CN103608464A - 艰难梭菌抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在脊椎动物受试者中治疗或预防艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的组合物和方法。所述方法用于向所述脊椎动物受试者施用有效减少或消除或预防艰难梭菌细菌感染的复发和/或诱导针对该蛋白的免疫应答的量的组合物。还提供了在脊椎动物中治疗或预防艰难梭菌感染的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于在脊椎动物受试者中治疗或预防革兰氏阳性细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)的感染的组合物和方法。提供了以有效减少、消除或预防感染复发的量向所述脊椎动物受试者施用蛋白质的方法。提供了在生物体中治疗或预防艰难梭菌感染的方法。
背景技术
艰难梭菌是一种人类肠道共生革兰氏阳性细菌,以2-5%的种群量存在。艰难梭菌具有二态生活周期,能够作为休眠但仍有传染性的芽孢和作为代谢活性的产毒素营养细胞存在。肠道中少量艰难梭菌的存在是无症状的;然而,细菌过度生长能够引起严重的和危及生命的疾病,特别是在老年人中。当正常肠道菌群被抗生素治疗消灭时,可能发生艰难梭菌的过度生长。因此,艰难梭菌是抗生素相关腹泻的主要原因,并且能够引起假膜性结肠炎(广泛的结肠炎症)。病原性艰难梭菌菌株产生几种已知毒素。两种这样的毒素,即肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B),造成在感染的患者中观察到的腹泻和炎症。
住院或留居在疗养院中增加了艰难梭菌感染的风险。据估计,在住院最多2周的患者中染得艰难梭菌的比率为13%,在住院超过4周的患者中为50%。因此,艰难梭菌是常见的医源性病原体,并且在全世界是住院患者发病和死亡的主因。由于艰难梭菌这种生物体形成耐热芽孢,艰难梭菌能够在医院或疗养院环境中长时间残留。一旦芽孢被摄入,由于它们的耐酸性,它们能够存活地通过胃。一旦进入结肠,芽孢可以在暴露于胆汁酸后萌发成营养细胞。
艰难梭菌感染在最初治疗后的复发是常见问题,因为在25%的进行过首次感染发作治疗的患者中发生疾病的复发。这主要是由于该生物体能够作为芽孢保持在休眠且耐抗生素的状态中这一事实。
当前用于治疗艰难梭菌感染的疗法针对生物体生活周期的营养阶段。这些治疗包括抗生素例如万古霉素或甲硝哒唑。氟喹诺酮类抗生素例如环丙沙星和左氧氟沙星的使用不幸地导致新的高毒力的且耐抗生素的艰难梭菌菌株的出现。其他的特别是用于预防复发的治疗包括预防性途径,例如使用益生菌以利用非致病生物体例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或布拉氏酵母菌(Saccharomycesboulardii)恢复肠道菌群。通过鉴定影响代谢功能或必需毒力因子的突变,已开发出基于鼠伤寒菌(Typhimurium)的活疫苗。Clin.Microbiol.Rev.5(1992)328-342。
到目前为止,在疫苗方面的尝试集中于A和B毒素以及营养细胞表面蛋白(SLPA),它们都是由代谢活性细菌产生的蛋白质。因此,所有当前疗法解决由营养阶段细菌造成的原发感染,而不针对由休眠但仍有感染性的芽孢引起的复发。有鉴于可能出现由毒性越来越高且耐药的艰难梭菌菌株引起的传染病,对于在靶向艰难梭菌生活周期的顽固芽孢期的基础上的用于治疗或预防与所述生物体相关的疾病的发生及其复发的有效疫苗组合物或抗体治疗仍存在未满足的需求。
发明概述
本文描述了用于在脊椎动物受试者中治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。
在第一方面,本发明提供了含有结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段的组合物,其中所述芽孢多肽或片段可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第二方面,本发明提供了含有结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段的组合物,其中所述芽孢多肽或片段可以具有与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:1O中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在第三方面,本发明提供了结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的分离的抗体或片段,其中所述多肽或片段可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第四方面,本发明提供了结合艰难梭菌芽孢多肽或片段的抗体或片段,其中所述多肽或片段可以具有与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在所述前四个方面的各种实施方式中,所述抗体或片段可以是多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、完整免疫球蛋白分子、scFv、嵌合抗体、Fab片段、F(ab’)2或二硫键连接的Fv。
在所述前四个方面的其他实施方式中,所述抗体或片段可以具有重链免疫球蛋白恒定结构域,其可以是人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域或人IgA1/2恒定结构域。
在所述前四个方面的其他实施方式中,所述抗体或片段可以具有轻链免疫球蛋白恒定结构域,其可以是人Igκ恒定结构域或人Igλ恒定结构域。
在所述前四个方面的再进一步的实施方式中,所述抗体或片段可以以至少1×109M或至少1×1010M的亲和常数(Kaff)结合抗原。
在所述前四个方面的其他实施方式中,所述抗体或其片段可以抑制或延迟芽孢萌发。
在所述第一和第二方面的某些实施方式中,所述组合物也可以含有结合艰难梭菌毒素A、毒素B的抗体或结合毒素A和毒素B的抗体的组合。在所述第一和第二方面的其他实施方式中,所述组合物还可以含有抗生素例如甲硝哒唑或万古霉素。
所述前四个方面的组合物可以通过向需要这样的治疗的患者施用有效减少或预防与艰难梭菌相关疾病的量的组合物而使用在治疗所述疾病的方法中,所述量可以是1至100毫克每千克受试者体重的范围内的量。所述组合物可以静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
在前四个方面的其他实施方式中,所述组合物可通过向动物施用有效量的所述组合物而用于被动免疫的方法中。
在第五方面,本发明提供了通过以在受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用一定量的艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中诱导免疫应答的方法,所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第六方面,本发明提供了通过以在受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中诱导免疫应答的方法,所述芽孢多肽或片段或变体可以具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在第七方面,本发明提供了难过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第八方面,本发明提供了以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或片段和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述芽孢多肽或片段可以具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在第五至第八方面的各种实施方式中,所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。在其他实施方式中,所述施用是口服、鼻内、静脉内或肌肉内施用。在其他实施方式中,所述变体是突变体,其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列,例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者,所述融合蛋白可以是蛋白质BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD及其片段中任一种,或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段,与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
在第九方面,本发明提供了含有有效免疫量的分离多肽或片段或变体和药学上可接受的载体的组合物,其中所述组合物在受试者中有效诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答,并且其中所述分离的多肽或片段或变体含有艰难梭菌芽孢多肽或片段,其可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第十方面,本发明提供了含有有效免疫量的分离多肽或片段或变体和药学上可接受的载体的组合物,其中所述组合物在受试者中有效诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答,并且其中所述分离的多肽或片段或变体具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在所述第九和第十方面的各种实施方式中,所述组合物还含有药学上可接受的佐剂,其可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或热休克蛋白。在这些方面的进一步实施方式中,所述变体是突变体,其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列,例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者,所述融合蛋白可以是蛋白质BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD及其片段中任一种,或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段,与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
在第十一方面,本发明提供了通过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述多肽或片段或变体可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第十二方面,本发明提供了通过以在需要治疗的受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂在所述受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述芽孢多肽或片段或变体具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在所述第十一和第十二方面的各种实施方式中,所述药学上可接受的佐剂可以是水包油型乳液、ISA-206、Quil A、白介素12或热休克蛋白。在这些方面的进一步他实施方式中,所述变体是突变体,其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列,例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者,所述融合蛋白可以是蛋白质BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH和Fe-Mn-SOD及其片段中任一种,或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段,与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
在第十三方面,本发明提供了编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的分离的核酸,所述芽孢多肽或片段或变体可以是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD。
在第十四方面,本发明提供了编码艰难梭菌芽孢多肽或片段或变体的分离的核酸,其中所述核酸编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
在所述第十三和第十四方面的各种实施方式中,所述变体是突变体,其可以是融合蛋白。所述融合蛋白可以含有艰难梭菌毒素A或B的序列,例如TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4或TcdA的C-末端受体结合片段。或者,所述融合蛋白可以是蛋白质BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD或FliD及其片段中任一种,或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的蛋白质及其片段,与所述蛋白质组的另一个成员的融合体。
在所述第十三和第十四方面的再进一步的实施方式中,所述核酸包含在表达载体中,其可以是细菌或哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例包括含有CMV启动子的表达载体。其他哺乳动物表达载体包括pcDNA3002Neo或pET32a。细菌表达载体的实例包括pET32a。在这些方面的某些实施方式中,所述表达载体可以包含在宿主细胞中,例如在哺乳动物细胞表达的情况下的HEK293F、NSO-1、CHO-K1、CHO-S或PER.C6,以及在细菌表达的情况下的大肠杆菌(E.coli)。
附图简述
图1A示出了用Asc I和Hpa I对BclA3-pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中BclA3插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒切除的BclA3的预期大小为1.6kb,且pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第1道:未消化的BclA3-pcDNA3002Neo质粒;第2道:消化的BclA3-pcDNA3002Neo质粒)。
图1B示出了纯化的BclA3蛋白的SDS-PAGE和western印迹分析。使用Akta Purifier,将BclA3转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱的蛋白在浓缩前以15μL的体积上样到SDS-PAGE凝胶上(左)。(第1道:纯化的BclA3蛋白)。所述蛋白质的预期大小为44kDa。第二块凝胶(右)以8μg蛋白质跑样,转移到硝酸纤维素膜上并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(第1道:纯化的BclA3蛋白-8μg)。
图2A示出了用AscI和HpaI对Alr-pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中Alr插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒切除的Alr的预期大小为1.3kb,和空pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第1道:未消化的Alr-pcDNA3002Neo质粒;第2道:消化的Alr-pcDNA3002Neo质粒)。
图2B示出了纯化的Alr蛋白质的SDS-PAGE分析。使用AktaPurifier,将Alr转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含β-巯基乙醇(2ME)的洗脱蛋白质以2μg的量上样到SDS-PAGE凝胶上(左)。(第1道:纯化的Alr蛋白质-2μg;第2道:纯化的Alr蛋白质-2μg+2ME)。所述蛋白质的预期大小为45kDa。第二凝胶(右)以~30μg蛋白质跑样以加大蛋白+/-2ME之间的差异(第3道:纯化的Alr蛋白质-2μg;第4道:纯化的Alr蛋白质-2μg+2ME)。
图2C示出了纯化的Alr蛋白的western印迹分析。使用AktaPurifier,将Alr转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含β-巯基乙醇(2ME)的洗脱蛋白质以2μg的量上样到SDS-PAGE凝胶上,然后转移到硝酸纤维素膜上并用抗his抗体(1:3000)探测(第2道:纯化的Alr蛋白质-2μg;第3道:纯化的Alr蛋白质-2μg+2ME)。所述蛋白质的预期大小为45kDa。
