4和A5中每一个都是CH，从而形成结构I-B。在式I的其它实例中，A6、A7、A8、A9和A10中每一个都是CH，从而形成结构I-C。在式I的又一些其它实例中，A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10中每一个都是CH，从而形成结构I-D。
任选地，根据式I的化合物包括烯酮并且是根据结构I-E的化合物。在一些实施方案中，烯酮被还原形成根据结构I-F的化合物。
Figure BDA0000387472710000202
在一些实施方案中，式I中的A3是如结构I-G所示的-CCO2H：
Figure BDA0000387472710000211
在式I的一些实例中，如果
Figure BDA0000387472710000212
是双键，A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8和A10是CH，A3是-CCO2H，R4、R7和R8各自是氢，R5和R6是甲基，并且R3是氰基，那么A9不是-CBr。
式I的一个具体实例是化合物RNPA-1000：
Figure BDA0000387472710000213
药物组合物
可以在药物组合物中提供本文中描述的化合物或其衍生物。取决于预定的施用模式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式，例如像片剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体或混悬液，优选是适于单次施用精确剂量的单位剂型。所述组合物将包括治疗有效量的本文中描述的化合物或其衍生物，联合可药学上可接受的载体，并且此外可以包括其它药用剂、医药剂、载体或稀释剂。可药学上可接受的表示不是生物学上或在其它方面不希望的物质，它可以连同选择的化合物一起向个体施用而不会以有害的方式与含有它的药物组合物的其它组分引起不可接受的生物作用或相互作用。
本文中使用的术语载体涵盖任何赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物配制的其它物质。用于组合物的载体的选择取决于组合物的预定施用途径。含有这些物质的可药学上可接受的载体和制剂的制备在例如University of the Sciences in Philadelphia，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia Pa-，2005编著的Remington′s Pharmaceutical Sciences，第21版中有描述。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和具有其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天门酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM(ICI，Inc.；Bridgewater，New Jersey)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM(BASF；Florham Park，NJ)。
适于肠外注射的含有本文中描述的化合物或其衍生物的组合物可以包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液，以及用于复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌散剂。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或煤介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可以如下维持适当的流动性：例如通过使用如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止微生物作用可以通过各种抗菌和抗真菌剂来促进，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可以包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可注射药物形式的长久吸收可以通过使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
用于口服施用本文中描述的化合物或其衍生物的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在这些固体剂型中，本文中描述的化合物或其衍生物与以下混合：至少一种惰性的常用赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或(a)填料或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐(alignate)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐，和碳酸钠，(e)溶液缓凝剂，例如石蜡，(f)吸收加速剂，例如季铵化合物，(g)润湿剂，例如十六醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软填充和硬填充明胶胶囊中用作填料。
如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以制备成具有包衣和壳，如肠溶衣和本领域熟知的其它物质。它们可以含有遮光剂并且也可以是在肠道某个部分以延迟的方式释放一种或多种活性化合物的那些组合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。活性化合物也可以是微囊封形式，如果合适，可具有一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用本文中描述的化合物或其衍生物的液体剂型包括可药学上可接受的乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类，具体来讲是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂之外，所述组合物还可以包括其它试剂，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。
除了活性化合物之外，混悬液还可以含有其它试剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶，或这些物质的混合物等。
用于直肠施用的本文中描述的化合物或其衍生物的组合物任选是栓剂，它可以通过使所述化合物与适合的无刺激性赋形剂或载体(如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，它们在常温下是固体但是在体温是液体，因此在直肠或阴道腔中熔融并且释放活性组分。
用于表面施用本文中描述的化合物或其衍生物的剂型包括软膏、散剂、喷雾剂和吸入剂。本文中描述的化合物或其衍生物是在无菌条件下与生理学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合的。眼用制剂、软膏、散剂和溶液也涵盖在所述组合物的范畴之内。
所述组合物可以包括一种或多种本文中描述的化合物和可药学上可接受的载体。本文中使用的术语可药学上可接受的盐是指在合理的医学判断的范畴内的本文中描述的化合物或其衍生物的那些盐，它们适用于与受试者的组织接触而没有不当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的益处/风险比率相称，并且对于它们的预定用途来说有效，以及可能时是指本文中描述的化合物的两性离子形式。术语盐是指本文中描述的化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在分离和纯化所述化合物期间原位制备或通过单独使游离碱形式的纯化化合物与适合的有机酸或无机酸反应并分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐，棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐、甲烷磺酸盐和十二烷基磺酸盐等。它们可以包括基于碱金属和碱土金属(如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲胺、四乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(参见S.M.Barge等，J.Pharm.Sci.(1977)66，1，至少关于本文中教导的组合物，将所述参考文献以引用的方式整体并入本文)。
向受试者施用本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐可以使用治疗有效量的本文中描述的化合物和组合物或本文描述的其可药学上可接受的盐持续有效治疗病症的时间段来进行。
本文中描述的化合物和组合物或本文中描述的其可药学上可接受的盐的有效量可以由一般技艺人士确定，并且对于哺乳动物来说包括每天每千克体重约0.5mg至约200mg活性化合物的示例性剂量，这可以用单次剂量或用单独的分次剂量的形式施用，如每天1至4次。或者，剂量可以是每天每千克体重约0.5mg至约150mg活性化合物、每天每千克体重约0.5mg至100mg活性化合物、每天每千克体重约0.5mg至约75mg活性化合物、每天每千克体重约0.5mg至约50mg活性化合物、每天每千克体重约0.5mg至约25mg活性化合物、每天每千克体重约1mg至约20mg活性化合物、每天每千克体重约1mg至约10mg活性化合物、每天每千克体重约20mg活性化合物、每天每千克体重约10mg活性化合物，或每天每千克体重约5mg活性化合物。当用于描述方法中化合物的量时，措辞有效量是指实现希望的药理学作用或其它作用的化合物的量，例如引起细菌酶抑制的量。
本领域技术人员将理解，对于任何具体的受试者来说，特定的剂量水平和给药频率可以改变，并且将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、那种化合物的代谢稳定性和作用时长、受试者的物种、年龄、体重、总的健康状况、性别和饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合和具体病状的严重度。
制备化合物的方法
