CN103582818A - 戈谢病的诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断受试者中的戈谢病的体外方法，所述方法包括下述步骤：在来自所述受试者的样品中检测生物标记，其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
Description
发明领域
本发明涉及用于诊断受试者中的戈谢病(Gaucher’s disease)的方法，用于确定受试者中的戈谢病的病程的方法，用于确定施用于已被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法，用于确定用于治疗戈谢病的化合物的有效性的方法，质谱法在检测生物标记中的用途，生物标记在戈谢病中的用途，用于确定生物标记在来自受试者的样品中的存在的试剂盒和软件产品，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1(lyso-Gb1)。
发明背景
溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases)，在本文中也称为溶酶体贮积病(lysosomal storage disorders)或LSD，是一组由溶酶体功能缺陷导致的罕见的遗传代谢病症。当机体细胞中的特定细胞器–溶酶体–功能失常时，导致LSD。一些比较突出的溶酶体贮积症是戈谢病(Gaucher’s disease)和法布里病(Fabry disease)。
LSD是由通常由脂质、糖蛋白或所谓的黏多糖代谢所需要的单个酶的缺陷导致的溶酶体功能障碍所引起的。个别地，LSD以约1:10,000至1:250,000的频率发生，然而，作为一个组来看，发病率约为1:5,000。这些病症中的大部分是常染色体隐性遗传的；然而，少部分是X连锁遗传的，如法布里病和亨特综合征(Hunter syndrome)(MPS II)。
同其他遗传病一样，个体典型地从其父母遗传溶酶体贮积症。尽管每种病症是由翻译成酶活性缺陷的不同的基因突变导致，但是它们均共有共同的生物化学特征–几乎所有的溶酶体病症都是由溶酶体内部异常的物质积聚产生的。
溶酶体贮积症主要影响儿童，并且他们通常在青年以及不可预知的年龄死亡，多数在出生后的几个月或几年内死亡。多数其他的儿童在患有他们的特定的病症的多种症状的几年后死于该病。
取决于具体的病症以及其他变量，如发病年龄，溶酶体贮积症的症状有不同，并且可以从轻微到严重。它们可以包括发育迟缓(developmentaldelay)、运动障碍(movement disorders)、发作(seizures)、痴呆(dementia)、耳聋(deafness)和/或失明(blindness)。一些患有溶酶体贮积症的人具有肿大的肝脏(肝大(hepatomegaly))和肿大的脾脏(脾大(splenomegaly))、肺和心脏问题以及发育异常的骨骼。
尽管对一些适应证已经使用骨髓移植和酶替代疗法(ERT)取得了良好的成功，但是对于溶酶体贮积症没有针对病因的治愈，并且治疗主要是针对症状的。另外，在专门的中心对多种这些疾病进行脐带血移植。另外，目前正针对这些疾病中的一些疾病评估底物减少疗法(substrate reductiontherapy，SRT)，这是一种用于减少贮存物质的积聚的方法。此外，正针对这些病症中的某些病症检验伴侣分子疗法，这是一种用来稳定患者产生的缺陷酶类的技术。基因疗法构成了这些基本的治疗的另一种选择。
迄今为止，只有应用直接检测β-葡糖苷酶的缺陷的生化检测以及遗传验证才能进行戈谢病的确定性诊断。由于多种不同的突变可能是特定的溶酶体贮积症的病因，因此，为了验证诊断，在戈谢病中应用整个β-葡糖苷酶基因的测序。
尽管尝试应用基于相关的生化异常如高碱性磷酸酶、血管紧张肽转变酶(ACE)和免疫球蛋白水平的诊断方法，或者在戈谢病的情形中，尝试通过显示“皱纸状”细胞质("crinkled paper"cytoplasm)和充满糖脂的巨噬细胞的细胞分析的诊断方法，但是，对于表现出对处于早期阶段的所述溶酶体贮积症的高特异性和高灵敏性检测、监测该疾病的进展以及对所应用的疗法的功效的早期监测的简单生化测试存在着未满足的需求。
因此，鉴定用于戈谢病的早期检测和诊断的生物标记非常有希望提高患者的临床结果。对于具有不明确的症状或没有症状的患者，或者检测对治疗没有响应的患者，这是特别重要的。
在多个方面，生物标记应该是技术上可行的，容易检测的；有用的，在实验/患者和对照之间或在治疗的和未治疗的之间具有一致性的、相对的量值；作为强的预测或预后是可靠的、精确和临床准确的，并且是可分类为的。
在戈谢病中，发现一些用作间接生物标记的溶酶体酶升高，所述溶酶体酶包括酒石酸抗性酸性磷酸酶，己糖胺酶和人壳多糖酶、壳三糖苷酶。因此，尝试通过测量戈谢细胞的这些替代标记如壳三糖苷酶和CCL18来监测组织中的贮藏细胞的减少(C.E.Hollak等，Marked elevation of plasmachitotriosidase activity.A novel hallmark of Gaucher disease(血浆壳三糖苷酶活性的显著升高。戈谢病的新标记),J.Clin.Invest.(临床研究杂志)93(1994)1288-1292;R.G.Boot等，Marked elevation of the chemokineCCL18/PARC in Gaucher disease:a novel surrogate marker for assessingtherapeutic intervention(戈谢病中趋化因子CCL18/PARC的显著升高：用于评估治疗干预的新替代标记),Blood(血液)103(2004)33-39)。然而，除了使用壳三糖苷酶作为戈谢病的生物标记中的其他缺点外，所述酶独立于同戈谢病病理学的直接联系而积聚。此外，给定的种族中有多至35%表现出编码壳三糖苷酶的基因的缺陷，这导致人为减少的或不可检测的壳三糖苷酶活性。
对于戈谢病患者血浆中的葡糖神经酰胺(Gb1)评估一级贮藏分子作为生物标记的应用，并且与健康个体中的Gb1水平进行比较(Groener等，Biochim Biophys Acta.2008年1-2月;1781(1-2):72-8.Epub2007年12月5日;Plasma glucosylceramide and ceramide in type1Gaucher disease patients:correlations with disease severity and response to therapeutic intervention(1型戈谢病患者中的血浆葡糖神经酰胺和神经酰胺：与疾病严重性的相关性和对治疗干预的响应);Groener JE等)。然而，尽管在所述研究中测量的Gb1在所述患者的血浆中是增加的，但是所述Gb1的增加并不突出，因此该分子的特异性和灵敏性低，这表明Gb1不适合用作戈谢病的生物标记。
在1989年，Rosengren等(Lysosulfatide(galactosylsphingosine-3-O-sulfate)from metachromatic leukodystrophy andnormal human brain(来自异染性脑白质营养不良和正常人脑的溶血硫苷脂(半乳糖苷鞘氨醇-3-O-硫酸酯))，Rosengren B,Fredman P,
JE,Svennerholm L.;J Neurochem.(神经化学杂志)1989年4月;52(4):1035-41.)已经表明在脂沉积症(lipidoses)中，不仅主要的鞘脂的分解代谢受影响，而且其溶血化合物(lyso-compound)也受影响。然而，所述研究推论该溶血化合物在神经鞘脂贮积症(sphingolipidoses)的发病机制中不起重要作用。因此，所述溶血化合物可能不是用于诊断神经鞘脂贮积症如戈谢病的适当生物标记。
重要的是注意到，除了上述方法(其表现出不令人满意的检测极限、灵敏性和/或特异性，并且因此证明不适合临床应用)之外，迄今为止还没有高特异性和高灵敏性的生物标记的应用，并且没有戈谢病的诊断方法可用。
因此，需要快速、简单、且更重要是可靠的诊断戈谢病的方法。
根据上述，本发明的基础问题是提供用于诊断戈谢病的方法。
本发明另一个基础问题是提供用于确定戈谢病的病程和预后的方法。
本发明的另一个基础问题是提供用于相当快速地确定施用于被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法。
本发明的另一个基础问题是提供用于确定用于治疗戈谢病的化合物的有效性的方法。
本发明的另一个基础问题是提供允许戈谢病的特异性和灵敏性诊断的生物标记。本发明的另一个基础问题是一种试剂盒，所述试剂盒包含与戈谢病特异性和灵敏性的生物标记相互作用的化合物。
这些和其他问题由本附上的独立权利要求的主题来解决。优选实施方案可以取自从属权利要求。
在第一方面，本发明的基础问题通过诊断受试者中的戈谢病的方法解决，这也是第一方面的第一实施方案，所述方法包括下述步骤：
a)在来自受试者的样品中检测生物标记，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1(lyso-Gb1)。
在第一方面的第二实施方案(其也是第一方面的第一实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
b)确定所述样品中存在的所述生物标记的水平。
在第一方面的第三实施方案(其也是第一方面的第一和第二实施方案的实施方案)中，所述生物标记的水平指示所述受试者是否患有戈谢病或指示所述受试者是否处于发展戈谢病的危险中。
在第一方面的第四实施方案(其也是第一方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案)中，所述来自受试者的样品是来自之前针对戈谢病进行治疗或诊断的受试者的样品。
在第一方面的第五实施方案(其也是第一方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案)中，所述来自受试者的样品是来自之前未针对戈谢病进行治疗的受试者或之前未针对戈谢病进行诊断的受试者的样品。
在第一方面的第六实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
c)基于关于所述受试者是否患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的诊断而施用、维持、减少、升高或不施用治疗。
在第一方面的第七实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
d)在步骤c)中施用、维持、减少、升高或不施用治疗后，在来自所述受试者的样品中检测所述生物标记。
在第一方面的第八实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
e)在步骤c)中施用、维持、减少、升高或不施用治疗后，确定所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平。
在第一方面的第九实施方案(其也是第一方面的第八实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
f)确定步骤b)中确定的所述生物标记的水平是否低于步骤e)中确定的所述生物标记的水平。
在第一方面的第十实施方案(其也是第一方面的第九实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
g)基于步骤f)施用、维持、减少、升高或不施用治疗。
在第一方面的第十一实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十实施方案的实施方案)中，所述方法还包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种另外的生物标记。
在第一方面的第十二实施方案(其也是第一方面的第十一实施方案的实施方案)中，所述方法还包括确定所述至少一种另外的生物标记在来自所述受试者的样品中的水平。
在第一方面的第十三实施方案(其也是第一方面的第十一和第十二实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记选自包括壳三糖苷酶和CCL18的组。
