CN103613680B - 一种醇沉竹节参多糖及其制备方法与它的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种醇沉竹节参多糖及其制备方法，该方法包括竹节参水提取、脱蛋白、氧化与醇沉等步骤。本发明使竹节参多糖具有明显的佐剂活性，其中60%醇沉竹节参多糖部分的佐剂活性最强，粘均分子量处于中间。自然界中植物多糖分布广泛，另由于其低毒性和有效性使其应用更具有优势，为开发新型疫苗佐剂找到了新的思路和方向。

Description

一种醇沉竹节参多糖及其制备方法与它的用途

【技术领域】

本发明属于疫苗佐剂技术领域。更具体地，本发明涉及一种醇沉竹节参多糖，还涉及所述醇沉竹节参多糖的制备方法，还涉及所述醇沉竹节参多糖的用途。

【背景技术】

竹节参系五加科人参属植物竹节参的干燥呈竹鞭状根茎，为我国的名贵特产少常用的中药材之一。竹节参多生长在海拔1000m以上的阔叶疏林阴湿地或岩石、沟涧旁边，对土壤条件要求较高，适宜在中性或微酸性环境中生长，喜腐殖质层厚、疏松肥沃、排水良好的沙壤土。在云南、贵州、四川、湖北、陕西、甘肃、河南、浙江、安徽、江西等省民间有较长的应用历史，还有少量出口香港。有滋补强壮，散瘀止痛，止血祛痰的功效，也是土家族著名民族药，一直被湖北恩施土家族先民奉为“草药之王”。随着现代药理学研究深入，竹节参的主要功效已经逐步地体现在某一类成分，甚至到某种成分上。竹节参的主要有效成分为竹节参皂苷和多糖类。

在现有技术中也记载了竹节参多糖的制备方法，例如CN101265302B以及CN101265301B记载了竹节参多糖的制备方法，但是使用该方法制备得到的竹节参多糖仅能用于简单药物和保健品之中，这些专利仅提及了竹节参多糖增强免疫力的功效，只是简单的体外增加淋巴细胞增殖活性，并未对其具体作用（疫苗佐剂）进行研究，更没有阐明用于疫苗佐剂。虽然大量研究结果显示，竹节参多糖能够明显增强机体的免疫调节功能，但是作为疫苗佐剂的研究并未见报道，而且用于疫苗佐剂的竹节参多糖在制备方法和产品的选择上具有更加严格的要求。

传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成，含有大量的非特异免疫原性物质，既有疫苗成分，也有佐剂作用，一般不需加佐剂。目前，用于人用疫苗的佐剂为铝盐佐剂(主要是氢氧化铝及其磷酸盐，Alum)。铝盐佐剂作为人类疫苗佐剂已使用了几十年，成为人用疫苗中常用的佐剂，具有良好的佐剂效果。随着新型疫苗的不断出现，铝盐佐剂显现出一些问题，其中包括：(1)因其理化性质特点，铝盐疫苗冷冻后胶体状态被破坏，因此不能冷冻干燥和在低温状态下运输，但现在的很多多肽疫苗必须要低温保存。(2)因含盐量高，贮存日久有结晶沉淀，使制备的疫苗稳定性得不到保障。(3)铝盐对人、畜的神经系统可能有影响。(4)在注射部位有时会发生局部无菌性脓肿，甚至可以形成肉芽肿，轻度局部反应较为常见。(5)对肿瘤疫苗不适合，以铝盐佐剂作疫苗主要适用于以抗体为保护性免疫的疫苗。(6)铝盐佐剂释放抗原物质的速度缓慢，效应也比较弱，对许多可溶性抗原都不够有效，对抗原的要求比较高。因此研究新型疫苗佐剂是制备新型疫苗的重要环节。

正在开发的新型疫苗如基因工程疫苗、核酸疫苗等具有良好的抗原特异性和低毒性，但免疫原性较差，尤其需要佐剂来增强其免疫原性及宿主对抗原的保护性应答。中药活性成分多糖属于天然物质，毒副作用小，取材广泛，开发新型中药佐剂是佐剂研究发展的重要途径和新的趋势。

