CN103623082A - 覆盆子提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药开发利用领域，具体涉及覆盆子开发利用。本发明提取物包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分任一部分；提取物具有预防、治疗抗老年痴呆作用。原料来自绿色植物，具有广阔的开发空间及应用前景。

Description

覆盆子提取物及其应用
技术领域
本发明属于中药开发利用领域，具体设计覆盆子开发利用。
背景技术
进入21世纪，老龄化社会正在悄然来临，我国于1999年末成为老年型国家，而且我国老年人口以3%的速度增长。在老年人中疾病的排列顺序是心脏病、肿瘤、脑血管病，第四位是老年性痴呆。据估计，在65岁以上的老年人中，有10%患有轻度和中度痴呆。4-5％患有严重痴呆，85岁以上的老人这个比例超过15％。有专家预言，老年性痴呆将是21世纪人类第一杀手，目前全球的老年性痴呆病人估计在2000-2500万。美国超过400万，中国已超过500万。痴呆给病人、家庭和社会带来诸多方面的危害，如个人生活质量下降，治疗药物、医疗、护理照料费用，由于病人的精神症状、行为和人格障碍给社会和他人带来损失。在美国老年性痴呆（Alzheimer’s disease, AD）的费用仅次于心脏病和肿瘤而居第三位，在1994年为830亿。我国虽然没有对AD病人费用统计，每年估计至少花费50亿元。到2050年，我国老年痴呆病人将超过3000万，预计费用将超过1万亿元。痴呆患者不仅对本人极为痛苦，而且对家庭和社会的负担很大，因此，寻找有效药物以延缓、控制AD病情的发展是极为重要的。
迄今，现代医学尚无能终止或逆转老年性痴呆病理改变而起到根本治疗作用的疗法。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种覆盆子提取物，及其在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。
本发明具体方案如下：
覆盆子提取物，包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分；
所述水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步骤提取：
1、取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液； 
聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上D101大孔树脂，用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液；
聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上D101大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液；
4、步骤2）氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3）乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分；该部分主要成分为甾醇和萜类成分；
将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮洗脱部分，该为部分主要成分为鞣质和黄酮聚合物。
取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分；该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分，该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
本发明还涉及上述提取物在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。
本发明提取物来自植物成分覆盆子，具有良好的抑制老年痴呆的作用。
附图说明
图1 HE染色照片
A 空白组海马CA1区 HE×400 B 模型组海马CA1区 HE×400 C 脑复康组海马CA1区 HE×400  D 水洗高剂量组海马CA1区 HE×400 E 水洗低剂量组海马CA1区 HE×400 F 氯仿高剂量组海马CA1区 HE×400 G 氯仿低剂量组海马CA1区 HE×400 H 丙酮高剂量组海马CA1区 HE×400 I 丙酮低剂量组海马CA1区 HE×400 J 乙酸乙酯高剂量组海马CA1区 HE×400 K 乙酸乙酯低剂量组海马CA1区 HE×400。
图2免疫组化照片