在第一方面的第十四实施方案(其也是第一方面的第十三实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是壳三糖苷酶。
在第一方面的第十五实施方案(其也是第一方面的第十三实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是CCL18。
在第一方面的第十六实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四和第十五实施方案的实施方案)中，所述方法还包括检测壳三糖苷酶和CCL18。
在第一方面的第十七实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五和第十六实施方案的实施方案)中，所述生物标记和/或至少一种另外的生物标记通过免疫测定、质谱分析、生物芯片阵列、功能性核酸和/或游离-Gb1的荧光衍生物来检测。
在第一方面的第十八实施方案(其也是第一方面的第十七实施方案的实施方案)中，所述生物标记通过质谱分析检测。
在第一方面的第十九实施方案(其也是第一方面的第十八实施方案的实施方案)中，质谱分析选自由SELDI、MALDI、MALDI-Q TOF、MS/MS、TOF-TOF和ESI-O-TOF组成的组。
在第一方面的第二十实施方案(其也是第一方面的第十九实施方案的实施方案)中，所述质谱分析使用MS/MS。
在第一方面的第二十一实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第二十实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀和/或HPLC。
在第一方面的第二十二实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十和第二十一实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀、HPLC和MS/MS。
在第一方面的第二十三实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一和第二十二实施方案的实施方案)中，所述受试者是人。
在第一方面的第二十四实施方案(其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案的实施方案)中，所述检测样品中的生物标记的步骤包括对所述样品进行蛋白沉淀步骤，使蛋白从所述样品沉淀，其中从所述样品沉淀蛋白提供样品的上清液，使所述样品的上清液进行HPLC和MS/MS，并且确定在所述样品的上清液中存在的所述生物标记和/或所述至少一种另外的生物标记的量。
在第二方面，本发明的基础问题通过用于诊断受试者中的戈谢病的方法解决，这也是第二方面的第一实施方案，所述方法包括：
i)向来自所述受试者的样品中添加内标，其中来自所述受试者的样品选自包括血浆、血清和血液的组；
ii)任选地混合包含所述内标的样品；
iii)对所述样品进行蛋白沉淀步骤，由此沉淀来自所述样品的蛋白，并且提供所述样品的上清液；
iv)任选地对所述样品的上清液进行提供上清液的第一分离步骤，由此优选地所述第一分离步骤是离心步骤；
v)对步骤c)或步骤d)的上清液或其部分进行第二分离步骤，其中所述第二分离步骤包括将部分上清液注射到HPLC-MS/MS系统中，并且使用具有从酸性水到乙腈/丙酮的梯度的HPLC柱；其中所述HPLC柱优选是选自包括C8和C18HPLC柱的组的HPLC柱，并且其中所述第二分离步骤提供分离的样品；
vi)对所述分离的样品进行MS/MS，其中MS/MS包括电喷雾离子化和多反应监测(Multiple Reacting Monitoring)；
其中所述方法优选是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案中任一个实施方案所述的方法；
并且进一步包括下述步骤：
a)在来自所述受试者的样品中检测生物标记，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1；
以及任选地下述步骤：
b)确定所述样品中存在的所述生物标记的水平。
在第二方面的第二实施方案(其也是第二方面的第一实施方案的实施方案)中，所述内标包括D5-丙酸氟替卡松(D5-fluticasone propionate)和/或溶血-Gb2。
在第二方面的第三实施方案(其也是第二方面的第一和第二实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案)中，步骤b)和/或步骤e)还包括将所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平与临界水平(cut-off level)比较。
在第二方面的第四实施方案(其也是第二方面的第一、第二和第三实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案，优选是第二方面的第三实施方案的实施方案)中，高于临界水平的所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平指示所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中。
在第二方面的第五实施方案(其也是第二方面的第四实施方案的实施方案)中，低于所述临界水平的所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平指示所述受试者不患有戈谢病或不处于发展戈谢病的危险中。
在第二方面的第六实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案)中，所述临界水平是这样选择的，以使诊断受试者中的戈谢病的灵敏度优选为约98.5%至100%，更优选为100%，并且诊断受试者中的戈谢病的特异性优选为99.4%至100%，更优选为100%。
在第二方面的第七实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案)中，步骤b)和/或步骤e)还包括将所述生物标记在所述受试者中的水平与在来自对照的样品中检测的所述生物标记的水平进行比较。
在第二方面的第八实施方案(其也是第二方面的第七实施方案的实施方案)中，所述对照是来自被肯定地检测为不患有戈谢病的受试者的样品。
在第二方面的第九实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案)中，所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平高于所述生物标记在对照样品中的水平指示所述受试者患有戈谢病和/或处于发展戈谢病的危险中。
在第二方面的第十实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性(non-neuronopathic type I)、II型慢性神经病性(chronic neuronopathic type II)和III型急性神经病性的组(acuteneuronopathic type III)。
在第二方面的第十一实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案，优选地是第二方面的第十实施方案的实施方案)中，来自所述受试者的样品选自由血液、血液制品、尿液、唾液、脑脊液、大便、组织样品和淋巴组成的组。
在第二方面的第十二实施方案(其也是第二方面的第十一实施方案的实施方案)中，来自所述受试者的样品选自由血液和血液制品组成的组。
在第二方面的第十三实施方案(其也是第二方面的第十一和第十二实施方案的实施方案)中，所述血液制品选自包括血清和血浆的组。
在第二方面的第十四实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案，优选是第二方面的第十三实施方案的实施方案)中，所述方法具有0.2ng/ml的检测极限。
在第二方面的第十五实施方案(其也是第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和第十四实施方案以及第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案的实施方案，优选是第二方面的第十一、第十二、第十三、第十四和第十五实施方案中任一项的实施方案)中，所述临界水平是5.0ng/ml。
在第二方面的第十六实施方案(其也是第二方面的第十一和第十二实施方案的实施方案)中，所述血液是全血。
在第二方面的第十七实施方案(其也是第二方面的第十七实施方案的实施方案)中，所述全血在干血滤纸卡(dry blood filter card)上收集。
在第二方面的第十八实施方案(其也是第二方面的第十七和第十八实施方案的实施方案)中，所述方法具有0.2ng/ml的检测极限。
在第二方面的第十九实施方案(其也是第二方面的第十七、第十八和第十九实施方案的实施方案)中，所述临界水平是20.0ng/ml。
在第三方面中，本发明的基础问题通过用于确定受试者中的戈谢病的病程的方法而解决，这也是第三方面的第一实施方案，所述方法包括下述步骤：
a)在若干个时间点确定在来自受试者的样品中存在的生物标记的水平，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第三方面的第二实施方案(其也是第三方面的第一实施方案的实施方案)中，所述受试者之前已针对戈谢病进行治疗或诊断。
在第三方面的第三实施方案(其也是第三方面的第一实施方案的实施方案)中，所述受试者之前未针对戈谢病进行治疗或其中所述受试者之前未针对戈谢病进行诊断。
在第三方面的第四实施方案(其也是第三方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
b)基于所述受试者是否患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的诊断施用、维持、减少、升高或不施用治疗。
在第三方面的第五实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三和第四实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
c)在步骤b)中施用、维持、减少、升高或不施用治疗后在来自所述受试者的样品中检测所述生物标记。
在第三方面的第六实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
d)在步骤b)中施用、维持、减少、升高或不施用治疗后确定所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平。
在第三方面的第七实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
e)确定在步骤a)中确定的所述生物标记的水平是否低于在步骤d)中确定的所述生物标记的水平；
在第三方面的第八实施方案(其也是第三方面的第七实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
f)基于步骤e)施用、维持、减少、升高或不施用治疗。
在第三方面的第九实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所述方法还包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种另外的生物标记。
在第三方面的第十实施方案(其也是第三方面的第九实施方案的实施方案)中，所述方法还包括确定所述至少一种另外的生物标记在来自所述受试者的样品中的水平。
在第三方面的第十一实施方案(其也是第三方面的第九和第十实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记选自包括壳三糖苷酶和CCL18的组。
在第三方面的第十二实施方案(其也是第三方面的第十一实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是壳三糖苷酶。