图3A显示了用AscI和HpaI对SlpA para-pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中SlpA旁系同源物插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒切除的SlpA旁系同源物的预期大小为1.9kb,和空pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第1道:未消化的SlpA para-pcDNA3002Neo质粒;第2道:消化的SlpA para-pcDNA3002Neo质粒)。
图3B示出了纯化的SlpA旁系同源物的SDS-PAGE和western印迹分析。使用Akta Purifier,将SlpA旁系同源物转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将含有和不含β-巯基乙醇(2ME)的洗脱蛋白质以2μg的量上样到SDS-PAGE凝胶上(左和中)。(第1道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质-2μg;第2道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质-2μg+2ME)。所述蛋白质的预期大小是84kDa。在另一凝胶(右)中以2μg蛋白质跑样,将其转移到硝基纤维素膜上,并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(第4道:纯化的SlpA旁系同源物蛋白质-2μg)。
图4A示出了用AscI和HpaI对CD1021-pcDNA3002Neo的限制性消化以证实质粒中CD1021插入片段的存在。从pcDNA3002Neo质粒上切除的CD1021的预期大小为1.8kb,和空pcDNA3002Neo质粒为6.8kb。(第1道:未消化的CD1021-pcDNA3002Neo质粒;第2道:消化的CD1021-pcDNA3002Neo质粒)。
图4B示出了纯化的CD1021的SDS-PAGE分析。使用AktaPurifier,将CD1021转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱蛋白质以2μg的量上样到SDS-PAGE凝胶上(第1道:纯化的CD1021蛋白质;第2道:纯化的CD1021蛋白质+2ME)。所述蛋白没有糖基化时的预期大小为65kDa。
图4C示出了纯化的CD1021的western印迹分析。另一凝胶以2μg蛋白质跑样,将其转移至硝基纤维素膜上,并用针对所表达蛋白质的His标签的抗体探测(左侧印迹上的第1道:纯化的CD1021蛋白质+2ME;右侧印迹上的第1道:纯化的CD1021蛋白质)。
图5示出了重组艰难梭菌毒素A片段4和毒素B片段1区域和完整Ted A和B毒素的SDS-PAGE分析。(A)胶体蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的毒素A片段4(第1道)。毒素A片段4的预期大小为114kDa。(B)抗His抗体探测的western免疫印迹上的毒素B片段1(第1道)。毒素B片段1的预期大小为82kDa。(C)胶体蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的完整毒素B(第1道)和完整毒素A(第2道)。毒素A的预期大小为308kDa,毒素B的预期大小为270kDa。
图6示出了纯化的FliD的SDS-PAGE。使用Akta Purifier,将FliD转染的上清液在HisTRAP Ni柱上纯化。将洗脱蛋白质以2μg的量上样到SDS-PAGE凝胶上(第1道:纯化的FliD蛋白质+2ME;第2道:纯化的FliD蛋白质)。所述蛋白质没有糖基化时的预期大小为55kDa。
图7示出了检测小鼠血清中的CD1021抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
图8示出了检测小鼠血清中的FliD抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
图9示出了检测小鼠血清中的Alr抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
图10示出了检测小鼠血清中的BclA3抗体与来自于菌株ATCC43255的分离的艰难梭菌芽孢的结合的ELISA结果。
图11示出了检测小鼠血清中的FliD抗体与纯化的艰难梭菌FliD蛋白质的结合的ELISA结果。
图12示出了检测小鼠血清中的Alr抗体与纯化的艰难梭菌Alr蛋白质的结合的ELISA结果。
图13示出了检测小鼠血清中的BclA3抗体与纯化的艰难梭菌BclA3蛋白质的结合的ELISA结果。
图14示出了检测小鼠血清中的CD1021抗体与纯化的艰难梭菌CD1021蛋白质的结合的ELISA结果。
图15示出了检验抗芽孢抗体对ATCC43255芽孢萌发的抑制效应的萌发分析的结果。
图16示出了艰难梭菌芽孢抗原的考马斯蓝染色。
图17示出了用兔抗艰难梭菌芽孢pAb探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
图18示出了用来自于Alr免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
图19示出了用来自于BclA3免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
图20示出了用来自于CD1021免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
图21示出了用来自于FliD免疫小鼠的血清探测的艰难梭菌芽孢抗原的Western印迹。
详细描述
总的来说,本发明涉及用于在脊椎动物受试者中预防或治疗革兰氏阳性生物体艰难梭菌的细菌感染的组合物和方法。提供了用于诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答的方法。所述方法用于向需要的脊椎动物受试者施用有效量的蛋白质或药剂以减少、消除或预防艰难梭菌的细菌感染或带菌状态。
提供了用于在受试者中诱导针对艰难梭菌细菌的免疫应答的组合物和方法,包括以在受试者中有效诱导免疫应答的量向受试者施用包含分离的多肽(例如艰难梭菌芽孢抗原)和佐剂的组合物。所述方法可用于产生抗体,其用于被动免疫或作为疫苗的组分以防止艰难梭菌的感染或感染复发。
应该理解,本发明不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统,它们当然可以改变。还应该理解,本文中使用的术语仅仅是出于描述特定方面的目的,并且不打算是限制性的。当在本说明书和随附的权利要求书中使用时,单数形式“一”、“一个”或“该”包括复数指称物,除非内容明确指明不是如此。
当在本文中用于指称可测量的值例如量、时间长度等时,术语“约”意味着涵盖与指定值有±20%或±10%、更优选地±5%、甚至更优选地±1%、且更优选地±0.1%的变异,因为这样的变异适合于执行所公开的方法。
除非另有定义,否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文所描述的相似或等同的任何方法和材料来测试本发明,但在本文中描述了优选的材料和方法。
“脊椎动物”、“哺乳动物”、“受试者”、“哺乳动物受试者”或“患者”可互换使用,且是指哺乳动物例如人类患者和非人类灵长动物,以及实验动物例如兔、大鼠和小鼠、奶牛、马、山羊和其他动物。动物包括所有脊椎动物例如哺乳动物和非哺乳动物,例如小鼠、绵羊、狗、奶牛、禽类、鸭、鹅、猪、鸡、两栖动物和爬行动物。
术语“佐剂”是指以非特异性方式起作用以提高对特定抗原或抗原组合的免疫应答的药剂,因此例如减少任何给定组合物中所需的抗原的量和/或降低产生针对目标抗原的充分免疫应答所需的注射频率。参见例如A.C.Allison J.Reticuloendothel.Soc.(1979)26:619-630。这样的佐剂在下面进一步描述。术语“药学上可接受的佐剂”是指能够安全地施用于受试者并可接受用于制药应用的佐剂。
当在本文中使用时,“定植”是指哺乳动物的肠道中艰难梭菌的存在。
“带菌状态”是细菌例如艰难梭菌可以在正常受试者中生长而不引起受试者患病的过程。带菌状态是环境、宿主和病原体的非常复杂的相互作用。各种因素控制无症状带菌状态与疾病状态。因此,本发明的一个方面包括治疗或预防带菌状态。
“治疗”或“处理”是指(i)阻止感染或重新感染,例如预防,或(ii)减轻或消除目标疾病的症状,即治疗。“治疗”或“处理”可以是指施用包含目标多肽例如艰难梭菌芽孢抗原或针对这些抗原产生的抗体的组合物。使用所述组合物治疗受试者可以预防或降低感染的风险和/或诱导针对目标多肽的免疫应答。治疗可以是预防性的(以阻止或延迟疾病的发作,或阻止其临床或亚临床症状的表现)或者可以是在疾病表现后治疗性地抑制或改善症状。
“预防”或“防止”是指用多肽或抗体组合物的预防性给药或疫苗接种。
“治疗有效量”或“有效减少或消除细菌感染的量”或“有效量”是指足以预防艰难梭菌细菌感染,或改善(例如减轻、减少、降低)与艰难梭菌细菌感染相关的至少一种症状,或诱导针对艰难梭菌抗原的免疫应答的多肽或抗体的量。组合物的施用不是必须消除艰难梭菌细菌感染的症状,只要化合物施用的益处超过害处即可。同样地,当在本文中用于指称艰难梭菌细菌感染时,术语“治疗”不打算指受试者必需从感染治愈或其所有临床征兆被消除,只要通过组合物的施用实现受试者状况的一些缓解或改善即可。
当在本文中使用时,术语“免疫应答”是指免疫系统细胞对在免疫细胞中产生生物化学变化的外部或内部刺激(例如抗原、细胞表面受体、细胞因子、趋化因子和其他细胞)的反应,其引起免疫细胞迁移、杀死靶细胞、细胞吞噬作用、抗体产生、免疫应答的其他可溶性效应物等。
“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意指受试者对组合物发起主动免疫应答,以使得在随后暴露于艰难梭菌细菌或细菌激发后,受试者能够对抗感染。因此,保护性免疫应答一般在受试者中降低随后暴露于艰难梭菌细菌时引起的发病和死亡的发生率。保护性免疫应答一般也减少艰难梭菌细菌在受试者中的定植。
“主动免疫应答”是指受试者对抗原例如艰难梭菌芽孢抗原的免疫原性反应。具体来说,该术语意指在受试者群体中具有一定益处的对随后暴露于艰难梭菌细菌或抗原的任何水平的保护,不论所述保护采取的是降低死亡率、减少症状例如胃胀或腹泻、防止复发还是降低疾病的任何其他有害效应等的形式,也不论所述保护是部分的还是完全的。“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“在遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与。它一般涉及淋巴网状组织中具有免疫能力的细胞的分化和增殖,其导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发生或两者。”Herbert B.Herscowitz,“Immunophysiology:Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation,”Immunology:Basic Processes117(Joseph A.Bellanti ed.,1985)。换句话说,主动免疫应答由宿主在由于感染或在本发明的情形中由于组合物的施用而暴露于免疫原后发动。主动免疫可以与被动免疫形成对照,后者通过“预先形成的物质(例如抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)从主动免疫的宿主向未免疫宿主的转移”来获得。同上。
“被动免疫”一般是指将预制抗体的形式的主动体液免疫力从一个个体转移到另一个个体。因此,被动免疫是可以通过抗体转移获得的短期免疫的形式,所述抗体可以以几种可能的形式施用,例如作为人类或动物血浆或血清、作为用于静脉内(IVIG)或肌肉内(IG)使用的合并的动物或人类免疫球蛋白、作为来自于被免疫受试者或从疾病恢复的供体的高滴度动物或人类IVIG或IG以及作为单克隆抗体。被动转移可以预防性地用于阻止疾病发作,以及可用于几种类型的急性感染的治疗。通常,源自于被动免疫的免疫力仅仅持续短时间,并提供即时保护,但是身体不发生记忆,因此患者具有晚些时候被相同病原体感染的风险。
多肽
术语“多肽”或“肽”是指氨基酸聚合物,不论聚合物的长度如何;因此,肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义中。该术语也不指定或排除多肽的表达后修饰,例如,包含糖基、乙酰基、磷酸酯基、脂基等的共价连接的多肽明确地被术语多肽所涵盖。在所述定义中还包括含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、仅天然存在于非相关生物系统中的氨基酸、来自于哺乳动物系统的修饰氨基酸等)的多肽、具有取代的键的多肽以及本领域中已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。
术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的肽”是就其来源或衍生源来说,(1)不伴有在其本原状态下与其天然相伴的组分,(2)不含来自于同一物种的其他蛋白质,(3)由来自于不同物种的细胞表达,或(4)自然界中不存在的蛋白质、多肽或肽。因此,化学合成或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的肽与其天然相伴组分“分离”。也可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术,通过分离而使蛋白质基本上不含天然相伴的组分。
在本发明的意义中,术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”、“抗原”或“抗体”包括一般在能够在受试者中诱导免疫应答或在抗体的情况下结合抗原方面表现出生物活性的变体、类似物、直系同源物、同源物和衍生物及其片段。
本发明的多肽包括源自于艰难梭菌芽孢抗原或其片段的氨基酸序列,其对应于天然存在的蛋白质或对应于变体蛋白质的氨基酸序列,即其中少数氨基酸被置换、添加或缺失但其保留基本上相同的免疫性质的天然存在蛋白质的氨基酸序列。此外,这样的衍生部分可以被氨基酸进一步修饰,特别是在N-和C-末端,以使得多肽或片段在构象上受限和/或允许在完成适当的化学作用后偶联到免疫原性载体上。本发明的多肽涵盖源自于艰难梭菌芽孢抗原的氨基酸序列的功能活性变体多肽,其中氨基酸已被缺失、插入或置换而基本上不损害其免疫性质,即这样的有功能活性变体多肽保留了基本的肽生物学活性。通常,这样的功能变体多肽具有与例如SEQ ID No:1至4中的氨基酸序列同源、优选地高度同源的氨基酸序列。
在一种实施方式中,这样的功能活性变体多肽显示出与选自SEQID No:1至4的氨基酸序列至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。多肽的序列相似性,其也被称为序列同一性,通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用为各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)指派的相似性量度值来匹配相似的序列。例如,GCG含有程序例如“Gap”和“Bestfit”,其可以使用缺省参数来确定密切相关的多肽(例如来自于不同物种的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG6.1版。也可以使用GCG6.1版中的程序FASTA,使用缺省或推荐的参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了质询和检索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分序列同一性(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990);Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000))。当将本发明的序列与含有来自于不同生物体的大量序列的数据库进行比较时,可选的算法是计算机程序BLAST、特别是blastp或tblastn,其使用缺省参数。参见例如Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
功能活性的变体包含天然存在的功能活性的变体例如等位基因变体和种变体,以及可以通过例如诱变技术或通过直接合成来产生的非天然存在的功能活性的变体。
功能活性变体可以表现出例如与本文公开的艰难梭菌芽孢抗原的氨基酸序列至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性,并仍保留生物活性。当这种比较需要比对时,将序列进行比对以获得最大同源性。变异位点可以发生在序列中的任何位置,只要生物活性与本文公开的艰难梭菌芽孢抗原基本上相似,例如诱导免疫应答的能力。关于如何得到表型沉默的氨基酸置换的指导提供在Bowie等,Science,247:1306-1310(1990)中,其教导为了研究氨基酸序列对改变的耐受性,存在两种主要策略。第一种策略利用进化过程中自然选择的氨基酸置换的耐受性。通过对不同物种中的氨基酸序列进行比较,可以确认在物种之间保守的氨基酸位置。这些保守的氨基酸对蛋白质功能可能是重要的。相反,其置换被自然选择所耐受的氨基酸位置表示了对蛋白质功能来说不关键的位置。因此,可以修饰耐受氨基酸置换的位置而仍维持修饰多肽的特定免疫原性活性。
第二种策略使用遗传工程以在克隆基因的特定位置处引入氨基酸变化,以鉴定对蛋白质功能来说关键的区域。例如,可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等,Science,244:1081-1085(1989))。然后可以测试得到的变体多肽的特定生物学活性。
