CN111398236A - 微流控芯片检测系统及应用和抗原抗体免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控芯片检测系统及应用和抗原抗体免疫检测方法，涉及免疫学技术领域，所述微流控芯片检测系统包括光源、微流控芯片和图像采集设备，所述光源用于照射所述微流控芯片，所述图像采集设备用于采集光源照射下所述微流控芯片中检测样品的图像。本发明提供的微流控芯片检测系统，采用光源照射微流控芯片，以使得图像采集系统能够采集微流控芯片中检测样品的图像，通过分析图像采集系统采集到的微流控芯片中待测物的图像，得到参与反应的待测物的体积，方便快捷。

Description

微流控芯片检测系统及应用和抗原抗体免疫检测方法
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其是涉及一种微流控芯片检测系统及应用和抗原抗体免疫检测方法。
背景技术
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。
随着微流控技术的发展，越来越多的微流控芯片被应用在临床检测领域。微流控芯片结构的精密性及可重复性保证了微流控芯片批间差异小，结果可重复；其微通道保证所需样本量极少，只需微升级别的样品，方便快捷。但是目前临床检测领域的微流控芯片主要是通过检测荧光素与检测抗原或抗体相标记后的荧光强度得到待测物的浓度，无法测定参与反应的待测物的体积。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种微流控芯片检测系统，以通过分析微流控检测芯片检测系统采集的微流控芯片中检测样品的图像，得到参与反应的待测物的体积。
本发明提供的微流控芯片检测系统，包括光源、微流控芯片和图像采集设备，所述光源用于照射所述微流控芯片，所述图像采集设备用于采集光源照射下所述微流控芯片中检测样品的图像。
进一步的，所述微流控芯片包括依次连通的加样区、结合区、反应区和废液区。
进一步的，所述微流控芯片中，所述加样区和所述结合区之间设置有过滤区。
进一步的，所述微流控芯片中，所述反应区包括微管道，所述微管道的直径为10μm－4mm。
进一步的，所述图像采集设备包括摄像头、摄像机和相机中的至少一种。
进一步，所述光源与所述微流控芯片之间依次设置有第一透镜和第一滤色片。
本发明的目的之二在于提供上述微流控芯片检测系统在抗原抗体免疫检测中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种抗原抗体免疫检测方法，采用本发明目的之一提供的微流控芯片检测系统，测定参与反应的待测物的体积。
进一步的，所述抗原抗体免疫检测方法包括如下步骤：
(a)在结合区底部设置第一抗原/抗体示踪剂复合物，在反应区底部固定第二抗原/抗体；
(b)将待测物加入加样区，待测物通过加样区流入结合区，在结合区和第一抗原抗体与示踪剂复合物结合后流入反应区，在反应区再与第二抗原/抗体结合，其中，未与第二抗原/抗体结合的待测物流入废液区；
(c)采用图像采集装置分别采集待测物流经结合区和反应区的图像，通过分析待测物在结合区和反应区的图像，得到参与反应的待测物的体积；
优选地，示踪剂包括荧光微球和/或酶结合物。
进一步的，所述待测物包括化学小分子、生物大分子、细菌和病毒中的至少一种；
优选地，所述生物大分子包括抗原、抗体、激素和抗生素中的至少一种；
优选地，所述化学小分子包括小分子药物和/或小分子毒品。
本发明提供的微流控芯片检测系统，采用光源照射微流控芯片，以使得图像采集系统能够采集微流控芯片中检测样品的图像，通过分析图像采集系统采集到的微流控芯片中待测物的图像，得到参与反应的待测物的体积，方便快捷。
本发明提供的抗原抗体免疫检测方法，通过本发明提供的微流控芯片检测系统获得参与反应的待测物体积，方便快捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的微流控芯片检测的结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的微流控芯片的结构示意图。
图标：
