CN103611584A - 一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞计数与分类仪器，具体的说是一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞计数方法。本发明通过在微流控芯片设置并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。在细胞计数过程中，通过事先将微通道抽成负压状态，使细胞样品自动进入微通道。本发明具有制作简单，体积小、便于使用、样品消耗量少、计数方便且通量高等特点，可以很好的满足临床需求。
Description
技术领域
本发明属于细胞计数与分类仪器，具体的说是一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞计数方法。
背景技术
细胞计数在生物领域的科学研究和日常医学诊断过程中都具有重要意义。在癌症治疗药物的研发中，常需考察治癌药物对目标细胞的作用效果，需定量对细胞进行计数；医院内为对病人进行疾病的排查，需进行血常规的检查，所以需要对血液中各类细胞进行计数与分类；为考察癌症病人是否存在癌细胞扩散，也需对其血液内的癌细胞进行计数；有些感染了结核的病人并无症状显示，为了确诊其是否被感染，也需对其血液中结核杆菌的数目进行计数。细胞计数对于白血病患者显得尤为重要，为准确得知化疗过程中患者体内的造血骨细胞的数量以随时对治疗方案进行修正，医生需多次对患者血液中的细胞进行计数。据以上所述，细胞尤其是与疾病或癌症有关的细胞的计数显得异常重要，而发展出能量高、计数准确且易于操作的便携式细胞计数器显得尤为重要。
目前已有一些细胞计数装置，比如流式细胞仪，通过细胞的荧光信号或非荧光的散射信号对细胞进行分选和计数，这种方法能量大，且能自动进行计数，但是仪器体积大，价格高，专业性强，所以它的通用性受到很大的限制。除了流式细胞仪，还有细胞计数板也可用作细胞计数，但是这种方法计数速度很慢，消耗人力资源大。因此，目前已有的这些细胞计数方法难以满足当下各领域特别是临床领域的需求。
发明内容
针对背景技术的不足，本发明通过在微流控芯片设置并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。在细胞计数过程中，通过事先将微通道抽成负压状态，使细胞样品自动进入微通道。本发明具有制作简单，体积小、便于使用、样品消耗量少、计数方便且通量高等特点，可以很好的满足临床需求。
本发明的目的是提供一种高通量的细胞计数与分类芯片，具有样品消耗量少、通量高且操作简易的特点。
本发明的技术方案是：一种微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS与基片键合在一起，其特征在于：所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。
如上所述的微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片经真空过程后将整个产品密封。
如上所述的微流控芯片，其特征在于：所述的基片为玻璃基片。
本发明还公开了一种基于微流控芯片的细胞计数方法，包括以下步骤：
步骤一、为目标细胞做荧光标记；
步骤二、制作细胞样品；
步骤三、细胞进样；
步骤四、图片获取及细胞计数与分类；
其特征在于：所述步骤三细胞进样的过程为：将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成负压状态，因此细胞会自动进样至微通道中，大部分细胞会停留在微通道的微腔室中。
如上所述的细胞计数方法，其特征在于：所述的制作细胞样品具体为：采用离心的方法去除上清液，再在离心管中加入磷酸缓冲液，充分吹打后离心，去除上清液，再加入少量磷酸缓冲液即可制得细胞样品
如上所述的细胞计数方法，其特征在于：所述的步骤一是通过连接有荧光染料的抗体与细胞表面抗原反应后，离心去除过量的抗体；此处针对不同细胞可以选择不同抗体，且样品细胞有多类时，可以同时选择几种带荧光标记的抗体。