如本领域技术人员所了解，本文中描述的化合物可以用有机合成领域技术人员已知的各种方式或其变化形式来制备。本文中描述的化合物可以从易得的起始物质制备。最优的反应条件可以随使用的具体反应物或溶剂而变，但是这些条件可以由本领域技术人员确定。
式I的变化包括添加、去除或移动针对各化合物描述的各种组元(constituent)。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，分子的手性可以变化。此外，化合物合成可能涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的使用以及适当的保护基的选择可以由本领域技术人员确定。保护基化学可以见于例如Wuts和Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第4版，Wiley & Sons，2006中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
制备公开的化合物和组合物中使用的起始物质和试剂是从如以下的商业供应商购得：Aldrich Chemical Co.，(Milwaukee，WI)、AcrosOrganics(Morris Plains，NJ)、Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)、Sigma(St.Louis，MO)、Pfizer(New York，NY)、GlaxoSmithKline(Raleigh，NC)、Merck(Whitehouse Station，NJ)、Johnson & Johnson(NewBrunswick，NJ)、Aventis(Bridgewater，NJ)、AstraZeneca(Wilmington，DE)、Novartis(Basel，Switzerland)、Wyeth(Madison，NJ)、Bristol-Myers-Squibb(New York，NY)、Roche(Basel，Switzerland)、Lilly(Indianapolis，IN)、Abbott(Abbott Park，IL)、Schering Plough(Kenilworth，NJ)或Boehringer Ingelheim(Ingelheim，Germany)，或者是按照如以下的参考文献中阐述的程序，通过本领域技术人员已知的方法制备：Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，第1-17卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd′s Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷和增刊(Elsevier Science Publishers，1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons，1991)；March′s Advanced OrganicChemistry，(John Wiley and Sons，第4版)；和Larock′s ComprehensiveOrganic Transformations(VCH Publishers Inc.，1989)。其它物质，如本文中公开的药物载体可以从商业来源获得。
制备本文中描述的化合物的反应可以在溶剂中进行，溶剂可以由有机合成领域的技术人员选择。溶剂在反应进行的条件下(即，温度和压力)大致上不与起始物质(反应物)、中间体或产物起反应。反应可以在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。产物或中间体形成可以根据本领域已知的任何适合的方法来监测。例如，产物形成可以通过光谱方法来监测，如核磁共振光谱法(例如1H或13C)红外光谱法、分光光度法(例如UV-可见光)或质谱，或通过色谱法(如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法)来监测。
具有各种不同基团的RNAP1000的类似物可以使用若干已知的合成方案来制备(Jendralla等，J.Med.Chem.，33(1)：61-70(1990))，包括方案1中的反应步骤。步骤1中所示的缩合可以使用微波技术加速(He等，J.Org.Chem.，7：1150-1157(2011))。向方案1中示出的R1位并入离去基团(如溴基)允许通过过渡金属催化的化学过程(如铃木(Suzuki)和布赫瓦尔德(Buchwald)缩合)进一步同系化(homologation)。
在步骤3中示出的诺文格尔反应(Knoevenagal reaction)可能预期产生立体异构体的混合物，但是异构体可以通过色谱法分离并且对应的(Z)异构体和(E)异构体可被单独转化成最终目标，从而提高了多样性集合。
方案1：
Figure BDA0000387472710000281
额外的多样性可以通过改变通用方案中的试剂来获得。用同系二酮取代丙烷-2,5-二酮将允许探索与吡咯核相邻的其它结合相互作用(方案2)。维尔斯迈尔-哈克甲酰化(Vilsmeier-Haack formylation)可以得到区域异构体的混合物，它们可以通过色谱法分离(Manetti等，ChemMedChem，1(9)：973-989(2006))并且单独转化成最终目标化合物。吲哚类似物可以使用类似的方案从已知的吲哚-3-甲醛制备(Khan等，Journal of Heterocyclic Chemistry，16(5)：997-999(1979))。
方案2：
Figure BDA0000387472710000282
腈的作用可以通过用抗转氨作用的受保护的丙二酸二酯(如方案3中示出的叔丁酯)取代丙二腈来研究。脱保护获得中间体酸，它可以被进一步精制来探索所述分子区域周围的SAR。最后，还原从诺文格尔反应(例如方案3步骤3)获得的加合物的双键提供有和没有烯酮部分的类似物。外消旋混合物可以通过手性HPLC测试，并且随后进行分离。
方案3：
活性测定
本文中提供鉴别用于治疗或预防微生物感染的化合物的方法。所述方法可以包括制备本文中描述的化合物或组合物以及测定所述化合物或组合物针对细菌核糖核酸酶(如RNA酶P)的抑制活性。RNA酶P是一种普遍存在的酶，它催化前体tRNA的5′端的成熟(参见Frank等，Annu Rev Biochem，67：153-180(1998)；Kazantsev等，Nat RevMicrobiol，4：729-740(2006)；Walker等，Crit Rev Biochem Mol Biol，41：77-102(2006))。所述酶由于是一种核糖核蛋白复合物(它包括单个核糖酶RNA分子和至少一种蛋白质组分)的这一事实，所以是独特的。在细菌内，核糖酶(rnpB)和蛋白质(RnpA)组分都是细胞活力所需要的；rnpB在体外介导tRNA加工，而RnpA还没有稳固确立功能(参见Gossringer等，J Bacteriol，188：6816-6823(2006)；Schedl等，ProcNatl Acad Sci USA，70：2091-2095(1973)；Waugh等，JBacteriol，172：6316-6322(1990))。域检索(参见Letunic等，Nucleic Acids Res，34：D257-260(2006)；Schultz等，Proc Natl Acad Sci USA，95：5857-5864(1998))揭示金黄色葡萄球菌RnpA残基40-111与核糖核酸酶样基序最一致。此外，一些RNA结合位点包埋在这个区域内(参见Spitzfaden等，J Mol Biol，295：105-115(2000))。已经发现大肠杆菌和枯草杆菌RNA酶P消化某些双股RNA模板，如向导RNA和4.5s RNA(参见Lundblad等，Proc Natl Acad Sci USA，105：2354-2357(2008))。那些模板的裂解严格地需要RnpA(参见Liu等，Cell，77：1093-1100(1994)；Marvin等，J Cell Biochem，108：1244-1251(2009))。如本文中提供的，RNA酶P介导的RNA消化可能取决于rnpB、RnpA或两者。因此，RnpA调控金黄色葡萄球菌RNA降解。
RNA降解可用于鉴别适合抑制细菌核糖核酸酶，因此适用于治疗或预防微生物感染的化合物。在一些实施方案中，可以使用基于荧光的测定来鉴别所述化合物。所述方法可以包括以下步骤：组合RNA、RnpA和荧光染料来形成混合物，使所述混合物与所述化合物接触，以及使用荧光监测细胞中RnpA介导的总细菌RNA降解。与对照相比，荧光降低指示RNA降解。本文中使用的减少的荧光是指与对照相比荧光降低至少约1％。例如，荧光减少可以是与对照相比，荧光减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。与对照相比，减少RnpA介导的总细菌RNA降解的化合物可被鉴定为用于治疗或预防微生物感染的化合物。适用于本文中描述的方法的荧光染料包括Quant-iT
Figure BDA0000387472710000301
(Invitrogen；Carlsbad，CA)。
在一些实例中，化合物可以使用如临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)MIC肉汤微量稀释方案(参见Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for BacteriaThat Grow Aerobically；核准标准，临床和实验室标准协会(CLSI，过去是NCCLS)，第7版，2006年1月，26(2)，M7-A7；另参见PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing；第18期信息增刊，临床和实验室标准协会(CLSI，过去是NCCLS)，2008年1月，28(1)，M100-S18)中详细说明的米勒欣顿(Mueller Hinton；MH)肉汤抗菌测定来进一步测定。
本文中提供的化合物和组合物作为细菌RNA酶的抑制剂的活性可以用标准测定(例如HPLC测定)来测量。所述化合物可以在细菌RNA酶酶测定中作为细菌RNA酶的抑制剂来测试。鉴定为细菌RNA酶抑制剂的化合物适用于治疗或预防微生物感染。使用所述测定所测定的化合物和组合物的活性可以用术语IC50报道。本文中使用的IC50是指在测量这种响应的测定中实现最大响应的50％抑制的具体测试化合物的量、浓度或剂量。