本发明的竹节参多糖的制备方法把竹节参总多糖分成几个有效部位，利用黏度法区分它们的主要成分；本发明方法制备得到的竹节参多糖具有非常明显的免疫佐剂作用，为开发新型疫苗佐剂指明了方向。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种疫苗佐剂用醇沉竹节参多糖的制备方法。

本发明的另一个目的是提供醇沉竹节参多糖。

本发明的另一个目的是提供所述醇沉竹节参多糖的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法。

该制备方法包括如下步骤：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5～15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85～95%乙醇水溶液中，浸泡1～5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：5～15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1～5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2～5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5～14/15的水分，得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：0.3～1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2～10次，得到脱蛋白的上清液；

C、氧化

往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述合并上清液的pH值调节至7.0～9.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液总体积的1～5%，然后在温度30～60℃下保温2～8h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30～90%，然后在室温下静置3～15h，再进行离心，离心上清液进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述竹节参渣与蒸馏水按照重量比1：8～12混合，然后加热回流提取2～4h。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述的减压浓缩是在压力0.001～0.01MPa下进行浓缩。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述浓缩水提取液与Sevage试剂的重量比是0.6～1.2。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，含有H₂O₂的脱蛋白上清液在温度38～50℃下保温3.2～6.5h。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，含有乙醇的无色溶液在室温下静置5～12h。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述真空干燥是在压力0.01～0.1MPa与温度30～50℃的条件下进行干燥。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的离心分离是在离心机转速1000～3000转/分的条件下进行分离的。

本发明还涉及采用所述制备方法所得到的醇沉竹节参多糖。

本发明还涉及所述的醇沉竹节参多糖在制备疫苗佐剂中的用途。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法。

该制备方法包括如下步骤：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5～15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85～95%乙醇水溶液中，浸泡1～5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：5～15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1～5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2～5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5～14/15的水分，得到浓缩的水提取液；

所述的竹节参原料是目前我国市场上销售的竹节参中药材，例如湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参。通常，竹节参中药材需要进行常规挑选、清洗、干燥等预处理后，再使用在中药材加工技术领域中通常使用的粉碎机对干燥竹节参进行粉碎，粉碎的竹节参再用标准筛进行筛分，收集20-40目竹节参粉作为本发明方法的处理原料。

根据本发明，用乙醇处理竹节参的作用在于去除竹节参另一主要成分皂苷及其它脂溶性杂质的干扰。

在本发明中，使用体积分数为85～95%乙醇水溶液浸泡竹节参粉，如果乙醇水溶液的浓度超过95%，则会使脂溶性皂苷成分除不去达不到脱脂的效果；如果乙醇水溶液的浓度低于85%，则会使得多糖含量降低；因此，乙醇水溶液的浓度为85～95%是合适的，优选地是88～92%。

在用乙醇处理竹节参时，竹节参与乙醇水溶液的重量比优选地是1：6～14，浸泡1.8～4.2h，更优选地是1：8～12，浸泡2.5～3.6h。

用乙醇处理竹节参所使用的设备是目前市场上普遍销售的圆底烧瓶，例如由蜀牛玻璃仪器公司以商品名圆底烧瓶销售的产品。

根据本发明，用蒸馏水提取竹节参的作用是使得竹节参中的水溶性糖完全提取出来。在用蒸馏水提取竹节参时，竹节参渣与蒸馏水的重量比优选地是1：6～12，加热回流提取1.8～4.2h。更优选地是1：8～10，加热回流提取2.8～4.0h。

用蒸馏水提取竹节参所使用的加热回流提取设备是目前市场上销售的电加热套，例如由巩义市予华仪器有限责任公司公司以商品名电热套销售的产品。

在减压浓缩时所使用的设备是目前市场上销售的旋转蒸发仪，例如由上海亚荣生化仪器厂公司以商品名RE-52AA型旋转蒸发仪销售的产品。

根据本发明，在压力0.001～0.01MPa与室温的条件下进行减压浓缩，浓缩除去其水量的4/5～14/15的水分最为合适，如果除去的水量小于4/5，则剩余体积太大，为后续操作带来不便并且浪费试剂；如果除去的水量大于14/15，则多糖过饱和，可能产生沉淀。优选地是除去6/7～12/13的水分，更优选地是除去8/9～11/12的水分。

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：0.3～1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2～10次，得到的脱蛋白的上清液。