按照Bowie等,这两种策略揭示出蛋白质对氨基酸置换的惊人的耐受性。作者还指出在蛋白质中某些氨基酸位置处可能容许哪些氨基酸改变。例如,埋得最深或最内部(在蛋白质的三级结构内)的氨基酸残基要求非极性侧链,而一般来说表面或外部侧链的很少特征是保守的。
将突变引入到蛋白质的氨基酸中的方法对于本领域技术人员来说是公知的。参见例如Ausubel主编的Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Inc.(1994);T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
也可以使用可商购的试剂盒例如“QuikChange定点诱变试剂盒”(Stratagene)或直接通过肽合成来引入突变。通过替换对多肽功能没有显著影响的氨基酸产生肽的功能活性变体可以由本领域技术人员来实现。
可以在本发明的多肽中进行的一种类型的氨基酸置换是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是将氨基酸残基用具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一种氨基酸残基置换的氨基酸置换。一般来说,保守氨基酸置换不显著改变蛋白质的功能性质。在两个或以上氨基酸序列通过保守置换而彼此不同的情况下,序列百分同一性或相似性程度可以向上调整以对于置换的保守性质进行校正。进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是公知的。参见例如Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。
具有化学性质相似的侧链的氨基酸组的实例包括:1)脂族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;2)脂族羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;3)含有酰胺的侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;以及7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者,保守置换是在Gonnet等,Science256:1443-45(1992)中公开的PAM250对数似然性矩阵中具有正值的任何改变。“轻度保守”置换是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任何改变。
也可以使用杂交技术分离功能活性变体。简单来说,使用与编码目标肽、多肽或蛋白例如艰难梭菌芽孢抗原的全部或部分核酸序列具有高同源性的DNA来制备功能活性肽。因此,本发明的多肽还包括功能上等同并且由与编码任一种艰难梭菌芽孢抗原的核酸或其互补序列杂交的核酸分子编码的实体。本领域技术人员可以使用容易获得的密码子表方便地确定编码本发明的肽的核酸序列。如此,这些核酸序列未在本文中给出。
编码功能活性变体的核酸分子也可以使用编码目标肽、多肽、蛋白质、抗原或抗体例如艰难梭菌芽孢抗原的核酸分子DNA的一部分作为探针,通过基因扩增方法例如PCR来分离。
出于本发明的目的,应该考虑到本发明的几种多肽、蛋白质、肽、抗原或抗体可以组合使用。可以设想所有可能的组合类型。例如,可以使用包含一种以上多肽(优选选自本文中公开的艰难梭菌芽孢抗原)的抗原。在某些实施方式中,抗原可以包括一种或多种芽孢抗原与源自于营养细胞的抗原例如毒素A或B组合。同样的序列可以以几个拷贝使用在相同多肽分子上,或者其中不同氨基酸序列的肽可以使用在相同多肽分子上;不同的肽或拷贝可以彼此直接融合或用适当的连接物分隔开。当在本文中使用时,术语“多聚化的(多)肽”是其中指氨基酸序列不同或相同的多肽存在于单一多肽分子上的两种组合类型。因此,在单一多聚化多肽分子上可以存在2至约20个相同和/或不同的肽。
在本发明的一种实施方式中,本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原源自于天然来源,或者从细菌来源分离。因此,可以使用标准的蛋白质纯化技术从来源分离本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原。
或者,本发明的肽、多肽和蛋白质可以化学合成或使用重组DNA技术产生。例如,本发明的肽、多肽或蛋白质可以通过本领域公知的固相程序来合成。适合的合成可以利用“T-boc”或“F-moc”程序来进行。环状肽可以通过固相程序,在全自动装置中使用公知的“F-moc”程序和聚酰胺树脂来合成。或者,本领域技术人员应该了解手动执行所述过程所必需的实验室程序。用于固相合成的技术和程序描述在E.Atherton和R.C.Sheppard的“Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach”,IRL at Oxford University Press出版(1989)和D.Andreau等的“Methods in Molecular Biology,Vol.35:Peptide Synthesis Protocols”(M.W.Pennington和B.M.Dunn主编),第7章pp91-171中。
或者,可以使用本领域公知的技术将编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸引入到能够在适合的表达系统中表达的表达载体中,然后分离或纯化表达的目标肽、多肽或蛋白质。在本领域中可获得多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统,并且可以使用这些表达系统中的任一种。任选地,可以将编码本发明的肽、多肽或蛋白质的多核苷酸在无细胞翻译系统中翻译。
对应于艰难梭菌芽孢抗原的核酸序列也可用于设计寡核苷酸探针和用于筛选基因组或cDNA文库中来自于其他艰难梭菌变体或甚至其他细菌物种的基因。用于制备寡核苷酸探针和DNA文库以及通过核酸杂交对它们进行筛选的基本策略对于本领域的普通技术人员来说是公知的。参见例如DNA Cloning:Vol.I,同上;Nucleic AcidHybridization,同上;Oligonucleotide Synthesis,同上;Sambrook等,同上。一旦通过阳性杂交鉴定来自被筛选文库的克隆,其可以通过限制性酶分析和DNA测序来证实特定文库插入片段含有艰难梭菌基因或其同源序列。然后可以使用标准技术进一步分离该基因,并且如果需要,使用PCR方法或限制性酶来删除全长序列的部分。
或者,可以通过合成而不是克隆来制备编码目标蛋白质的DNA序列。DNA序列可以被设计成具有适用于特定氨基酸序列的密码子。一般来说,如果序列被用于表达,人们应该选择对于目标宿主来说优选的密码子。通过标准方法从制备的重叠寡核苷酸组装完整序列,并将其组装成完整的编码序列。参见例如Edge(1981)Nature292:756;Nambair等,(1984)Science223:1299;Jay等,(1984)J.Biol.Chem.259:6311。
一旦所需蛋白质的编码序列已被制备或分离,可以将它们克隆到任何适合的载体或复制子中。大量克隆载体对于本领域技术人员来说是已知的,适合的克隆载体的选择是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体和它们可以转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌的革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母菌)、YCp19(酵母菌)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。参见Sambrook等,同上;DNA Cloning,同上;B.Perbal,同上。可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(在本文中合称“控制”元件)的控制之下,以便在用含有该表达构建物的载体转化的宿主细胞中将编码所需蛋白质的DNA序列转录成RNA。编码序列可以含有或可以不含信号肽或前导序列。前导序列可以在翻译后加工中被宿主移除。参见例如美国专利号4,431,739、4,425,437、4,338,397。载体的实例包括pET32a(+)和pcDNA3002Neo。
允许相对于宿主细胞的生长调控蛋白质序列的表达的其他调控序列也可能是需要的。调控序列对于本领域技术人员来说是已知的,且其实例包括对化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)做出响应以引起基因表达的启动或关闭的调控序列。载体中也可以存在其他类型的调控元件,例如增强子序列。
在插入到载体例如上述克隆载体中之前,可以将控制序列和其他调控序列与编码序列连接。或者,可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适合的限制性位点的表达载体中。
在某些情况下,可能必需修饰编码序列以便可以将其以适合的定向连接于控制序列,即维持正确的阅读框。也可能希望产生蛋白质的突变体或类似物。突变体或类似物可以通过删除一部分编码蛋白质的序列、通过序列的插入和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸来制备。用于修饰核苷酸序列的技术例如定点诱变描述在例如Sambrook等,同上;DNA Cloning,同上;Nucleic Acid Hybridization,同上中。
然后使用表达载体来转化适宜的宿主细胞。多种哺乳动物细胞系在本领域中是已知的,并包括可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得的永生化细胞系,例如但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、HEK293F细胞、NSO-1细胞以及其它细胞。同样地,细菌宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌(Streptococcus spp.)可以与本发明的表达构建体一起使用。可用于本发明中的酵母宿主包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、吉利蒙德毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括但不限于埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa caiifornica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、菲律宾实蝇(Spodoptera frifiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
具有目标多核苷酸例如艰难梭菌芽孢抗原的表达载体也可以是本领域技术人员通常用于需要的宿主的DNA疫苗接种的载体。DNA疫苗接种可以以任何方式使用,例如用于首次宿主抗原性激发和/或用于目标抗原的加强激发。DNA疫苗接种和相关技术的一般特征在本领域中是公知的。也可以使用用于测量针对目标抗原的免疫应答是否已经产生和/或在宿主中是否已经建立针对细菌激发的保护的公知技术容易地确定DNA载体的适合剂量。
取决于所选的表达系统和宿主,可以通过将用上述表达载体转化的宿主细胞在使得目标蛋白得以表达的条件下进行培养来产生本发明的蛋白质。然后从宿主细胞分离该蛋白质并对其进行纯化。适合的生长条件和回收方法的选择在本领域的技术范围之内。
艰难梭菌芽孢抗原蛋白质序列也可以使用已知氨基酸序列或源自于目标基因的DNA序列的氨基酸序列,通过化学合成例如固相肽合成来产生。这样的方法对于本领域技术人员来说是已知的。对于固相肽合成技术参见例如J.M.Stewart和J.D.Young,Solid PhasePeptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)以及G.Barany和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,E.Gross和J.Meienhofer主编,Vol.2,Academic Press,NewYork,(1980),pp.3-254;对于经典的溶液合成,参见M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)以及E.Gross和J.Meienhofer主编,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,同上,Vol.1。如果所研究的抗原的小片段能够在目标受试者中引起免疫应答,则肽的化学合成可能是优选的。
本发明的多肽还可以包括作为存在多基因、可选转录事件、可选RNA剪接事件和可选翻译和翻译后事件的结果而产生的多肽。多肽可以表达在引起与肽在原始细胞中表达时存在的基本上相同的翻译后修饰的系统例如培养细胞中,或者表达在引起当在原始细胞中表达时存在的翻译后修饰(例如糖基化或切割)中发生改变或省略的系统中。
本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原可以作为融合蛋白来产生,所述融合蛋白含有不是本文公开的艰难梭菌芽孢抗原序列的一部分的其他不同氨基酸序列,例如氨基酸连接物或信号序列或免疫原性载体,以及可用于蛋白质纯化的配体例如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。融合蛋白中可以存在一种以上本发明的多肽。异源多肽可以融合到例如本发明的肽、多肽或蛋白质的N-末端或C-末端。本发明的肽、多肽、蛋白质或抗原也可以作为包含同源氨基酸序列的融合蛋白来产生。可用于本发明的实施中的融合蛋白的实例包括但不限于本文描述的艰难梭菌芽孢抗原与艰难梭菌毒素A或B的部分,例如Tcd A的N-末端催化结构域、Tcd B的N-末端催化结构域或TcdB的C-末端片段4的融合体。也可以将艰难梭菌芽孢抗原或其片段彼此融合以形成适合用于本发明中的融合蛋白。
梭菌芽孢蛋白
在本发明的实施中可以使用多种艰难梭菌芽孢蛋白质中的任一种。这样的芽孢蛋白质可以通过搜索已知的艰难梭菌序列,包括最近已被测序的多种菌株的完整基因组序列来鉴定。可用于本发明的实施的芽孢蛋白质的进一步的实例也描述在文献中。参见例如Henriques和Moran,Annual Rev.Microbiol.,61:555-88(2007)。艰难梭菌芽孢蛋白质的代表性实例包括下面所描述的那些。
BclA蛋白(包括BclA1、BclA2和BclA3)是胶原蛋白样蛋白质,其参与艰难梭菌芽孢的外孢壁的形成。外孢壁包围芽孢外被并造成芽孢抗性。诸如表面暴露的外孢壁蛋白的靶标是用于治疗的良好的潜在靶标。例如,BclA蛋白在炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中具有直系同源物,并且已显示用BclA进行的免疫通过抑制萌发在动物中显示出针对炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)芽孢定植的保护作用。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌BclA序列的代表性实例包括但不限于具有下列NCBI登记号的蛋白质:FN545816(对于BclA1、A2和A3分别为402547-404145、3689444-3691084和3807430-3809466区)。
艰难梭菌中的Alr(丙氨酸消旋酶)蛋白是一种外孢壁酶,其参与将萌发与营养限制培养基中存在的芽孢数量相关联的群体感应类型的机制。在芽孢杆菌物种中也存在直系同源蛋白质,其中所述蛋白已被显示存在于芽孢形成的晚期,并且对于抑制过早萌发从而提高细菌的存活率来说是必需的。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌Alr序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816(3936313-3937470区)的蛋白质。
SlpA蛋白编码S-层,其是芽孢上的主要表面抗原。已显示,SlpA蛋白在患者中诱导强的血清IgG应答(参见Kelleher D.等,J.Med.Micro.,55:69-83(2006))。所述蛋白被分成N-末端(LMW)部分和C-末端(HMW)部分。SlpA HMW蛋白高度保守,并因此作为靶是有吸引力的。
SlpA旁系同源物蛋白是艰难梭菌菌株630中与高MW SlpA亚基的氨基酸序列近缘的一大类开放阅读框(旁系同源物)。该氨基酸序列与枯草芽孢杆菌的两种细胞壁结合蛋白N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(CWLB/LytC)及其增强子(CWBA/LytB)45%同源的(包括保守置换)。序列同源性具有功能相关性,因为艰难梭菌高MWSLP亚基显示出酰胺酶活性。通过与枯草芽孢杆菌的相似性,已表明同源性结构域介导对细胞壁的锚定,并因此鉴定了一类细胞壁组分。与此相一致的是,许多slpA旁系同源物编码典型的信号序列,表明它们是分泌的或膜结合的。在迄今为止鉴定到的29个slpA旁系同源物中,有12个定位在slpA周围的密集排列的簇中,并全都以相同方向转录,表明了协同调控和相关功能的可能性。已显示,在营养生长期间,紧邻slpA的3’的6个slpA样基因(ORF2至7)进行转录。COG2247是推测的细胞壁结合结构域。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌slpA序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816(3157304-3159175,3162172-3164448区)的蛋白质。下面在实施例3中示出了COG2247,一种推测的细胞壁结合结构域。