在某些方面，公开的化合物和组合物实际上不需合成，但是反而可以用作任何分子建模技术的靶标来预测和表征与细菌RNA酶的相互作用。这是通过结构信息和计算机建模实现的。计算机建模技术允许可视化所选择的分子的三维原子结构以及合理设计将与所述酶相互作用的新化合物。所述酶的三维构建通常取决于来自所选择的分子的x射线结晶学分析或NMR成像的数据。这种数据对于细菌RNA酶来说是可获得的。分子动力学需要力场数据(例如Merck分子力场(Merck Molecular Force Field))。计算机图形系统能够预测新化合物如何与酶连接，并且允许所述化合物的结构的实验操作达到完美的结合特异性。当在一或两个中做出小的变化时，预测相互作用是什么相互作用需要分子力学软件和计算增强的计算机，其通常与在分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的接口耦接。
分子建模系统的实例是CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation，Waltham，MA)。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建、图形建模和分析。QUANTA允许分子行为彼此之间交互式构建、改进、可视化和分析。一旦在硅(silico)中鉴定出以希望的方式与细菌RNA酶相互作用的化合物，就可以如本文中所公开来合成和测定实际的化合物。
使用方法
本文中提供治疗、预防或限制受试者的微生物感染的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文中描述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐。本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐适用于治疗人(例如，小儿和老人群体)和动物(例如，兽医应用)的微生物感染和癌症。微生物感染包括例如细菌和真菌感染。细菌感染包括由杆菌、球菌、螺旋菌和弧菌引起的感染。在一些实例中，微生物感染是细菌感染(例如，革兰氏阳性细菌感染)。在一些实例中，细菌感染是葡萄球菌感染，如金黄色葡萄球菌。本文中描述的化合物和组合物适用于治疗各种金黄色葡萄球菌感染，包括耐药性金黄色葡萄球菌感染和生物膜相关的金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，所述金黄色葡萄球菌感染是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌MRSA)。在其它实施方案中，所述金黄色葡萄球菌感染是耐万古霉素金黄色葡萄球菌。任选地，所述金黄色葡萄球菌感染具有多耐药性。在一些实例中，本文中描述的化合物和组合物可用于治疗杆菌感染(例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus))、链球菌感染(例如，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes))和肠球菌感染(例如，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和耐万古霉素肠球菌)。
本文中描述的治疗或预防方法还可以包括用一种或多种其它药剂(例如抗菌剂)治疗。所述一种或多种其它药剂和本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐可以以任何顺序施用，包括同时施用，以及以最多相隔几天的时间上隔开的顺序来施用。所述方法还可以包括多于单次施用所述一种或多种其它药剂和/或本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐。所述一种或多种其它药剂和本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐的施用可以通过相同或不同的途径来实现。当用一种或多种其它药剂治疗时，本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐可被组合成包括一种或多种其它药剂的药物组合物。例如，本文中描述的化合物或组合物或其可药学上可接受的盐可以与如以下的其它抗菌剂组合成药物组合物：醋氨苯砜(acedapsone)；磺胺苯砜钠(acetosulfonesodium)；阿来霉素(alamecin)；阿立西定(alexidine)；阿姆地诺西林(amdinocillin)；阿姆地诺西林双酯；阿米环素(amicycline)；氨氟沙星(amifloxacin)；甲磺酸氨氟沙星；阿米卡星(amikacin)；硫酸阿米卡星；氨基水杨酸；氨基水杨酸钠；阿莫西林(amoxicillin)；安福霉素(amphomycin)；氨苄西林(ampicillin)；氨苄西林钠；阿帕西林钠(apalcillin sodium)；安普霉素(apramycin)；天冬菌素(aspartocin)；硫酸阿司米星(astromicin sulfate)；阿维霉素(avilamycin)；阿伏帕星(avoparcin)；阿奇毒素(azithromycin)；阿洛西林(azlocillin)；阿洛西林钠；盐酸巴氨西林(bacampicillin hydrochloride)；杆菌肽(bacitracin)；亚甲基双水杨酸杆菌肽；杆菌肽锌；斑伯霉素(bambermycins)；苯沙酸钙；红霉素B(berythromycin)；硫酸倍他霉毒(betamicin sulfate)；比阿培南(biapenem)；比尼霉素(biniramycin)；盐酸珍尼柳酯(biphenamine hydrochloride)；硫酸镁双巯氧吡啶(bispyrithionemagsulfex)；布替卡星(butikacin)；硫酸丁酰苷菌素(butirosin sulfate)；硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate)；卡巴氧(carbadox)；羧苄青霉素二钠(carbenicillin disodium)；羧苄青霉素茚满基钠；羧苄青霉素苯基钠；羧苄青霉素钾；卡芦莫南钠(carumonam sodium)；头孢克洛(cefaclor)；头孢羟氨苄(cefadroxil)；头孢孟多(cefamandole)；头孢孟多酯钠(cefamandole nafate)；头孢孟多钠；头孢帕罗(cefaparole)；头孢三嗪(cefatrizine)；头孢氮氟钠(cefazaflur sodium)；头孢唑啉(cefazolin)；头孢唑啉钠；头孢拉宗(cefbuperazone)；头孢地尼(cefdinir)；头孢吡肟(cefepime)；盐酸头孢吡肟；头孢替考(cefetecol)；头孢克肟(cefixime)；盐酸头孢甲肟(cefmenoxime hydrochloride)；头孢美唑(cefmetazole)；头孢美唑钠；头孢尼西单钠(cefonicid monosodium)；头孢尼西钠；头孢哌酮钠(cefoperazone sodium)；头孢雷特(ceforanide)；头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)；头孢替坦(cefotetan)；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安(cefotiam hydrochloride)；头孢西丁(cefoxitin)；头孢西丁钠；头孢咪唑(cefpimizole)；头孢咪唑钠；头孢匹胺(cefpiramide)；头孢匹胺钠；硫酸头孢匹罗(cefpirome sulfate)；头孢泊肟普昔酯(cefpodoximeproxetil)；头孢丙烯(cefprozil)；头孢沙定(cefroxadine)；头孢磺啶钠(cefsulodin sodium)；头孢他啶(ceftazidime)；头孢布烯(ceftibuten)；头孢唑肟钠(ceftizoxime sodium)；头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)；头孢呋辛(cefuroxime)；头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)；头孢呋辛匹伏替(cefuroxime pivoxetil)；头孢呋辛钠；头孢赛曲钠(cephacetrile sodium)；头孢氨苄(cephalexin)；盐酸头孢氨苄；氨基苯乙酰头孢菌素(cephaloglycin)；头孢噻啶(cephaloridine)；噻吩头孢菌素钠(cephalothinsodium)；头孢匹林钠(cephapirin sodium)；头孢拉定(cephradine)；盐酸西托环素(cetocycline)；乙酰氯霉素(cetophenicol)；氯霉素；棕榈酸氯霉素；氯霉素泛酸复合物；氯霉素琥珀酸钠；氨基苯磷酸氯己定(chlorhexidine phosphanilate)；氯二甲酚；硫酸氢氯四环素；盐酸氯四环素；西诺沙星(cinoxacin)；环丙沙星(ciprofloxacin)；盐酸环丙沙星；西罗霉素(cirolemycin)；克拉霉素(cirolemycin)；盐酸克林沙星(clinafloxacin hydrochloride)；克林霉素(clindamycin)；盐酸克林霉素；盐酸克林霉素棕榈酸酯；磷酸克林霉素；氯法齐明(clofazimine)；苄星邻氯青霉素(cloxacillin benzathine)；邻氯青霉素钠(cloxacillinsodium)；氯羟喹(cloxyquin)；多粘菌素E甲磺酸钠(colistimethatesodium)；硫酸粘杆菌素(colistin sulfate)；香豆霉素(coumermycin)；香豆霉素钠；环青霉素(cyclacillin)；环丝氨酸；达福普汀(dalfopristin)；氨苯砜(dapsone)；达托霉素(daptomycin)；地美环素(demeclocycline)；盐酸地美环素；去甲四环素(demecycline)；地奴真菌素(denofungin)；二氨藜芦啶(diaveridine)；双氯青霉素(dicloxacillin)；双氯青霉素钠；硫酸双氢链霉素；双硫氧吡啶(dipyrithione)；地红霉素(dirithromycin)；强力霉素(doxycycline)；强力霉素钙；强力霉素磷酸复合物(doxycycline fosfatex)；海克酸强力霉素(doxycycline hyclate)；屈克沙星钠(droxacin sodium)；依诺沙星(enoxacin)；依匹西林(epicillin)；盐酸差向四环素(epitetracycline hydrochloride)；红霉素(erythromycin)；醋硬脂酸红霉素(erythromycin