Sevage试剂是由氯仿与正丁醇按照体积比5:1组成的试剂。该步骤利用蛋白质在氯仿等溶剂中变性的特点，让所述提取液与Sevage试剂混合、震摇、静置，将蛋白质分离除去，这种方法条件温和，不会引起多糖变性。

该步骤使用的设备是化工技术领域里通常使用的设备大型离心机，例如由济南福的机械有限公司以商品名落地式大型离心机TG21KR销售的产品。

优选地，所述浓缩水提取液与Sevage试剂的重量比是0.6～1.2。

优选地，所述重复除蛋白次数为3-5次。

C、氧化

往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述上清液的pH值调节至7.0～9.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液总体积的1～5%，然后在温度30～60℃下保温2～8h，得到一种无色溶液。

在本发明中，所使用氨水的浓度不是特别关键，通常是以重量计25～35%。

在本发明中，H₂O₂的作用在于将有色的酚类等物质氧化成无色的酸类。如果H₂O₂的体积为所述脱蛋白上清液总体积的1.0%以下时，则不能充分的达到氧化脱色的效果；如果H₂O₂的体积为所述脱蛋白上清液总体积的5.0%以上时，则脱色并未明显增强而浪费时间和试剂；因此H₂O₂的体积为所述脱蛋白上清液总体积的1～5%是合适的。

优选地，所述H₂O₂的体积是所述脱蛋白上清液总体积的1.5～4.5%，更优选地是2.0～4.0%。

在本发明中，含有H₂O₂的脱蛋白上清液优选地在温度38～50℃下保温3.2～6.5h，更优选地在温度42～46℃下保温4.2～5.5h。

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30～90%，然后在室温下静置3～15h，再进行离心，离心上清液进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

在这个步骤中，含有乙醇的无色溶液优选地在室温下静置5～12h，更优选地在室温下静置8～10h。

在这个步骤中，所述真空干燥是在压力0.01～0.1MPa与温度30～50℃的条件下进行干燥。

本发明使用的真空干燥设备是目前市场上销售的产品，例如由上海一恒科学仪器有限公司以商品名真空干燥箱销售的产品。

在本发明中，所述的离心分离是在离心机转速1000～3000转/分的条件下进行分离的。所述的离心机是目前市场上销售的离心机，例如由北京京立离心机有限公司以商品名低速大容量离心机销售的产品。

在本发明中，往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30～90%，因为若使溶液中乙醇浓度小于30%，则乙醇浓度太低，所得多糖量较少；若加入乙醇量大于90%，虽然得到多糖量增加，但后续药理实验证实作为免疫佐剂的效果降低，所以使乙醇浓度达到体积分数为30～90%较为合适，更优选地为55-62%。

本发明还涉及采用所述制备方法所得到的竹节参多糖。所述竹节参多糖的红外图谱如附图2：

从图中可知，在3200-3600cm^-1之间出现一个宽峰，这是多糖分子内或分子间氢键0-H伸缩振动的结果，在2950cm^-1附近是次甲基(—CH2—)中C—H的伸缩振动吸收峰；在1200-1400cm^-1吸收峰是C-H的弯曲振动引起的，它和C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收，1500cm^-1吸收峰是羰基C=O的伸缩振动；1030cm^-1为醇羟基的伸缩振动；在1150cm^-1附近的峰为吡喃糖环的醚键(C-O-C)伸缩振动；在900cm^-1附近的吸收峰为吡喃糖环醚键(C-O-C)非对称伸缩振动；因此，所述30%、60%及90%醇沉竹节参多糖都是含有吡喃糖环的多糖。

采用所述制备方法所得到的醇沉竹节参多糖的含量测定方法如下：

5%苯酚的配制：

称取苯酚100g，加0.1g铝片和0.05g碳酸氢钠，进行常压蒸馏，收集180±2℃馏分。精确称取约10.0g该馏分，置于200mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，4℃保存备用。

葡萄糖对照溶液的配制：

精确称取50mg减压真空干燥至恒重的葡萄糖，溶于在50mL容量瓶中的蒸馏水中，精确移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，加到25mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到一组葡萄糖对照溶液。

本发明醇沉竹节参多糖测试液配制：

精密称定竹节参粉末1g（过四号筛），置圆底烧瓶中，加入50mL80%乙醇，回流3次，每次2h，弃滤液，粉末挥干溶剂后加50mL蒸馏水，称重，静置1h，回流2h，放冷，称重，用蒸馏水补足重量，摇匀，滤过，滤液即是竹节参多糖测试液。