在第三方面的第十三实施方案(其也是第三方面的第十一实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是CCL18。
在第三方面的第十四实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案的实施方案)中，所述方法还包括检测壳三糖苷酶和CCL18。
在第三方面的第十五实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和第十四实施方案的实施方案)中，所述生物标记和/或所述至少一种另外的标记通过免疫测定、质谱分析、生物芯片阵列、功能性核酸和/或游离溶血-Gb1的荧光衍生物来检测。
在第三方面的第十六实施方案(其也是第三方面的第十五实施方案的实施方案)中，所述生物标记通过质谱分析的方式检测。
在第三方面的第十七实施方案(其也是第三方面的第十六实施方案的实施方案)中，质谱分析选自由SELDI、MALDI、MALDI-Q TOF、MS/MS、TOF-TOF和ESI-O-TOF组成的组。
在第三方面的第十八实施方案(其也是第三方面的第十七实施方案的实施方案)中，所述质谱分析使用MS/MS。
在第三方面的第十九实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七和第十八实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀和/或HPLC。
在第三方面的第二十实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八和第十九实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀、HPLC和MS/MS。
在第三方面的第二十一实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十和第二十一实施方案的实施方案)中，所述受试者是人。
在第三方面的第二十二实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一和第二十二实施方案的实施方案)中，所述在来自所述受试者的样品中检测生物标记的步骤包括从来自所述受试者的样品沉淀蛋白，其中从所述样品沉淀蛋白提供样品的上清液；对一定体积的上清液进行HPLC和MS/MS，并且确定在来自所述受试者的样品中存在的所述生物标记和/或所述至少一种另外的生物标记的量。
在第三方面的第二十三实施方案(其也是第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
在第四方面中，本发明的基础问题通过用于确定使用到被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法来解决，这也是第四方面的第一实施方案，所述方法包括下述步骤：
a)在若干个时间点确定在来自受试者的样品中存在的生物标记的水平，
其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第四方面的第二实施方案(其也是第四方面的第一实施方案的实施方案)中，所述受试者之前已针对戈谢病进行治疗或诊断。
在第四方面的第三实施方案(其也是第四方面的第一实施方案的实施方案)中，所述受试者之前未针对戈谢病进行治疗或其中所述受试者之前未针对戈谢病进行诊断。
在第四方面的第四实施方案(其也是第四方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
b)基于所述生物标记水平的减少施用、维持、减少、升高或不施用施用于所述受试者的至少一种治疗。
在第四方面的第五实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三和第四实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
c)在来自所述受试者的样品中检测所述生物标记，其中所述样品在步骤b)中施用、维持、减少、升高或不施用至少一种治疗后开始所述治疗之前已经被采集。
在第四方面的第六实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案)中，所述治疗选自包括酶替代疗法、底物减少疗法、伴侣分子疗法、基因疗法、DNA/RNA跳跃(DNA/RNAskipping)的干细胞移植的组。
在第四方面的第七实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
d)确定在步骤a)中确定的所述生物标记的水平是否低于在步骤c)中确定的所述生物标记的水平。
在第四方面的第八实施方案(其也是第四方面的第七实施方案的实施方案)中，所述方法还包括下述步骤：
e)基于步骤d)施用、维持、减少、升高或不施用施用于所述受试者的至少一种治疗。
在第四方面的第九实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案)中，所述方法还包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种另外的生物标记。
在第四方面的第十实施方案(其也是第四方面的第九实施方案的实施方案)中，所述方法还包括确定所述至少一种另外的生物标记在来自所述受试者的样品中的水平。
在第四方面的第十一实施方案(其也是第四方面的第九和第十实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的标记选自包括壳三糖苷酶和CCL18的组。
在第四方面的第十二实施方案(其也是第四方面的第十一实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是壳三糖苷酶。
在第四方面的第十三实施方案(其也是第四方面的第十一实施方案的实施方案)中，所述至少一种另外的生物标记是CCL18。
在第四方面的第十四实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案的实施方案)中，所述方法还包括检测壳三糖苷酶和CCL18。
在第四方面的第十五实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和第十四实施方案的实施方案)中，任一种/所述生物标记通过免疫测定、质谱分析、生物芯片阵列、功能性核酸和/或游离溶血-Gb1的荧光衍生物来检测。
在第四方面的第十六实施方案(其也是第四方面的第十五实施方案的实施方案)中，所述生物标记通过质谱分析检测。
在第四方面的第十七实施方案(其也是第四方面的第十六实施方案的实施方案)中，质谱分析选自由SELDI、MALDI、MALDI-Q TOF、MS/MS、TOF-TOF和ESI-O-TOF组成的组。
在第四方面的第十八实施方案(其也是第四方面的第十七实施方案的实施方案)中，所述质谱分析使用MS/MS。
在第四方面的第十九实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七和第十八实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀和/或HPLC。
在第四方面的第二十实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八和第十九实施方案的实施方案)中，所述方法还包括蛋白沉淀、HPLC和MS/MS。
在第四方面的第二十一实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九和第二十实施方案的实施方案)中，所述受试者是人。
在第四方面的第二十二实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十和第二十一实施方案的实施方案)中，所述在来自所述受试者的样品中检测生物标记的步骤包括从来自所述受试者的样品沉淀蛋白，其中从所述样品沉淀蛋白提供所述样品的上清液；对一定体积的上清液进行HPLC和MS/MS，并且确定在来自所述受试者的样品中存在的所述生物标记和/或所述至少一种另外的生物标记的量。
在第四方面的第二十三实施方案(其也是第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一和第二十二实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
在第五方面中，本发明的基础问题通过确定用于治疗戈谢病的化合物的有效性的方法而解决，这也是第五方面的第一实施方案，所述方法包括下述步骤：
a)确定生物标记在患有戈谢病的受试者中的水平；
b)给所述受试者施用所述化合物；
c)再次确定所述生物标记在所述受试者中的水平；
d)确定在步骤a)中确定的所述生物标记的水平是否低于在步骤c)中确定的所述生物标记的水平，
其中步骤c)中确定的所述生物标记的水平低于在步骤a)中确定的所述生物标记的水平指示所述化合物的有效性，并且其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第五方面的第二实施方案(其也是第五方面的第一实施方案的实施方案)中，所述方法还包括确定所述生物标记在对照中的水平。
在第五方面的第三实施方案(其也是第五方面的第一和第二实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
在第六方面中，本发明的基础问题通过质谱在检测生物标记中的用途而解决，其也是第六方面的第一实施方案，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第六方面的第二实施方案(其也是第六方面的第一实施方案的实施方案)中，所述检测包括使用HPLC。
在第六方面的第三实施方案(其也是第六方面的第二实施方案的实施方案)中，所述检测包括MS/MS。
在第七方面中，本发明的基础问题通过优选地在根据第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案、第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八和第十九实施方案、第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案、第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案以及第五方面的第一、第二和第三实施方案中任一项的方法中使用针对戈谢病的生物标记来解决，这也是第七方面的第一实施方案，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第七方面的第二实施方案(其也是第七方面的第一实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
在第八方面中，本发明的基础问题通过用于确定生物标记在来自受试者的样品中的存在的试剂盒而解决，这也是第八方面的第一实施方案，其中所述试剂盒包括：
a)所述生物标记的相互作用配偶体；
b)任选地固体载体，所述固体载体包含至少一种与其连接的捕获剂，其中所述捕获剂结合所述生物标记；和
c)对使用所述固体载体检测所述生物标记的使用说明，
其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
在第八方面的第二实施方案(其也是第八方面的第一实施方案的实施方案)中，所述试剂盒用于
a)诊断戈谢病；
b)确定受试者中戈谢病的病程；和/或
c)确定施用于受试者的至少一种治疗的有效性，
其中在a)、b)和/或c)中所用的方法优选是根据第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三和第二十四实施方案、第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八和第十九实施方案、第三方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案、第四方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案以及第五方面的第一、第二和第三实施方案中任一项所述的方法。