acistrate)；依托红霉素(erythromycinestolate)；琥乙红霉素(erythromycin ethylsuccinate)；葡庚糖酸红霉素；乳糖酸红霉素；丙酸红霉素；硬脂酸红霉素；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；氟罗沙星(fleroxacin)；氟氯青霉素(floxacillin)；氟氘丙氨酸(fludalanine)；氟甲喹(flumequine)；磷霉素(fosfomycin)；磷霉素氨丁三醇；呋莫西林(fumoxicillin)；呋唑氯铵；酒石酸呋噻咪唑(furazoliumtartrate)；夫西地酸钠(fusidate sodium)；夫西地酸；硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)；格洛莫南(gloximonam)；短杆菌肽(gramicidin)；卤普罗近(haloprogin)；海他西林(hetacillin)；海他西林钾；海克西定(hexedine)；依巴沙星(ibafloxacin)；亚胺培南(imipenem)；异康唑(isoconazole)；异帕米星(isepamicin)；异烟肼；交沙霉素(josamycin)；硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)；吉他霉素(kitasamycin)；左呋喃他酮(levofuraltadone)；左普匹西林钾(levopropylcillin potassium)；来红霉素(lexithromycin)；林可霉素(lincomycin)；盐酸林可霉素；洛美沙星(lomefloxacin)；盐酸洛美沙星；甲磺酸洛美沙星；氯碳头孢(loracarbef)；磺胺米隆(mafenide)；甲氯环素(meclocycline)；磺基水杨酸甲氯环素；磷酸巨霉素钾(megalomicin potassium)；美喹多司(mequidox)；美罗培南(meropenem)；甲烯土霉素(methacycline)；盐酸甲烯土霉素；乌洛托品(methenamine)；马尿酸乌洛托品；杏仁酸乌洛托品；甲氧西林钠；美替普林(metioprim)；盐酸甲硝哒唑(metronidazolehydrochloride)；磷酸甲硝哒唑；美洛西林(mezlocillin)；美洛西林钠；米诺环素(ninocycline)；盐酸米诺环素；盐酸米林霉素(mirincamycinhydrochloride)；莫能菌素(monensin)；莫能菌素钠；萘夫西林钠(nafcillinsodium)；萘啶酮酸钠(nalidixate sodium)；萘啶酮酸；纳他霉素(natainycin)；尼拉霉素(nebramycin)；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；十一烯酸新霉素；硫酸奈替米星(netilmicin)；中性霉素(neutramycin)；硝呋唑烯(nifuiradene；硝呋地腙(nifuraldezone)；硝呋太尔(nifuratel)；硝呋隆(nifuratrone)；硝呋达齐(nifurdazil)；硝呋米特(nifurimide)；硝呋吡醇(nifiupirinol)；硝呋奎唑(nifurquinazol)；硝呋噻唑(nifurthiazole)；硝环素(nitrocycline)；呋喃妥因(nitrofurantoin)；硝米特(nitromide)；诺氟沙星(norfloxacin)；新生霉素钠(novobiocin sodium)；氧氟沙星(ofloxacin)；昂纳妥普瑞(onnetoprim)；苯唑西林(oxacillin)；苯唑西林钠；肟莫南(oximonam)；肟莫南钠；恶喹酸(oxolinic acid)；土霉素(oxytetracycline)；土霉素钙；盐酸土霉素；帕地霉素(paldimycin)；对氯苯酚；保洛霉素(paulomycin)；培氟沙星(pefloxacin)；甲磺酸培氟沙星；培那西林(penamecillin)；苄星青霉素G(penicillin G benzathme)；青霉素G钾；青霉素G普鲁卡因(penicillin G procaine)；青霉素G钠；青霉素V；苄星青霉素V；海巴明青霉素V(penicillin V hydrabamine)；青霉素V钾；戊胺唑酮钠(pentizidone sodium)；氨基水杨酸苯酯；哌拉西林钠(piperacillin sodium)；吡苄西林钠(pirbenicillin sodium)；吡地西林钠(piridicillin sodium)；盐酸盐酸吡利霉素(pirlimycinhydrochloride)；盐酸匹氨青霉素(pivampicillin hydroehloride)；双羟萘酸匹氨青霉素(pivampicillin pamoate)；丙苯酸匹氨青霉素(pivampicillin probenate)；硫酸多粘菌素B；泊非霉素(porfiromycin)；普匹卡星(propikacin)；吡嗪酰胺(pyrazinamide)；吡啶硫酮锌(pyrithionezinc)；醋酸喹地卡明(quindecamine acetate)；奎奴普丁(quinupristin)；消旋甲砜霉素(racephenicol)；雷莫拉宁(ramoplanin)；雷尼霉素(ranimycin)；雷洛霉素(relomycin)；瑞普米星(repromicin)；利福布汀(rifabutin)；利福美坦(rifametane)；利福克昔(rifamexil)；利福酰胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福喷丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；罗利环素(rolitetracycline)；硝酸罗利环素；蔷薇霉素(rosaramicin)；丁酸蔷薇霉素；丙酸蔷薇霉素；磷酸蔷薇霉素钠；硬脂酸蔷薇霉素；罗索沙星(rosoxacin)；洛克沙砷(roxarsone)；罗红霉素(roxithromycin)；山环素(sancycline)；山费培南钠(sanfetrinem sodium)；沙莫西林(sarmoxicillin)；沙匹西林(sarpicillin)；吸水真菌素(scopafungin)；西索米星(sisomicin)；硫酸西索米星；司帕沙星(sparfloxacin)；盐酸大观霉素(spectinomycin hydrochloride)；螺旋霉素；盐酸司他霉素(stallimycin hydrochloride)；司替霉素(steffimycin)；硫酸链霉素；链霉素异烟胼；磺胺苯(sulfabenz)；磺胺苯酰(sulfabenzamide)；磺胺醋酰(sulfacetamide)；磺胺醋酰钠；磺胺西汀(sulfacytine)；磺胺嘧啶(sulfadiazine)；磺胺嘧啶钠；磺胺多辛(sulfadoxine)；磺胺林(sulfalene)；磺胺甲嘧啶(sulfamerazine)；磺胺对甲氧嘧啶(sulfameter)；磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)；磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)；磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)；磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)；磺胺恶唑(sulfamoxole)；磺胺酸锌(sulfanilatezinc)；磺胺硝苯(sulfanitran)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；磺胺噻唑(sulfathiazole)；磺胺甲苯吡唑(sulfazamet)；磺胺异恶唑(sulfisoxazole)；磺胺醋酰异恶唑(sulfisoxazole acetyl)；磺胺异恶唑二乙醇胺(sulfisboxazole diolamine)；磺粘菌素(sulfomyxin)；硫培南(sulopenem)；舒他西林(sultamricillin)；磺氨苄青霉素钠(suncillin sodium)；盐酸酞氨西林(talampicillin hydrochloride)；替考拉宁(teicoplanin)；盐酸替马沙星(temafloxacin hydrochloride)；替莫西林(temocillin)；四环素；盐酸四环素；四环素磷酸复合物；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；苯硫甲青霉素钾(thiphencillin potassium)；替卡西林甲酚钠(ticarcillin cresyl sodium)；替卡西林二钠；替卡西林单钠；替克拉酮(ticlatone)；氯化氯苯噻碘(tiodonium chloride)；妥布霉素(tobramycin)；硫酸妥布霉素；托氟沙星(tosufloxacin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；硫酸甲氧苄啶；三重磺胺嘧啶(trisulfapyrimidine)；醋竹桃霉素(troleandomycin)；硫酸丙大观霉素(trospectomycin sulfate)；短杆菌素(tyrothricin)；万古霉素；盐酸万古霉素；维及尼霉素(virginiamycin)或佐博霉素(zorbamycin)。
本文中进一步提供抑制细菌核糖核酸酶(如金黄色葡萄球菌RNA酶P的蛋白质组分)的方法。在一些实施方案中，细菌核糖核酸酶是RnpA。所述方法包括使细菌核糖核酸酶与有效量的一种或多种本文中描述的化合物或组合物接触。这些量足以在体内或体外获得所述组合物的化合物或活性组分的治疗有效浓度。
本文中描述的方法和化合物适用于预防性治疗和治疗性治疗。本文中使用的术语治疗(treating)或治疗(treatment)包括预防；延迟发作；发作之后的体征或症状恶化的减弱、根除或延迟；以及预防复发。对于预防性使用来说，在发作之前(例如，在细菌感染的明显体征之前)、早期发作期间(例如，初始出现细菌感染体征和症状)或确立发炎反应或出现细菌感染之后向受试者施用治疗有效量的本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐。预防性施用可以在显现感染症状之前的几天至几年发生。例如，预防性施用可以在暴露于金黄色葡萄球菌的受试者的预防性治疗中使用。治疗性治疗涉及在确诊细菌感染之后向受试者施用治疗有效量的本文中描述的化合物和组合物或其可药学上可接受的盐。