本发明醇沉竹节参多糖最大吸收波长的选择：

吸取葡萄糖标准溶液、本发明醇沉竹节参多糖测试液各1mL至具塞试管中，加入2.0mL苯酚，迅速加入7.0mL浓硫酸，混匀，置40℃水浴中30min，在冰浴中冷却10min。以试剂空白为参比，在200～1100nm波长范围进行扫描，确定最大吸收波长为478nm。扫描结果见附图1。

标准曲线的绘制：

精确量取葡萄糖与测试溶液各1mL，测定吸光度，得到在每1mL含葡萄糖40～160μg范围内葡萄糖量与吸收度呈良好的线性关系，回归方程为A=49.379X+0.1741R2=0.9997。根据回归方程，计算样品中竹节参多糖的含量。

本发明用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖制备方法具有下述特点与优势：

A、采用水回流提取法简单、成本低、易于实现大量生产。

B、水提醇沉法能够将大部分的多糖完全沉淀出来，效率较高。

C、分段醇沉可以将不同极性、不同分子量的多糖区分开来，寻找最强免疫佐剂活性的活性部位。

本发明还涉及所述的醇沉竹节参多糖在制备疫苗佐剂中的用途。

佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，它可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

采用粘度法测定不同醇沉部位多糖粘均分子量，随后进行动物实验并采用ELISA检测抗体滴度（参见实施例部分）及特异性细胞免疫学活性测定，通过这些实验证明，采用本发明方法制备的醇沉竹节参多糖具有佐剂活性。

该佐剂活性表征如下：

应用抗原免疫小鼠，同时分别加入多糖作为免疫佐剂，然后分离小鼠血清，通过ELISA方法检测小鼠特异性抗体产生效价，通过对比ELISA结果中实验组与对照组的OD值，及通过刺激淋巴细胞测定抗原特异性细胞免疫及细胞因子的产生，判断佐剂效果。

与现有的疫苗佐剂相比，本发明醇沉竹节参多糖疫苗佐剂具有优点如下：

A、竹节参多糖疫苗佐剂副作用小、来源广泛、易于生产。

B、竹节参多糖佐剂具有刺激Th1细胞免疫及刺激抗体产生的强大佐剂活性，能更大的辅助疫苗发挥作用。

C、竹节参多糖属于中药疫苗佐剂，为进一步开发新型疫苗佐剂奠定了基础。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明是竹节参多糖具有明显的佐剂活性，其中60%醇沉竹节参多糖部分，粘均分子量处于中间，其佐剂活性明显优于铝佐剂。

ELISA实验结果中，60%醇沉中粘多糖，其多糖佐剂活性表征指标值明显高于单纯抗原组，特异性细胞免疫活性也明显高于铝佐剂。而且，竹节参多糖来源广泛，副作用小，因此，可以作为临床开发的疫苗佐剂。

【附图说明】

图1是本发明醇沉竹节参多糖在波长200～1100nm范围内的吸收光谱；

样品1-葡萄糖，样品2-多糖

图2是60%醇沉竹节参多糖红外光谱图；

图3表示佐剂对小鼠淋巴细胞增殖的细胞因子IL-2产生的影响；

图4表示佐剂对小鼠淋巴细胞增殖的细胞因子IFN-γ产生的影响；

图5表示佐剂对小鼠OVA特异性抗体IgG及其亚型产生的影响。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。在本发明中，在没有特殊说明的前提下，液相混合物中的组分的百分比应当理解为体积百分比，固相混合物的组分的百分比应当理解为重量百分比。

实施例1：本发明醇沉竹节参多糖的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：14，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85%乙醇水溶液中，浸泡1h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：5，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1.8h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.006MPa下减压浓缩得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：0.8，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液在离心机转速2000转/分的条件下进行离心分离，离心的上清液接着重复上述操作4次，得到的离心上清液合并；

C、氧化

往步骤B得到的合并离心上清液中加入以重量计28%氨水，将所述合并上清液的pH值调节至7.6，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的1.5%，然后在温度38℃下保温3.2h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30%，然后在室温下静置3h，再在离心机转速2000转/分的条件下进行离心，离心上清液在压力0.06MPa与温度35℃的条件下进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