CD1021(CotH)蛋白是在艰难梭菌芽孢上发现的一种假设蛋白质,已经针对其产生了抗体。由于这种蛋白质是表面暴露的,使其成为用于治疗的良好靶标。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌CD1021序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为AM180355(1191725-1193632区)的蛋白质。
IunH编码肌苷水解酶,一种存在于炭疽芽孢杆菌外孢壁中的酶,在艰难梭菌中具有该酶的直系同源物。已提出这种酶在芽孢萌发的启动中发挥作用。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌IunH序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为FN545816(1866580-1867548区)的蛋白质。
Fe-Mn-SOD或超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧化物至氧和过氧化氢的歧化作用的一类酶,因此是细胞中的重要抗氧化防御者。许多细菌含有这种酶的带有铁和锰的形式。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌Fe-Mn-SOD序列的代表性实例包括但不限于NCBI登记号为NC_013316(1802293-1802997区)的蛋白质。
fliD基因编码艰难梭菌的鞭毛帽蛋白(FliD)。已显示这种蛋白在体外和体内具有粘附性质,特别是已显示在与粘膜的粘附中有作用。已显示,与患有CDAD的患者组相比,在对照组中针对FliD的抗体水平明显更高,表明这种蛋白质能够诱导可能在宿主防御机制中发挥作用的免疫应答。独立的研究显示,该蛋白质存在于测试的17个临床分离株中的15个中,表明它存在在大多数菌株中。同一项研究还显示,在具有不同临床分离株的17位患者中,15位具有针对FliD的抗体。可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌FliD序列的代表性实例包括但不限于具有下列NCBI登记号的蛋白质:Q9AHP4、AF297024、AF297025、AF297026、AF297027和AF297028。
表1提供了可以在本发明的实施中使用的艰难梭菌芽孢抗原蛋白质的示例性氨基酸序列。应该理解,下面提供的示例性序列的变体和片段也被本发明所涵盖。
表2提供了编码表1的蛋白质的核酸序列。
宿主免疫和抗体产生
在某些实施方式中,在过表达并纯化艰难梭菌芽孢抗原后,将其制备成用于递送至宿主以引发免疫应答的免疫原。宿主可以是本领域中已知可用于生物技术筛选分析并能在施用免疫原时产生可回收的抗体的任何动物,例如但不限于兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、马、猴、狒狒和人。在一个方面,宿主是转基因的并产生人抗体,例如表达人类抗体全部组成成分的小鼠,从而极大促进人类治疗剂的开发。
当在本文中使用时,术语“抗体”是指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。这样的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab、Fab′、F(ab)′片段和/或完整抗体的F(v)部分及其变体。该术语涵盖所有同种型,包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
当在本文中使用时,术语“抗体片段”具体来说是指保留了亲本抗体的抗原结合功能的抗体全序列的不完整或分离的部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab’)2和Fv片段、双特异抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
完整“抗体”包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可以进一步细分成被称为互补性决定区(CDR)的超变区域,其间插有更加保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR构成,从氨基端向羧基端以下列顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、R4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。术语抗体包括保留结合能力的完整抗体的抗原结合部分。结合部分的实例包括(i)Fab片段,其是由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,其是包含在铰链区处通过二硫桥相连的两个Fab片段的二价片段;(iii)Fd片段,其由VH和CH1结构域构成;(iv)Fv片段,其由抗体单臂的VL和VH结构域构成;(v)dAb片段(Ward等,Nature,341:544-546(1989)),其由VH结构域构成;以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)。
当在本文中使用时,术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码,但它们可以使用重组方法通过合成的连接物来连结,所述连接物能够使它们形成为其中VL和VH区域配对以形成单价分子的单一蛋白质链(被称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等,Science,242:423-426(1988);以及Huston等,Proc Natl Acad Sci USA,85:5879-5883(1988))。这样的被术语“抗体”片段所包含的单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割来制备。
当在本文中使用时,术语“人序列抗体”包括具有源自于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。本发明的人序列抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。这样的抗体可以在非人类转基因动物中产生,例如在PCT申请公布号WO01/14424和WO00/37504中所描述的。然而,当在本文中使用时,术语“人序列抗体”不打算包括其中源自于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗体(例如人源化抗体)。
还可以产生重组免疫球蛋白。参见Cabilly,美国专利号4,816,567,在此以其全文并为所有目的引入作为参考;以及Queen等,Proc Natl Acad Sci USA,86:10029-10033(1989)。
当在本文中使用时,术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组成表现出针对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此,术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体,其具有源自于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。一个方面,人单克隆抗体通过杂交瘤生产,所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的B细胞,所述B细胞从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的非人类转基因动物例如转基因小鼠获得。
当在本文中使用时,术语“抗原”是指激励抗体产生并能引起免疫应答的物质。它在本公开中可以与术语“免疫原”互换使用。在严格意义上,免疫原是引发免疫系统的应答的物质,而抗原被定义为与特定抗体结合的物质。抗原或其片段可以是与特定抗体发生接触的分子(即表位)。当使用蛋白质或蛋白质片段来免疫宿主动物时,蛋白质的众多区域能够诱导特异性结合抗原(蛋白质上的给定区域或三维结构)的抗体的产生(即引发免疫应答)。抗原可以包括但不限于艰难梭菌芽孢蛋白质及其片段。
当在本文中使用时,术语“人源化抗体”是指至少一种其中非抗原结合区和/或抗原结合区中的氨基酸序列已被改变以使得所述抗体更接近类似于人抗体并仍保留其原始结合能力的抗体分子。
此外,可以使用被开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison,等,Proc Natl Acad Sci,81:6851-6855(1984),在此以其全文引为参考),所述方法将来自于具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自于具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起。例如,可以将来自于对自身诱导物特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物活性的人体分子的基因剪接在一起。嵌合抗体是其中不同部分源自于不同动物物种的分子,例如具有源自于鼠类mAB的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。
此外,已开发了用于产生人源化抗体的技术(参见例如美国专利号5,585,089和美国专利号5,225,539,在此以其全文引为参考)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个被称为互补性决定区(CDR)的超变区中断的“框架”区构成。简单来说,人源化抗体是来自于非人类物种的抗体分子,其具有来自于非人类物种的一个或多个CDR和来自于人免疫球蛋白分子的框架区。
或者,可以使所描述的用于产生单链抗体的技术适应于产生针对本公开的免疫原性偶联物的单链抗体。单链抗体通过将Fv区的重链和轻链片段经氨基酸桥相连来形成以产生单链多肽。抗体分子的Fab和F(ab’)2部分可以利用公知的方法,在基本上完整的抗体分子上分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应来制备。参见例如美国专利号4,342,566。Fab′抗体分子部分也是公知的,并且由F(ab’)2部分产生,之后使用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键,随后将得到的蛋白质硫醇用诸如碘乙酰胺的试剂进行烷基化。
抗体分析法
在对宿主进行免疫并使得引发针对免疫原的免疫应答后,可以进行筛选分析以确定是否产生所需的抗体。这样的分析可以包括测定目标抗体以证实它们的特异性和亲和性并确定那些抗体是否与其他蛋白质交叉反应。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗原与它们的相应抗体之间的相互作用。该相互作用依赖于结合分子所识别的蛋白质特定结构(即抗原或表位)的存在。为了使结合为特异性的,它应该包括目标表位而非背景抗原的抗体结合。
在抗体产生后,对它们进行分析以证实它们对目标抗原是特异性的,并确定它们与其他抗原是否表现出交叉反应性。进行这样的分析的一种方法是血清筛选分析,如美国申请公布号2004/0126829中所述的,其内容在此明确地引为参考。然而,其他用于质量控制的分析方法也在本领域普通技术人员的技能范围之内,并因此也在本公开的范围之内。
本公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据它们对抗原的结合亲和性来描述或指定。抗体对抗原的亲和性可以使用适合的方法通过实验来测定。(参见例如Berzofsky等,“Antibody-Antigen Interactions”,Fundamental Immunology,Paul,W.E.编辑,Raven Press:New York,N.Y.(1984);Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992);以及本文中描述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量,测量到的特定抗体-抗原相互作用的亲和性可能发生变化。因此,亲和性和其他抗原结合参数(例如KD、Ka、Kd)的测量优选地使用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液来进行。
亲和性结合常数(Kaff)可以使用下式来确定:
其中:
[mAb]是游离抗原位点的浓度,[mAg]是在两种不同抗原浓度下测定的游离单克隆结合位点的浓度(即[mAg]t和[mAg’]t)(Beatty等,J Imm Meth,100:173-179(1987))。
对于抗体来说,术语“高亲和性”是指至少约1×107升/摩尔、或至少约1×108升/摩尔、或至少约1×109升/摩尔、或至少约1×1010升/摩尔、或至少约1×1011升/摩尔、或至少约1×1012升/摩尔、或至少约1×1013升/摩尔、或至少约1×1014升/摩尔或更高的平衡结合常数(Kaff)。“高亲和性”结合对于抗体同种型可能发生变化。平衡解离常数KD是同样用于描述抗体亲和性的术语,并且是Kaff的倒数。
佐剂
本发明的组合物可以包括佐剂以进一步提高一种或多种艰难梭菌芽孢抗原蛋白质的免疫原性。这样的佐剂包括起到增强对肽或肽的组合的免疫应答的作用,从而降低为了产生充分的免疫应答的组合物中所需的抗原量和/或所需的注射频率的任一种或多种化合物。适合的佐剂包括适合在哺乳动物、优选地在人体中使用的佐剂。可用于人体中的已知的适合佐剂的实例包括但不必限于明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3%w/v角鲨烯,0.5%w/v聚山梨酸酯80(吐温80),0.5%w/v失水山梨糖醇三油酸酯(Span85))、含CpG的核酸、QS21(皂角苷佐剂)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱乙酰化MPL)、Aquilla提取物、ISCOMS(参见例如Sjolander等,(1998)J.Leukocyte Biol.64:713;WO90/03184、WO96/11711、WO00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO06/134423和WO07/026190)、LT/CT突变体、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白介素等。对于兽医应用(包括但不限于动物实验)来说,人们可以使用弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637,被称为正MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A,被称为MTP-PE)和RIBI,其含有从细菌提取的三种组分,即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和在2%角鲨烯/吐温80乳液中的细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