100－微流控芯片；101－加样区；102－过滤区；103－结合区；104－反应区；105－废液区；201－光源；202－第一透镜；203－第一滤色片；300－图像采集设备；401－荧光探测器；402－第二透镜；403－第二滤色片。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
目前体外诊断产品市场上的微流控检测试剂盒大都是利用抗原和抗体特异性结合的原理，用不同的荧光素作为标记抗体或抗原，与固定相的抗体或抗原，特异性的和待检测样本中的抗原或抗体，形成复合体，最后检测复合体的荧光强度来完成测定样本中待测物的浓度。但是仍没有测定待测物体积的设备。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种微流控芯片检测系统，包括光源、微流控芯片和图像采集设备，所述光源用于照射所述微流控芯片，所述图像采集装置用于采集光源照射下所述微流控芯片中检测样品的图像。
在本发明中，光源用于照射微流控芯片，光源可以为单色光源，其中，单色光源可以但不局限于为单色LED光源。
在本发明的一种优选实施方式中，单色LED光源的中心波长信号大于荧光信号的波长，还可以为红光或者近红外光，进而采用本发明的光源可以减少在进行荧光检测时造成干扰。
在本发明的一种优选实施方式中，光源与微流控芯片之间依次设置有第一透镜和第一滤色片，以进一步提高光源的抗干扰能力，减小发散角和提高照明效果。
在本发明的一种优选实施方式中，微流控芯片包括依次连通的加样区、结合区、反应区和废液区。
在本发明的优选实施方式中，加样区用于滴加待测物，待测物通过加样区在毛细管作用下进入结合区与结合区内第一抗原/抗体与示踪剂复合物结合后，继续流入反应区，在反应区与固定在反应区底部的第二抗原/抗体结合，未与反应区中第二抗原/抗体结合的待测物流入废液区。
在本发明的一种优选实施方式中，加样区设置成圆形或椭圆形的腔体结构，也可以设置成其它形状。
在本发明的一种优选实施方式中，结合区设置于加样区和反应区之间，其一端呈锥形，用于与加样区相连通，另一端呈微管道状用于与反应区相连通。
在本发明的一种优选实施方式中，加样区和结合区之间设置有过滤区，以利于将待测物中的杂质去除，避免杂质的存在影响检测结果。
在本发明的进一步优选实施方式中，过滤区可以由阵列排布的微柱组成，微柱直径为1μm－2mm，相邻微柱之间的距离为10μm－5mm。
典型但非限制性的，微柱直径如为1μm、2μm、5μm、8μm、10μm、12μm、15μm、18μm、20μm、30μm、50μm、80μm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm或2mm。
典型但非限制性的，相邻微柱之间的距离为10μm、12μm、15μm、18μm、20μm、30μm、50μm、80μm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。
在本发明的一种优选实施方式，过滤区由滤纸组成，滤纸根据待测物的不同选择不同的型号。
在本发明的一种优选实施方式中，反应区包括微管道，微管道的直径为10μm－4mm。
典型但非限制性的，微管道的直径如为10μm、12μm、15μm、18μm、20μm、30μm、50μm、80μm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm或4mm。
在本发明的一种实施方式中，反应区呈微管道状，以利于待测物在毛细管作用下在反应区流动。
在本发明的一种优选实施方式中，图像采集设备包括摄像头、摄像机和相机中的至少一种。
上述“至少一种”指的是图像采集设备既可以为摄像头、摄像机或相机，也可以同时采用摄像头、摄像机或相机中的两种或三种同时获取图像信息。
在本发明的一种优选实施方式中，所获取的图像信息包括但不限于图片或视频等。
在本发明的一种优选实施方式中，微流控芯片检测系统还可以包括荧光探测器，该荧光探测器用于探测反应区的荧光强度，从而根据荧光强度计算得到待测物的浓度。
在本发明的一种优选实施方式中，荧光探测器与微流控芯片之间依次设置有第二透镜和第二滤色片，以进一步减少干扰，提高检测的准确度。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了上述微流控芯片检测系统在抗原抗体免疫检测中的应用。