采用本说明书描述的方法测定本实施例制备醇沉竹节参多糖的竹节参多糖含量是52.8%。

实施例2：本发明醇沉竹节参多糖的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：8，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85%乙醇水溶液中，浸泡2.5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：8，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取4.2h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取5次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.008MPa下减压浓缩得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：1.0，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液在离心机转速2600转/分的条件下进行离心分离，离心的上清液接着重复上述操作6次，得到的离心上清液合并；

C、氧化

往步骤B得到的合并离心上清液中加入体积分数为35%氨水，将所述合并上清液的pH值调节至7.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的4.5%，然后在温度30℃下保温6.5h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为45%，然后在室温下静置15h，再在离心机转速2600转/分的条件下进行离心，离心上清液在压力0.08MPa与温度40℃的条件下进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

采用本说明书描述的方法测定本实施例制备醇沉竹节参多糖的竹节参多糖含量是65.1%

实施例3：本发明醇沉竹节参多糖的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为90%乙醇水溶液中，浸泡3.6h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：10，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取3次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.001MPa下减压浓缩得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：0.3，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液在离心机转速1000转/分的条件下进行离心分离，离心的上清液接着重复上述操作2次，得到的离心上清液合并；

C、氧化

往步骤B得到的合并离心上清液中加入体积分数为25%氨水，将所述合并上清液的pH值调节至8.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的1%，然后在温度50℃下保温2h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为60%，然后在室温下静置5h，再在离心机转速1000转/分的条件下进行离心，离心上清液在压力0.01MPa与温度30℃的条件下进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

采用本说明书描述的方法测定本实施例制备醇沉竹节参多糖的竹节参多糖含量是81.8%。

实施例4：本发明醇沉竹节参多糖的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为90%乙醇水溶液中，浸泡5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取4次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.002MPa下减压浓缩得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液在离心机转速2600转/分的条件下进行离心分离，离心的上清液接着重复上述操作8次，得到的离心上清液合并；

C、氧化

往步骤B得到的合并离心上清液中加入体积分数为28%氨水，将所述合并上清液的pH值调节至9.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的5%，然后在温度42℃下保温8h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为75%，然后在室温下静置12h，再在离心机转速1500转/分的条件下进行离心，离心上清液在压力0.02MPa与温度46℃的条件下进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

采用本说明书描述的方法测定本实施例制备醇沉竹节参多糖的竹节参多糖含量是65.9%。

实施例5：本发明醇沉竹节参多糖的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：6，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为90%乙醇水溶液中，浸泡1.8h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：6，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取2.8h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取5次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.004MPa下减压浓缩得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1：0.6，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液在离心机转速2000转/分的条件下进行离心分离，离心的上清液接着重复上述操作10次，得到的离心上清液合并；

C、氧化

往步骤B得到的合并离心上清液中加入体积分数为35%氨水，将所述合并上清液的pH值调节至8.5，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的2.0%，然后在温度60℃下保温4.2h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为90%，然后在室温下静置8h，再在离心机转速2000转/分的条件下进行离心，离心上清液在压力0.04MPa与温度50℃的条件下进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖，也称之90%醇沉竹节参多糖。

采用本说明书描述的方法测定本实施例制备醇沉竹节参多糖的竹节参多糖含量是62.3%。

试验实施例：

一、粘度法测定不同醇沉部位的多糖粘均分子量

1、本发明醇沉竹节参多糖溶液粘度流出时间ti

①在粘度计中注入10mL本发明醇沉竹节参多糖溶液；

②测量时，将由上海笛柏化学品技术有限公司销售的粘度计沿A管一侧放倒，使计内溶液由A球全部进入B球，再慢慢顺时针抬起粘度计45°角度，使a球溶液顺利流入定体积c球，并注满。此时可将粘度计竖直，多余溶液及液表面气泡由f管流入b球，观察记录液面通过e1、e2刻度线时所用的时间，即为要测得ti（平行测量2次，偏差＜0.5s）；