L 空白组 Pser404-tau×400 M 模型组 Pser404-tau×400 N 脑复康组 Pser404-tau×400 O 水洗高剂量组 Pser404-tau×400 P 水洗高剂量组 Pser404-tau×400 Q 丙酮高剂量组 Pser404-tau×400 R丙酮低剂量组 Pser404-tau×400 S 氯仿高 剂量组 Pser404-tau×400 T 氯仿低剂量组 Pser404-tau×400 U乙酸乙酯高剂量组 Pser404-tau×400 V乙酸乙酯低剂量组 Pser404-tau×400。
具体实施方式
实施例1 覆盆子提取物制备
1、取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液； 
聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上D101大孔树脂，用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液；
聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上D101大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液；
4、水洗部分：步骤2）氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3）乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分；该部分主要成分为甾醇和萜类成分；
丙酮洗脱部分：将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮部分，该为部分主要成分为鞣质和黄酮聚合物；
氯仿部分：取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分；该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
乙酸乙酯部分：取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分，该部分主要成分为黄酮和酚酸类。
实施例2覆盆子提取物对肾阳虚型老年性痴呆大鼠海马CA1区形态学及tau蛋白过度磷酸化的影响实验
兔抗Pser404-tau试剂盒，Abgent公司产品；兔SP检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为11137A10；DAB显色试剂盒,北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为911882A。
1实验方法
1.1 造模与给药
SD大鼠120只，雄性，SPF级，体重180-220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(湘)2009-0004。实验动物适应1周后，Morris水迷宫实验筛选动物，剔除10只后（剔除离群，在逃避潜伏期内总是找不到平台的大鼠），随机分成11组：空白组、模型组、脑复康组、覆盆子水洗高剂量组、水洗低剂量组、丙酮洗脱高剂量组、丙酮洗脱低剂量组、氯仿醇洗高剂量组、氯仿醇洗低剂量组、乙酸乙酯提取高剂量组、乙酸乙酯提取低剂量组，每组10只。每天观察记录动物的一般情况，每5天称体重一次，观察体重变化情况。
空白组腹腔注射生理盐水（0.5ml/100g），其余各组均腹腔注射D-半乳糖（125mg/kg），连续6周，造成亚急性衰老模型。然后空白组和模型组灌胃生理盐水（ 1ml/100g ），脑复康（西药单一成分：吡拉西坦）组（0.4g/100g · d）预防性灌胃脑复康混悬液；
各给药组灌胃覆盆子提取物，取实施例1覆盆子水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，所得计量以覆盆子原药材计，分别分为高剂量组和低剂量组。高剂量各组均预防性灌胃2.4g/100g · d，低剂量各组均预防性灌胃1.2g/100g · d，连续4周。
灌胃最后2周，采用氢化可的松混悬液给大鼠肌肉注射（25mg/kg）造成肾阳虚模型，造模完成后进行历时6天的Morris水迷宫实验。
1.2 脑标本处理
心脏取血后直视下将输液针刺入左心室至升主动脉，同时剪开右心耳，用0.9%温生理盐水250ml灌注至肝脏完全变白，右心室流出澄清液体后，右脑快速取出放预冷的4%多聚甲醛固定24h，乙醇系列脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚2-4μm，连续切片，每5张取一张，分别进行HE染色和免疫组化染色。光镜下每张切片计数3个视野(400×)的细胞，总和除以3作为该大鼠的细胞计数。
1.3 形态学检测