通过采用本发明第一个方面提供的微流控检测系统能够在不需要设定定量反应腔的情况下即可方便快捷测定参与反应的待测物的体积，有效降低了抗原抗体免疫检测的成本，具有广阔的应用前景。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种抗原抗体免疫检测方法，其采用本发明第一个方面提供的微流控芯片检测系统，即可在不改造现有微流控芯片结构的基础上，通过获取待测物在流经微流控芯片时的图像，得到参与反应的待测物的体积，有效降低了抗原抗体免疫检测的成本，具有广阔的应用前景。
在本发明中，“参与反应的待测物”指的是能够与固定在结合区中的第二抗原/抗体发生反应的待测物。
在本发明的一种优选实施方式中，抗原抗体免疫检测方法，包括如下步骤：
(a)在结合区底部设置第一抗原/抗体与示踪剂复合物，在反应区底部固定第二抗原/抗体；
(b)将待测物加入加样区，待测物通过加样区流入结合区，在结合区和第一抗原/抗体与示踪剂复合物结合后流入反应区，在反应区再与第二抗原/抗体结合，其中，未与第二抗原/抗体结合的待测物流入废液区；
(c)采用图像采集装置分别采集待测物流经结合区和反应区的图像，通过分析待测物在结合区和反应区的图像，得到参与反应的待测物的体积。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(a)中，在反应区底部设置的第一抗原/抗体与示踪剂复合物能够在反应区内自由流动。
在本发明的一种优选实施方式中，“/”代表“或”，上述“第一抗原/抗体”指的是“第一抗原或第一抗体”，上述“第二抗原/抗体”指的是“第二抗原或第二抗体”。
在本发明的一种优选实施方式中，示踪剂包括但不限于荧光微球和酶结合物等物质。
在本发明的一种实施方式中，示踪剂为荧光微球时，步骤(a)中，在反应区底部设置第一抗原/抗体与荧光微球复合物采用如下方法制备得到：
(1)取稀土荧光微球溶液经活化后加入第一抗体/抗原进行标记，对标记第一抗原/抗体的微球进行封闭处理后再经清洗、重悬，得到第一抗原/抗体与荧光微球复合物；
(2)将第一抗原/抗体与荧光微球复合物点样至微流控芯片上的结合区，并干燥，即完成在反应区底部设置第一抗原/抗体与荧光微球复合物。
在本发明的一种优选实施方式中，荧光微球为含有稀土元素Eu或Tb或Sm的荧光微球，荧光微球由聚苯乙烯、二氧化硅、四氧化三铁等材料中的一种或多种聚合形成。
在本发明的一种优选实施方式中，荧光微球的表面包括但不限于带有羧基、氨基修饰或不带修饰的微球。
在本发明的一种优选实施方式中，荧光微球的直径为10nm－100μm。
典型但非限制性的，稀土荧光微球的直径如为10μm、20μm、50μm、80μm、1μm、2μm、5μm、8μm、10μm、20μm、30μm、50μm、70μm、80μm、90μm或100μm。
在本发明的一种优选方式中，对荧光微球的活化包括但不限于使用EDC、戊二醛等物质对荧光微球进行活化。
在本发明的一种优选实施方式中，第一抗体/抗原与荧光微球的复合物为标记一种或同时标记多种抗体或抗原的复合物。
在本发明的一种优选实施方式中，在结合区点样后的干燥的方法包括但不限于烘箱烘干、冷冻干燥和真空干燥。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(a)中，在结合区底部固定第二抗原/抗体采用如下方法制备得到：
将第二抗原/抗体在反应区点样，使得第二抗原/抗体固定于反应区底部，干燥，即完成在结合区底部固定第二抗原/抗体。
在本发明的一种优选实施方式中，上述干燥的方法包括但不限于自然风干、烘箱烘干、冷冻干燥和真空干燥等。
在本发明的一种优选实施方式中，第二抗原/抗体在反应区点样，点样并固定的方法包括但不限于被动吸附、共价偶联、亲核吸附等方法。
在本发明的一种优选实施方式中，微流控芯片上可定量标记一个或多个抗体/抗原，因而能实现单一样品的多个项目同时检测，提高检测效率。
在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(c)中，采用图像采集装置分别采集待测物进入结合区后与第一抗原/抗体与荧光微球复合物结合充分后的图像P1和待测物与第一抗原/抗体于荧光微球复合物结合后的结合物流经结合区进入反应区后与第二抗原抗体充分结合后的图像P2，通过P1和P2分别计算得到流经结合区和反应区的待测物体积V1和V2，计算两者的差值即为参与反应的待测物的体积。