在第八方面的第三实施方案(其也是第八方面的第一和第二实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
在第九方面中，本发明的基础问题通过软件产品解决，这也是第九方面的第一实施方案，所述软件产品包括：
a)评估归结于样品的数据的代码，所述数据包括在所述样品中检测至少一种生物标记，所述生物标记选自包括游离的溶血-Gb1、壳三糖苷酶和CCL18的组；和
b)执行分类算法的代码，所述分类算法以所述检测的函数分类所述样品的戈谢病状态。
在第九方面的第二实施方案(其也是第九方面的第一实施方案的实施方案)中，戈谢病选自包括I型非神经病性、II型慢性神经病性和III型急性神经病性的组。
本发明人已经令人惊讶地发现游离的溶血-Gb1构成这样的生物标记，该生物标记允许用于诊断受试者中的戈谢病的方法，更具体地，使用所述游离的溶血-Gb1作为生物标记以高特异性和灵敏性诊断受试者中的戈谢病的方法。
本发明人还已经令人惊讶地发现能够通过本发明的方法检测的游离的溶血-Gb1以约1/1000的总Gb1的浓度在受试者的血液中循环。并且，本发明人已经令人惊讶地发现，与总Gb1不同，在受试者的血液中存在的游离的溶血-Gb1可用于诊断受试者中的戈谢病的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测生物标记的步骤，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。本发明人还已经令人惊讶地发现通过本发明的方法在来自受试者的样品中确定的游离的溶血-Gb1的水平允许以高灵敏性和高特异性诊断戈谢病。
目前为止，本发明与现有技术教导的不同之处在于，本发明的方法包括确定溶血-化合物的水平，使用所述溶血-化合物作为诊断神经鞘脂贮积症的生物标记。更具体地，本发明人已经令人惊讶地发现在来自受试者的样品中确定游离的溶血-Gb1的水平允许以高灵敏性和高特异性诊断戈谢病。
本发明人的另一个优点是已经认识到在戈谢病中积聚的总Gb1的一部分作为其游离的溶血形式(lyso form)的分子(即，游离的溶血-Gb1)存在，并且除Gb1之外，以所述游离的溶血形式在受试者的血液中循环。
术语“溶酶体贮积病”，其也被称为“溶酶体贮积症”或“LSD”，用在本文中时，优选是指由溶酶体功能缺陷导致的遗传病和代谢紊乱。溶酶体贮积病是由通常由脂质、糖蛋白或所谓的黏多糖代谢所需要的单个酶的缺陷导致的溶酶体功能障碍所引起的。与其他遗传病一样，个体从其父母遗传溶酶体贮积症。尽管每种病症是由翻译成酶活性缺陷的不同的基因突变导致，但是它们均具有共同的生物化学特征–所有的溶酶体病症都是由溶酶体内部异常的物质积聚产生的。
术语“戈谢病”用在本文时优选是指一种溶酶体贮积症(LSD)，更具体地，是神经鞘脂贮积症，神经鞘脂贮积症的特征在于葡糖脑苷脂在巨噬细胞-单核细胞系统的细胞中的沉积。戈谢病是最常见的溶酶体贮积症(James,William D.;Berger,Timothy G.;等，(2006).Andrews'Diseases of theSkin:clinical Dermatology(皮肤的脓疱性细菌疹(Andrews'Diseases)：临床皮肤病学).Saunders Elsevier.ISBN0-7216-2921-0)。其是由酶葡糖脑苷脂酶的遗传性缺陷导致的。所述缺陷由编码葡糖脑苷脂酶的基因中的隐性突变导致，并且影响男性和女性，所述葡糖脑苷脂酶是一种位于染色体1(1q21)上的特异性的溶酶体水解酶(也称为β-葡糖苷酶，EC3.2.1.45,PDB1OGS)。β-葡糖苷酶中的不同突变决定该酶的剩余活性，并且在很大的程度上，决定表型。
葡糖脑苷脂酶在本文中还称为β-葡糖脑苷脂酶、β-葡糖苷酶、酸性β-葡糖苷酶、葡糖神经酰胺酶或D-葡糖-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶。
该酶为55.6KD、497个氨基酸长的蛋白，其具有葡糖神经酰胺酶活性，即，该酶通过分解(即，水解)葡糖脑苷脂(其为糖脂代谢的中间体)的β-糖苷键而催化被称为葡糖脑苷脂的脂肪物质的分解。葡糖脑苷脂，在本文中也称为葡糖神经酰胺或Gb1，是红细胞和白细胞的细胞膜组成成分。当该酶有缺陷时，底物积聚，特别是在单核细胞谱系的细胞中。这是由于清除这些细胞的巨噬细胞不能清除废物，所述废物积聚在原纤维中，并且变成所谓的戈谢细胞(Gaucher cells)，其在光学显微镜下表现得与揉皱的纸相像。脂肪物质可以积聚在脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中。
戈谢病具有三种常见的临床亚型：
●I型非神经病性，在本文中也称为I型，其是最常见的疾病形式，大约每50,000例活产中发生1例。其最通常在Ashkenazi Jewish血统的人中发生。症状可以在生命早期开始或在成年期开始，并且包括肿大的肝和非常肿大的脾(统称肝脾大(hepatosplenomegaly))；脾可能破裂并且引起另外的并发症。骨骼软弱(Skeletal weakness)和骨病可能是广泛的。脾肿大和骨髓替代引起贫血(anemia)、血小板减少症(thrombocytopenia)和白血球减少症(leukopenia)。脑没有被病理性影响，但是可能有肺损伤以及罕见的肾损伤。该组中的患病受试者通常容易出现青肿(由于低的血小板水平)并且由于低的红细胞数量而经历疲劳。取决于疾病发作和严重性，I型患者可能很好地活到成年期。多数患病受试者具有轻微的疾病形式或者可能不表现出任何症状。
●II型慢性神经病性，在本文还称为II型，可能在儿童期或者甚至在成年期的任何时间开始，并且大约每100,000例活产中发生1例。与急性的或III型形式相比，其特征在于缓慢进展的但是较轻微的神经病症状。主要的症状包括肿大的脾和/或肝，发作(seizures)，协调性差，骨骼不齐(skeletal irregularities)，眼运动障碍(eye movement disorders)，血液病症(包括贫血)和呼吸问题。患者通常活到其青少年期的早期和成年期。
●III型急性神经病性，在本文还称为III型，典型地在出生6个月内开始，并且发病率约为每100,000例活产中有1例。症状包括肿大的肝和脾，广泛和进展性的脑损伤，眼运动障碍，痉挛状态(spasticity)，发作，肢体僵硬(limb rigidity)以及吮吸和吞咽能力差。受影响的儿童通常活到2岁就死亡。
由于没有考虑可观察到的症状的所有谱度，这些亚型已经受到一些批评。还存在复合的杂合变异，其相当大地增加了预测疾病病程的复杂性。
在II型和III型戈谢病中，由于在脑发育过程中的复杂的脂质更新以及神经髓鞘的形成，葡糖脑苷脂在脑中积聚。
症状可能包括肿大的脾和肝，肝脏功能失常，骨骼障碍和骨损伤(其可能是疼痛的、严重性的神经病并发症)，淋巴结肿胀以及(偶尔地)邻近关节肿胀，下腹膨胀(distended abdomen)，皮肤呈褐色色调，贫血，低血小板和眼白(巩膜)上的黄色脂肪沉积。最严重影响的人还可能更容易受感染影响。
治疗：酶替代治疗在本文还称为ERT，是一种治疗的选择。然而，由于引入了具有活性β-葡糖苷酶的单核细胞群，所以成功的骨髓移植可能治愈该疾病的非神经学表现。重要的是提及该过程带有显著的风险，并且很少在戈谢病患者中进行。如果患者严重贫血或者当肿大器官影响患者的舒适性时，可能非常罕见地需要手术摘除脾(脾切除术)。输血可能对一些贫血患者有益。其他患者可能需要关节置换手术来改善运动性和生命质量。其他治疗选择包括针对感染的抗生素，针对发作的抗癫痫药(antiepileptics)，针对骨损伤的二膦酸盐(bisphosphonates)和肝移植。
ERT基于长期静脉内施用重组葡糖脑苷脂酶(伊米苷酶(imiglucerase)，Genzyme；velaglucerase，Shire；taliglucerase，Protalix)(G.A.Grabowski等，Enzyme therapy in type I Gaucher’s disease:comparativeefficacy of mannose-terminated glucocerebrosidase from natural andrecombinant sources(I型戈谢病的酶疗法：来自天然和重组来源的甘露糖-封端的葡糖脑苷脂酶的比较功效),Ann.Intern.Med.122(1995)33-39.)。对于I型和大部分III型患者，使用静脉内重组葡糖脑苷脂酶(诸如例如伊米苷酶)的ERT可以显著减小肝和脾的尺寸，减少骨骼异常，并且逆转其他的表现症状。
最近的底物减少疗法在本文中还称为SRT，已经开发为戈谢病的替代治疗(F.M.Platt等，N-butyl-deoxynojirirnycin is a novel inhibitor ofglycosphingolipid biosynthesis(N-butyl-deoxynojirirnycin是一种新型的鞘糖脂生物合成抑制剂),J.Biol.Chem.(生物化学杂志)269(1994)8362-8365.)。使用N-butyl-deoxynojirimycin(miglustat,Actelion)部分抑制鞘糖脂合成尝试用来平衡戈谢病患者中减少的分解代谢能力。由于其能够穿过血液屏障进入脑，所以，可以证明SRT能够有效终止II型。目前对于可能在患有II型和III型戈谢病的患者中发生的严重脑损伤没有有效的治疗。
ERT和SRT二者通常导致显著的临床改善，诸如肝脾大的减轻，血液学异常的校准，骨骼退化的稳定或改善。
葡糖脑苷脂，在本文中也称为葡糖神经酰胺或Gb1，意指其中单糖头基为葡萄糖的任意脑苷脂。
本领域技术人员应该理解，用在本文中时，优选与各种方法联合的术语“溶血-Gb1”，优选意指所述分子以其游离的氨基形式存在。更精确地，当在本文中使用时，优选地，溶血-Gb1与Gb1的不同之处在于没有脂肪酸部分连接到该分子的鞘氨醇部分的伯氨基。此外，溶血-Gb1在本文中还称为葡糖鞘氨醇或溶血-葡糖脑苷脂，并且具有下式：
本领域技术人员应该理解，术语“游离的溶血-Gb1”用在本文中优选是指按原样存在于来自受试者的样品(如血液)中的溶血-Gb1，并且优选地，不是对所述受试者的样品的操作所产生的。所述对样品的操作可以是Groener等(Groener等，Plasma glucosylceramide and ceramide in type1Gaucher disease patients:Correlations with disease severity and response totherapeutic intervention(1型戈谢病患者中的血浆葡糖神经酰胺和神经酰胺：与疾病严重性和针对治疗干预的响应的相关性).Biochimica etBiophysica Acta1781(2908)72～78,2007)描述的。按照此，按原样存在于采集样品的受试者的血液的游离的溶血-Gb1更特别地不是分别由对包含在血液中的样品和优选在患者身体外的样品的化学、生物化学或物理处理产生的溶血-Gb1。本领域技术人员应该理解，游离的溶血-Gb1当用于本文时，优选是除了Gb1之外存在的，并且是由受试者的代谢活动产生的化合物。因此，Gb1，是与戈谢病相关地积聚的分子，存在于来自受试者的样品中，已经与存在于受试者的血液中的游离的溶血形式，即，游离的溶血-Gb1比较，至少一个脂肪酸部分连接到溶血-Gb1的鞘氨醇部分的伯氨基。