套件
本文中还提供用于治疗或预防受试者的炎症或癌症的套件。套件可以包括本文中描述的任何化合物或组合物。例如，套件可以包括式I化合物。套件可以进一步包括一种或多种抗菌剂(例如，苯唑西林)。套件可以包括本文中描述的任何化合物或组合物的口服制剂。套件可以额外包括套件的使用说明(例如，治疗受试者的说明书)。
以下实施例意图进一步说明本文中描述的方法和化合物的某些方面，而不希望限制权利要求书的范畴。
实施例
金黄色葡萄球菌RNA降解因子是凭经验鉴别的，并且如下文显示的，它们被证明代表了有前途的抗微生物药物开发靶标。为此，利用了金黄色葡萄球菌引起感染的能力部分是因为毒力因子的广泛谱系的时序表达这一事实，这些毒力因子中有许多在实验室培养条件期间是以细胞密度依赖性方式调控的(参见Novick，R.P.，Mol Microbiol，48：1429-1449(2003))。随后进行研究来确定金黄色葡萄球菌毒力因子表达中的生长期调控的变化是否在mRNA降解的水平发生以及这个过程中涉及的蛋白质是否可以包括生物体的RNA降解机制的成员。因此，使用Affymetrix GeneChips来比较在指数期和静止期生长期间的充分表征的金黄色葡萄球菌毒力因子的mRNA衰变率。
结果显示在两种生长期之间，许多金黄色葡萄球菌毒力因子转录物的mRNA转换性质是不同的。此外，发现指数期和静止期细胞的总mRNA衰变性质显著不同；884种金黄色葡萄球菌mRNA物质在静止期生长期间是稳定的。在表达与mRNA衰变相关的基因中有核糖核酸酶P(RnpA)的蛋白质组分，表明它可以在大量mRNA转换中发挥作用。与那种可能性一致的是，证明重组型金黄色葡萄球菌RnpA在体外显示核糖核酸酶活性以及RnpA耗尽的细胞显示降低的mRNA降解。因为RnpA是一种必需的金黄色葡萄球菌酶，它的哺乳动物蛋白具有低的氨基酸保守性，所以它是抗微生物药物发现的适当的靶标。因此，使用高通量和次级筛选测定来鉴别RnpA介导的RNA降解的小分子抑制剂。这些试剂之一显示抑制金黄色葡萄球菌mRNA转换，显示针对MRSA、VISA和VRSA以及具有高RnpA保守性的其它革兰氏阳性病原体的抗微生物活性，并且在鼠类急性致死感染模型中限制发病。总体来说，这些结果显示RnpA是一种金黄色葡萄球菌RNA降解机制的先前未被表征的成员并且验证了它作为抗微生物药物发现靶标的效用。
实施例1：金黄色葡萄球菌转换中的生长期依赖性改变
对于半衰期测定，使金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1、RN4220(pCN51；含有CdCl2诱导型启动子的质粒)、RN4220(pRNPA；能够产生全长rnpA mRNA的pCN51)或RN4220(pRNPA-A.S.；能够产生rnpA反义RNA的pCN51)生长至指数期中期或静止期，添加利福平(rifampin)(200μg/ml)来中止转录，并且在转录中止后0分钟、2.5分钟、5分钟、15分钟和30分钟取菌株UAMS-1的等分试样。为保存试剂，在转录中止后0分钟和10分钟取RN4220衍生物的等分试样。接种确保培养物没有出现利福平抗性。除了RN4220pRNPA-A.S.细胞评估四次之外，每个菌株和/或生长期评估两次。从每个等分试样中分离RNA，标记，杂交到金黄色葡萄球菌GeneChip(Affymetrix；Santa Clara，CA)中，平均复本，并且如先前描述(参见Anderson等，JBacteriol，188：6739-6756(2006)；Roberts等，JBacteriol，188：2593-2603(2006))测定所有mRNA物质的mRNA半衰期。为测量RNPA1000激发细胞的mRNA转换特征，用0.5X MIC的RnpA抑制剂或等体积化合物溶剂(DMSO)处理指数期金黄色葡萄球菌30分钟。随后中止转录物合成并且在转录中止后0分钟和5分钟测量mRNA物质的转录物滴度(参见Anderson等，J Bacteriol，188：6739-6756(2006)；Roberrs等，J Bacteriol，188：2593-2603(2006))。
结果显示在两种生长期之间，许多(41％)毒力因子转录物的mRNA转换性质不同，表明mRNA转换中的调控的变化可能影向它们的表达。此外，观察到生物体产生至少五种静止期特异性的小的稳定RNA(SSR)，即一类假设的调控性非编码RNA分子(参见Anderson等，J Bacteriol，188：6739-6756(2006)；Roberrs等，JBacteriol，188：2593-2603(2006))。此外，指数期和静止期细胞的总mRNA转换性质显著不同。与先前的测量结果一致，发现大部分(90％)指数期转录物迅速降解(半衰期≤5分钟)，9％显示中等稳定性(半衰期>5分钟但≤30分钟)，以及1％是稳定的(半衰期≥30分钟)(参见Anderson等，JBacteriol，188：6739-6756(2006)；Roberts等，J Bacteriol，188：2593-2603(2006))。然而，在静止期生长期间，76％、21％和3％的mRNA物质分别显示短的、中等的以及稳定的半衰期(图1)。RNA酶J1和RNA酶Y都没有发现以生长期依赖性的方式有差别地表达。在静止期生长期间受抑制的367个基因中有rnpA，它编码核糖核酸酶P的蛋白质组分。
实施例2：金黄色葡萄球菌RnpA显示核糖核酸酶活性并且影响细胞mRNA降解
蛋白质纯化
对每个假定的金黄色葡萄球菌核糖核酸酶预测的开放阅读框架进行PCR扩增并且插入质粒pET-30Ek/LIC(Novagen；Madison WI)的不依赖连接的克隆位点(ligation-independent cloning site)。测序证实这在质粒的异丙基β-D-1-硫代半乳糖哌喃糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)诱导型启动子的控制下将六聚组氨酸标签融合到每种蛋白质的N端。转型之后，通过Ni+2亲和力色谱法从在IPTG存在下生长(4小时)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中纯化每种蛋白质。更具体来说，将10g细胞团悬在含有complete mini无EDTA蛋白酶抑制剂片剂(Roche；Branford，CT)和20mM咪唑的50ml缓冲液A(300mM NaCl、50mM Na2HPO4，pH7.4)中。细胞通过在15,000psi下七次穿过Emulsifex-C3微射流机(Avestin Inc.；Ottawa，Canada)来破裂。通过在12,000×g离心30分钟除去细胞碎片并且将上清液加入具有AKTA-FPLC高效液相色谱系统(GE HealthcareBio-Sciences；Pittsburgh，PA)的5mL Ni-NTA FF-crude亲和柱(GEHealthcare Bio-Sciences；Piscataway，NJ)上。用在缓冲液A中的线性咪唑梯度(80mM至500mM)洗脱单个峰中的蛋白质。通过考马斯(Coomasie)染色的SDS-PAGE和基质辅助激光脱附/离子化(MALDI)分析光谱法(Wistar Institute；Philadelphia，PA)来评估每种蛋白质的存在。
质粒
分别在金黄色葡萄球菌穿梭载体pCN51的诱导型CdCl2的控制下，质粒pRNPA-S和pRNPA-A.S.含有包括预测的正义和反义取向的夏因-达尔加诺序列(Shine-Delgarno sequence)的假定的rnpA转录单元(参见Charpentier等，Appl Environ Microbiol，70：6076-6085(2004))。简要地说，使用分别含有5′端EcoRI和KpnI限制酶位点(下划线)的引物5′GAATTCTCAAATAAAAACGATAAATAAGCGAGTGATGTTA(正向)(SEQ ID NO.8)和5′GGTACCTTACTTAATCTTTTTATTAAAAACTTTGGCAA(反向)(SEQ ID NO.9)，或限制酶序列已被逆转的引物将rnpA开放阅读框架和34nt上游序列从金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1中进行PCR扩增。将所生成的PCR产物连接到pCRII-TOPO载体中并且转型到大肠杆菌INVaF′细胞中用于增殖(Invitrogen，Carlsbad，CA)。随后使用QIAprep Spin Miniprep Kits(Qiagen，Valencia，CA)纯化质粒DNA，随后用EcoRI和KpnI消化以释放质粒插入物，使用QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen)对其进行凝胶纯化并且连接到EcoRI和KpnI消化的pCN51。DNA测序证实质粒pRNPA-S和pRNPA-A.S的完整性。
蛋白质印迹
通过Invitrogen(Carlsbad，CA)产生亲和力纯化的PolyQuik兔金黄色葡萄球菌RnpA多克隆抗体。在补充有诱导RNA表达的2.5μMCdCl2和用于质粒维持的10μg/ml红霉素的TSB介质中生长30分钟之后，从含有质粒载体(pCN51)、RnpA过表达质粒(pRNPA-S)或RnpA反义RNA质粒(pRNPA-A.S.)的RN4220细胞分离总细菌蛋白。通过常规Bradford测定来测定所得的蛋白质浓度并且在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中使2.0μg每种蛋白质样品或纯化的金黄色葡萄球菌RnpA进行电泳并且转移至聚偏氟乙烯膜(Millipore，Billerica，MA)中。用10％牛奶封闭膜，洗涤，用兔RnpA抗体(1：1000稀释物)孵育，洗涤，用辣根过氧化酶缀合的抗兔抗体(1：1000稀释物；GE Healthcare)孵育并且按照制造商建议(GE Healthcare)使用Amersham ECL蛋白质印迹系统处理。
结果