增强组合物的有效性的其他示例性佐剂包括但不限于:(1)水包油型乳液制剂(含有或不含其他特异性免疫刺激剂例如胞壁酰基肽(参见下文)或细菌细胞壁组分),例如(a)MF59(WO90/14837;“Vaccine design:the subunit and adjuvant approach”中的第10章,Powell&Newman主编,Plenum Press1995),含有5%角鲨烯、0.5%吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)和0.5%Span85(失水山梨糖醇三油酸酯)(任选地含有共价连接到二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺上的胞壁酰三肽(MTP-PE)),其使用微流化器配制成亚微米颗粒,(b)SAF,含有10%角鲨烯、0.4%吐温80、5%pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP,其微流化成亚微米乳液或涡旋振荡以产生较大粒径的乳液,和(c)RIBI佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.),其含有2%角鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分例如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS),优选为MPL+CWS(DETOX);(2)可以使用皂角苷佐剂,例如QS21、STIMULON(Cambridge BioScience,Worcester,Mass.)、Abisco(Isconova,Sweden)或Iscomatrix(Commonwealth Serum Laboratories,Australia),或由其产生的颗粒例如ISCOM(免疫刺激复合物),该ISCOMS可以不含另外的去垢剂,例如WO00/07621;(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA);(4)细胞因子,例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(例如γ-干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱乙酰化MPL(3dMPL),例如GB-2220221、EP-A-0689454,任选地当与肺炎球菌糖一起使用时基本上不含明矾,例如WO00/56358;(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油型乳液的组合,例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231;(7)包含CpG基序的寡核苷酸[Krieg Vaccine2000,19,618-622;Krieg Curr opin Mol Ther20013:15-24;Roman等,Nat.Med.,1997,3,849-854;Weiner等,PNAS USA,1997,94,10833-10837;Davis等,J.Immunol,1998,160,870-876;Chu等,J.Exp.Med,1997,186,1623-1631;Lipford等,Ear.J.Immunol,1997,27,2340-2344;Moldoveami等,Vaccine,1988,16,1216-1224;Krieg等,Nature,1995,374,546-549;Klinman等,PNAS USA,1996,93,2879-2883;Ballas等,J.Immunol,1996,157,1840-1845;CoWdery等,J.Immunol,1996,156,4570-4575;Halpern等,Cell Immunol,1996,167,72-78;Yamamoto等,Jpn.J.Cancer Res.,1988,79,866-873;Stacey等,J.Immunol,1996,157,2116-2122;Messina等,J-Immunol,1991,147,1759-1764;Yi等,J.Immunol,1996,157,4918-4925;Yi等,J.Immunol,1996,157,5394-5402;Yi等,J.Immunol,1998,160,4755-4761;和Yi等,J.Immunol,1998,160,5898-5906;国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581],即含有至少一个CG二核甘酸,其中胞嘧啶是未甲基化的;(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯,例如WO99/52549;(9)与辛苯聚糖组合的聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)或与至少一种其他非离子型表面活性剂例如辛苯聚糖组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152);(10)皂角苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO00/62800);(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒,例如WO00/23105;(12)皂角苷和水包油型乳液,例如WO99/11241;(13)皂角苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+甾类),例如WO98/57659;(14)起到免疫刺激剂作用以增强组合物效能的其他物质,例如胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE);(15)toll样受体(TLR)的天然或合成的配体(例如在Kanzler等,2007,Nature Medicine13,p1552-9中所述的),包括TLR3配体例如polyl:C和类似化合物例如Hiltonol和安普利近。
佐剂还可以包括例如乳化剂、胞壁酰二肽、阿夫立定、水性佐剂例如氢氧化铝、基于壳聚糖的佐剂和本领域中已知的各种皂角苷、油类和其他物质中的任一种,例如爱菲金、LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、合成的寡核苷酸及其组合(Schiins等,Curr.Opi.Immunol.(2000)12:456),分枝杆菌(Mycobacterialphlei)(草分枝杆菌(M.phlei))细胞壁提取物(MCWE)(美国专利号4,744,984),草分枝杆菌DNA(M-DNA)、M-DNA-草分枝杆菌细胞壁复合物(MCC)。例如,可以在本文中起到乳化剂作用的化合物包括天然和合成的乳化剂,以及阴离子、阳离子和非离子化合物。在合成的化合物中,阴离子型乳化剂包括例如月桂酸和油酸的钾盐、钠盐和铵盐,脂肪酸的钙盐、镁盐和铝盐(即金属皂)和有机磺酸盐例如月桂基硫酸钠。合成的阳离子剂包括例如鲸蜡基三乙基溴化铵,而合成的非离子剂以甘油酯(例如单硬脂酸甘油酯)、聚氧乙烯二醇酯和醚类以及失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如失水山梨糖醇但棕榈酸酯)及其聚氧乙烯衍生物(例如聚氧乙烯失水山梨糖醇但棕榈酸酯)为例。天然乳化剂包括阿拉伯树胶、明胶、卵磷脂和胆甾醇。
其他适合的佐剂可以使用油成分例如单一油、油的混合物、油包水型乳液或水包油型乳液来形成。油可以是矿物油、植物油或动物油。矿物油或其中油组分是矿物油的水包油型乳液是优选的。就此而言,“矿物油”在本文中被定义为从矿脂经蒸馏技术获得的液体烃类的混合物;该术语与“液体石蜡”、“液体矿脂”或“白色矿物油”同义。该术语还打算包括“轻质矿物油”,即类似地通过矿脂的蒸馏获得但是具有比白色矿物油略低的比重的油。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,同上。特别优选的油组分是以商品名EMULSIGEN PLUSTM销售的水包油型乳液(包含轻矿物油以及0.05%甲醛和30mcg/mL庆大霉素作为防腐剂),其可以从MVPLaboratories,Ralston,Nebraska获得。适合的动物油包括例如鳕鱼肝油、比目鱼油、鲱鱼油、橙鲷鱼油和鲨鱼肝油,其全都是可商购的。适合的植物油包括但不限于芥花油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油等。
或者,也可以使用多种脂族含氮碱类作为疫苗制剂的佐剂。例如,已知的免疫佐剂包括矿物、季铵化合物、胍类、苯甲脒类和硫脲鎓盐类(Gall,D.(1966)Immunology11:369-386)。具体的化合物包括二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)(可以从Kodak获得)和N,N-二(十八烷基)-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。DDA作为免疫佐剂的使用已被描述;参见例如Kodak LaboratoryChemicals Bulletin56(1):1-5(1986);Av.Drug Deliv.Rev.5(3):163-187(1990);J.Controlled Release7:123-132(1988);Clin.Exp.Immunol.78(2):256-262(1989);J.Immunol.Methods97(2):159-164(1987);Immunology58(2):245-250(1986);和Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.68(3):201-208(1982)。阿夫立定也是公知的佐剂。参见例如Wolff,III等的美国专利号4,310,550,其一般地描述了N,N-长链烷基-N′,N′-双(2-羟乙基)丙二胺以及具体地阿夫立定作为疫苗佐剂的使用。Babiuk的美国专利号5,151,267和Babiuk等(1986)Virology159:57-66也涉及使用阿夫立定作为疫苗佐剂。
与疫苗一起使用的一种佐剂是“VSA3”,其是包含DDA的EMULSIGEN PLUSTM佐剂的改良形式(参见美国专利号5,951,988,在此以其全文引为参考)。
包括本发明的方面中的一种或多种肽的组合物可以通过使用本领域技术人员公知的技术,包括但不限于混合、超声和微流化,将组合物制剂和佐剂均匀且密切地进行结合来制备。佐剂优选地占组合物的约10至50%(v/v)、更优选地约20至40%(v/v)和最优选地约20至30%或35%(v/v),或这些范围之内的任何整数。
药物组合物
本发明的一个方面提供了包含免疫有效量的分离的艰难梭菌芽孢抗原蛋白质或编码这样的抗原性蛋白质的分离核酸以及药学上可接受的载体的组合物,其中所述组合物在脊椎动物受试者中有效地减轻、消除或阻止艰难梭菌细菌感染。进一步的方面提供了包含针对艰难梭菌芽孢抗原蛋白质的抗体以用于提供针对艰难梭菌感染的被动免疫的组合物。
本发明的组合物通常被制备成采取液体溶液或悬液形式的注射剂,或制备成适合于在注射前在液体介质中制成溶液或悬液的固体形式。制剂也可以制备成固体形式、乳化或活性成分包封在用于持续递送的脂质体介质或其他颗粒载体中。例如,疫苗可以采取下述形式:油乳液、油包水型乳液、水包油包水型乳液、位点特异性乳液(site specific emulsion)、长驻留乳液(long residence emulsion)、粘性乳液、微乳液、纳米乳液、脂质体、微粒、微球、纳米球、纳米粒子和各种天然或合成的聚合物,例如允许疫苗持续释放的不可再吸收的非渗透性聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和共聚物、可溶胀的聚合物如水凝胶或可再吸收的聚合物如胶原蛋白和某些聚酸或聚酯如用于制造可吸收缝合线的聚酸或聚酯。
将多肽配制成用于递送至哺乳动物受试者的组合物。所述组合物单独地和/或与药学上可接受的介质或赋形剂混合地施用。适合的介质是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外,介质可以含有少量辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或在组合物的情形中提高组合物的有效性的佐剂。适合的佐剂如上所述。本发明的组合物还可以包括辅助物质例如药理试剂、细胞因子或其他生物反应调节剂。
此外,包括例如一种或多种艰难梭菌芽孢抗原的组合物可以被配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成的),并且其使用无机酸例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵或氢氧化铁以及如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱衍生。
制备这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,最新版。
组合物被配制成含有有效量的蛋白质,其准确量可以由本领域技术人员容易地确定,其中所述量取决于待治疗的动物和动物的免疫系统合成抗体的能力。待施用的组合物或制剂含有足以在待治疗受试者中实现所需状态的量的一种或多种分泌的蛋白质。出于本发明的目的,治疗有效量的包含蛋白质的组合物含有约0.05至1500μg蛋白质、优选地约10至1000μg蛋白质、更优选地约30至500μg和最优选地约40至300pg蛋白质,或这些值之间的任何整数。例如,本发明的肽可以以约0.1μg至约200mg,例如约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约2mg的剂量施用于受试者,其中在例如1周、2周、3周、4周、两个月、3个月、6个月和/或1年后提供任选的加强剂。对于预防目的来说,各剂量中肽的量被选择为在典型的疫苗接种者中诱导免疫保护性应答而没有显著不良副作用的量。在初始疫苗接种后,受试者可以以足够的间隔接受一次或几次加强免疫。应该理解,对于任何特定患者来说,具体的剂量水平取决于多种因素,包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄率、药物组合及正在治疗的特定疾病的严重性。
施用途径包括但不限于口服、局部、皮下、肌肉内、静脉内、皮下、真皮内、透皮和真皮下施用。取决于施用途径,每剂的体积优选地为约0.001至10ml、更优选地约0.01至5ml和最优选地约0.1至3ml。组合物可以根据时间表,在适合于受试者的年龄、体重和病症、所使用的具体疫苗制剂和施用途径的时间段内,以单剂治疗或多剂治疗(加强)施用。
在某些实施方式中,施用单剂本发明的多肽或药物组合物。在其他实施方式中,施用多剂本发明的肽或药物组合物。施用频率可以随着多种因素中的任一种而变化,例如症状的严重性、所需的免疫保护程度、组合物用于预防还是治愈目的等。例如,在某些实施方式中,本发明的肽或药物组合物每月施用一次、每月施用两次、每月施用三次、每隔一周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一日一次(qod)、每日(qd)、每日两次(qid)或每日三次(tid)施用。当本发明的组合物用于预防目的时,它们一般进行引发和加强剂量两者的施用。预期加强剂量将隔开足够的时间,或优选地每年或在循环抗体水平低于所需水平的时间给予。加强剂量可以在不存在原始免疫原性载体分子的情况下由肽构成。这样的加强剂构建体可以包含可选的免疫原性载体,或者可以不存在任何载体。这样的加强剂组合物可以使用或不使用佐剂来配制。
本发明的多肽的给药持续时间,例如肽施用的时间长度,可以随着多种因素中的任一种例如患者的反应而变化。例如,多肽可以在约一日至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约8个月至约一年、约一年至约2年或约2年至约4年或更多的时间段内施用。
可以使用任何适合的药物递送装置将组合物递送至脊椎动物受试者。例如,常规针式注射器、弹簧或压缩气体(空气)注射器(Smoot的美国专利号1,605,763,Laurens的美国专利号3,788,315,Clark等的美国专利号3,853,125,Morrow等的美国专利号4,596,556和Dunlap的美国专利号5,062,830)、液体喷射注射器(Scherer的美国专利号2,754,818,Gordon的美国专利号3,330,276和Lindcaner等的美国专利号4,518,385)和颗粒注射器(McCabe等的美国专利号5,149,655,和Sanford等的美国专利号5,204,253),都适合用于该组合物的递送。
如果使用喷射注射器,在高压和高速例如1200-1400PSI下射出液体疫苗组合物的单次喷射,从而在皮肤中产生开口并穿透到适合于免疫的深度。
组合物或核酸或多肽或抗体可以与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成药物组合物。药学上可接受的载体可以含有起到例如使本发明的药物组合物稳定或者提高或降低其吸收或清除速率的作用的生理上可接受的化合物。生理上可接受的化合物可以包括例如糖类如葡萄糖、蔗糖或右旋糖,抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽,螯合剂,低分子量蛋白质,降低肽或多肽的清除或水解的组合物,或者赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。也可以使用去污剂来稳定或者提高或降低药物组合物(包括脂质体载体)的吸收。用于肽和多肽的药学上可接受的载体和制剂对于专业技术人员来说是已知的,并详细描述在科学和专利文献中,参见例如最新版的Remington′sPharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(“Remington′s”)。
其他生理上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或对防止微生物的生长或作用来说特别有用的防腐剂。各种防腐剂是公知的,并包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员将会认识到,药学上可接受的载体(包括生理上可接受的化合物)的选择取决于例如本发明的肽或多肽的施用途径及其特定的生理化学特性。
一个方面,如果组合物是水溶性的,将组合物的溶液或者核酸、肽、多肽或抗体溶解在药学上可接受的载体例如水性载体中。可以在用于肠、肠胃外或透粘膜药物递送的制剂中使用的水性溶液的实例包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、Hank′s溶液、Ringer′s溶液、右旋糖/盐水、葡萄糖溶液等。当需要时,制剂可以含有药学上可接受的辅助物质以模拟生理条件,例如缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂、去污剂等。添加剂还可以包括另外的活性成分例如杀细菌剂或稳定剂。例如,溶液可以含有乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯或三乙醇胺油酸酯。这些组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术灭菌,或者可以过滤除菌。得到的水性溶液可以进行包装用于原样使用或进行冷冻干燥,将冷冻干燥的制备物在施用前与无菌水性溶液组合。在这些制剂中肽的浓度可以广泛变化,并且主要基于流体体积、粘度、体重等,按照所选的具体施用方式和患者的需要进行选择。