术语“样品”优选地用在本文中意指有限量的受试者的材料，其中所述受试者的材料是受试者和/或受试者的机体的部分或采集自受试者和/或受试者的机体，并且其中所述材料选自包括体液(如血液、血液制品/尿液、唾液、脑脊液和淋巴)以及粪便或作为受试者和/或受试者机体的部分的组织和或细胞物质中的任一种。本领域技术人员应该认识到，本发明的生物标记在所述样品中的存在和/或水平意在类似于所述生物标记在较大量的所述受试者的材料中的存在和/或水平并且表示所述生物标记在较大量的所述受试者的材料中的存在和/或水平。更精确地，并且作为示例性的非限制性的实例，在来自受试者的几毫升(ml)血液的样品中确定的本发明的生物标记的水平还表示所述生物标记在受试者机体的血液中的水平。此外，在本发明的诊断受试者中的戈谢病的方法的实施方案中，来自受试者的样品包括例如处理的、固定的和/或保存的形式的所述受试者的材料，以使所述样品适合用在本发明的方法中，其中所述处理、固定和/或保存优选不产生溶血-Gb1。因此，样品中受试者的材料可以被稀释，例如，用适于本发明的方法的溶剂如甲醇和/或水；可以被干燥，例如在滤纸卡(filter card)上；可以在已经干燥后溶解，例如，用适于本发明的方法的溶剂如甲醇和/或水；或者可以添加物质，其中所述物质防止血液凝固，诸如例如EDTA或肝素。本领域技术人员应该进一步理解，本发明的方法包括将所述受试者材料分离成所述受试者材料的单一成分和/或从所述受试者材料提取所述受试者材料的单一成分，例如，血液分离成血浆或血清，并且从样品沉淀细胞血成分或蛋白。应该直接地理解，在所述处理、固定和/或保存后，对所述样品进行本发明的方法以检测和/或确定所述样品中包含的生物标记的水平，其中所述处理、固定和/或保存优选不产生溶血-Gb1。
在其中在干血滤纸卡(dry blood filter card)上采集全血的本发明的方法的实施方案中，优选地在直径为3mm的所述干血滤纸卡的位置上采集约3μl的全血。本领域的技术人员将认识到这样采集的准确体积可能随特定患者的血细胞比容而变化。
葡糖神经酰胺与其前体神经酰胺的水平在现有技术中用来使其在血浆中的存在与I型戈谢病的严重性和对施用治疗的响应相关(Groener等，Plasma glucosylceramide and ceramide in type1Gaucher’s disease patients:Correlations with disease severity and response to therapeutic intervention(1型戈谢病患者中的血浆葡糖神经酰胺和神经酰胺：与疾病严重性和对治疗干涉的响应的相关性).Biochimica et Biophysica Acta1781(2908)72～78,2007)。由此，尽管在治疗的和未治疗的I型戈谢病患者的血浆中神经酰胺的水平没有显著差异，但是发现Gb1的水平有差异。
在Groener等(Groener等，同前所述)报道的研究中，Gb1/神经酰胺的比率用来区分戈谢病患者和健康患者。基本上如在Groener等(J.E.M.Groener等，HPLC for simultaneous quantification of total ceramide,glucosylceramide,and ceramide trihexoside concentrations in plasma(用于同时定量血浆中的总神经酰胺、葡糖神经酰胺和神经酰胺己三糖苷浓度的HPLC),Clin.Chern.53(2007)742-747)，使用高效液相色谱(HPLC)测量Gb1和神经酰胺。与之联系，重要的是理解血浆中存在的Gb1主要由糖部分和神经酰胺部分组成。神经酰胺部分包含鞘氨醇和脂肪酸部分。按照现有技术的方法，提取脂质，并且通过碱性水解使神经酰胺和葡糖神经酰胺脱酰基，由此形成溶血形式，即，溶血-Gb1(T.Taketomi等，Rapidmethod of preparation of lysoglycosphingolipids and their confirmation bydelayed extraction matrix-assisted laser desporption ionization time-of-flightmass spectrometry(制备溶血鞘糖脂的快速方法及其通过延迟提取基质-辅助的激光去吸附离子化飞行时间质谱法验证),J.Biochem.(Tokyo)(生物化学杂志(东京))120(1996)573-579)。然后，将这样产生的溶血-Gb1通过在伯胺基处用邻苯二醛(OPA)进行衍生化而用荧光染料标记。之后，衍生的鞘氨醇碱通过反相HPLC分离并且用荧光检测器检测。因此，所述现有技术方法能够检测由游离的溶血-Gb1和Gb1组成的总Gb1，并且不能区分在来自受试者的样品中的游离的溶血-Gb1的水平与Gb1的水平。在由Gb1的NH2基团分解多个脂肪酸部分后的所述总Gb1的水平通常在5-30μg/mL血浆或血清的范围内。由此明显的是，在Groener等(Groener等，同前所述)的方法中，将可以分别从来自受试者的样品(优选血液样品)制备和获得的总-Gb1用作生物标记，而不是包含在血液中且因此包含在样品中而未进行一个或多个脂肪酸部分的分解(优选由处理样品的操作者进行的分解)的游离的溶血-Gb1。迄今为止，本发明涉及游离的溶血-Gb1的检测，而不是如现有技术教导的总-Gb1的检测。本发明的方法的实施方案包括检测和/或确定游离的溶血-Gb1在来自受试者的样品中的水平，游离的溶血-Gb1和/或游离的溶血-Gb1的水平与可能在受试者的血液中存在的Gb1或Gb1的水平单独地和/或分开地确定。在另一个实施方案中，除了检测和/或确定游离的溶血-Gb1的水平之外，还检测/确定Gb1和/或Gb1的水平。
重要的是，在血浆中循环、并且足够亲脂以致可以根据现有技术的所述方法使用有机溶剂与Gb1同时提取的每个伯胺因此被标记，因此能够妨碍对分解的溶血-Gb1的检测。
尽管在所述现有技术的研究中被测量为溶血-Gb1的总Gb1在所述患者的血浆中是增加的，但是总Gb1的所述增加不突出，因此该方法的特异性和灵敏性低，这表明Gb1不适合用作戈谢病的生物标记。
与其联系，重要的是注意到，就本发明人的知识而言，在本文的实施例中联系本发明所述的数据表示关于现有技术中戈谢病的生物标记(即，壳三糖苷酶和CCL18)与游离的溶血-Gb1的直接比较的特异性和灵敏性的第一次系统性分析。
提供≥99,0%的灵敏性和/或特异性，如由本发明的方法确定的游离的溶血-Gb1是适于与戈谢病相关的临床应用的生物标记。迄今为止，本发明的生物标记及其应用明显超过了现有技术已知的生物标记(更具体地，壳三糖苷酶和CCL18中的一种)的表现。应该直接理解，与本发明的方法相比，Groener等(Groener等，同前所述)所用的方法的不利之处在于所述现有技术的方法的特异性和灵敏性较低，并且基于所述现有技术的方法使用总Gb1而不是游离的溶血-Gb1来诊断戈谢病不适合其可靠的临床应用，即，所述方法没有足以通过可靠的统计学保证的预测来诊断戈谢病的灵敏性和特异性。
壳三糖苷酶：之前已经发现，戈谢细胞分泌壳三糖苷酶，并且在患有戈谢病的症状性患者的血浆中的壳三糖苷酶平均升高几百倍(Hollak等，Marked elevation of plasma chitotriosidase activity.A novel hallmark ofGaucher disease(血浆壳三糖苷酶活性的显著升高。戈谢病的新型标记).JClin Invest.(临床研究杂志)1994;93:1288-1292)。因此，血浆壳三糖苷酶用作针对戈谢病表现症状的替代标记并且用于诊断、疾病发作的早期确定以及监测治疗功效(Hollak等，Marked elevation of plasma chitotriosidaseactivity.A novel hallmark of Gaucher disease(血浆壳三糖苷酶活性的显著升高。戈谢病的新型标记).J Clin Invest.(临床研究杂志)1994;93:1288-1292;Mistry等，A practical approach to diagnosis and management ofGaucher's disease(戈谢病诊断和管理的实践方法).Baillieres Clin Haematol.1997;10:817-838;Cox等，Novel oral treatment of Gaucher's disease withN-butyldeoxynojirimycin(OGT918)to decrease substrate biosynthesis(使用N-butyldeoxynojirimycin(OGT918)新型口服治疗戈谢病减少底物的生物合成).Lancet.2000;355:1481-1485;Hollak等，Clinically relevanttherapeutic endpoints in type I Gaucher disease(I型戈谢病的临床相关的治疗终点).J Inherit Metab Dis.2001;24:97-105)。
然而，血浆壳三糖苷酶水平不反映一种具体的临床症状，而是反映戈谢细胞的总机体负担(Aerts等，Plasma and metabolic abnormalities inGaucher's disease(戈谢病的血浆和代谢异常).Baillieres Clin Haematol.1997;10:691-709)；此外，其不反映由骨病理学和脑损伤驱使的疾病负担。壳三糖苷酶的水平不与戈谢病的病理生理学直接相关。另外，治疗后壳三糖苷酶的水平急剧变低，使得壳三糖苷酶不适合快速评估患者正在进行或已经进行的治疗的功效以及独立于疾病起因的疾病的复发。
此外，使用血浆壳三糖苷酶作为戈谢细胞标记受到这样的事实的妨碍：患者，包括患有戈谢病的那些患者，由于壳三糖苷酶基因中的24个碱基对(bp)的重复可能缺乏壳三糖苷酶活性。明显地，不能通过测量血浆壳三糖苷酶活性来监测这些个体(Hollak等，Marked elevation of plasmachitotriosidase activity.A novel hallmark of Gaucher disease(血浆壳三糖苷酶活性的显著升高。戈谢病的新型标记).J Clin Invest.(临床研究杂志)1994;93:1288-1292;Boot等，The human chitotriosidase gene.Nature of inheritedenzyme deficiency(人壳三糖苷酶基因。遗传的酶缺陷的性质).J BiolChem.(生物化学杂志)1998;273:25680-25685)。壳三糖苷酶基因中24-bp重复的频率取决于种族，并且可以高至几乎35%(Prof.Guiliani,Brasil,未公布的数据)。
CCL18：葡糖神经酰胺-装载的巨噬细胞或戈谢细胞是CCL18的主要来源。在患有戈谢病的患者的血浆中的CCL18水平显著升高(Boot,R.G.等，2004.Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucherdisease:a novel surrogate marker for assessing therapeutic intervention(戈谢病中趋化因子CCL18/PARC的明显升高：用于评估治疗干涉的新型替代标记).Blood103:33-39.)。因此，尝试使用血浆中的CCL18水平作为监测所用的治疗的成功性的替代标记。然而，发现升高的CCL18水平还与多种疾病相关，诸如与不同类型的癌症和关节、肺和皮肤的炎症相关。例如，与不患有卵巢癌的患者相比，患有卵巢癌的患者的腹水含有显著升高的CCL18水平(巴德－基亚里综合征(Budd-Chiari syndrome))(Schutyser,E.等，2002.Identification of biologically active chemokine isoforms fromascitic fluid and elevated levels of CCL18/pulmonary and activation-regulatedchemokine in ovarian carcinoma(从腹水液中鉴定生物活性趋化因子异构体以及卵巢癌中CCL18/肺和活化-调节的趋化因子的升高的水平).J Biol.Chem.(生物化学杂志)277:24584-24593.)。由于CCL18吸引并且激活特定的免疫细胞，因此CCL18在免疫抑制中起作用。此外，发现患有急性淋巴性白血病(acute lymphocytic leukemia)的儿童表现出升高的CCL18水平，而患有急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)的儿童不表现出升高的CCL18血清水平(Struyf,S等，2003.ARC/CCL18is a plasma CCchemokine with increased levels in childhood acute lymphoblasticleukemia(ARC/CCL18是血浆CC趋化因子，在儿童期急性淋巴母细胞白血病中水平升高).Am J Pathol.163:2065-2075.)。同样地，血浆CCL18水平不反映一种具体的临床症状，而是反映戈谢细胞的总机体负担。从上文可以看出，CCL18表现出极低的诊断戈谢病的特异性，并且因此主要用作缺乏壳三糖苷酶活性的患者的“辅助性”替代标记。