发现重组型金黄色葡萄球菌RnpA催化rRNA和葡萄球菌蛋白A(spa)mRNA(图2B和图2C)以及三种其它测试的mRNA物质的消化。在这些测定条件期间，其它假定的金黄色葡萄球菌核糖核酸酶(包括RNA酶III、RNA酶HII、RNA酶HIII、RNA酶Y、RNA酶J1和BN)没有显示等效的RNA降解活性(图2B)。SDS-PAGE和基质辅助激光脱附/离子化(MALDI)分析证实观察到的核糖核酸酶活性与金黄色葡萄球菌RnpA的存在相关(图2A)。在图2A中，通过串联质谱(Wistar Institute；Philadelphia，PA)证实在约17.2kDa处的带(实线箭头；带2)是金黄色葡萄球菌RnpA，而确定顶部的少量污染物(虚线箭头)是大肠杆菌50S核糖体蛋白L3(带1)或金黄色葡萄球菌RnpA多肽片段，其对应于氨基酸11-107(带3和带4)或12-107(带5)。尽管如此，大约1000倍过量的(25μg)在上述核糖核酸酶测定中使用的RnpA纯化产物的SDS-PAGE评估显示在蛋白质制剂内有痕量的四种其它多肽，从而提高了污染性大肠杆菌核糖核酸酶可能与RnpA产物一起存在的可能性。MALDI分析显示这些蛋白质是以下的身份：大肠杆菌核糖体蛋白L3，和三种金黄色葡萄球菌RnpA片段，其与成的熟替代性转译产物相比，大概反映蛋白质制备期间的全长RnpA的蛋白水解性降解。没有检测到大肠杆菌核糖核酸酶，表明蛋白质制剂的核糖核酸分解活性可能是归因于金黄色葡萄球菌RnpA。此外，逆转录酶介导的PCR显示在制剂中不可检测到大肠杆菌rnpB，从而确定RnpA核糖核酸酶活性不是由于由金黄色葡萄球菌RnpA和大肠杆菌rnpB RNA组成的嵌合RNA酶P分子的形成。实际上，在标准的和提高的Mg+2反应条件期间，体外合成的大肠杆菌rnpB既不催化金黄色葡萄球菌RNA降解(单独的)，又不影响RnpA介导的RNA消化的活性。
虽然金黄色葡萄球菌RNA酶J1在本文中使用的反应条件中显示低的核糖核酸分解活性，但是随后的研究显示它在不同的缓冲条件中是一种强力的核糖核酸酶(参见Even等，Nucleic Acids Res，33：2141-2152(2005))，并且能够用作进一步评价金黄色葡萄球菌RnpA的假定的体外核糖核酸酶活性的对照。更具体来说，评估了它的RnpA介导的spa mRNA降解是否能够通过添加亲和力纯化的兔多克隆金黄色葡萄球菌RnpA抗体来抑制。初步研究没有显示抗体限制RnpA或RNA酶J1核糖核酸分解活性。然而，预期免疫球蛋白混合物内抗体的唯一子集可以识别影响酶活性的RnpA抗原表位，spa消化产物的逆转录PCR扩增被用作监测所述抗体对RnpA介导的转录物降解有(如果有)什么作用的更敏感的方法。结果显示抗体添加的确实际上微弱地抑制全长spa mRNA的RnpA介导的降解，但是对RNA酶J1活性没有影响(图2D)。等量的预免疫血清对RnpA活性没有影响。总之，这些数据表明金黄色葡萄球菌RnpA的先前没有被识别的功能是RNA消化功能。
预期必需的细菌RNA转换蛋白的小分子抑制剂干扰细菌生长并且代表新一类的抗微生物剂。在那个方面，金黄色葡萄球菌RnpA是一种报道的必需酶(参见Chaudhuri等，BMC Genomics，10：291(2009)；Ji等，Science，293：2266-2269(2001))，因此可能被认为是化学治疗剂开发的靶标。实际上，预测与-34至+353rnpA mRNA转译起始位点(在质粒pCN51的氯化镉诱导型启动子的控制下(参见Charpentier等，ApplEnviron Microbiol，70：6076-6085(2004)))互补的反义RNA分子的诱导限制在10μm诱导剂存在下的金黄色葡萄球菌增殖。相反，在不存在诱导剂的情况下，没有观察到表达对应正义股RNA分子或反义质粒菌株的细胞的生长缺陷(图6)。这些结果表明金黄色葡萄球菌RnpA是一种必需的蛋白质。此外，使用这种rnpA反义RNA系统，评估了RnpA是否影响金黄色葡萄球菌细胞mRNA转换。因此，测量了只含有质粒载体的细胞或含有带有质粒的rnpA mRNA或rnpA反义RNA的复本的细胞在2.5μM CdCl2存在下的生长期间的RNA降解性质。如图6所示，凭经验确定2.5μM氯化镉是允许分别在rnpAmRNA或rnpA反义表达菌株内的RnpA产量提高或降低，但是不限制产生反义RNA的菌株的细菌生长的最优浓度。因此，RNA转换分析显示降低的RnpA水平与许多mRNA物质的稳定相关，表明所述酶促进大量细胞RNA降解。更具体来说，发现在过表达RnpA并含有载体的细胞中产生的全部指数期转录物的88％和87％分别显示小于10分钟的半衰期。RnpA过表达不加速细胞RNA降解这一发现可能表明蛋白质的RNA降解活性取决于保持在野生型水平的辅因子，或所述蛋白质没有达到有效增加RNA转换的浓度。无论如何，63％的在RnpA耗尽的细胞中产生的转录物显示小于10分钟的半衰期，表明所述蛋白质促进金黄色葡萄球菌mRNA转换(图5A)。
实施例3：RnpA介导的RNA降解的小分子抑制剂的鉴别
以上结果表明金黄色葡萄球菌RnpA是一种必需的酶，它显示体外核糖核酸酶活性并且参与细胞RNA降解。此外，所述蛋白质遍及革兰氏阳性菌是相当保守的，但是对于哺乳动物蛋白质缺少氨基酸保守，使它成为新型抗生素药物开发的有吸引力的靶标。因此，使用基于荧光的高通量测定来筛选RnpA介导的RNA降解的小分子抑制剂的29,066种商业化合物(ActiProbe-25K和Natural product文库；Timtec；Newark，DE)(图3A)。
具体来说，在ActiProbe-25K和Natural Product文库的成员(总计29,940种化合物；TimTec Inc.；Newark，DE)中筛选金黄色葡萄球菌RnpA介导的总细菌RNA降解的小分子抑制剂。所有反应(50μl)都在96孔格式中进行，并且在1X反应缓冲液(2mM NaCl、2mM MgCl2、50mM Tris-HCl，pH6.0)中含有20pmol RnpA、200ng金黄色葡萄球菌总RNA和约5μM的每种化合物。将混合物在37℃孵育20分钟，期间添加Quant-iT
Figure BDA0000387472710000451
(100μl；Invitrogen)来定量剩余RNA底物的量。按照剩余底物/起始底物*100计算酶抑制百分比。对于抑制滴定测定，将1pmol的spamRNA与单独的20pmol RnpA(阳性对照)或在递增量(0μM、25μM、50μM、100μM、125μM、150μM、200μM、250μM和500μM)的RNP1000存在下在37℃孵育1小时。此后，将20μl每种反应混合物在含有1.2％甲醛的琼脂糖凝胶中进行电泳并且观察溴化乙锭染色。
总共有十四种分子对酶RNA转换活性的抑制≥50％。基于凝胶的次级测定证实这些分子中的五种是RnpA介导的RNA降解的真正抑制剂(图3B)。这些化合物之一，即RNPA1000(图3C；IC50=100-125μM)，在任何测试浓度(0-750μM)下都不影响商购大肠杆菌RNA酶HI、RNA酶A、RNA酶I或机构内部纯化的金黄色葡萄球菌RNA酶J1的活性，但是确实适度地抑制大肠杆菌RNA酶III活性(IC50=500-750μM；数据未示出)。这些数据和其它数据(参见下文)表明RNPA1000可能对金黄色葡萄球菌RnpA具有特异性，然而如同任何小分子一样，我们不能排除所述试剂可能也会影响其它金黄色葡萄球菌酶的可能性。为了评估RnpA抑制剂是否显示作为抗微生物剂的潜力，进行了一系列实验来评价RNPA1000是否抑制金黄色葡萄球菌生长并且可以限制全身性感染模型中的金黄色葡萄球菌发病。
实施例4：抗微生物敏感度测试
除RN4220衍生物外，使用阳离子调节的米勒-欣顿肉汤或补充有5％溶解马血的MH肉汤(用于测试链球菌属(Streptotococcus spp.))，按照临床和实验室标准协会(CLSI)准则，通过肉汤微量稀释法测定了RNPA1000针对细菌的体外活性。用105个菌落形成单位(CFU)/ml接种含有RNPA1000的连续稀释物(0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml)的微量滴定板并且在37℃下孵育18小时。每种分离物的MIC定义为通过肉眼检测完全抑制生物体生长的RNPA1000的最低浓度。按照上述操作，但是微量滴定孔含有涵盖最初不完全抑制生长的最低浓度(16μg/ml)和完全抑制生长的浓度(32μg/ml)的以1μg/ml递增的RNPA1000浓度，通过重复测试进一步改善每种金黄色葡萄球菌菌株的MIC。测定的每种金黄色葡萄球菌菌株的MIC值是重复测量(n=5)的平均分数。接种含有RNPA1000浓度≥MIC的孔以便最小杀菌测量。可能时，在层流净化罩(laminar flowhood)中用VRSA菌株进行实验以使设备污染的可能性最小化。对于含有质粒载体(pCN51)的RN4220细胞，通过如上所述的微量稀释法，但是使细胞在补充有2.5μM CdCl2和0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml或128μg/ml RNPA1000的胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth medium)中生长，以进行RNPA1000的RnpA过度产生质粒(pRNPA-S)或RnpA产生不足质粒(pRNPA-A.S.)的体外抗微生物活性测定。还在不存在和存在0.25倍、0.5倍、2倍和4倍所述菌株对于苯唑西林(1μg/ml)、利福平(0.5μg/ml)、万古霉素(2μg/ml)或达托霉素(1μg/ml)的MIC下进行时间杀灭测定来监测RNPA1000对金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1的抗微生物性质。将指定量的RNPA1000和/或商业抗生素加入指数期中期(2×108cfu/ml)金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1细胞中并且在37℃下孵育。在抗微生物激发后0小时、2小时、4小时、8小时和24小时取等分试样，连续稀释，并且接种以计算(enumerate)所得cfu/ml。所有时间杀灭测定都重复至少3次。结果在表1中提供。
表1
Figure BDA0000387472710000471
a提供的生物体和相关抗生素抗性表型(在括号中)：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)：万古霉素中敏金黄色葡萄球菌(VISA)；耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)；多耐药性肺炎链球菌(MDR)；耐万古霉素屎肠球菌(VRE)。
b除金黄色葡萄球菌和牛链球菌外，所有菌株都是临床血液分离物：美国型(美国MRSA系)是从疾病防治中心(Centers for Disease Control andPrevention)获得的：金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1是临床骨髓炎分离物；分离物NRS1、NRS3、VRS1和VRS10是通过金黄色葡萄球菌的抗微生物剂抗性网络(Network of Animicrobial Resistance inStaphylococcus aureus：NARSA)获得；牛链球菌菌株ATCC49147是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的.
