CN103604922A - 呼吸道合胞病毒检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

呼吸道合胞病毒检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域，本发明试剂盒采用咽拭子擦拭患儿咽部，通过盐酸氨溴索药物使咽拭子鼻咽分泌物溶解，经高速离心后，沉淀物鼻咽上皮细胞加入到2.0ml含1.0％(V/V)Triton X-100的磷酸盐缓冲液中，静置30min，剧烈震荡，使呼吸道合胞病毒从咽上皮细胞脱落出来，取溶解液加入到呼吸道合胞病毒检测酶标板上，采用酶联免疫吸附法检测呼吸道合胞病毒，经温浴、洗涤、加生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体，链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物，再加入底物液，读取结果。本发明操作简单、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，适用于检测鼻咽部上皮细胞感染呼吸道合胞病毒，可以作为儿童感染呼吸道合胞病毒的重要检查指标。

Description

呼吸道合胞病毒检测试剂盒及使用方法
技术领域
一种呼吸道合胞病毒检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域。
背景技术
目前国内检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染方法有电镜检测、培养鉴定法、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验、凝集法、荧光免疫特异性抗体检测法等，文献指出在各种方法中，抗原较抗体检测更敏感。临床实验室常用间接免疫荧光法检测RSV，其次还有病毒分离培养法，PCR法，病毒细胞培养需要的时间长、费用高，有时甚至几周才能出结果，不适合临床检验，间接免疫荧光法操作简单，方便，适合于临床实验室检测RSV，以德国欧蒙公司为代表的试剂盒应用最普遍，该方法为用RSV感染的细胞作为抗原，人体内产生的RSV抗体与受RSV感染的细胞反应，加入标记异硫氰酸荧光素的羊抗人IgM，实验前需用驴抗人IgG抗体吸附抗呼吸道合胞病毒IgG抗体，此法的最大缺点是体内IgG抗体的非特异性结合，造成假阳性，结果不易判读。
发明内容
本发明的目的是提供一种样品前处理简单，快速、灵敏、准确的检测呼吸道合胞病毒的方法。
本发明试剂盒主要由盒体(1)，酶标板(2)中设有反应孔(3)的板条，A试剂瓶(分泌物前处理液)(4)，B试剂瓶(生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体)(5)，C试剂瓶(含Triton X-100的磷酸盐缓冲液)(6)，D试剂瓶(链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物)(7)，E试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)，F试剂瓶(H2O2)(9)，G试剂瓶(硫酸溶液)(10)，塑料托架(11)及酶标板(2)均安放在盒体(1)内。
本发明用咽拭子擦拭患儿咽部，加入到2ml含有30g/L盐酸氨溴索磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至60min，高速离心(10000G，10min)，取沉淀物加入到2.0ml含1.0％(V/V)Triton X-100的磷酸盐缓冲液中，静置30min，剧烈震荡，使呼吸道合胞病毒从咽上皮细胞脱落出来，取50μl上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反应板中，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入50μl生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入试剂E、F各50μl，至37℃水浴箱水浴10min，加1滴终止液酶标仪测定A490nm值。
在本发明中，该试剂盒检测的标本是鼻咽分泌物中上皮细胞，其中，盐酸氨溴索药物为粘液溶解剂，临床上常用于呼吸科病人降低痰液的粘稠度而易于排出，本品的巯基(-SH)结构可使粘蛋白的双硫(-S-S-)结构断裂，降低痰粘度，在本发明中，经盐酸氨溴索作用使咽部上皮细胞从粘液中分离开。Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂，分子量为646.86(分子式为C34H62O11)，它能溶解脂质，增加对细胞膜的通透性，RSV寄生于口腔咽部活体细胞内，Triton X-100作用于细胞膜使RSV病毒从细胞中脱离出来，在链霉亲和素-生物素偶联ELISA法检测中，链霉亲和素-生物素系统是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术，研究证明链霉亲和素-生物素依靠接触表面均一的多层膜来维持其稳定的结合，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的抗体可通过其生物素连接多个链霉亲和素分子，一个链霉亲和素分子又可桥联多个酶分子，由于此法能结合更多酶标记物，放大了检测信号，使检测灵敏度放大1000倍，因此，能检测病毒载量低的咽部上皮细胞，特别适合呼吸道合胞病毒早期感染。
本文采用将生物素-链霉亲和素系统引入ELISA检测系统，经特殊处理咽部上皮细胞，利用该系统的放大效应和链霉亲和素-酶复合物具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性强等特点，提高了检测灵敏度，特别适合早期感染的诊治，具有重要临床价值，并可应用该技术平台检测SARS病毒，H7N9病毒等其它病毒检测，具有重要意义。
具体实施方式
一、呼吸道合胞病毒酶标板的制备
将抗呼吸道合胞病毒抗体用包被液稀释成1∶200倍，加入100μl包被微孔反应板的微孔，加入含1％小牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液350μl/每孔，室温封闭2小时，4℃过夜。甩尽孔内液体后，用洗涤液洗3次，每次3分钟。二、生物素化抗体的制备
生物素化抗体的制备用0.1mmol/L NaHCO3溶液将羊抗人IgM呼吸道合胞病毒抗体稀释成1mg/L，每毫升抗体溶液中加二甲基甲酰胺溶解的生物素N羟基丁二酰亚胺酯，加入NaHB40.1ml混匀，4℃2小时后对0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析，4℃过夜。加入适量中性甘油后小量分装。
三、链霉亲和素偶联过氧化物酶标记物的制备
链霉亲和素偶联过氧化物酶标记物辣根过氧化物酶5mg溶于蒸馏水0.5ml中，加入60mmol/L NaOI4 0.5ml，置4℃ 20min后加入0.16mol/L乙二醇0.5ml，再置4℃ 30分钟。加入链霉亲和素5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加KBH4(5mg/ml)0.3ml，置4℃ 3小时，加等容积饱和磷酸铵，4℃ 30分钟后4000r/min离心15min。沉淀物用pH7.40.02mol/L磷酸盐缓冲液0.5ml溶解，用磷酸盐缓冲液透析除铵。
四、磷酸盐缓冲液(0.15M pH7.4 PBS)配置：KH2PO4 0.2克，Na2HPO4·12H2O 2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-200.5ml，加蒸馏水至1000ml。
五、A试剂前处理液的配置：在1L洗涤液中加入盐酸氨溴索30g，即为前处理液。
六、C试剂在1L洗涤液中加入10ml Triton X-100，即为C试剂。
附图说明
图1呼吸道合胞病毒检测试剂盒示意图。
图2酶标板示意图。
具体实施方式
实施例1
1.样品处理用咽拭子擦拭患儿咽部，加入到2ml含有30g/L盐酸氨溴索磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至60min，高速离心(10000G，10min)，取沉淀物加入到2.0ml磷酸盐-吐温缓冲液(含1.0％(V/V)Triton X-100)中，静置30min。
2.检测方法取50μl上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反应板中，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入50μl生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体，37℃水浴30min，洗涤5次；加入链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物，37℃水浴30min，洗涤5次；加入试剂E、F各50μl，至37℃水浴10min，加1滴终止液酶标仪测定A490nm值。
3.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，也可测OD值，在ELISA检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
实施效果
1.两种检测呼吸道合胞病毒检测方法阳性率比较见表1：
表1 本发明方法和间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒的阳性率比较：
Figure BSA0000098041130000031
注：两组检测方法经卡方检验分析，X2＝0.5079，P＞0.05两组检测方法阳性率比较差异无统计学意义。
2.两种检测呼吸道合胞病毒检测方法敏感性、特异性比较见表2
Figure BSA0000098041130000032
注：两组检测方法中，链霉亲和素-生物素偶联ELISA法其敏感性和特异性高于间接免疫荧光法。
经比较两种方法阳性率无显著性差异，在灵敏度和特异性方面，本发明方法更优，更适合于临床早期感染诊断。