本发明的技术效果体现在：本发明的微流控芯片具有制作简单，体积小、便于使用等特点。本发明的方法用连接有荧光染料的抗体对目标细胞进行选择性标记，特异性强；细胞进样时，由于微通道已被抽成真空状态，因此进样口的细胞样品会自动进样；微通道中体积小，所样品消耗非常少；CCD拍照后可通过软件对目标细胞进行自动计数，计数效率高；通过不同荧光标记的抗体可以同时对细胞进行计数和分类。
附图说明
图1微流控芯片掩膜示意图，白色部分为透光区域，黑色部分为不透光区域；
图2（A）为微流控芯片阳模加工匀胶前烘步骤示意图；
图2（B）为微流控芯片阳模加工曝光步骤示意图；
图2（C）为微流控芯片阳模加工后烘步骤示意图；
图2（D）为微流控芯片阳模加工坚模步骤示意图；
图3为微流控芯片示意图；
图4（A）所拍细胞明场图；
图4（B）所拍细胞暗场图。
具体实施方式
名称解释：PDMS为聚二甲基硅氧烷的英文缩写
PGMEA为丙二醇甲醚醋酸酯的英文缩写
下面结合附图对本发明做进一步地详细说明。
本发明所述的高通量细胞计数与分类方法，包括以下步骤：
第一步、为目标细胞做荧光标记。将一种或多种连接有荧光染料的抗体加至含有一种或多种目标细胞悬液的离心管中，充分混合均匀，常温下孵育10分钟。
第二步、采用离心的方法去除上清液，再在离心管中加入磷酸缓冲液，充分吹打后离心，去除上清液，再加入少量磷酸缓冲液即可制得细胞样品。本步骤中的离心方法为：离心时间5分钟，每分钟转速1000转，后续步骤中将离心时间和转速在离心步骤中用括号标注。
第三步、将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成负压状态，因此细胞会自动进样至微通道中，大部分细胞会停留在微通道的微腔室中，即细胞完成进样。
微流控芯片的PDM S具有透气性，如果将整个PDM S放在真空干燥器，抽成真空后，整个PDMS层一直处于负压状态。拿出该产品放置在一般的环境中，该产品还能保持5分钟至10分钟的负压，只要此时将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，细胞便会自动进样至微通道中。
第四步、进样后，将芯片静置约10 分钟，即可在显微镜下用CCD进行荧光照片的拍摄。目标细胞带有荧光，在荧光照片上体现为亮点，而非目标细胞不会呈现亮点；若同时存在多类目标细胞，则可通过选取不同滤片组对相应目标细胞进行荧光照片的采集。最后采用软件例如Image Pro Plus对目标细胞（即图片中的亮点）进行自动计数，然而根据成像区域的体积和成像区域内的目标细胞数目即可算出目标细胞的浓度。
下面通过一个具体的实施方式对本发明做进一步的说明。
实例1：检测人血中自免细胞的数目。
人血中含有的白细胞内有部分是自免细胞，且人与人之间自免细胞所占白细胞比例有较大差异，对自免细胞数目的测定非常重要。自免细胞表面有CD4抗体，可用连接有荧光素的CD4抗体对其自免细胞进行特异性标记，然后根据荧光场下图片中的亮点个数对自免细胞进行计数。
1. 细胞样品制备
将取到的血液样本去除红细胞，用磷酸缓冲液缓冲液（pH 7.4）悬浮剩下的白细胞。取出200微升细胞液， 离心(1000转每分钟, 离心5分钟), 去除上清液；加入50微升 磷酸缓冲液缓冲液，加入10微升标记物（荧光素连接的CD4抗体），混匀，常温孵育15分钟后，离心（1200转每分钟, 离心10分钟）, 去除上清液；加入1毫升 磷酸缓冲液缓冲液，轻轻混匀，离心(1200转每分钟, 离心10分钟)，去除上清液；再加入200微升 磷酸缓冲液缓冲液制得最后的细胞样品。
2. 微流控芯片及其制作工艺。
本发明的微流控芯片包括PDMS和玻璃基片，PDMS与玻璃基片键合在一起，所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔；在进样前将阵列式微通道抽成真空状态；进样时，滴加于进样口的细胞即可自动进入微通道中。