在本发明的一种优选实施方式中，通过图像P1和P2计算V1和V2的算法示例如下：
由于微流控芯片中，结合区及反应区的微通道的宽度和高度都是已知的，以设置有第一抗原/抗体与示踪剂的结合区的微通道为2mm宽微通道为例，取图像P1上微通道上边长等于微通道宽度的一个正方形，统计该正方形内的像素个数，由此得到图像面积与像素数量的对应关系，从而可以根据拍摄的图像P1中的像素点数计算得到图像总面积，通过该面积乘以微通道的高度，即可计算得到流经结合区的待测物体积V1，同理可以计算得到流经反应区的待测物体积V2。
在本发明的一种优选实施方式中，微流控芯片检测系统设置有荧光探测器时，还可以根据荧光探测器探测到的反应区的荧光强度，计算得到待测物的浓度。
在本发明的一种优选实施方式中，待测物化学小分子、生物大分子、细菌和病毒中的至少一种；
上述“至少一种”指的是待测物既可以为化学小分子、生物大分子、细菌或病毒中的任意一种，还可以为上述物质两种或两种以上物质的混合物。
在本发明的进一步优选实施方式中，化学小分子包括但不限于小分子药物和小分子毒品等。
所述生物大分子包括但不限于抗原、抗体、激素和抗生素等。
下面结合实施例和对比例将本发明提供的技术方案做进一步的描述。
实施例1
本实施例提供了一种微流控芯片检测系统，如图1所示，包括光源201、微流控芯片100和图像采集设备300，光源201用于照射微流控芯片100，图像采集设备300用于采集光源201照射下微流控芯片100中检测样品的图像。
在本实施例的一种优选实施方式中，光源201与微流控芯片100之间依次设置有第一透镜202和第一滤色片203，以进一步提高光源201的抗干扰能力，减小发散角和提高照明效果。
在本实施例的一种优选实施方式中，如图2所示，微流控芯片100包括依次连通的加样区101、结合区103、反应区104和废液区105。
在本实施例一种的优选实施方式中，加样区101用于滴加待测物，待测物通过加样区101在毛细管作用下进入结合区103与结合区103内第一抗原/抗体与荧光微球的复合物结合后，继续流入反应区104，在反应区104与固定在反应区104底部的第二抗原/抗体结合，未与反应区104中第二抗原/抗体结合的待测物流入废液区105。
在本实施例的一种优选实施方式中，加样区101和结合区103之间设置有过滤区102，以利于将待测物中的杂质去除，避免杂质的存在影响检测结果。
在本实施例的一种优选实施方式中，反应区104包括微管道，微管道的直径为10μm－4mm。
在本实施例的一种优选实施方式中，图像采集设备300选自摄像头、摄像机或相机中的一种。
在本发明的一种优选实施方式中，微流控芯片100检测系统还可以包括荧光探测器401，该荧光探测器401用于探测反应区104的荧光强度，从而根据荧光强度计算得到待测物的浓度。
在本实施例的一种优选实施方式中，荧光探测器401与微流控芯片100之间依次设置有第二透镜402和第二滤色片403，以进一步减少干扰，提高检测的准确度。
实施例2
本实施例提供了一种采用实施例1提供的微流控芯片进行抗原抗体免疫检测的方法，包括如下步骤：
(1)微流控芯片的制备：微流控芯片由亲水的基片和盖片组成，将基片和盖片统一注塑生产后进行表面改性，得到微流控芯片；
(2)荧光微球与第一抗原/抗体复合物的制备：
(2.1)取1mg稀土荧光微球(购置bangslabs)，离心后去除上清，用400μL包被缓冲液洗涤两次，包被缓冲液配方：称量9.76g MES(2－吗啉乙磺酸)，溶于1L蒸馏水，用5M NaOH调节pH＝6.0；
(2.2)活化：在洗涤后的微球中分别加入50μL的EDC(浓度为0.1mg/mL)，室温震荡1h；
(2.3)活化后的胶乳，离心去上清，用10M PB缓冲液洗涤两次，加入适当量第一抗体(PCT)，室温震荡2h，使得第一抗体与荧光微球结合；
(2.4)在步骤(2.3)制备得到的第一抗体与荧光微球的结合物中加入50Mm的羟胺，震荡30min，通过离心，去除上清，加入封闭缓冲液，室温震荡30min。封闭缓冲液配方：1％BSA，10mM PB；
(2.5)将封闭后的结合物离心去上清，用10Mm PBS清洗三次；清洗好后的微球离心去上清，加入400μL微球储存液，保存于4℃，得到第一抗体与荧光微球的复合物；微球储存液配方：1％BSA，0.1％Tween－20，0.05％叠氮钠，10mM PB；