HE染色：⑴烤片30min-1h；⑵二甲苯Ⅰ10min；⑶二甲苯Ⅱ10min；⑷无水乙醇Ⅰ3min；⑸无水乙醇Ⅱ3min；⑹95%乙醇Ⅰ3min；⑺95%乙醇Ⅱ3min；⑻75%乙醇3min；⑼自来水洗去乙醇几秒；⑽苏木精染色5min；⑾自来水泛蓝30min；⑿伊红10-30秒；⒀95%乙醇Ⅰ过；⒁95%乙醇Ⅱ过；⒂无水乙醇Ⅰ3min；⒃无水乙醇Ⅱ3min；⒄干燥；⒅二甲苯Ⅰ2min；⒆二甲苯Ⅱ2min；⒇干燥，中性树胶封片。
1.4 免疫组化染色法检测海马CA1区Pser404-tau阳性细胞的表达
⑴58℃烤片1.5h；⑵常规脱蜡至水：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→95%乙醇Ⅰ3min→95%乙醇Ⅱ3min→80%乙醇3min→双蒸水3min×3次；⑶抗原修复：高压锅煮沸后修复10min，PBS冲洗3min×3次；⑷滴加3%H2O2去离子水37℃孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3min×3次；⑸滴加封闭用正常山羊血清工作液37℃孵育15min，倾去，勿洗；⑹滴加一抗工作液，4℃过夜；⑺37℃复温45min，PBS冲洗5min×3次；⑻滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育15min，PBS冲洗5min×3次；⑼滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS冲洗5min×3次；⑽二氨基联苯胺（DAB）显色5min，自来水冲洗30min；⑾苏木精复染5min，自来水冲洗20min；⑿脱水透明：95%乙醇Ⅰ（过）→95%乙醇Ⅱ（过）→无水乙醇Ⅰ3min→无水乙醇Ⅱ3min→干燥→二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min→干燥→中性树胶封片。
2 统计学处理
所有数据用                                                
Figure 2013106242230100002DEST_PATH_IMAGE001
表示，使用SPSS11.5软件进行单因素方差分析，组间用LSD法。
3 结果
3.1 海马CA1区HE染色结果
结果见表1及图1。正常组：大鼠海马形态完整，细胞排列致密整齐，形态正常，细胞结构正常，核仁清晰，神经元细胞数量多。
模型组：大鼠海马形态破碎，结构异常，细胞变形，空泡坏死，胞核固缩，核深染，神经元细胞数量明显减少。
给药组：相比较模型组而言，除水洗低剂量和氯仿低剂量，各给药组大鼠海马神经细胞形态均有不同程度的恢复。神经元细胞数量比模型组多，染色较正常，排列较整齐，结构较正常，分布较均匀。
表1 覆盆子活性成分对肾阳虚型老年性痴呆大鼠海马CA1区细胞总数、
坏死细胞数、细胞坏死率的影响（
Figure 719793DEST_PATH_IMAGE001
）
组别　 N 细胞总数 坏死细胞数 细胞坏死率
空白组 6 51.44±11.84** 8.89±4.63** 0.17±0.05**
模型组 6 32.81±4.58▲▲ 31.67±4.76▲▲ 0.96±0.03▲▲
脑复康 6 41.17±7.35 10.56±2.35** 0.26±0.06**
水洗高剂量 6 51.95±7.51** 30.44±2.48 0.59±0.08**
水洗低剂量 6 48.72±12.22** 42.28±9.24 0.88±0.06
丙酮高剂量 6 40.06±6.74 28.22±5.52 0.71±0.10**
丙酮低剂量 6 34.39±8.29 21.22±7.71** 0.61±0.12**
氯仿高剂量 6 45.06±15.00* 27.17±9.45 0.63±0.20**
氯仿低剂量 6 47.89±11.08** 43.55±9.70 0.91±0.04
乙酸乙酯高剂量 6 39.67±7.53 26.89±4.13 0.69±0.10**
乙酸乙酯低剂量 6 45.72±7.26* 29.94±6.45 0.65±0.10**
与空白组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01 ；与模型组相比，*P<0.05， **P<0.01
3.2 免疫组化结果
见表2及图2。海马CA1区Pser404-tau阳性细胞呈棕色颗粒，为胞浆显色。阳性细胞在正常组有弱表达；与空白对照组比较，模型组阳性细胞个数明显增加；与模型对照组比较，各给药组海马CA1区Pser404-tau阳性细胞明显减少（P<0.01）。
表2 各组大鼠海马CA1区Pser404-tau蛋白阳性细胞表达的比较（
Figure 986826DEST_PATH_IMAGE001
）
组别 N 阳性细胞数
空白组 5 2.07±0.55**
模型组 5 35.67±7.98▲▲