c各金黄色葡萄球菌分离物都测试5次；其它生物体一式两份进行测试.
d最低抑制浓度(MIC)是按照临床和实验室标准协会(CLSI)关于抗微生物敏感度测试的准则测定的.随后更精确地测量金黄色葡萄球菌MRSA分离物.
如表1所示，RNPA1000针对以下各物显示适度的抗微生物活性：两种充分表征的基因型不同的金黄色葡萄球菌分离物，即UAMS-1(临床骨髓炎分离物；MIC26μg/ml)和USA300-0114[美国社区相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染(MRSA)的主要起因；MIC23μg/ml]，以及遍及美国传播的其它主要MRSA系的代表(参见McDougal等，JClin Microbiol，41：5113-5120(2003))。同样地，RNPA1000针对万古霉素中敏金黄色葡萄球菌(VISA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)显示抗微生物活性。时间杀灭测定显示RNPA1000充当抑菌剂(图7，图A)，并且它不影响其它抗葡萄球菌剂(包括万古霉素、达托霉素或利福平)的抗微生物活性(数据未示出)，但是确实适度地增大苯唑西林的效价(图7，图B和图C)。所述RnpA抑制剂还针对表皮葡萄球菌、抗生素敏感和多耐药性肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌和蜡状芽胞杆菌显示抗微生物活性。RNPA1000还针对粪肠球菌、屎肠球菌和耐万古霉素屎肠球菌(VRE)显示轻微的活性，但是不影响大肠杆菌或鲍氏不动杆菌生长(表1)。后者是可预期的，因为大肠杆菌和鲍氏不动杆菌RnpA与金黄色葡萄球菌RnpA享有有限的氨基酸同一性(分别是24％和26％)(图8)。此外，纯化的鲍氏不动杆菌RnpA在我们的测定条件中不显示核糖核酸分解活性(数据未示出)。在外排泵抑制剂利血平的存在下，肠球菌对RNPA1000的敏感度从64μg/ml的MIC提高至32μg/ml的MIC，表明肠球菌本身可能对RnpA抑制剂敏感。相反地，外排抑制剂对鲍氏不动杆菌RNPA1000敏感度没有影响(表1)。总之，这些结果表明细菌RNPA1000敏感度与对金黄色葡萄球菌RnpA的氨基酸相似性和所述酶的RNA降解活性相关。
为了评估金黄色葡萄球菌对RNPA1000的敏感度是否可归因于细胞RnpA的抑制，直接测量了用亚抑制浓度(0.5X MIC)的RnpA抑制剂激发的金黄色葡萄球菌的mRNA转换性质。处理30分钟之后，与模拟物处理的细胞相比，RNPA1000降低金黄色葡萄球菌细胞的mRNA降解速率(图5A)。因此，RnpA抑制性化合物降低细胞mRNA降解，这大概是通过限制酶的细胞功能来实现。RNPA1000处理的细胞的mRNA转换性质类似于RnpA耗尽细胞的mRNA转换性质(图2E)，表明所述药剂可能影响所述酶。为了更直接地确定RNPA1000的抗微生物作用是否是由RnpA的细胞抑制介导的，评估了产生过多和产生过少金黄色葡萄球菌RnpA的细胞的RNPA1000敏感度。使含有载体或野生型rnpA mRNA或rnpA反义RNA的质粒复本的金黄色葡萄球菌在CdCl2诱导型启动子的控制下在2.5μM诱导剂和递增浓度的RNPA1000存在下生长。如上所述，这种浓度的氯化镉诱导RnpA蛋白表达的轻微变化(RnpA过量产生或产生不足)，但是足够适度以使细胞生长不受影响。如图5B所示，含有载体并且过度产生RnpA的细胞显示32μμg ml-1的MIC，而RnpA产生不足的细胞的MIC是8μμg ml-1。后者表明金黄色葡萄球菌的RNPA1000敏感度与细胞RnpA水平相关并且所述药剂的抗微生物作用模式部分地具有RnpA依赖性。
实施例5：细胞毒性测定
随后评估了对应于有效细菌MIC值(10-50μg/ml)的RnpA抑制剂浓度是否引起人细胞的细胞毒性。将HepG2人肝细胞(105个细胞)接种在微量滴定板的单个孔中并且在补充有10％胎牛血清的杜贝可氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media)中在5％二氧化碳、37℃下孵育16小时。随后用丝裂霉素C(5μg/ml；阳性对照)或0μg/ml、25μg/ml或50μg/ml RNPA1000激发细胞24小时或48小时。在代谢活性的细胞内添加并随后还原四氮唑盐(tetrazolium salt)(MTT)之后，按照制造商建议(美国典型微生物菌种保藏中心；Manassas，VA)，通过分光光度法(570nm)测量细胞活力。
MTT细胞增殖测定的测量结果显示24小时的RnpA抑制剂暴露在任何测试的浓度下都没有引起人HepG2细胞毒性(数据未示出)。然而，在25μg/ml(对应于大部分MRSA系的最低抑制浓度)下，长久的RNP1000暴露(48小时)引起轻度的细胞毒性(图4A)，而较高的浓度显示增大的毒性(数据未示出)。
实施例6：RnpA抑制剂对生物膜相关的细菌的抗微生物功效
金黄色葡萄球菌成功作为细菌性病原体可能是部分由于其在植入的医疗器械上形成生物膜的能力，这大概为细菌向第二寄主位点的传播提供了集中点。治疗生物膜相关的感染中的复杂问题之一是生物膜相关的细菌固有地对抗生素治疗具有抵抗力。例如，一项最新的体外研究显示，尽管使用本质上对每种抗生素敏感的菌株，但是5X MIC的达托霉素、利奈唑酮(linezolid)或万古霉素在处理24小时之后仅使生物膜相关细菌减少<2log，并且甚至当以20X MIC施用3天的过程，这些抗生素中也没有一种清除生物膜相关的金黄色葡萄球菌(参见Weiss等，Antimicrob Agents Chemother，53：2475-2482(2009))。转录剖析研究显示，生物膜相关的金黄色葡萄球菌尽管在生理学上是独特的，但是类似于漂浮的静止期细胞(参见Beenken等，J Bacteriol，186：4665-4684(2004))。实际上，类似于静止期细菌，与指数期细胞相比，在金黄色葡萄球菌生物膜相关的和生物膜脱离的细菌中rnpA表达分别减至1/4.3和1/6.2(Dunman和Horswill，未出版)。因为在生物膜相关的细菌内可能存在低水平的RnpA，所以可能需要较少的RnpA抑制分子来干扰蛋白质的功能，因此干扰抗微生物活性。因此，生物膜相关的金黄色葡萄球菌可能对RnpA抑制剂(如RNPA1000)显示相当的敏感度。
要测定这个，如Weiss等，Antimicrob Agents Chemother，53：2475-2482(2009)中所述进行体外生物膜测定。简要地说，将14号氟化乙丙烯Introcan Safety导管(B.Braun，Bethlehem，PA)的1cm区段用人血浆涂布，并且放入含有2ml生物膜培养基和金黄色葡萄球菌菌株UAMS-1(最终OD600nm为0.05)的12孔微量滴定板的单个孔中。在37℃下孵育过夜之后除去导管，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并且转移至含有0倍、5倍、10倍或20倍的RNPA1000的金黄色葡萄球菌MIC的新鲜生物膜培养基中。在3天期间每天回收暴露于每种剂量(n=3)的导管，每天替换培养基。在每个回收时间点之后在PBS中冲洗导管并且通过超声处理和接种来计算粘附的细菌。使用对数转化的细菌计数数据的方差分析(ANOVA)来评价RNPA1000暴露的作用。
如图4C所示，用5X MIC RNPA1000处理生物膜相关的金黄色葡萄球菌24小时引起细菌负荷降低3-log，表明在短期暴露期间，所述药剂与达托霉素、万古霉素或利奈唑酮是同样强力的(如果不是更强力)。此外，虽然从未实现细菌清除，但是增大暴露时长或RNPA1000浓度会增强抗微生物活性。有利地比较了最大RNPA1000抗微生物效价(在生物膜相关的细菌中降低5-log)与在相同模型和条件中评估的商购抗生素的活性(达托霉素降低6-log，利奈唑酮降低5-log；万古霉素降低4-log)(参见Weiss等，Antimicrob Agents Chemother，53：2475-2482(2009))。总之，这些结果表明RnpA在金黄色葡萄球菌生物膜维持中发挥重要的生物作用，以及相应的抑制剂在治疗生物膜相关的感染中可能具有广阔的治疗效用。
实施例7：急性致死感染模型
因为RNPA1000在短期HepG2暴露期间没有毒性并且在长久HepG2暴露期间只有适度毒性，所以它可以充当评估RnpA抑制分子在全身性小鼠感染模型中是否是有效的适当工具。通过腹膜内注射(0.5ml)野生型金黄色葡萄球菌菌株Smith来激发雌性5-6周龄CD-1小鼠，产生4.55×105个菌落形成单位/动物的最终接种物；等于10-100LD50并且在接种后24小时内导致未处理对照动物(N=5)的死亡。将RNPA1000溶解在DMSO和PEG400的1：1混合物中；在水中制备万古霉素。在感染后30分钟，通过皮下注射(0.2ml)向动物(5个/剂量组)分别施用16mg/kg、64mg/kg和256mg/kg或0.25mg/kg、1mg/kg、4mg/kg和16mg/kg RNPA1000或万古霉素。在研究过程中(5天)每天记录未接受处理、接受单次剂量的万古霉素或RnpA抑制剂的存活动物百分比。结果在表格2和图4B中示出。