③再向粘度计原溶液中依次加入5mL、10mL水，测量其ti。

2、水粘度流入时间t0的测量

用双蒸水洗粘度计3次，再向粘度计中注入10mL左右的双蒸水，操作步骤同上，测其流出时间t0（平行测量2次，偏差＜0.5s）。

3、粘度计最后清洗处理测完后，倾净计内水，使管内尽量不要有残余水珠，将计内废液倒入回收瓶中，侧到放置于实验台上。

二、动物实验

A、实验方法

1、动物分组及免疫方法

本实施例中将竹节参中粘多糖生理盐水溶液和OVA（sigmaAldrich公司）生理盐水溶液混合后在室温下以每分钟50转的转速震荡30分钟，制备竹节参中粘多糖生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液的混合液。其它佐剂与OVA的混合液都是以同样的条件和方法制备。将30只Balb/c雌性小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组:每只皮下注射生理盐水0.2mL;其它各组均按表中所列的剂量进行相应的免疫。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天，在第二次免疫后的14天，取小鼠眼球放血，制备相应的血清，及无菌条件下取小鼠脾脏，进行下列研究。

2、脾细胞悬液的制备

将小鼠断颈处死，用75%的酒精浸泡消毒;无菌条件解剖小鼠取脾;用剪刀剔除结缔组织和脂肪，将脾组织置于放有纱布的平皿内，加3m11640培养液，研磨脾组织，用纱布过滤，吸取1640液得脾细胞悬液。悬液收集到无菌离心管，以1800rpm/min离心5min，弃上清液，加入红细胞裂解液，待红细胞裂解后，以1800rpm/min离心5min，用1640液洗涤细胞两次，用RPMI1640培养液将细胞稀释成1x10⁶个/ml，制成单细胞悬液，用于特异性淋巴细胞增殖实验。

3、特异性淋巴细胞增殖反应

将上述制备的淋巴细胞接种于96孔培养板中，每孔加100μl脾细胞悬液(1x10⁶个/ml)，各孔加等体积OVA溶液(终浓度为10μg/ml)，重复3孔，用RPMI1640(100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10%小牛血清)补到200μl，另设空白对照组。在温度37℃、5％CO₂培养箱中培养68h后，各孔分别加20μl四甲基偶氮唑盐(Methylthiazoletetrazolium,MTT上海生工生物工程技术服务有限公司)溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，吸去上清液，加入200μl酸性二甲基亚砜（DMSO）溶液，振荡，于室温放置15min，用酶标仪于570nm处测定吸光度（OD）值，并按下式计算刺激指数(SI)：

SI(刺激指数)=加有OVA抗原的OD值/未加入OVA抗原的OD值

4、ELISA检测淋巴细胞培养上清中IL-2和IFN-γ的含量

收集上述培养淋巴细胞的上清液，依照试剂盒（美国R&D公司）说明书测定细胞因子，具体操作如下：

1）包被用磷酸缓冲液（PBS）稀释后的捕获抗体，每孔100ul，在温度4℃下包被过夜。

2）ELISA（酶联免疫吸附试验）洗涤液洗三遍后，甩去酶标板内液体，再对着吸水纸轻拍几下。

3）使用1%BSA（牛血清白蛋白）室温封闭90min后重复步骤2。

4）将获取的细胞上清液直接加入已包被有抗体的ELISA板，每孔100μl，在室温下2h。

5）重复步骤2。

6）将生物素标记检测抗体稀释后（终浓度为2000pg/mL）加入ELISA板，每孔100μL，在室温下2h。

7）重复步骤2。

8）将ABC（酶标记亲和素）工作液100倍稀释后加入ELISA板，每孔100μl，置温度37℃箱中反应30min，1×PBS洗3次后，加入TMB显色液100μl，再次置37℃避光反应10-15min。

9）直接加入TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）终止液，每孔50μl后，在450nm波长的酶标仪进行测定。

10）按照试剂盒说明，绘制标准曲线，经OD值计算出各组的细胞因子浓度。

5、ELISA方法测定血清中OVA特异性抗体及亚类效价

收集小鼠外周血血清，测定OVA特异性抗体。在96孔酶标板上，每孔加入100μlOVA的包被液(50μLmLOVA的碳酸盐缓冲液)，置4℃孵育24h，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加封闭液200μL,于37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3min。加100μL待测血清，并用血清稀释液进行倍比稀释。37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG抗体稀释液(1:20000)、羊抗小鼠IgG1抗体稀释液(1:16000)和羊抗小鼠IgG2b抗体稀释液(1:8000)100μL,37℃孵育2h，洗涤3次，每次3min。每孔加100μLTMB底物溶液(A液和B液各50μL),37℃暗处放置10min，每孔加50μL/孔2NH2SO4溶液终止反应。置酶标仪于波长450nm处测定OD值，根据公式计算效价。样品效价=样品的OD值（A450nm）/阴性对照OD值≥2.1时的样品的最大稀释倍数。