为了便于微流控芯片的使用，在产品制作完成后，将其放置在真空干燥器中，抽成真空后，使整个PDM S层一直处于负压状态，然后将整个产品密封。使用时，只要撕开密封袋，将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，细胞便会自动进样至微通道中。
2.1 掩膜制作
使用AutoCAD软件对掩模图形进行设计，采用25400 dpi激光打印机将设计好的掩模图形打印在菲林胶片上，本研究PDMS阵列式细胞检测装置使用的AutoCAD掩模图形如图1所示，图中黑色部分为不透光区域，白色部分为透光区域即微通道区域，包括六条并列的微通道，每条微通道含有六个微腔室。掩膜的功能在于区分图形区和非图形区，在光照时实现光刻胶的局部曝光，从而将掩模设计的图形转移到光刻胶层。本实施例中的光刻胶选取SU-8 光刻胶。
2.2 基片清洗及匀胶
如附图2（A）所示，匀胶之前，预备涂光刻胶的硅片（直径为3英寸）需先经丙酮（除油脂、手印等）、Piranha溶液（浓硫酸与过氧化氢体积比为3 : 1）和超纯水的严格清洗，并采用高温（150摄氏度1小时h或200摄氏度20分钟）烘干以除去硅片上的吸附水。在硅片中心滴加3毫升的SU-8 光刻胶，后置于匀胶机转盘的中心位置，使硅片中心与转盘中心重合，通过真空抽吸固定硅片，采用匀胶程序（600转每分钟18秒，然后1500 转每分钟60秒）匀胶，其对应SU-8 胶厚度为50微米。匀胶后，涂覆光刻胶的硅片需要平整放置至少1小时以上进行前置，利用SU-8 光刻胶的自平整特性，消除匀胶过程中造成的细小坑洼或波纹，以使SU-8 光刻胶层均匀、平整而无气泡。
整个阳模的制作过程(包括匀胶、前烘、曝光、后烘、坚模五个工艺步骤)在装有黄光特种灯管（滤除可见光中的蓝光和紫外的波长）的百级超净间（每立方英尺空气中直径大于等于0.5微米的尘粒数小于100个）内进行。
2.3 前烘
如附图图2（A）所示，采用以下加热程序对SU-8光刻胶进行前烘：从室温以2摄氏度每分钟的速度升温至65摄氏度，在65摄氏度的温度下保持15分钟，再以2摄氏度每分钟的速度升温至95摄氏度，在95摄氏度的温度下保持120分钟后，以2摄氏度每分钟的速度降温至室温。前烘是SU-8阳模制作过程中非常重要的一个环节。前烘的作用是除去光刻胶内的大部分溶剂，同时使光敏分子在垂直方向上获得高斯分布，增加光刻胶在基片上的粘着力。前烘不足易导致光刻胶发软，在曝光时粘附掩模，从而污染菲林胶片，且最终不能获得精细图形，甚至在显影时漂胶；前烘过度则会导致显影时间增长，使得图形在Z轴上有歧视效应。一般来说前烘应该缓慢升温，使胶内分子能够稳定扩散。
2.4 曝光
如附图2（B）所示，通过光刻可以将掩模上的图形转移至光刻胶上。光刻的原理为：经过前置和前烘后，光敏分子均匀分布在光刻胶层，经过紫外光i线（365 纳米）的照射后，光引发剂吸收光子发生光化学反应，生成强酸，在后烘过程中作为酸性催化剂引发SU-8 光刻胶的交联反应，每一个环氧基都能与同分子或不同分子的其他环氧基反应。交联形成的致密交联网络结构在其后的显影过程中变得惰性而不能被显影液溶解，微结构部分由此在胶内与非结构部分区分开来。本研究采用90 s的时间进行光刻胶的曝光。
2.5 后烘
如附图2（C）所示，采用以下的加热程序对硅片进行后烘：从室温以2摄氏度每分钟的速度升温至65摄氏度，在65摄氏度的温度下保持15分钟，再以2摄氏度每分钟的速度升温至95摄氏度，在95摄氏度的温度下保持40分钟后，以2摄氏度每分钟的速度降温至室温。后烘是为了进一步除去光刻胶中的溶剂，促进化学交联反应的进行，后烘充分能使曝光区域内交联反应充分，从而在显影中获得垂直的微结构。
2.6 显影和定影
显影和定影是在硅片上生成图形的关键步骤。显影液为PGMEA，定影液为异丙醇，显影时间为80秒。显影和定影的具体操作为：轻轻摇动显影容器使硅片上的光刻胶被均匀溶解，采用异丙醇定影，若显影不完全，在硅片上将会呈现白色沉淀物，将其用PGMEA冲洗掉，继续显影，直至再次用异丙醇冲洗时不再出现白色物质，即表明显影完全，用氮气枪将硅片吹干后，可以很明显的看到设计的图形。显影对于光刻胶来说是一个从外至内的过程，成功显影的结果应该具有垂直而精细的边壁结构。
2.7 坚膜