Claims (9)

1.一种呼吸道合胞病毒酶免疫检测试剂盒，其特征在于由盒体(1)，酶标板(2)中设有反应孔(3)的板条，A试剂瓶(分泌物前处理液)(4)，B试剂瓶(生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体)(5)，C试剂瓶(含Triton X-100的磷酸盐缓冲液)(6)，D试剂瓶(链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物)(7)，E试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)，F试剂瓶(H2O2)(9)，G试剂瓶(硫酸溶液)(10)，塑料托架(11)及酶标板(2)均安放在盒体(1)内。
2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的塑料托架(11)上制有孔和凹槽。
3.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成均放在盒体(1)内。
4.一种呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于用咽拭子擦拭患儿咽部，加入到2ml含有30g/L盐酸氨溴索磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至60min，高速离心(10000G，10min)，取沉淀物加入到2.0ml含1.0％(V/V)Triton X-100的磷酸缓冲液盐中，静置30min，剧烈震荡，使呼吸道合胞病毒从咽上皮细胞脱落出来，取50μl上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反应板中，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入50μl生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物，37℃水浴箱水浴30min，洗涤5次；加入试剂E、F各50μl，至37℃水浴箱水浴10min，加1滴终止液酶标仪测定A490nm值。
5.按照权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于所述的A试剂瓶(分泌物前处理液)为含有30mg/L盐酸氨溴索磷酸盐缓冲液。
6.按照权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于所述的B试剂瓶，为生物素化抗呼吸道合胞病毒抗体。
7.按照权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于所述的C试剂瓶为含有1.0％(V/V)Triton X-100的磷酸盐缓冲液。
8.按照权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于所述的D试剂瓶，为链霉亲和素偶联过氧化物酶复合物。
9.按照权利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫检测方法，其特征在于所述的酶底物液，E试剂瓶为邻苯二胺(OPD)试剂，F试剂瓶为H2O2。
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