脑复康 5 3.4±0.87**
水洗高剂量 5 4.07±2.25**
水洗低剂量 5 5.2±1.71**
丙酮高剂量 5 2.93±0.89**
丙酮低剂量 5 5±1.23**
氯仿高剂量 4 3.58±0.57**
氯仿低剂量 4 3.92±0.96**
乙酸乙酯高剂量 5 5.33±0.82**
乙酸乙酯低剂量 5 4.27±0.98**
与空白组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01 ；与模型组相比，*P<0.05， **P<0.01
4.小结
相比较模型组而言，除水洗低剂量和氯仿低剂量，各给药组大鼠海马神经细胞形态均有不同程度的恢复。神经元细胞数量比模型组多，染色较正常，排列较整齐，结构较正常，分布较均匀。与模型对照组比较，各给药组海马CA1区Pser404-tau阳性细胞明显减少（P<0.01）。提示：覆盆子氯仿部位、乙酸乙酯部位可能通过降低AchE活性，升高ChAT活性，保护海马CA1区神经元损伤，减少细胞tau蛋白表达而起到改善肾阳虚型痴呆大鼠学习记忆。在后续的实验研究中，有必要对该两有效部位成分进行进一步分离，以期明确覆盆子改善肾阳虚型痴呆学习记忆的物质基础。
实施例3 覆盆子有效部位单体成分的分离
1仪器与试剂
INOVA-500 型核磁共振仪（内标TMS）,VGZAB-HS 型质谱仪，X4型显微熔点测定仪(B北京泰克仪器有限公司)，IR红外，DU-650紫外可见光谱仪（美国贝克曼公司），硅胶（青岛海洋化料厂），聚酰胺 （浙江台州路桥四甲生化塑料厂），SephadexLH-20凝胶(Pharmacia公司)，其他试剂均为分析纯。覆盆子药材购于樟树，经江西中医学院刘庆华老师鉴定后为悬钩子属植物华东覆盆子Rubus chingii Hu 的果实。
2 提取与分离
覆盆子药材粉碎后药材粉碎后，用80%乙醇渗漉，直至药液基本无色，回收乙醇得浸膏。浸膏用水混悬，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。
2.1 氯仿部分的分离与精制
取氯仿部分上硅胶柱，氯仿-甲酸乙酯梯度洗脱。用紫外检测器监测流出峰，每一个峰为一流分，共收集洗脱液40流份。浓缩各流份，用TLC比较，合并相似组分。流份18-22回收溶剂后重结晶得化合物Ⅰ（β-谷甾醇）。流份6-17回收溶剂后，再用硅胶柱细分，氯仿-甲酸乙酯梯度洗脱得化合物Ⅱ（十六烷酸）。流份23-26回收溶剂后，再用硅胶柱细分，甲苯-甲酸乙酯梯度洗脱，分别得化合物Ⅲ（十六碳烯酸）、Ⅳ（谷甾醇十六烯酸酯）。
2.2乙酸乙酯部分的分离与精制
取乙酸乙酯部分上硅胶柱，分别用氯仿-甲酸乙酯梯度和甲酸乙酯-丙酮梯度洗脱。用紫外检测器监测流出峰，每一个峰为一流分，共收集洗脱液30份。浓缩各流份，用TLC比较，合并相似组分。流分17-27回收溶剂后，再用C18柱细分，甲醇-水梯度洗脱，流份3-4回收溶剂后得化合物Ⅴ（山奈酚），流份6-8再过SephadexLH-20凝胶柱20%甲醇-水洗脱得化合物Ⅵ（蔷薇酸）。
3 结构鉴定
化合物Ⅰ：白色针状结晶（乙酸乙酯），mp136～138 ℃，Liebermann-Burchard 反应显绿色，Molish 反应阴性，表示有甾类化合物。将化合物与已知对照品混合，测熔点不下降，经已知对照品共薄层，在三种溶剂系统下展开，Rf值一致。13C-NMR 所得数据与文献[5，6]中报道β-谷甾醇(β-sitosterol)数据比较基本一致。所以化合物Ⅰ为β-谷甾醇(β-sitosterol)。
化合物Ⅱ ：白色粉末（氯仿），mp68～70℃。易溶于氯仿、乙谜，微溶于甲醇。从1H-NMR可看出, 一个活波氢δ11.95一个甲基δ0.84,14个亚甲基14个亚甲基δ1.22和δ2.16。13C-NMR显示16个碳信号，其中一个甲基δ14.143,一个羧基δ179.803。将其13C-NMR的数据与文献[7]报道的十六烷酸数据一致。因此化合物Ⅱ为十六烷酸（Exadecanioc acid）。对比情况如表3。
表3 化合物Ⅱ碳谱数据与文献数据比较
NO FLEL-17-A 文献值 NO FLEL-17-A 文献值
1 179.803 178.8 9 29.628 29.789
2 34.046 33.891 10 29.267 29.235
3 31.966 32,078 11 29.397 29.432
4 29.732 29,459 12 29.277 26.365
5 29.721 29,320 13 29.105 29.021
6 29.706 28,987 14 24.727 24.579
7 29.693 29,450 15 22.728 23.267
8 34.046 34,302 16 14.143 13.987