如附图2（D）所示，将显影后具有微结构的硅片置于真空烘箱中，135摄氏度的温度下静置120分钟，自然冷却，加固交联后的PGMEA在基片上的粘附, 此处得到的微结构称为阳模。
上述2.2至2.7的加工过程示意图如图2（A）至图2（D）所示。
2.8 PDMS固化
首先将PDMS预聚体（二甲基硅氧烷单体）和固化剂按照10：1的比例搅拌混匀，置于真空干燥器中真空脱气后，倒在有围堰的坚膜后的硅片上，置于热平板上65摄氏度温度下烘烤4小时后，PDMS将通过交联反应形成有弹性的透明固体。将PDMS从SU-8阳模上剥离下来，在入口处用针头打孔，从而得到有微通道结构的PDMS基片。将玻璃片与PDMS键合即得到PDMS阵列式细胞检测装置。
2.9 玻璃基片处理
将玻璃基片先用丙酮超声清洗30分钟后（除油脂、手印等），用超纯水漂洗后加入Piranha溶液80摄氏度温度下超声清洗30分钟，再用超纯水超声清洗后，置于热平板上150摄氏度温度下烘烤1小时后，除去基片上的吸附水，冷却至室温。
2.10 键合
打开等离子体清洗器清洗空腔，清除腔内杂质，并获得稳定氧气流；将需要键和的PDMS和玻璃基片平放入腔内，待键合的表面朝上放置；抽真空，打开高频电源至600伏，当达到所需真空度时清洗机会起辉（紫红色），氧气流量为600毫升每分钟，清洗60秒；取出、对齐、贴合后，置于150分钟热平板上静置30分钟，使PDMS与玻璃基片键合在一起，得到阵列式微流控芯片。
2.11 微通道真空处理
将加工好的微流控芯片放置于真空干燥器中，用外设真空泵抽真空20分钟，然后取出微流控芯片，在入口处贴上胶带以保持微通道内负压状态。
3. 细胞进样
用移液枪取5微升上述制好的细胞样品滴加至微通道的入口处，由于通道中负压的存在，细胞样品会自动流进微通道中。进样后让将微流控芯片静置10分钟。
4. 细胞成像
将进样好的微流控芯片置于倒置荧光显微镜的载物台上，在明场和荧光场下，采用20倍物镜，对微通道中同一位置的细胞进行明场和暗场图片的拍摄。其中，暗场（即荧光图片）用汞灯作为光源对荧光素进行激发，滤片组为：激发滤片460-490纳米，二色镜 505纳米，发射滤片510-550纳米。
由于目标细胞标记了荧光素，在暗场下为亮点。通过软件Image Pro Plus计算暗场（如图4（B））下亮点的个数，对比明场（如图4（A））下细胞的总个数，就可得知所拍图片中目标细胞占细胞总数的比例；另外，根据成像区域的体积其区域内目标细胞的个数可以推算出细胞样品内目标细胞的个数或浓度。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS与基片键合在一起，其特征在于：所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片经真空过程后将整个产品密封。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述的基片为玻璃基片。
4.一种基于微流控芯片的细胞计数方法，包括以下步骤：
步骤一、为目标细胞做荧光标记；
步骤二、制作细胞样品；
步骤三、细胞进样；
步骤四、图片获取及细胞计数与分类；
其特征在于：所述步骤三细胞进样的过程为：将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成负压状态，因此细胞会自动进样至微通道中，大部分细胞会停留在微通道的微腔室中。
5.如权利要求4所述的细胞计数方法，其特征在于：所述的制作细胞样品具体为：采用离心的方法去除上清液，再在离心管中加入磷酸缓冲液，充分吹打后离心，去除上清液，再加入少量磷酸缓冲液即可制得细胞样品。
6.如权利要求4所述的细胞计数方法，其特征在于：所述的步骤一是通过连接有荧光染料的抗体与细胞表面抗原反应后，离心去除过量的抗体；此处针对不同细胞可以选择不同抗体，且样品细胞有多类时，可以同时选择几种带荧光标记的抗体。
7.如权利要求4所述的细胞计数方法，其特征在于：所述的微流控芯片为权利要求1、2或3所述的微流控芯片。
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