(3)在结合区设置第一抗体与荧光微球的复合物：吸取1μL包被了第一抗体与荧光微球的复合物，点样至结合区的底部，在37℃烘箱中，放置1.5h烘干；
(4)将表面修饰后的盖片浸泡入5％戊二醛溶液中，室温反应30min后，用水清洗，37℃烘干，吸取0.5μL第二抗体(PCT)，点样在对应反应区，在湿盒中抚育1h后，用10mM PBS清洗后在37℃烘干10min；将盖片放入1％BSA 10MmPBS溶液中，封闭30min；用10Mm PBS清洗后，在37℃烘干；
(5)芯片键合：采用双面胶键合的方式，将盖片与极片键合在一起；
(6)待测物参与反应体积的测定
(6.1)将待测物加入加样区，待测物流经结合区和第一抗体与荧光微球的复合物结合后流入反应区，与固定在反应区底部的第二抗体反应，未参与第二抗体反应的待测物及待测物与荧光微球的复合物的结合物流入废液区；
(6.2)在光源照射下，使用相机分别采集待测物和第一抗体与荧光微球的复合物充分结合后流经结合区的图像P1和待测物和第一抗体与荧光微球的复合物与第二抗体充分反应后在反应区的图像P2；
(6.3)通过P1和P2分别计算得到流经结合区和反应区的待测物体积V1和V2，计算两者的差值即可得到与第二抗体反应的待测物的体积。
在本实施例的一种优选实施方式中，还可以采用荧光探测器测定待测物的浓度。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片检测系统，其特征在于，包括光源、微流控芯片和图像采集设备，所述光源用于照射所述微流控芯片，所述图像采集设备用于采集光源照射下所述微流控芯片中检测样品的图像。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片检测系统，其特征在于，所述微流控芯片包括依次连通的加样区、结合区、反应区和废液区。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片检测系统，其特征在于，所述加样区和所述结合区之间设置有过滤区。
4.根据权利要求2所述的微流控芯片检测系统，其特征在于，所述反应区包括微管道，所述微管道的直径为10μm－4mm。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片检测系统，其特征在于，所述图像采集设备包括摄像头、摄像机和相机中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片检测系统，其特征在于，所述光源与所述微流控芯片之间依次设置有第一透镜和第一滤色片。
7.根据权利要求1－6任一项所述的微流控芯片检测系统在抗原抗体免疫检测中的应用。
8.一种抗原抗体免疫检测方法，其特征在于，采用权利要求1－6任一项所述的微流控芯片检测系统，得到参与反应的待测物的体积。
9.根据权利要求8所述的抗原抗体免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)在结合区底部设置第一抗原/抗体与示踪剂复合物，在反应区底部固定第二抗原/抗体；
(b)将待测物加入加样区，待测物通过加样区流入结合区，在结合区和第一抗原/抗体与示踪剂复合物结合后流入反应区，在反应区再与第二抗原/抗体结合，其中，未与第二抗原/抗体结合的待测物流入废液区；
(c)采用图像采集装置分别采集待测物流经结合区和反应区的图像，通过分析待测物在结合区和反应区的图像，得到参与反应的待测物的体积；
优选地，所述示踪剂包括荧光微球和/或酶结合物。
10.根据权利要求9所述的抗原抗体免疫检测方法，其特征在于，所述待测物包括化学小分子、生物大分子、细菌和病毒中的至少一种；
优选地，所述生物大分子包括抗原、抗体、激素和抗生素中的至少一种；
优选地，所述化学小分子包括小分子药物和/或小分子毒品。
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CN113181981A (zh) * 2021-04-27 2021-07-30 江苏液滴逻辑生物技术有限公司 一种数字微流控自身免疫抗体多重检测系统

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