固体制剂可用于经肠(口服)施用。它们可以配制成例如丸剂、片剂、粉剂或胶囊。对于固体组合物来说,可以使用常规的无毒固体载体,其包括例如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用来说,药学上可接受的无毒组合物通过将任何通常使用的赋形剂例如前面列出的那些载体与一般地10%至95%的活性成分(例如肽)合并来形成。非固体制剂也可用于经肠施用。载体可以选自各种油类,包括石油、动物、植物或合成来源的油类,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。适合的药物赋形剂包括例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。
组合物或核酸、多肽或抗体在口服施用时可以受到保护以免消化。这可以通过将核酸、多肽或抗体与组合物复合以赋予其对酸水解和酶促水解的抗性,或者通过将核酸、肽或多肽包装在具有适宜抗性的载体例如脂质体中来实现。保护化合物以免于消化的手段在本领域中是公知的,参见例如Fix,Pharm Res.13:1760-1764,1996;Samanen,J.Pharm.Pharmacol.48:119-135,1996;美国专利号5,391,377,其描述了用于治疗剂的口服递送的脂质组合物(进一步详细讨论了脂质体递送,参见下文)。
系统性施用也可以通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮施用来说,可以在制剂中使用适合于待穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂在本领域中是公知的,并且对于例如透粘膜给药来说,包括胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外,可以使用去污剂来促进渗透。透粘膜施用可以通过喷鼻剂或使用栓剂进行。参见例如Sayani,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.13:85-184,1996。对于局部、透皮施用来说,将药剂配制成软膏、霜剂、油膏、粉剂和凝胶。透皮递送系统也可以包括例如贴片。
作为本发明的方面的组合物或核酸、多肽或抗体也可以以持续递送或持续释放机构施用,所述机构能够在内部递送制剂。例如,可生物降解微球或胶囊或能够持续递送肽的其他可生物降解聚合物构造可以包括在本发明的制剂中(参见例如Putney,Nat.Biotechnol.16:153-157,1998)。
对于吸入来说,作为本发明的方面的组合物或核酸、多肽或抗体,可以使用本领域已知的任何系统包括干粉气溶胶、液体递送系统、空气喷射喷雾器、推进剂系统等来递送。参见例如Patton,Biotechniques16:141-143,1998;用于多肽大分子的产品和吸入递送系统,例如由Dura Pharmaceuticals(San Diego,Calif)、Aradigrn(Hayward,Calif)、Aerogen(Santa Clara,Calif)、Inhale TherapeuticSystems(San Carlos,Calif)等制造。例如,药物制剂可以以气溶胶或薄雾的形式施用。对于气溶胶施用来说,制剂可以与表面活性剂和推进剂一起,以精细分散的形式提供。另一方面,用于将制剂递送至呼吸组织的装置是在其中将制剂雾化的吸入器。其他液体递送系统包括例如空气喷射喷雾器。
在制备本发明药物的过程中,可以使用并操作多种制剂改良形式以改变药代动力学和生物分布。用于改变药代动力学和生物分布的许多方法对于本领域的普通技术人员来说是已知的。这样的方法的实例包括在由诸如蛋白质、脂质(例如脂质体,参见下文)、糖类或合成聚合物(上面讨论的)构成的囊泡中保护本发明的组合物。对于药代动力学的一般性讨论,参见例如Remington′s,第37-39章。
本发明的组合物或核酸、多肽或抗体可以单独地或作为药物组合物通过本领域已知的任何手段例如全身性地、区域性地或局部地(例如直接施用到肿瘤中或导向肿瘤),通过动脉内、鞘内(IT)、静脉内(IV)、肠胃外、胸膜腔内、局部、口服或局部施用,以及皮下、气管内(例如通过气溶胶)或透黏膜(例如颊、膀胱、阴道、子宫、直肠、鼻粘膜)递送。用于制备可施用组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的,并详细描述在科学或专利文献中,参见例如Remington′s。对于“区域效应”例如集中于特定器官来说,一种施用方式包括动脉内或鞘内(IT)注射以例如集中于特定器官例如脑和CNS(参见例如Gurun,Anesth Analg.85:317-323,1997)。例如,在希望将本发明的核酸、肽或多肽直接递送至脑的情况中,颈动脉内注射是优选的。如果需要高的系统剂量,肠胃外施用是优选的递送途径。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的,并详细描述在例如Remington′s中。也参见Bai,J.Neuroimmunol.80:65-75,1997;Warren,J.Neurol.Sci.152:31-38,1997;Tonegawa,J.Exp.Med.186:507-515,1997。
一个方面,将包含本发明的组合物或核酸、多肽或抗体的药物制剂并入在脂质单层或双层例如脂质体中,参见例如美国专利号6,110,490、6,096,716、5,283,185、5,279,833。本发明的方面还提供了将本发明的水溶性核酸、肽或多肽连接于单层或双层的表面的制剂。例如,可以将肽连接于含有酰肼-PEG-(二硬脂酰基磷脂酰)乙醇胺的脂质体(参见例如Zalipsky,Bioconjug.Chem.6:705-708,1995)。可以使用脂质体或任何形式的脂质膜,例如平面脂质膜或完整细胞例如红细胞的细胞膜。脂质体制剂可以通过任何手段,包括静脉内、透皮(参见例如Vutla,J.Pharm.Sci.85:5-8,1996)、透粘膜或口服施用。本发明还提供了本发明的核酸、肽和/或多肽掺入到胶束和/或脂质体中的药物制剂(参见例如Suntres,J.Pharm.Pharmacol.46:23-28,1994;Woodle,Pharm.Res.9:260-265,1992)。脂质体和脂质体制剂可以按照标准方法来制备,并且在本领域中也是公知的,参见例如Remington′s;Akimaru,Cytokines Mol.Ther.1:197-210,1995;Alving,Immunol.Rev.145:5-31,1995;Szoka,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467,1980;美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028。
一个方面,组合物使用保护蛋白质对抗身体的快速消除的载体来制备,例如受控释放制剂,包括植入物和微包封递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。也可以使用脂质体悬液(包括靶向被感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)作为药学上可接受的载体。它们可以按照本领域技术人员已知的方法来制备,如美国专利号4,522,811中所述。
将口服或肠胃外组合物配制成单位剂量形式以利于施用和剂量的均匀是有利的。本文中使用的单位剂量形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单元;各个单元含有与所需药物载体相结合的经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。
这样的化合物的毒性和治疗效力可以通过标准的制药程序在细胞培养物或实验动物中测定,例如测定LD50(使50%群体致死的剂量)和ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比率是治疗指数,且它可以表示成LD50/ED50的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物,但应该仔细设计递送系统,其将这样的化合物靶向于受影响的组织的位点以便将对未感染细胞的潜在损伤降至最低,从而降低副作用。
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括ED50而具有很少或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以随着所使用的剂型和所利用的给药途径在该范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物来说,治疗有效剂量最初可以从细胞培养分析来估计。剂量可以在例如炎症或涉及不希望的炎症的障碍的动物模型中配制以获得包括如在细胞培养中所确定的IC50(即获得症状的半最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。血浆中的水平可以一般地例如通过为标记的药剂的高效液相色谱来测量。在研究例如临床前方案中有用的动物模型在本领域中是已知的,例如炎症障碍的动物模型,例如在Sonderstrup(Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003)和Nikula等,Inhal.Toxicol.4(12):123-53,2000)中所描述的。
正如本文中所定义的,疫苗组合物、蛋白质或多肽例如抗体的治疗有效量(即有效剂量)在约0.001至30mg/kg体重的范围内,例如约0.01至25mg/kg体重、约0.1至20mg/kg体重,或约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg体重。蛋白质或多肽可以在约1至10周之间、例如2至8周之间、约3至7周之间或约4、5、6周内,每天或每周一次或几次施用。在某些情况下,可能在几个月或更长时间内需要所述剂量。专业技术人员将会认识到,某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排,包括但不限于疾病或障碍的严重性、以前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外,用治疗有效量的药剂例如蛋白质或多肽(包括抗体)治疗受试者可以包括单次治疗或者优选地可以包括一系列治疗。
对于抗体来说,剂量一般为约10mg/kg体重(例如10mg/kg至20mg/kg)。部分人抗体和完全人抗体与其他抗体相比在人体内一般具有更长的半衰期。因此,更低剂量和较低频率的施用通常是可能的。可以使用修饰例如脂质化来稳定抗体并增强摄入和组织渗透(例如到脑中)。用于抗体脂质化的方法由Cruikshank等,J.AcquiredImmune Defiiency Syndromes and Human Retrovirology,14:193,1997描述。
本发明的方面涵盖了包含有效免疫量的分离的艰难梭菌芽孢抗原蛋白质和药学上可接受的载体的组合物,其中所述组合物在脊椎动物受试者中有效地减少或消除艰难梭菌细菌感染。
药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本文中所描述的化合物可用于制备在本文中描述的任何治疗方法中使用的药物。
药物组合物一般被配制成无菌、基本上等渗并完全符合美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)的所有良好制造规范(Good Manufacturing Practice)(GMP)法规。
治疗方案:药代动力学
本发明的药物组合物方面可以根据施用方法以多种单位剂量形式施用。用于典型的疫苗组合物或核酸、肽和多肽以及抗体药物组合物的剂量对于本领域技术人员来说是公知的。这样的剂量通常在性质上是建议性的,并根据具体的治疗情况或患者耐受性进行调整。足以实现这一点的核酸、肽或多肽的量被定义为“治疗有效剂量”。给药时间表和对于这种用途来说有效的量,即“给药方案”,取决于多种因素,包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重性、患者健康的总体状态、患者的身体状态、年龄、药物制剂和活性剂浓度等。在为患者计算给药方案时,给药方式也考虑在内。给药方案还必须考虑到药代动力学,即药物组合物的吸收率、生物利用度、代谢、清除率等。参见例如最新版Remington′s;Egleton,Peptides18:1431-1439,1997;Langer,Science249:1527-1533,1990。
在治疗性应用中,将组合物以足以至少部分抑制或预防病症或疾病和/或其并发症的量施用于处于艰难梭菌细菌感染的风险中或患有活动感染的患者。例如,一个方面,包含可溶性肽药物组合物的疫苗组合物用于静脉内(IV)施用的剂量为约0.01mg/hr至约1.0mg/hr,经几小时(通常为1、3或6小时)施用,其可以以间歇周期重复几周。可以使用相当更高的剂量(例如高达约10mg/ml的范围),特别是当药物被施用于隔开的位点而不进入血流中,例如进入体腔或器官的内腔例如脑脊液(CSF)中时。
治疗方法
本文中还描述了通过施用本发明的组合物来治疗处于病症的风险中(或对病症易感)的受试者的预防性和治疗性方法,或预防或治疗艰难梭菌细菌感染的方法。
预防性方法
本发明的一个方面涉及通过施用包含有效免疫量的蛋白质和药学上可接受的载体的组合物在受试者中预防或治疗艰难梭菌细菌感染或细菌携带或两者的方法,其中所述组合物在脊椎动物受试者中有效减少或消除艰难梭菌细菌感染。处于由艰难梭菌细菌感染和细菌携带所引起或造成的障碍或不想要的症状的风险中的受试者可以通过本文中所述的或在本领域中已知的诊断或预后分析的任何组合来鉴定。一般来说,这样的障碍包括胃肠障碍例如胃胀、腹泻和腹痛。所述药剂作为预防性药剂的施用可以在症状显现之前进行,以便与不存在药剂的情况下的症状相比阻止、延迟或减轻症状。
治疗性方法
本发明的一个方面涉及通过施用包含有效免疫量的蛋白质和药学上可接受的载体的组合物在受试者中预防或治疗艰难梭菌细菌感染或细菌携带的方法,其中所述组合物在脊椎动物受试者中有效减少或消除艰难梭菌细菌感染。在另一种实施方式中,涉及通过施用包含有效量的抗体和药学上可接受的载体的组合物在受试者中预防或治疗艰难梭菌细菌感染或细菌携带的方法,其中所述组合物在脊椎动物受试者中有效减少或消除艰难梭菌细菌感染。
试剂盒
本发明提供了包含组合物,例如核酸、表达盒、载体、细胞、多肽和抗体的试剂盒。所述试剂盒也可以含有教示本文中所述的本发明方法和用途的说明材料。
下面的用于执行本发明的具体方面的实例仅仅出于说明性目的而提供,并且不打算以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:艰难梭菌BclA3蛋白质的表达和纯化
来自于高毒力菌株R20291的艰难梭菌BclA3序列从NCBI公共数据库获得(登记号:FN545816(区域:3807430-3809466))。使用标准的分子生物学方法,移除BclA3基因的信号肽和跨膜区域并添加HAVT20前导序列、His-标签和Kozak序列,然后使用AscI和HpaI限制性酶位点将构建体克隆到pcDNA3002Neo质粒中(SEQ IDNO:23)。随后对BclA3的序列进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达。
使用来自于Qiagen的EndoFree Giga试剂盒从甘油原液生长的培养物提取对应于BclA3的质粒DNA。质粒DNA的身份通过用AscI和HpaI限制性酶的限制性消化来证实(参见图1A)。
在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以用于BclA3蛋白质的大规模表达。将总共3×108个细胞用300μgBclA3质粒DNA转染。在转染后3天和7天,通过离心收集上清液。将转染过的上清液通过0.22μm滤膜过滤,并使用AktaPurifier FPLC在Ni柱(HisTRAP HP,GE Healthcare)上纯化。(对于FPLC程序,参见表3)。将洗脱的蛋白质缓冲交换到D-PBS中,并通过BCA分析测定蛋白质浓度。从300ml培养物纯化总共16mg蛋白质。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE上电泳以确定大小,并且也转移至硝酸纤维素膜上,其用抗His标签抗体探测以证实获得了含有His标签的大小正确的蛋白质(参见图1B)。我们发现获得了大于预期大小的蛋白质,这可能是由于在哺乳动物细胞的表达而使蛋白质被糖基化。使用质谱法来进一步证实蛋白质的身份。
表3:用于转染上清液的HisTRAP HP纯化的程序
实施例2:艰难梭菌Alr蛋白的表达和纯化
来自于高毒力菌株R20291的艰难梭菌Alr序列从NCBI公共数据库获得(登记号:FN545816(区域:3936313-3937470))。使用标准的分子生物学方法,移除Alr基因的信号肽和跨膜区并添加HAVT20前导序列、His-标签和Kozak序列,然后使用AscI和HpaI限制性酶位点将构建体克隆到pcDNA3002Neo质粒中(SEQ ID NO:24)。随后对Alr的序列进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达。