与使用壳三糖苷酶和CCL18相关，应该注意到，在所有患者的10-30%中，壳三糖苷酶未检测为阳性，即，尽管患有戈谢病，但是患者检测为阴性，并且因此还将放弃治疗的施用。此外，在这些情形中，所述标记不能进一步用作随访标记以用于监测，例如，ERT。如果怀疑患者受壳三糖苷酶缺陷影响，则CCL18用作诊断戈谢病的生物标记，其中利用CCL18作为生物标记的方法表现出相对低的特异性和灵敏性，即，在所有患者的约25%中，诊断假阳性或假阴性。
术语“戈谢病状态”用在本文中优选是指受试者中所述疾病的状态。各种类型的戈谢病状态的实例包括，但不限于，受试者患有或发展戈谢病的风险，受试者中该疾病的阶段和治疗所述疾病的有效性。其他状态和每种状态的程度在本领域中是已知的。在本发明的一个实施方案中，戈谢病状态包括重度、轻度或健康的戈谢病状态。
术语“诊断”用在本文中优选意指确定疾病或病症在受试者中存在或不存在和/或确定受试者是否处于发展疾病、病症或与疾病或病症相关的症状的危险中以及预测疾病状态。
术语“检测”在本发明的情形中意指这样的方法，所述方法包括检测物质在样品中的存在或不存在和/或定性所述物质的类型。检测可以通过本领域已知的方法以及本文进一步所述的那些方法完成，所述方法包括，但不限于，葡糖苷酶的直接测量，例如，测序编码葡糖苷酶的基因。任何适当的方法可以用来检测本文所述的一种或多种生物标记。这些方法包括，但不限于，质谱法(例如HPLC-MS/MS)，荧光(例如夹心免疫测定)，HPLC-荧光或HPLC-UV，优选在游离的溶血-Gb1衍生化后进行。
用于本文时，生物标记优选是任意生物化合物，诸如蛋白及其片段，肽，多肽，蛋白聚糖，糖蛋白，脂蛋白，碳水化合物，脂质，核酸，有机或无机化学品，天然聚合物和小分子，与一种表型状态(例如，不患有疾病)相比，所述生物化合物在来自另一种表型状态(例如，患有所述疾病)的受试者的样品中差异性存在，并且其可以从来自受试者的样品中分离或在来自受试者的样品中测量。此外，生物标记可以是整个完整的分子，或其可以是优选通过质谱分析检测的其部分，抗体，特异性结合所述生物标记的另一种蛋白，特异性结合所述生物标记的功能性核酸和/或荧光标记。此外，如果生物标记的可测量的方面与给定的患者状态(如戈谢病的特定状态)相关，则认为该生物标记能够提供信息。这样的可测量的方面可以包括，例如，所述生物标记在来自受试者的样品中的存在、不存在或水平和/或其作为生物标记的特征(profile)的部分的存在。可测量的方面还可以是生物标记的两个以上可测量方面的比，例如，所述生物标记可以或可以不具有已知的性质。生物标记的特征包括至少两个所述可测量的方面，其中所述可测量的方面可以对应于相同或不同种类的生物标记，例如，核酸和碳水化合物。生物标记特征还可以包括至少三个、四个、五个、10个、20个、30个或更多个可测量的方面。在一个实施方案中，生物标记特征包括数百个或甚至上千个可测量的方面。在另一个实施方案中，生物标记特征包括至少一个生物标记的至少一个可测量的方面和至少一个内标的至少一个可测量的方面。
在按照本发明方法的一个实施方案中，向来自受试者的样品中添加内标。应该认识到，通过向要进行本发明的方法的样品添加内标(在本文中还称为IS)，即，样品的掺加(spiking)，IS在所述样品中的浓度是已知的，并且例如，通过确定例如在HPLC-质谱图中的内标的峰下面积，即，峰面积，可以因此计算峰面积和物质(例如，IS和/或生物标记，在本情形中生物标记为游离的溶血-Gb1)浓度之间的相关性，例如，通过计算游离的溶血-Gb1的峰面积与IS的峰面积的比来计算相关性。本领域的技术人员应该进一步认识到，有多种分子可以用作IS。然而，优选的是与分子诸如生物标记(例如，游离的溶血-Gb1)相比具有相似的化学结构的IS。根据此，在一个实施方案中，本发明人选择了溶血-Gb2，其与溶血-Gb1的区别在于包含另外的糖部分并且另外地在自然中不是像这样存在的。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中，可以区分作为IS的分子与游离的溶血-Gb1。在另一个优选的实施方案中，这样选择IS，以使该分子理想地在自然中不存在或很罕见。在其中将内标添加到来自受试者的样品中的本发明的一个实施方案中，优选的是这样添加IS，以使其在添加到样品中之前溶解在溶剂中，例如，溶解在乙醇中。在另一个优选的实施方案中，这样选择溶剂，以使所述溶剂能够引起蛋白沉淀，优选能够在进行本发明的方法时引起蛋白沉淀步骤。
在本发明的一些实施方案中，蛋白沉淀和/或蛋白沉淀步骤是本发明的方法的部分。应该理解，在用于本文时，沉淀优选意指在溶液中形成固体，即，例如，在来自受试者的样品(例如血清)中形成蛋白沉淀。当在样品中发生沉淀(例如，蛋白沉淀)时，所形成的固体称为沉淀物，或者当通过离心压缩时，为团块(pellet)。在每种情形中，在固体上的剩余的液体称为上清液。本发明考虑不同的沉淀和/或分离所述上清液和所述沉淀物或团块的方法，其中特别包括，沉淀或沉降和离心。本领域技术人员将知晓用于蛋白沉淀和/或分离上清液和蛋白沉淀物的其他方法，然而，所述技术人员将认识到，如果应用一种方法，优选应用本发明的方法，沉淀的蛋白将使结合本发明使用的装置如柱或HPLC-柱失灵时，优选将所述沉淀的蛋白从溶剂和/或样品中分离出来。
在本发明的一些实施方案中，将通过本发明的方法确定的本发明的生物标记(例如，游离的溶血-Gb1)在样品中的水平，与通过本发明的方法确定的同一种或另一种本发明的生物标记在另一种样品(例如，来自同一患者，来自另一名患者，来自对照和/或来自相同或不同的时间点)中的水平、和/或临界水平、和/或对照水平和/或IS水平进行比较。与此联系，“比较”或“相比于”用在本文中优选地意指生物标记的水平的两个以上的值的数学比较。因此，如果至少两个所述值彼此比较，所述值中哪一个高、低或相等将是直接显而易见的。
在本发明的一些实施方案中，还在对照中确定生物标记的水平。当用于本文时，对照优选是来自这样的受试者的样品，其中所述受试者的戈谢病状态是已知的。在一个实施方案中，对照是健康患者的样品。在另一个实施方案中，将一定量的所述生物标记添加到所述健康患者的样品中，然后用本发明的方法确定所述生物标记在包含所述添加的生物标记的所述健康患者的样品中的水平。在另一个实施方案中，对照是来自至少一名具有已知的戈谢病状态的受试者的样品，所述已知的戈谢病状态包括重度、轻度或健康戈谢病状态，例如，对照患者。在另一个优选的实施方案中，对照是来自未针对戈谢病进行治疗的受试者的样品。在另一个优选的实施方案中，对照是来自单一受试者的样品或是来自不同受试者的样品集合(pool)和/或是在不同时间点从受试者采集的样品。
术语“水平”或“生物标记的水平”用在本文中优选意指物质(优选本发明的生物标记，更优选游离的溶血-Gb1)在样品或受试者中的浓度。技术人员将理解在特定的实施方案中，所述样品作为未处理的样品不必进行本发明的方法，所述方法包括确定所述生物标记的水平，即，可以对所述样品进行例如蛋白沉淀、分离(例如离心和/或HPLC)的步骤，并且然后对其进行确定生物标记的水平的步骤，例如，使用质谱分析。还将注意到，当术语生物标记的“一个”水平与待根据本发明确定的本发明的生物标记的水平联系使用时，意指待由本发明的方法确定且包含在要对其进行本发明的方法的样品中的本发明的生物标记的“这一”水平。
如果不同组中的生物标记的平均水平或中值水平被计算为在统计学上具有显著性，则生物标记的水平在戈谢病的不同状态之间是不同的。常用的统计学显著性检验特别包括t-检验、ANOVA、Wilcoxon、Mann-Whitney、优势率(odds ratio)和Kruskal-Wallis。生物标记，单独的或组合的，提供受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险的量度。因此，本发明的生物标记在本发明的实施方案中可用作针对疾病、药物或治疗的治疗有效性的标记。
术语“确定生物标记的水平”用在本文中优选意指这样的方法，所述方法包括定量至少一种物质在来自受试者的样品中的量和/或定量在受试者的机体的一部分(如唾液、血液、淋巴、血清、血浆或液体)中包含的所述物质的量，和/或定量所述物质在受试者中的量，所述物质选自包括生物标记的组。
本领域技术人员将理解，检测和/或确定游离的溶血-Gb1在来自受试者的样品中的水平，因此优选地包括存在于受试者的血液中的Gb1不被化学转变、转化或衍生，以致游离的溶血-Gb1不能被检测到和/或其水平不能与Gb1分开地和/或单独地确定。本领域技术人员将认识到，在来自进行脱乙酰基步骤(例如，通过在甲醇氢氧化钠中水解)的受试者的样品中存在的Gb1将导致脂肪酸部分从Gb1分解，因此将不利地导致不能与游离的溶血-Gb1区分开的Gb1的化学转变、转化或衍生形式。因此，本发明人的优点在于认识到与Gb1区分的游离的溶血-Gb1可用于诊断戈谢病的方法。
在本发明的优选实施方案中，所述方法用于检测和/或确定游离的溶血-Gb1在来自受试者的样品中的水平，其中在来自受试者的样品中存在的Gb1不进行导致Gb1脱乙酰基的步骤，优选地不进行导致脂肪酸部分从样品中包含的Gb1上分解下来的步骤。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在来自受试者的样品中存在的Gb1不被化学转变、转化或衍生。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在导致脂肪酸部分从Gb1上分解的步骤之前和/或在Gb1被化学转变、转化或衍生的步骤之前，将在来自受试者的样品中存在的游离的溶血-Gb1与在来自受试者的样品中存在的Gb1分离。在另一个优选实施方案中，检测和/或确定生物标记在来自受试者的样品中的水平的步骤在使用HPLC进行分离后应用质谱分析进行，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
如果受试者不患有与戈谢病相关的症状，则认为受试者关于戈谢病是健康的受试者。并且，在本发明的方法的实施方案中，如果其不具有脑苷酶基因的功能部分的突变和/或不具有导致葡糖脑苷脂酶或其活性的减少或缺失的脑苷酶基因的突变(所述突变导致与戈谢病相关的症状)，则认为该受试者是健康的。如果对来自受试者的样品进行本文所述的针对这些突变的遗传检测，则将检测到所述突变。在本发明的另一个实施方案中，来自健康受试者的样品用作本发明的方法中的对照样品或作为空白基质(blank matrix)。本文所述的空白基质优选是来自健康受试者的样品。然而，将理解，所述空白基质可以包含天然水平的游离的溶血-Gb1。
在本发明的一个实施方案中，生物标记的水平指示受试者患有疾病或病症或处于发展疾病或病症的危险中。通过本发明所述的方法确定的生物标记的水平与所述生物标记的对照水平相比较，其中所述比较的结果允许诊断疾病。
更具体地，将所述生物标记在来自受试者的样品中的水平与所述生物标记的对照水平相比较包括将所述生物标记在来自受试者的样品中的水平与临界水平比较，其中如果与临界水平相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平升高、增加或更高，则这指示所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中，和/或，其中如果与临界水平相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平减少或更低，则这指示所述受试者不患有戈谢病或不处于发展戈谢病的危险中。也在本发明之内的是，将所述生物标记在来自受试者的样品中的水平与对照水平相比允许确定戈谢病的严重性，其中，如果与对照水平相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平升高、增加或更高，则这指示所述受试者患有更严重状态或进展的戈谢病或处于发展更严重状态或进展的戈谢病的危险中；并且其中，如果与对照水平相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平减少或更低，则这指示所述受试者患有较不严重状态或进展的戈谢病或处于发展较不严重状态或进展的戈谢病的危险中。在本发明的另一个实施方案中，将所述生物标记在来自受试者的样品中的水平与对照水平相比较包括将所述生物标记在所述受试者中的水平与在来自对照的样品中检测的所述生物标记的水平进行比较，其中，如果与对照样品相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平升高、增加或更高，则这指示所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中；和/或，与对照样品相比，所述生物标记在来自受试者的样品中的水平升高、增加或更高，则这指示所述受试者患有更严重状态或进展的戈谢病或处于发展更严重状态或进展的戈谢病的危险中。所述对照优选地选自包括健康受试者、患有戈谢病或处于患上戈谢病症状的风险中的受试者、对脑苷酶基因的突变或突变的组合检测为阳性的受试者的组，其中脑苷酶基因的突变或突变的组合指示所述受试者发展更严重或较不严重状态或进展的戈谢病的前景。在本发明的另一个实施方案中，对照水平在来自对照的样品中确定，其中任选地在确定游离的溶血-Gb1在来自对照的样品中的水平之前，向来自对照的样品中加入特定量的游离的溶血-Gb1。