化合物Ⅲ：白色无定型粉末（氯仿），mp 45-47℃。可溶于乙醚，氯仿，乙酸乙酯，微溶于甲醇。从1H-NMR可以看出，三个活泼氢，一个甲基，12个亚甲基。将其13C-NMR的数据跟十六烷酸的比较，除显示有双键外，其他基本一致。IR1660cm-1显示有烯烃双键峰，IR650 cm-1显示有烯氢。将该物质的碳谱数据氢谱数据与油酸(十八碳-顺-9-烯酸)的碳谱数据比较除少了2个碳谱数据其他皆一致。综上所述推断化合物Ⅲ为十六碳烯酸（Gadic acid）。
化合物Ⅳ 为白色无定型粉末(氯仿)，mP 52-54℃。易溶于氯仿，乙醚，微溶于甲醇，乙酸乙酯，不溶于丙酮。Liebermann-Burchard 反应显阳性，Molish 反应阴性，表示有甾类化合物。IR1738cm-1处显示有酯基，推断该物质为酯类。谱数据显示有45个碳原子信息，该化合物碳谱和信息为β-谷甾醇和十六烯酸碳谱信息的叠加。对比信息如表4。所以推断化合物Ⅳ为β-谷甾醇与十六碳烯酸所成的酯即β-谷甾醇十六烯酸酯（Sitosterol 16 olefinic acid ester）。该化合物的结构如下:
表4 化合物Ⅳ碳谱数据与十六碳烯酸/β-谷甾醇比较
Figure 2013106242230100002DEST_PATH_IMAGE003
化合物Ⅴ为黄色粉末(甲醇)，Mp275-277℃。可溶于甲醇，盐酸镁粉反应阳性,示为黄酮类化合物：三绿化铁一铁氰化钾反应阳性,示有酚羟基存化。该物质在甲醇溶液中的紫外最大吸收波长λmax为：209，254（带
Figure 123410DEST_PATH_IMAGE004
）、373（带
Figure DEST_PATH_IMAGE005
）.根据带波长位置，提示可能为黄酮醇类物质。加入诊断剂AlCl3/HCl后带
Figure 720406DEST_PATH_IMAGE005
红移56nm提示有3位和5位羟基。将化合物与已知对照品混合，测熔点不下降，经已知对照品共薄层，在三种溶剂系统下展开，Rf值一致。1H NMR 和13C NMR 所得数据与文献[8]报道的山萘酚数据比较基本一致。所以推断化合物Ⅴ为山奈酚（KaemPefrol）。
化合物Ⅵ为白色无定型粉末(甲醇),mp268-270℃。可溶于吡啶，氯仿-甲醇，丙酮。在预制硅胶G板上点样展开,30%硫酸加热后显红色.1H-NMR，13C-NMR数据与文献[9，10]报道的蔷薇酸一致，故推断化合物Ⅵ为蔷薇酸(Euscaphic acid)。从表5可以看出，化合物Ⅵ的17号碳在图谱中没有信息，因为该碳为季碳信息小，被溶剂峰掩盖了，所以看不出来。取上述化合物分别进行对Aβ引起的和H2O2引起的神经细胞损伤的保护作用实验。
表5 化合物Ⅵ碳谱数据与文献数据比较
Figure DEST_PATH_IMAGE007
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实施例4单体成分对神经细胞损伤的保护实验
1. 单体成分对Aβ（β-淀粉样蛋白）引起的神经细胞损伤的保护实验
1.1 实验方法
取对数生长期PC12神经细胞以4×105密度接种于96孔板100μL/孔.分为空白组，模型组，给药组，每组五个副孔。孵箱内培养24h。吸出培养基，给药组加入含药培养基100μL/孔，药物终浓度为100μmol/L；空白组和模型组加入空白培养基100μL/孔。模型组和给药组，每孔加入2μL的Aβ1mmol/L,终浓度为20μmol/L。继续培养48h。每孔加入20μL的MTT，培养4h。吸去培养基，每孔加入150μLDMSO，在摇床上摇匀10min，酶标仪570nm处测OD值。
1.2 实验结果
用SPSS进行单因素方差分析，模型组与空白组比较P<0.01,说明造模成功；β-谷甾醇、油酸与模型组比较P<0.05,说明这两组药对细胞有明显的保护作用；β-谷甾醇油酸酯、蔷薇酸、山奈酚与模型组比较P<0.01,说明这3组药对细胞有显著的保护作用。见表6。
表6  覆盆子单体成分对Aβ引起的神经细胞损伤的保护实验结果
实验组 正常组 模型组 β-谷甾醇 β-谷甾醇十六烯酸酯 蔷薇酸 山奈酚 十六烯酸
1 1.682 1.078 1.257 1.164 1.191 1.282 1.117
2 1.59 1.038 1.224 1.251 1.128 1.247 1.057
3 1.582 1.13 1.177 1.31 1.332 1.288 1.284
4 1.589 1.182 1.198 1.276 1.291 1.451 1.291
5 1.587 1.07 1.161 1.28 1.265 1.319 1.295
Figure 412418DEST_PATH_IMAGE008
 1.606△△   ±0.038 1.0996* *   ±0.057 1.2034△   ±0.038 1.2562△△  ±0.056 1.2414△△  ±0.082 1.3174△△  ±0.079 1.2088△   ±0.113
注：**与空白比较p<0.01显著性差异，△与模型比较p<0.05有明显差异，△△与模型比较p<0.01显著性差异。