使用来自于Qiagen的EndoFree Giga试剂盒从甘油原液生长的培养物提取对应于Alr的质粒DNA。质粒DNA的身份通过用AscI和HpaI限制性酶限制性消化来证实(参见图2A)。
在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以用于Alr蛋白的大规模表达。将总共3×108个细胞用300μg Alr质粒DNA转染。在转染后3天和7天,通过离心(室温下3000rpm15min)收获上清液。将转染的上清液通过0.22μm滤器过滤,并使用AktaPurifierFPLC在Ni柱(HisTRAP HP,GE Healthcare)上纯化。(对于FPLC程序,参见表3)。将洗脱的蛋白质缓冲更换到D-PBS中,并通过BCA分析测定蛋白质浓度。从300ml培养物纯化总共34mg的蛋白质。有趣的是洗脱的蛋白质为明显黄色(其在蛋白质被浓缩时变得更深)这一事实。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE上电泳以确定大小,并且也转移至硝基纤维素膜上,将其用抗His标签抗体探测以证实获得了含有His标签的大小正确的蛋白质(参见图2C)。我们发现尽管蛋白质以正确大小运行,但它不结合抗His标签抗体,这可能是由蛋白质的折叠造成的。我们证明了可能发生蛋白质聚集,因为使用非还原样品时观察到较大条带,而在用β-巯基乙醇处理的样品中凝胶被解析到正确大小的条带(图2B)。使用质谱法来证实蛋白质的身份。
实施例3:艰难梭菌SlpA旁系同源物蛋白的表达和纯化
来自于高毒力菌株R20291的艰难梭菌SlpA旁系同源物序列从NCBI公共数据库获得(登记号:FN545816(区域:3157304-3159175))。使用标准的分子生物学方法,移除SlpA旁系同源物基因的信号肽和跨膜区并添加HAVT20前导序列、His-标签和Kozak序列,然后使用AscI和HpaI限制性酶位点将构建体克隆到pcDNA3002Neo质粒中(SEQ ID NO:25)。随后对SlpA旁系同源物的序列进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达。
使用来自于Qiagen的EndoFree Giga试剂盒从甘油原液生长的培养物提取对应于SlpA旁系同源物的质粒DNA。质粒DNA的身份通过用AscI和HpaI限制性酶限制性消化来证实(参见图3A)。
在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以用于大规模表达SlpA旁系同源物蛋白。将总共3×108个细胞用300μg SlpA旁系同源物质粒DNA进行转染。在转染后3天和7天,通过离心(室温下3000rpm15min)收获上清液。将转染的上清液通过0.22μm滤器过滤,并使用AktaPurifier FPLC在Ni柱(HisTRAP HP,GEHealthcare)上纯化(对于FPLC程序,参见表3)。将洗脱的蛋白质缓冲交换到D-PBS中,并通过BCA分析测定蛋白质浓度。从300ml培养物纯化总共14mg蛋白质。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE上电泳以确定大小,并且也转移至硝基纤维素膜上,其用抗His标签抗体探测以证实获得了含有His标签的大小正确的蛋白质(参见图3B)。我们发现尽管蛋白质以84kDa的正确大小运行,但它不结合抗His标签抗体,这可能是由于蛋白质的折叠造成的。使用质谱法来证实蛋白质的身份。
实施例4:艰难梭菌CD1021蛋白的表达和纯化
艰难梭菌CD1021核酸序列从NCBI公共数据库获得(登记号:AM180355(区域:1191725-1193632;也参见WO2009/108652A1))。使用标准的分子生物学方法,移除CD1021基因的信号肽和跨膜区并添加HAVT20前导序列、His-标签和Kozak序列,然后使用AscI和HpaI限制性酶位点将构建体克隆到pcDNA3002Neo质粒中(SEQID NO:26)。随后对CD1021的核酸序列进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达。
使用来自于Qiagen的EndoFree Giga试剂盒从甘油原液生长的培养物提取对应于CD1021的质粒DNA。质粒DNA的身份通过用AscI和HpaI限制性酶限制性消化来证实(参见图4A)。
在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以用于大规模表达CD1021蛋白。将总共3×108个细胞用300μgCD1021质粒DNA转染。在转染后3天和7天,通过离心(室温下3000rpm15min)收获上清液。将转染的上清液通过0.22μm滤器过滤,并使用AktaPurifier FPLC在Ni柱(HisTRAP HP,GE Healthcare)上纯化(对于FPLC程序,参见表3)。将洗脱的蛋白质缓冲交换到D-PBS中,并通过BCA分析测定蛋白质浓度。从300ml培养物纯化总共10mg蛋白质。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE上电泳以确定大小,并且也转移至硝基纤维素膜上,其用抗His标签抗体探测以证实获得了含有His标签的大小正确的蛋白质(参见图4C)。我们发现获得了大于预期大小的蛋白质,这很可能是由于在哺乳动物细胞中表达而使蛋白被糖基化。使用质谱法来进一步证实蛋白质的身份。
实施例5:艰难梭菌FliD蛋白的表达和纯化
FliD基因从艰难梭菌R20291菌株获取,并被确定为在几个菌株(ATCC43255、630和CD196)中为88%保守的。使用标准的分子生物学方法,移除FliD基因的信号肽和跨膜区并添加HAVT20前导序列、His-标签和Kozak序列,然后使用AscI和HpaI限制性位点将序列克隆到pcDNA3002Neo质粒中(SEQ ID NO:30)。随后对FliD的核酸序列进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达。
从甘油原液生长的培养物提取质粒DNA。质粒DNA使用来自于Qiagen的EndoFree Giga试剂盒提取。在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以获得大量FliD蛋白。将总共3×108个细胞用300μg FliD质粒DNA转染。在转染后3天和7天,通过离心收集上清液。将来自于转染细胞的上清液通过0.22μm滤器过滤,并使用AktaPurifier FPLC通过Ni柱(HisTRAP HP,GE Healthcare)(对于FPLC程序,参见表3)。将洗脱的蛋白质缓冲交换到D-PBS中,并通过BCA分析测定浓度。从300ml培养物纯化总共68mg蛋白质。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上电泳以确认其大小(参见图6)。预测蛋白质为55kDa,然而,它以~65kDa的比预期更大的大小运行。更大的大小可能是由于蛋白质被哺乳动物细胞糖基化,或者它可能是由于二聚化。通过质谱法确认所述蛋白质为FliD蛋白。
实施例6:在小鼠中产生针对艰难梭菌芽孢抗原的抗体
为了产生抗体,将成对的5至12周龄BALB/c小鼠(来自于Charles River,Wilmington,MA或另一来源),用根据给药途径与等体积的弗氏完全佐剂佐剂(Difco,BD Biosciences,Oakville,ON,Canada)或另一种适合的佐剂混合的磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH7.2)中的2-50μg重组蛋白质皮下或腹膜内(或编码抗原的DNA通过肌肉内(im)注射)接种(在第1日)。在第21、35和50日,提供与等量的适合佐剂(弗氏不完全佐剂(Difco))混合的PBS中的2-25μg重组蛋白质的皮下(或ip)加强注射(或DNA通过im注射)。通过ip、iv向小鼠提供PBS中的0.5-5μg重组蛋白质的最后加强(或者对于DNA通过im),并在3天后处死小鼠。
按照Berry等(2004)所述,通过酶联免疫吸附分析(ELISA)或其他适合的分析法,使用在接种流程期间从小鼠收集的血清使用适合的96孔板或类似的板(例如MaxiSorpTM,Nalge-NUNC,Rochester,NY)来监测对抗原或完整芽孢的血清IgG应答。将分析板用重组抗原或作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)或另一种适合的蛋白质,各自以每孔75-1000ng的量包被。在检测到足够的IgG滴度后(例如在ELISA测定法中405nm处的OD比背景高至少3-5倍),小鼠接受最后的推进加强并处死。分离脾脏和/或淋巴结,并按照描述(Berry等,2004)进行杂交瘤产生和生长。随后按照以前的描述进行mAb收获、浓缩和同种型分型(Berry等,2004)。
或者,使用单细胞分选或整体分选(通过FACS或使用适合的柱)分离CD38+或CD138+成淋巴细胞,并将回收的RNA用于使用噬菌体或表达盒进行mAb的表达筛选。使用免疫和免疫前血清(用PBS中的0.2%BSA稀释1:2000)分别作为阳性和阴性对照。使用HiTrapTM蛋白G HP或另一种适合的柱子,按照制造商的说明书(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)纯化mAb。在用PBS进行缓冲交换后,使用Micro BCA蛋白质分析试剂盒,按照制造商的说明书(Pierce,Rockford,IL)测定mAb浓度。如果需要,转基因小鼠可以接受附加的加强以引发高滴度IgG应答,指示足够的B细胞敏化。
实施例7:在兔中产生针对艰难梭菌芽孢抗原的抗体
为了产生抗体,在用与等体积弗氏完全佐剂混合的磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH7.2)中的50-200μg重组蛋白质进行皮下(SQ)免疫之前的第0日,对2只兔子进行预先取血。在第28、47和66日,提供与等量弗氏不完全佐剂混合的PBS中的20-100μg重组蛋白质的皮下加强剂。在四个不同位点对兔子进行免疫;两个在后腿处,两个在肩胛骨处。免疫接种使用luer-lok连接器来制备,以允许轻微乳化。兔子在第59天进行化验取血,并在第78天进行最终取血。最终取血在动物处于麻醉下进行。
通过酶联免疫吸附分析(ELISA)或其他适合的分析法,使用在化验取血期间从兔子收集的血清使用适合的96孔板(例如MaxiSorpTM,Nalge-NUNC,Rochester,NY)来监测对蛋白质的血清Ab应答。将板用重组蛋白质或作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)或其他蛋白质,均以每个孔75-1000ng的量进行包被。将免疫和免疫前血清(用PBS中的0.2%BSA稀释1∶2000)分别用作阳性和阴性对照。在检测到足够的Ab滴度后(在ELISA中405nm处的OD比背景高至少3-5倍),兔子接受最后的加强并经历最终取血。如果滴度不足,兔子将接受附加的加强。使用蛋白A柱从最终取血纯化pAb,随后将用PBS交换缓冲液并测定pAb浓度。
实施例8:在仓鼠中测试艰难梭菌芽孢抗原的保护性效应(主动免疫)
将金色叙利亚仓鼠(雌性,6-7周龄)用编码芽孢抗原的DNA(1Oμg/仓鼠)免疫(i.d.)两次(Vl,V2,分别在第1和28日),并用相应的重组蛋白质(1Oμg/仓鼠)免疫一次(V3,第35日)。参见下面的图示。在各次疫苗接种后进行取血以测试抗体生产(ELISA)。在最后一次疫苗接种后一周,将仓鼠用克林霉素(30mg/kg,口服)治疗。抗生素治疗后12小时,将动物用艰难梭菌B1株的100个芽孢(在0.2ml盐水中)进行口胃激发,并每日监测临床征兆。任何显示出不可逆发病的动物出于人道原因被安乐死,剩余的存活仓鼠在激发后7天被安乐死。通过临床征兆、存活率并通过测定在安乐死时在盲肠中回收到的芽孢数来评估保护作用。保护性抗原预计引起回收的芽孢以及在数日的过程中芽孢脱落的减少,并引起存活的改善。
实施例9:在仓鼠中测试抗艰难梭茵芽孢抗原的抗体的保护效应
A.原始激发模型
为了测试针对芽孢抗原的mAb的保护能力,将仓鼠通过单一或组合的i.p.递送的抗体(50mg/kg/天)进行处理总共4天(在施用艰难梭茵芽孢之前72、48、24和0h)。在口胃递送艰难梭菌B1菌株的100个芽孢之前12小时,对动物腹膜内注射克林霉素。每日观察仓鼠的死亡,直至所有仓鼠死于疾病或变得没有疾病症状。当单一提供抗体时,预计它们将存活率提高50%,并且这种保护在第5天后减退(20%)。还预计抗体治疗将尸检时粪便中的CFU降低1log。此外,预计组合疗法将在第2天导致保护增加至95%,以及整个研究期间产生明显的保护(50%),其中CFU降低2log。
B.复发模型
使用抗生素消除艰难梭菌的治疗杀死营养体细菌,但是留下芽孢。这是造成复发性感染的主要问题,其中患者在抗生素治疗之间具有CDAD发作。为了确定抗体在复发情形中是否能够阻止死亡,可以使用仓鼠复发模型(Babcock等,2009)。在这种模型中,仓鼠用针对艰难梭菌疾病提供保护的万古霉素进行治疗,但是当万古霉素治疗中断时,仓鼠疾病复发。如上所述向仓鼠施用克林霉素,并且在12小时后将它们用艰难梭菌B1菌株芽孢(100,000CFU)口胃激发。在芽孢激发当天和随后两天每天提供万古霉素(10mg/kg/天)。在芽孢激发后第2至6天,将仓鼠用mAb(50mg/kg/天)的组合进行治疗。使用组合进行的治疗预计在70%的仓鼠中防止复发,与此相比在接受单独万古霉素的仓鼠中为40%。预计治疗还引起细菌芽孢脱落的减少(2log,相比于在单独万古霉素组中的1log)。当单独使用mAb时预计存活率也提高,尽管具有显著较低的45%的存活率,并且粪便中回收到的CFU减少1log。
实施例10:用芽孢抗原免疫接种小鼠以产生mAb
将小鼠用芽孢抗原免疫以产生mAb。每个抗原组具有4只小鼠,其用70%PBS+30%Emulsigen中的10μg/小鼠的纯化抗原和5μg/小鼠的CpG i.p.免疫/加强。对小鼠提供3次加强,在初始免疫后每周1次。在最终取血之前对小鼠进行最后一次加强(4μg/小鼠,在PBS中)。然后对含有针对芽孢抗原的mAb的血清进行鉴定。
实施例11:体外芽孢抗原mAb鉴定
1)检测ELISA。进行这种分析以测试来自于用艰难梭菌芽孢抗原免疫的小鼠的抗体与芽孢抗原和完整芽孢的结合。使用抗艰难梭菌芽孢(ATCC43255)多克隆抗体作为所述分析的阳性对照。
a)完整芽孢ELISA。将芽孢的等分试样解冻并在包被缓冲液中稀释至105个芽孢/mi的浓度。向96孔ELISA板的每个孔添加100μl体积的芽孢(104个芽孢/孔)。将板密封并在室温下留置过夜。
第二天,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBST,以除去未附着的任何芽孢。将密封的板使用pH7.4的PBS中的5%脱脂奶(300μl/孔)在37℃下封闭1.5小时。在封闭后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBST,以除去封闭缓冲液。将第一抗体(来自于免疫小鼠的小鼠血清)从1/100的稀释度开始进行1∶2的连续稀释。将用作阳性对照的抗艰难梭菌芽孢多克隆Ab(pAb)稀释至1/1000。将抗体稀释液装入板的适合的孔中(100μl/孔)。将板密封并使其在37℃下温育1小时。在第一抗体温育后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBST,以除去未结合的第一Ab。适合的第二抗体以推荐的制造商稀释度使用,并装入板的适合的孔中(100μl/孔)以检测任何结合的第一Ab。将板密封并使其在37℃下温育1小时。在第二抗体温育后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBST,以除去未结合的第二Ab。为了检测任何结合的抗体,将过氧化物酶底物装入各个孔中(100μl/孔),并使其在暗处在室温下温育10-30分钟。在温育后使用终止溶液(50μl/孔)终止反应,并在450nm下读板。
结果:完整芽孢ELISA显示了结合于分离的艰难梭菌芽孢菌株ATCC43255的各种芽孢抗体,如图7、8、9和10中所示。
b)芽孢抗原ELISA。将芽孢抗原在包被缓冲液中稀释至0.03μg/μL的浓度。向96孔ELISA板的每个孔加入体积为100μl的稀释液。将板密封并使其在室温下过夜。
第二天,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBS,以除去任何未结合的抗原。将密封的板使用1%BSA(300μl/孔)在室温下封闭至少1.5小时。在封闭后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBS,以除去封闭缓冲液。将第一抗体(来自于免疫小鼠的小鼠血清)从1/50的稀释度开始进行1∶2的连续稀释。将用作阳性对照的抗艰难梭菌芽孢多克隆Ab(pAb)从1/50的稀释度开始进行1∶2的连续稀释。将抗体稀释液装入板的适合的孔中(100μl/孔)。将板密封并使其在室温下温育至少1小时。在第一抗体温育后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBS,以除去未结合的第一Ab。适合的第二抗体以推荐的制造商稀释度使用,并装入板的适合的孔中(100μl/孔)以检测任何结合的第一Ab。将板密封并使其在室温下温育至少1小时。在第二抗体温育后,将板洗涤3次,每次洗涤使用300μl/孔的PBST,以除去未结合的第二Ab。为了检测任何结合的抗体,将碱性磷酸酶底物装入各个孔中(100μl/孔),并使其在暗处在室温下温育至少1小时。在405nm处读板。