本发明人的优点在于，可以建立用于诊断受试者中的戈谢病的方法，其中所述方法包括在来自受试者的样品中检测生物标记，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1，优选地进一步包括确定所述生物标记在来自受试者的样品中的水平，并且更优选地进一步包括将所述生物标记在来自受试者的样品中的水平与临界水平比较，其表现出高灵敏性，即，至少99,0%、99,1%、99,2%、99,3%、99,4%、99,5%、99,6%、99,7%、99,8%、99,9%或100%的灵敏性，以及至少99,0%、99,1%、99,2%、99,3%、99,4%、99,5%、99,6%、99,7%、99,8%、99,9%或100%的高特异性。在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的方法允许诊断受试者中的戈谢病而不依赖于受试者中戈谢病的进展状态。更具体地，本发明的方法允许诊断具有戈谢病的早期状态的受试者中的戈谢病以及诊断具有戈谢病的晚期或进展状态的受试者中的戈谢病。
一种方法正确诊断戈谢病的能力通常被测量为所述方法的灵敏性、所述方法的特异性或所操作的接受者特征曲线(在本文还称为"ROC曲线")下的面积。ROC曲线是对于诊断方法的不同的可能的临界水平的真阳性率针对假阳性率的图。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。灵敏性是被检测预测为阳性的真阳性的百分数，而特异性是被检测预测为阴性的真阴性的百分数。ROC-曲线提供作为1-特异性的函数的检测的灵敏性。ROC-曲线下面积越大，检测的预测值越有力。因此，灵敏性的增加将伴随着特异性下降。曲线越接近左轴并且越接近ROC空间的顶边，检测越准确。相反，曲线距离ROC图的45度对角线越近，检测的准确性越低。因此，ROC下面积是检测准确性的量度。检测的准确性取决于所述检测是否很好地将被检测的组分成具有讨论的疾病和不具有讨论的疾病的那些组。曲线下面积(在本文中还称为“AUC”)为1表示完美的方法，而0.5的面积表示不怎么有用的方法。因此，本发明的优选诊断方法具有大于0.50的AUC，更优选的方法具有大于0.9的AUC，并且最优选的方法具有大于0.998的AUC。
关于方法的有用性的其他可用且适当的量度是阳性预测值和阴性预测值。阳性预测值是检测为阳性的实际阳性的百分数。阴性预测值是检测为阴性的实际阴性的百分数。
使用现有技术的生物标记，例如，壳三糖苷酶和/或CCL18定性受试者中的戈谢病状态的方法表现出典型地不超过90%的灵敏性和特异性。
本领域技术人员将认识到，尽管本发明所述的方法的特异性和灵敏性如上述一样高，并且如下文的实施例中所述确定，但是不可能排除个例，其中患有戈谢病的患者用本发明的方法检测为假阴性或者其中不患有戈谢病的患者用本发明的方法检测为假阳性。考虑所述情形，当确定本发明所述的方法的特异性和灵敏性时，该特异性和灵敏性将低于上述值。然而，本领域技术人员还将认识到，对于诊断戈谢病的方法，上文已经列出的这样高的特异性和这样高的灵敏性之前从未被描述过。因此，重要的是注意到，尽管如果患者集合体不同于实施例部分中所报道的，例如，进行本发明的方法的患者人数不同，本发明方法的灵敏性和特异性可能改变，但是，本发明人具有这样坚定的信念：现有技术中没有已知的使用生物标记的方法将获得比本发明所述的方法更高的特异性和更高的灵敏性。由于本发明的方法的检测极限允许在许多健康受试者中确定游离的溶血-Gb1的水平，因此这是特别真实的。因此，应用本发明的方法检测为假阴性的患病受试者是因为这样的原因而被检测为假阴性：所述生物标记在来自所述检测为假阴性的患病受试者的样品中的水平同所述生物标记在来自健康受试者的样品中的水平一样高。特别地，重要的是注意到，所述检测为假阴性的受试者不是因为这样的原因而被检测为阴性：所述生物标记的水平太低而不能通过本发明的方法确定。
物质如游离的溶血-Gb1的“检测极限”，用在本文中时，优选是通过确定所述物质的水平的方法确定的该物质的水平，其中少于或低于所述检测极限的水平不能通过所述方法确定。因此，直接清楚的是，“临界水平”和“检测极限”，用在本文中时，优选不必是相同的，尽管二者都反映物质的特定水平，例如，本发明的生物标记的特定水平。将立即理解，相反地，将这样选择临界水平以使所述方法的选择性和灵敏性尽可能高。与其相反，检测极限表示本发明的生物标记的绝对水平，其反映使用确定所述生物标记的水平的方法可以检测到的生物标记的最低水平。因此，直接清楚的是，检测极限取决于用于确定物质水平的方法和通过所述方法确定其水平的物质。技术人员将立即明白，高的检测极限，例如，高于理想临界水平的检测极限，可能导致本发明的低灵敏性，因为被检测预测为阳性的真阳性的百分数也取决于对于所述真阳性是否可以确定生物标记的水平。换言之，如果检测极限高于理想的临界水平，则具有略高于所述临界水平的生物标记水平的真阳性可能不能与具有低于临界水平的生物标记水平的真阴性区分开，原因在于对于具有略高于临界水平的生物标记水平的真阳性和具有低于临界水平的生物标记水平的阴性二者不能确定生物标记的水平。因此，直接清楚的是，低的检测极限是有利的。因此，本发明人还有一个优点是表明低的检测极限允许诊断受试者中的戈谢病的方法，所述方法包括以更高的选择性和灵敏性确定样品中存在的生物标记的水平的步骤。“理想的临界水平”用在本文中优选是本文所述的临界水平，使用所述临界水平的方法具有最高的选择性和灵敏性。
本发明所述的方法的一个实施方案包括：通过本发明的方法，通过诊断受试者中的疾病或病症(优选是戈谢病)来验证所述方法的步骤；通过遗传检测，包括对基因进行测序，优选对本领域技术人员已知其突变引起疾病或病症的基因进行测序，更优选地在戈谢病的情形中对脑苷酶基因进行测序，诊断受试者中的疾病或病症(优选戈谢病)的步骤；和将所述方法的结果与所述遗传检测进行比较。健康受试者，用在本文中时，如果所述受试者不患有与疾病或病症相关的症状，并且如果遗传检测的结果揭示本领域技术人员已知其突变将引起所述疾病或病症的基因没有突变，则优选认为其相对于所述疾病或病症是健康的。健康受试者还将理解为是肯定地检测为不具有戈谢病的受试者。
术语“定性受试者中的戈谢病状态”用在本文中优选意指受试者生物标记特征的分类，其选自包括下述的组：鉴定或检测戈谢病在受试者中的存在或不存在，预测受试者中戈谢病的发作或发展戈谢病的危险，确定受试者中戈谢病的病程，确定和/或预测受试者中戈谢病的严重性，确定受试者是否患有戈谢病早期状态或戈谢病晚期或进展状态，或确定受试者中的生物标记的水平是否随时间显著变化。
术语“处理受试者治疗”或“受试者处理”用在本文中时优选地是指临床医生或医师在确定了戈谢病状态后的行为。例如，如果本发明所述的方法的结果是不确定的或者存在必须确认状态的理由，则医师可以订制新的检测，诸如检测葡糖脑苷脂酶的功能和/或对编码葡糖脑苷脂酶的基因进行测序。备选地，如果状态表明对戈谢病的治疗是适当的，则医师可以为受试者安排治疗戈谢病的时间表。同样地，如果状态是阴性的或者如果结果表明治疗已经成功了，则可以不需要进一步的处理。然而，本领域技术人员将立即认识到，除了基因疗法之外，所施用的任何疗法，例如，ERT和/或SRT，必须对戈谢病患者终身施用。此外，本发明的一个实施方案是，处理受试者治疗包括对施用给患者的、作为戈谢病的治疗施用的药物的剂量(例如，在ERT中应用的重组酶的单位)进行滴定。在本发明的方法的一些实施方案中，其中，在若干个时间点确定在来自受试者的样品中存在的生物标记的水平，或者将其与生物标记的其他水平、临界水平和/或所述生物标记在对照中的水平进行比较，技术人员将应用或不应用治疗，或者修改已经应用的治疗，从而治疗或不治疗或继续治疗戈谢病。
下述在本发明之内：技术人员将施用剂量和/或维持剂量或修改剂量，例如，如果所述生物标记水平的比较显示，例如，所述生物标记的水平高于例如临界水平，即，患者被诊断患有戈谢病；或者在同一患者中在早期时间确定的水平更低或相同，即，所施用的治疗是不充分的，即，没有导致该水平的减少，则施用一定剂量或更高的剂量，即，升高剂量。另一方面，如果所述生物标记水平的比较显示，例如，所述生物标记的水平低于例如临界水平，即，患者被诊断不患有戈谢病；或者在同一患者中在早期时间确定的水平更高，即，所施用的治疗是充分的，即，确实引起该水平下降，则技术人员将施用或不施用一定的剂量或维持剂量或减少剂量，例如，不施用剂量或施用较低的剂量。在本发明的实施方案中，基于所述比较的相对高水平的游离的溶血-Gb1指示施用高剂量的在ERT中施用的重组酶和/或基于所述比较的相对低水平的游离的溶血-Gb1指示施用低剂量的在ERT中施用的重组酶。然而，还将立即明白，技术人员将考虑患者的病史，即，处理患有戈谢病且被治疗以致生物标记的水平低于临界水平的患者的受试者治疗的技术人员，例如，将决定不停止治疗，而是减少剂量和增加本发明方法的进一步施用之间的时间。
戈谢病的病程可以通过本发明所述的方法通过确定在疾病病程的不同时间点在来自受试者的样品中的生物标记水平来确定。重要的是注意到，本发明所述的诊断戈谢病的方法的单一施用允许诊断戈谢病，并且在某些实施方案中，包括基于受试者是否患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的诊断处理受试者治疗的步骤。如果因此对其样品进行本发明的方法的受试者的针对患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的检测为阳性，则熟练的临床医师将知晓关于处理受试者治疗如何决定，即，受试者该怎样治疗，例如，施用与ERT相关的特定剂量的酶。将立即理解，不依赖于熟练的临床医师关于怎样处理受试者治疗的决定，熟练的临床医师可以决定在晚期时间点再施用本发明所述的方法至少一次。因此，本发明的实施方案是，在不同时间点确定的生物标记水平可以进行比较，其中不同时间点意指至少两个时间点。不希望受到任何理论的限制，本发明人已经发现本发明的生物标记在来自一名特定患者的样品中的水平可以与在从所述患者采集样品的时间点所述患者中的疾病严重性相关。因此，将立即理解，与较早时间点的样品中确定的生物标记的水平相比，在较晚时间点的样品中确定的生物标记的升高的水平指示，与在较早时间点的受试者状态相比，在较晚时间点的受试者状态更严重。与在较早时间点的样品中确定的生物标记的水平相比，在较晚时间点的样品中确定的生物标记水平减少指示，与在较早时间点的受试者的状态相比，在较晚时间点的受试者状态的严重性更轻。因此，在一个方面中，本发明提供用于确定受试者中的戈谢病的病程的方法，所述方法包括在若干个时间点确定在来自受试者的样品中存在的生物标记水平的步骤，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。在另一个方面中，本发明涉及确定施用于被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法，所述方法包括在若干个时间点确定来自受试者的样品中存在的生物标记水平的步骤，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。