表2
Figure BDA0000387472710000511
存活百分比是指腹腔内注射金黄色葡萄球菌和施用RNPA1000后5天之后存活动物的共识(consensus)。括号中的数字表示实验重复次数。未处理的对照小鼠的每个成员在细菌接种(0mg/kg)24小时内断气。万古霉素充当阳性对照。
如图4B所示，皮下注射RNPA1000限制了向CD-1小、鼠腹腔内注射的野生型金黄色葡萄球菌(每个动物4.55×105cfu)的致死效应。虽然这种细菌接种物(等于10-100LD50)在24小时内导致未处理对照动物100％的死亡，但是RNPA1000以剂量依赖性方式提供保护。在研究过程中，施用最高RnpA抑制剂剂量(256mg/kg)可再现地导致50％的存活率，而128mg/kg和64mg/kg分别导致30％和20％的存活率(图4B；表2)。值得注意的是，在任何测试的浓度(32mg/kg、64mg/kg、128mg/kg、256mg/kg；表2)下，化合物(单独)的给药方案不影响动物存活率。总之，这些结果表明RNPA1000在急性致死金黄色葡萄球菌感染模型中限制细菌致病性，半数有效剂量(ED50)介于64-256mg/kg之间。因此，RNPA1000可被认为是用于基于药物化学来产生更强力的衍生物的平台。这些结果还提供了以下概念的证据：RnpA抑制剂在全身性小鼠感染模型中是有效的以及RNPA1000代表了研究RnpA对感染过程的贡献的工具。
随附的权利要求书的化合物和方法的范畴不受限于本文中描述的特定化合物和方法，本文中描述的化合物和方法意图作为权利要求书的几个方面的说明，并且功能等效的任何化合物和方法都在本公开的范畴内。除了本文中示出和描述的化合物和方法之外，希望所述化合物和方法的各种修改属于随附的权利要求书的范畴。此外，虽然仅特定描述了某些代表性化合物、方法以及这些化合物和方法的方面，但是希望其它化合物和方法以及所述化合物和方法的各种特征的组合也属于随附的权利要求书的范畴，即使不特定地叙述也是如此。因此，本文中可以明确地提到步骤、要素、组分或组元的组合；然而，即使不明确说明，也包括步骤、要素、组分和组元的所有其它组合。
Figure IDA0000387472770000011
Figure IDA0000387472770000021
Figure IDA0000387472770000031
Figure IDA0000387472770000041
Figure IDA0000387472770000051

Claims (18)

1.一种治疗或预防受试者的微生物感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的具有以下结构的RNA酶抑制剂：
Figure FDA0000387472700000011
或其可药学上可接受的盐或前药，其中：
Figure FDA0000387472700000012
是单键或双键；
A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；
A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；
每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；且
R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基，
其中R6和R7任选组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌感染是革兰氏阳性细菌感染。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌感染是葡萄球菌感染。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是耐药性金黄色葡萄球菌感染。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是生物膜相关的金黄色葡萄球菌感染。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA酶抑制剂是RnpA抑制剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA酶抑制剂是
Figure FDA0000387472700000021
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用第二化合物，其中所述第二化合物是抗菌化合物。
11.一种抑制细菌核糖核酸酶的方法，所述方法包括使所述细菌核糖核酸酶与有效量的具有以下结构的RNA酶抑制剂或其可药学上可接受的盐或前药接触：
Figure FDA0000387472700000031
其中：
Figure FDA0000387472700000032
是单键或双键；
A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；
A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；
每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、代取的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；且
R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基，
其中R6和R7任选组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细菌核糖核酸酶是金黄色葡萄球菌RNA酶P。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述细菌核糖核酸酶是金黄色葡萄球菌RNA酶P是RnpA。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述接触发生在体内。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述接触发生在体外。
16.一种化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0000387472700000041
或其可药学上可接受的盐或前药，其中：
Figure FDA0000387472700000042
是单键或双键；
A1、A2、A3、A4和A5各自独立地选自N或CR1；
A6、A7、A8、A9和A10各自独立地选自N或CR2；
每个R1、每个R2、R3、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的杂炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基或取代的或未取代的羧基；且
R4是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的杂烯基、取代的或未取代的炔基或取代的或未取代的杂烷基，
其中R6和R7任选组合形成取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基；且
其中如果
Figure FDA0000387472700000051
是双键，A1、A2、A4、A5、A6、A7、A8和A10是CH，A3是-CCO2H，R4、R7和R8各自是氢，R5和R6是甲基，并且R3是氰基，那么A9不是-CBr。
17.一种组合物，其包含一种或多种如权利要求16所述的化合物和可药学上可接受的载体。
18.一种鉴别用于治疗或预防微生物感染的化合物的方法，其包括以下步骤：
a)组合RNA、RnpA和荧光染料来形成混合物；
b)使所述混合物与所述化合物接触；以及
c)使用荧光监测细胞中RnpA介导的总细菌RNA降解，其中与对照相比，荧光减少指示RNA降解，
其中与对照相比，减少所述RnpA介导的总细菌RNA降解的化合物被鉴定为用于治疗或预防所述微生物感染的所述化合物。
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