C、实验结果

1、粘度法测定不同醇沉部位多糖分子量结果

60%醇沉竹节参多糖的粘度系数为8.167mL·g-1，经公式[η]=k*Mηα（其中K为常数，K=0.007575mL·g-1，α=0.76温度为25℃，溶剂为水时）计算粘均分子量分别为1.45×10⁴。

2、特异性淋巴细胞增殖活性

竹节参中粘多糖（PanaxjaponicusmediumviscositypolysaccharidesPJMVP）属于60%醇沉的多糖，在竹节参总多糖中属于中等粘度，所以命名为PJMVP。

3、对OVA诱导的OVA免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

PJMVP对OVA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响结果见表1。实验结果表明与OVA对照组相比，不同剂量的PJMVP均能极显著促进OVA诱导的小鼠特异性淋巴细胞增殖反应P<0.01;而Alum与单纯OVA相比，没有显著促进OVA特异性淋巴细胞增殖活性。

表1特异性淋巴细胞增殖实验

注:实验测定值用平均值±标准差表示((n=5)，各组与铝佐剂组比较*P<0.05，**P<0.01

4、竹节参中粘多糖对培养的淋巴细胞中IL-2、IFN-γ含量的影响

上述刺激培养的淋巴细胞，于72小时收集上清，应用ELISA试剂盒测定上清中IL-2、IFN-γ含量。实验结果如附图3和附图4，这些实验结果显示培养的淋巴细胞上清中IL-2、IFN-γ含量，在不同剂量的PJMVP组均能显著促进IL-2、IFN-γ的分泌，与抗原OVA组比较P<0.01;而Alum与单纯OVA相比，其IL-2、IFN-γ的分泌没有明显差异。结果表明，PJMVP有良好的促进淋巴细胞分泌IL-2及IFN-γ的作用，提示他们具有促进Th1淋巴细胞增殖的活性。

由ELISA检测抗体滴度图5可以看出：各种佐剂均具有促进抗体生成效应，其中PJMVP作用最为明显，可显著提高免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、IgGl和IgG2b抗体效价。而Alum只具有刺激IgG和IgG1抗体产生作用，对IgG2b没有明显的促进作用（与OVA比较）。这些结果提示Alum主要针对Th2型的免疫效应，对Th1型细胞免疫活化作用较弱，与文献报道一致。PJMVP具有促进Th1和Th2型细胞免疫活化作用介导的抗体产生。

Claims (8)

1.一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A、竹节参水提取

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85~95%乙醇水溶液中，浸泡1~5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：5~15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1~5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2~5次，蒸馏水提取液合并，再在压力0.001~0.01MPa下进行减压浓缩，除去其水量的4/5~14/15的水分，得到浓缩的水提取液；

B、脱蛋白

按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂按重量比1：0.3~1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2~10次，得到脱蛋白的上清液；

C、氧化

往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述上清液的pH值调节至7.0~9.0，再向其中缓慢滴加H₂O₂，在不断的搅拌下使H₂O₂的体积达到所述脱蛋白上清液体积的1~5%，然后在温度30~60℃下保温2~8h，得到一种无色溶液；

D、醇沉

往步骤C得到的无色溶液中加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30~90%，然后在室温下静置3~15h，再进行离心，离心上清液进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述竹节参渣与蒸馏水按照重量比1：8~12混合，然后加热回流提取2~4h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，含有H₂O₂的脱蛋白上清液在温度38~50℃下保温3.2~6.5h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，含有乙醇的无色溶液在室温下静置5~12h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，所述真空干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50℃的条件下进行干燥。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的离心分离是在离心机转速1000~3000转/分的条件下进行分离的。

7.根据权利要求1-6所述制备方法得到的醇沉竹节参多糖。

8.根据权利要求7所述的醇沉竹节参多糖在制备疫苗佐剂中的用途。