2. 单体成分对H2O2引起的神经细胞损伤的保护实验
2.1 实验方法
取对数生长期PC12神经细胞，轻轻吹打至细胞完全脱落。离心，去上清液，培养基重悬细胞，细胞计数后，将细胞以105个/ml的浓度接种于96孔板100μl/孔。培养箱孵育24h，细胞贴壁，轻轻吸去培养基，加之前配置好的含药培养基100μl/孔，空白组和模型组加等量空白培养基。培养箱孵育24h，除空白组外，每孔加入含H2O2浓度为200μmol/L的培养基100μl，H2O2终浓度为50μmol/L。培养箱孵育2h，加MTT，孵育4h。酶标仪测OD值。
2.2 实验结果
通过SPSS分析，空白组与模型组有显著性差异（P<0.01），表明造模成功。在药物浓度100μmol/L时，与模型组比较，β-谷甾醇油酸酯有明显差异（P<0.05），其余五个给药组有显著差异（P<0.01），与空白组比较，山奈酚有明显差异（P<0.05）。在药物浓度10μmol/L时，与模型组比较，只有山奈酚有显著差异（P<0.01）。在药物浓度1μmol/L时，与模型组比较，只有油酸有明显差异（P<0.05）。结果见表7。
表7  覆盆子单体成分对H2O2引起的神经细胞损伤的保护实验结果(
Figure 149430DEST_PATH_IMAGE008
)
组别 N 药物浓度100μmol/L 药物浓度10μmol/L 药物浓度1μmol/L
空白组 5 0.590△△±0.0282 0.590△△±0.0282 0.590△△±0.0282
模型组 5 0.373**±0.0478 0.373±0.0478 0.373±0.0478
蔷薇酸 5 0.579△△±0.0888 0.330±0.0445 0.331±0.0674
β-谷甾醇 5 0.616△△±0.0801 0.352±0.0514 0.353±0.0463
山奈酚 5 0.688△△±0.0333 0.465△△±0.0454 0.373±0.0841
十六烯酸 5 0.662△△±0.0841 0.432±0.0562 0.477△±0.0775
β-谷甾醇十六烯酸酯 5 0.483△±0.0333 0.371±0.0198 0.378±0.0803
注：**与空白比较p<0.01显著性差异，△与模型比较p<0.05有明显差异，△△与模型比较p<0.01显著性差异。
3. 小结
以上结果说明，各成分单体对H2O2损伤和Aβ损伤的神经细胞都有保护作用。提示覆盆子中的甾体类及其衍生物化合物和黄酮类成分都是覆盆子抗老年痴呆的活性成分。
实施例5
将实施例1中各组分，添加常规的药用辅料，制成常规的片剂等剂型。

Claims (3)

1.覆盆子提取物，其特征在于包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分；
所述水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步骤提取：
1）取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2）氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液； 
聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上大孔树脂，用丙酮洗脱优选用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液；
3）乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液；
聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液；
4）取步骤2）氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3）乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分；
取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分；
将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮洗脱部分；
取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分。
2.如权利要求1所述覆盆子提取物，其特征在于所述步骤2）和3）中大孔树脂为D101大孔树脂。
3.权利要求1所述覆盆子提取物在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。
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