结果:来自于芽孢抗原ELISA的结果表明,在小鼠中产生的芽孢抗体结合纯化的艰难梭菌芽孢抗原,如图11至14中所示。
2)萌发分析。进行该分析以筛选从艰难梭菌芽孢抗原免疫的小鼠获得的血清对芽孢萌发的抑制。所述分析的前提是,当芽孢萌发时,获取的O.D.读数应该随时间减小。如果血清中的抗体抑制萌发,则与未处理的芽孢相比,应该存在着O.D.随时间的更慢的减小。使用抗艰难梭菌芽孢(ATCC43255)多克隆抗体作为本分析的阳性对照。
使用新近纯化的芽孢制备芽孢悬液(107个芽孢/处理),并将其在60℃水浴中热激活20分钟,然后冷却至室温。将芽孢超声2分钟以打碎任何团块。将体积为200μl的悬液转移至新的管中,并加入1μl pAb。将管在冰上温育30分钟。然后向管加入萌发培养基(800μl的BHIT-G),并将内含物转移至比色皿。在一小时时间段内每10分钟对比色皿进行读数(600nm处的O.D.)。在读数之间将比色皿在37℃下摇床(50rpm)上温育。
结果:使用pAb的萌发分析显示,识别芽孢的抗体能够延迟萌发的发生(图15)。
实施例12:Western印迹试验
进行Western印迹以测试来自于用艰难梭菌芽孢抗原免疫的小鼠的抗体对芽孢表面上表达的蛋白的识别。
使用SDS提取缓冲液和尿素提取缓冲液从ATCC43255芽孢制备蛋白质提取物。将蛋白质提取物与四种重组芽孢抗原蛋白质的混合物一起在两块12%SDS-PAGE凝胶上电泳。将一块凝胶用考马斯蓝染色以显现蛋白质条带;将另一块凝胶转移至硝基纤维素膜上,并用抗完整芽孢的多克隆Ab进行印迹。将尿素提取物在单独的SDS-PAGE凝胶上电泳;将各单独凝胶用来自于用不同芽孢抗原免疫的小鼠的血清印迹。
a)蛋白质提取。将ATCC43255芽孢(3×107)用PBS洗涤,并用1mL SDS提取缓冲液(62.5mM Tris-HCl,pH6.8;25%甘油;2%SDS;5%β-巯基乙醇和0.01%溴酚蓝)重悬浮;将样品煮沸15min并通过0.2μm滤器以除去芽孢。
将ATCC43255芽孢(3×107)用PBS洗涤,并用1mL尿素提取缓冲液(8M脲和10%β-巯基乙醇在50mM Tris-HC1中)重悬浮;将样品在30℃下温育2小时,每10min进行涡旋振荡,并通过0.2μm滤器以除去芽孢。
b)Western印迹:i)转移:将预先浸泡的过滤垫、硝基纤维素和Whatman滤纸在1X转移缓冲液中放置20分钟。将凝胶与过滤垫、硝基纤维素和Whatman滤纸在1X转移缓冲液中平衡5分钟。转移在2-8℃下以100V进行1小时。ii)染色:将膜用5%脱脂奶在室温下封闭1hr。将膜在室温下在TBS-T中洗涤3×10分钟。以蛋白质一侧朝上将膜置于含有20mL第一抗体(1∶1000)溶液的容器中,并在2-8℃下温育18-24小时。将膜在室温下在TBS-T中洗涤3×10分钟。然后以蛋白质一侧朝上将膜置于含有20mL第二抗体(1∶10000)溶液的容器中,并在室温下温育2小时。将膜在室温下在TBS-T中洗涤3×10分钟。iii)检测:从冰箱取出SIGMAFASTTM /NBT剂并升温至室温。将2片置于20mL(2X)LW中并涡旋振荡直至溶解。将膜与SIGMAFASTTM /NBT温育约30秒或直至达到所需强度。然后将膜用大量LW洗涤以防止过度染色。允许膜干燥并避光储存以用于将来参考。
结果:Western印迹显示,在用艰难梭菌芽孢抗原免疫的小鼠中产生的抗体识别芽孢蛋白,如图16至21中所示。
尽管已经描述并说明了本发明的特定方面,但这些方面应该被当作仅仅示例说明本发明而不是限制正如随附的权利要求书所解释的本发明。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请在此为所有目的以其全文引为参考,如同各个单独的出版物或专利申请被具体并单独地指明为所有目的引为参考一样。
尽管出于清楚理解的目的,通过图示和实例对上述发明的一些详细情况进行了描述,但根据本发明的教导,本领域的普通技术人员可以容易地看出可以对本发明做出某些改变和修改而不背离随附的权利要求书的精神或范围。
Claims (72)
1.一种组合物,其包含结合艰难梭菌(C.difficile)芽孢多肽或其片段的抗体或其片段,其中所述多肽或其片段选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD。
2.一种组合物,其包含结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段的抗体或其片段,其中所述多肽或其片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
3.一种分离的抗体或其片段,其结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段,其中所述多肽或其片段选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD。
4.一种抗体或其片段,其结合艰难梭菌芽孢多肽或其片段,其中所述多肽或其片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段是多克隆抗体。
6.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段是单克隆抗体。
7.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段是人抗体。
8.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段选自:(a)完整免疫球蛋白分子;(b)scFv;(c)嵌合抗体;(d)Fab片段;(e)F(ab’)2;和(f)二硫键连接的Fv。
9.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其包含选自下列的重链免疫球蛋白恒定结构域:(a)人IgM恒定结构域;(b)人IgG1恒定结构域;(c)人IgG2恒定结构域;(d)人IgG3恒定结构域;(e)人IgG4恒定结构域;和(f)人IgA1/2恒定结构域。
10.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其包含选自下列的轻链免疫球蛋白恒定结构域:(a)人Igκ恒定结构域;和(b)人Igλ恒定结构域。
11.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段以至少1×109M的亲和常数(Kaff)与抗原结合。
12.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段以至少1×1010M的亲和常数(Kaff)与抗原结合。
13.权利要求1-2任一项的组合物,其还包含选自结合艰难梭菌毒素A、毒素B的抗体及结合毒素A和毒素B的抗体组合的成员。
14.权利要求1-2任一项的组合物,其还包含抗生素。
15.权利要求14的组合物,其中所述抗生素是甲硝哒唑或万古霉素。
16.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法,所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求1-2任一项的组合物。
17.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法,所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求3-4任一项的组合物。
18.一种治疗艰难梭菌相关疾病的方法,所述方法包括向需要的受试者施用有效减轻或预防所述疾病的量的权利要求13的组合物。
19.权利要求16的方法,其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
20.权利要求17的方法,其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
21.权利要求18的方法,其中所述组合物静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)或口服施用。
22.权利要求16的方法,其中所述组合物以1至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
23.权利要求17的方法,其中所述组合物以1至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
24.权利要求18的方法,其中所述组合物以1至100毫克每千克受试者体重的范围的量施用。
25.一种被动免疫方法,所述方法包括向动物施用有效量的权利要求1-2任一项的组合物。
26.一种被动免疫方法,所述方法包括向动物施用有效量的权利要求3-4任一项的抗体或其片段。
27.一种在受试者中诱导免疫应答的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者给药艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂,所述多肽或片段或变体选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD。
28.一种在受试者中诱导免疫应答的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效诱导免疫应答的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂,所述多肽或片段或变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
29.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂,所述多肽或片段或变体选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD。
30.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体和药学上可接受的佐剂,所述多肽或片段或变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
31.权利要求27-30任一项的方法,其中所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。
32.权利要求27-30任一项的方法,其中所述施用是口服、鼻内、静脉内或肌肉内施用。
33.权利要求27-30任一项的方法,其中所述变体是突变体。
34.权利要求27-30任一项的方法,其中所述变体是融合蛋白。
35.权利要求34的方法,其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
36.权利要求35的方法,其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
37.权利要求34的方法,其中所述融合蛋白是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员,或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段组成的组中的成员,与该组的另一个成员的融合体。
38.一种组合物,其包含有效免疫量的分离的多肽或其片段或变体和药学上可接受的载体,其中所述组合物在受试者中有效地诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答,并且其中所述分离的多肽或其片段或变体包含选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpAHMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艰难梭菌芽孢多肽或其片段。
39.一种组合物,其包含有效免疫量的分离的多肽或其片段或变体和药学上可接受的载体,其中所述组合物在受试者中有效地诱导针对艰难梭菌感染的免疫应答,并且其中所述分离的多肽或其片段或变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
40.权利要求38或39的组合物,其中所述组合物还包含药学上可接受的佐剂。
41.权利要求40的组合物,其中所述药学上可接受的佐剂包括水包油乳液。
42.权利要求40的组合物,其中所述药学上可接受的佐剂是ISA-206和Quil A。
43.权利要求40的组合物,其中所述药学上可接受的佐剂是白介素12或热休克蛋白。
44.权利要求38或39的方法,其中所述变体是突变体。
45.权利要求38或39的方法,其中所述变体是融合蛋白。
46.权利要求45的方法,其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
47.权利要求46的方法,其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
48.权利要求45的方法,其中所述融合蛋白是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员,或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10及其片段组成的组中的成员,与该组的另一个成员的融合体。
49.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂,所述多肽或片段或变体选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD。
50.一种在需要的受试者中减少或预防艰难梭菌感染的方法,所述方法包括以在所述受试者中有效减少或预防感染的量向所述受试者施用一定量的编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体的核酸和药学上可接受的佐剂,所述核酸编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
51.权利要求49或50的方法,其中所述变体是突变体。
52.权利要求49或50的方法,其中所述变体是融合蛋白。
53.权利要求52的方法,其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
54.权利要求53的方法,其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
55.权利要求52的方法,其中所述融合蛋白是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、S1pA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD组成的组中的成员,或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组中的成员,与该组的另一个成员的融合体。
56.一种分离的核酸,其编码选自BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD的艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体。
57.一种分离的核酸,其编码艰难梭菌芽孢多肽或其片段或变体,其中所述核酸编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80-95%同一的氨基酸序列。
58.权利要求56或57的核酸,其中所述变体是突变体。
59.权利要求56或57的核酸,其中所述变体是融合蛋白。
60.权利要求59的核酸,其中所述融合蛋白包含艰难梭菌毒素A或B的序列。
61.权利要求60的核酸,其中所述艰难梭菌毒素A或B的序列选自TcdA的N-末端催化结构域、TcdB的N-末端催化结构域、TcdB的C-末端片段4和TcdA的C-末端受体结合片段。
62.权利要求59的核酸,其中所述融合蛋白是BclA1、BclA2、BclA3、Alr、SlpA旁系同源物、SlpA HMW、CD1021、IunH、Fe-Mn-SOD和FliD及其片段组成的组中的成员,或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:1O及其片段组成的组中的成员,与该组的另一个成员的融合体。
63.一种表达载体,其包含权利要求56或57的核酸。
64.权利要求63的表达载体,其中所述表达载体是哺乳动物表达载体。
65.权利要求64的表达载体,其中所述哺乳动物表达载体包含CMV启动子。
66.权利要求63的表达载体,其中所述表达载体是pcDNA3002Neo或pET32a。
67.一种宿主细胞,其包含权利要求63的表达载体。
68.权利要求67的宿主细胞,其中所述宿主细胞是HEK293F、NSO-1、CHO-K1、CHO-S或PER.C6。
69.权利要求63的表达载体,其中所述表达载体是细菌表达载体。
70.权利要求69的表达载体,其中所述表达载体是pET32a。
71.权利要求67的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。
72.权利要求1-4任一项的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段抑制或延迟芽孢萌发。
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