本领域技术人员将立即理解，本发明的方法因此允许基于本发明方法的结果来选择疗法和/或调整所选的疗法的药量和/或剂量。例如，如果给受试者安排了治疗戈谢病的时间表，则本发明所述的用于诊断受试者中的戈谢病的方法可以每3个月施用一次，并且比较因此确定的生物标记水平，从而确定施用给所述受试者的一种或多种治疗和/或一种疗法/多种疗法的有效性。如果受试者达到这样的状态，其中稳定水平的生物标记随时间得以保持，则本发明所述的用于诊断受试者中的戈谢病的方法的施用频率可以减少为每6个月一次。如果疗法的剂量改变，例如，ERT中施用的重组酶的单位减少或增加，则本发明所述的用于诊断受试者中的戈谢病的方法的施用频率可以恢复至每3个月一次。通过比较在来自受试者的样品中确定的生物标记的水平，熟练的医师将认识到所述生物标记的水平是否增加、减少或者稳定水平的生物标记是否随时间得以维持。因此，根据用本发明所述的方法确定的生物标记水平的比较，熟练的医师可以决定减少疗法剂量，例如，减少ERT中所用的重组酶的单位；增加疗法剂量；或维持疗法剂量。12个月内游离的溶血-Gb1水平的约60%的减少指示成功的戈谢病治疗，其中当在本文中使用时减少优选地是指在一段时间的末期确定的通过本发明的方法确定的游离的溶血-Gb1水平与在所述时间的开始确定的通过本发明的方法确定的游离的溶血-Gb1水平比较。因此，熟练的医师可以决定减少所施用的疗法的剂量或者维持所述疗法的剂量。如果游离的溶血-Gb1的水平的减少显著较弱，则熟练的医师可以决定增加疗法剂量。本发明人还有一个优点是已经认识到游离的溶血-Gb1水平的减少与疗法的有效性相关。在一段时间期间(例如，12个月)内，游离的溶血-Gb1的水平的减少越强，则疗法越成功，如例如ERT、SRT或基于伴侣分子的疗法。因此，本发明的另一个实施方案是本发明的方法用于比较施用给受试者的一种疗法或至少两种疗法的有效性。
因此，本领域技术人员将认识到，可以通过频繁确定来自受试者的样品中的游离的溶血-Gb1的水平来监测单个受试者中的进展，即，戈谢病的病程，以及疗法的有效性。
在另一个方面中，本发明涉及用于确定施用于被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法，所述方法包括在若干个时间点确定在来自所述受试者的样品中存在的生物标记水平的步骤，其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。与上文已经描述的与处理受试者治疗相关的内容相联系，本领域技术人员将立即理解，可以施用本发明的方法来比较一种治疗或至少两种治疗的组合的有效性。因此，可以通过本发明的方法检测并比较用于戈谢病的一些新的药物、剂型、剂量或治疗。
本发明的一个实施方案是本发明所述的用于诊断戈谢病的方法不依赖于受试者先前是否已经进行或没有进行针对戈谢病的治疗。因此，来自受试者的样品可以是来自先前已经进行戈谢病治疗的受试者的样品或是来自先前没有进行戈谢病治疗的受试者的样品。因此，本发明的另一个实施方案是本发明的方法包括下述步骤：处理受试者治疗和/或在受试者处理后确定在来自所述受试者的样品中的生物标记的水平。所述受试者治疗可以基于所述受试者是否患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的诊断；基于在受试者处理后对在来自受试者的样品中的生物标记的检测；或基于在受试者处理后对在来自受试者的样品中的所述生物标记的水平的确定。然而，本领域技术人员将理解，一些不具有戈谢病的患者或一些被成功地治疗了戈谢病的患者的样品将表现出低于检测极限的游离的溶血-Gb1的水平。
不希望受任何理论的限制，本发明人假设在来自受试者的样品中存在的游离的溶血-Gb1的水平进一步与患有戈谢病的受试者中该疾病的严重性相关。与此相联系，本发明人通过评估本文提供的结果(例如，在本文的图4中所示的)发现，尽管原则上在特定的患者中游离的溶血-Gb1的水平是不同的，并且更具体地可能在具有相同突变的特定个体中是不同的，游离的溶血-Gb1的水平越高，根据临床评分、在统计学平均值方面戈谢病病程的严重性就越高。因此，游离的溶血-Gb1的水平与戈谢病的严重性相关之处在于，在被肯定地检测为具有已知通常引起轻度(例如N370S突变)或更严重的(例如L444P突变)戈谢病病程的葡糖脑苷脂酶基因的独特的突变的患者中，在所述受试者中确定的游离的溶血-Gb1的水平与通常与所述突变相关的严重性统计学相关。
因此，本发明不同方面的另一个实施方案涉及用于确定受试者中戈谢病的严重性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)确定在来自受试者的样品中存在的生物标记的水平，其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1，以及下述步骤：
b)确定戈谢病的严重性，例如，通过将优选通过本发明的方法确定的受试者中的游离的溶血-Gb1的水平与临床评分相比。
与此联系，重要的是注意到，如果在来自对其进行本发明的方法的、在对脑苷酶基因(纯合的与复合杂合的)进行测序后表现出L444P突变的、患有戈谢病的患者的样品中确定游离溶血-Gb1的水平，则游离溶血-Gb1的平均水平高于在来自施用相同方法、在对脑苷酶基因进行测序后表现出N370S突变的患有戈谢病的受试者的样品中确定的游离溶血-Gb1的平均水平(图4)。已知突变L444P引起更严重的戈谢病病程–在对于所述突变受试者是纯合的情形中尤其是这样。与此相对应，与纯合的N370S突变相比，在纯合的中确定更高的游离溶血-Gb1的平均水平(分别为194ng/ml和159ng/ml，参见图4)。并且，具有复合杂合L444P突变的患者具有比纯合的患者显著更低的游离溶血-Gb1水平(分别为89ng/ml和45.4ng/ml)。本领域技术人员将知晓分类戈谢病或症状或其症状整体的严重性的临床评分。因此，本发明的方法的一个实施方案是预测患者中戈谢病的病程，并且更具体地，基于按照本发明的方法确定的生物标记水平来确定戈谢病的严重性。
本发明的一个实施方案为在不具有壳三糖苷酶基因突变、特别是不具有本文所述的24-bp重复的患者中确定的壳三糖苷酶的水平作为关联戈谢病的严重性的基础，这在于，如本文所述，在来自所述患者的样品中确定的壳三糖苷酶的平均水平与戈谢病的严重性相关。因此，例如，低于200nmolMU/h/ml的壳三糖苷酶的水平与不患有戈谢病的患者的戈谢病状态相关。与此联系，重要的是注意到，针对戈谢病进行治疗的患者还可能表现出低于200nmolMU/h/ml的壳三糖苷酶水平。大于2000nmolMU/h/ml的水平与“充分发展的(fullblown)”或“重度”戈谢病状态相关，并且200至2000nmolMU/h/ml的壳三糖苷酶水平与“轻度”戈谢病状态相关。
与此联系，重要的是注意到，在来自患有另一种LSD如C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick)或克拉伯病(Krabbe’s disease))的受试者的样品中也可以发现200至1000nmolMU/h/ml的壳三糖苷酶水平，由此使得壳三糖苷酶不适合用于诊断戈谢病。因此，以上结合用壳三糖苷酶水平关联戈谢病严重性所列出的考虑典型地仅施用于这样的患者，其中通过突变分析证实存在或不存在戈谢病和/或其他已知表现出升高的壳三糖苷酶水平的LSD。
如果按照本发明所述的方法在所述不具有壳三糖苷酶基因突变的患者、特别是不具有本文所述的24-bp重复的患者中确定游离的溶血-Gb1水平，则在来自每名所述患者中的样品中确定的游离的溶血-Gb1的所述水平与所述患者的壳三糖苷酶水平相关和/或与所述患者的戈谢病严重性等级和/或戈谢病状态相关。因此，确定戈谢病的严重性等级和/或戈谢病状态，包括健康的、轻度的和重度的，并且更优选地，戈谢病的严重性等级和/或戈谢病状态与上文列出的壳三糖苷酶水平和/或壳三糖苷酶水平的范围相关。
本领域技术人员将认识到，在来自受试者的样品中确定的本发明的生物标记的水平(其中如上文所述，所述生物标记的水平与戈谢病的严重性相关)将指示施用特定的疗法和/或所述疗法的给药或剂量。例如，如果按照本发明的方法确定的生物标记水平与“重度”或“充分发展的”戈谢病状态相关，则给所述受试者安排治疗戈谢病的时间表，并且本发明所述的用于诊断受试者中的戈谢病的方法可以每3个月施用一次，并且将比较因此确定的生物标记水平，以确定施用给所述受试者的一种或多种治疗和/或一种或多种疗法的有效性。如果所述受试者达到某种状态，其中生物标记的水平与“轻度”戈谢病相关或者其中随时间维持稳定的生物标记水平，则施用本发明所述的用于诊断受试者中的戈谢病的方法的频率可以减少为每6个月一次。
在另一个方面中，本发明涉及确定用于治疗戈谢病的组合物的有效性的方法。所述方法可以包括下述步骤：确定具有戈谢病的受试者中游离的溶血-Gb1的水平；给所述受试者施用一定量的所述化合物，所述量足以确定所述化合物的有效性；在所述受试者中再次确定游离的溶血-Gb1的水平；比较在施用所述组组合物之前和之后确定的游离的溶血-Gb1的水平，其中与在施用所述组合物之后确定的游离的溶血-Gb1水平相比，在施用所述组合物之后确定的游离的溶血-Gb1的较低水平表示所述组合物用于治疗戈谢病的有效性。
现在将通过下述附图和实施例进一步举例说明本发明，从中可以理解其他的特征、实施方案和优点。
更具体地，
图1A是显示游离的溶血-Gb1水平(以ng/ml血浆计)的箱线图(boxplot)；
图1B是显示按受试者性别分组的游离的溶血-Gb1水平(以ng/ml血浆计)的箱线图；
图2A是显示游离的溶血-Gb1和壳三糖苷酶的接受者操作特征(ROC)曲线的图；
图2B是显示游离的溶血-Gb1和CCL18的接受者操作特征(ROC)曲线的图；
图3A是显示总共20名德国戈谢病患者的作为随时间变化的函数的游离的溶血-Gb1(以ng/ml血浆计)的图；
图3B是显示总共24名未治疗的戈谢病患者(10名德国患者，14名以色列患者)的作为随时间变化的函数的游离的溶血-Gb1(以ng/ml血浆计)的图；
图3C是显示总共9名以色列戈谢病患者在疗法开始之前和之后的作为随时间变化的函数的游离的溶血-Gb1(以ng/ml血浆计)的图；
图3D是显示以色列和德国戈谢病患者在疗法开始之前和之后的作为随时间变化的函数的游离的溶血-Gb1的基于回归的值(以ng/ml血浆计)的图；
图4是显示两种常见突变的游离的溶血-Gb1的中值水平的表；
图5A是显示健康受试者的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的HPLC-质谱色谱图；
图5B是显示戈谢病患者的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的HPLC-质谱色谱图；
图5C是显示戈谢病患者的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的HPLC-质谱色谱图。
附图简述
图1A是显示游离的溶血-Gb1的水平的箱线图；y-轴表示通过本发明所述的方法在患者的血浆中确定的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的对数化水平，其中x-轴显示患者的分组，其已经按照实施例2中所述的那样进行了分组。该箱线图通过箱(box)的底部和顶部分别表示每组患者的第25百分位数和第75百分位数；接近箱中间的条带表示每组的第50百分位数(即，中值)；短线(whisker)表示高于或低于数据平均值的一个标准偏差；不包括在所述短线之间的任何数据用小圆圈或星形显示为离群值。水平线表示5ng/ml的临界水平。
图1B是显示另外按照受试者性别分组的如图1A所示的游离的溶血-Gb1的水平的箱线图；y-轴表示通过本发明所述的方法在患者血浆中确定的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的对数化水平，其中x-轴表示患者的分组，其已经按照实施例2中所述并且另外按照患者性别进行了分组。该箱线图通过箱的底部和顶部分别表示每组患者的第25百分位数和第75百分位数；接近箱中间的条带表示每组的第50百分位数(即，中值)；短线(whisker)表示高于或低于数据平均值的一个标准偏差；不包括在所述短线之间的任何数据用小圆圈或星形显示为离群值。水平线表示5ng/ml的临界水平。
图2A是显示游离的溶血-Gb1和壳三糖苷酶的接受者操作特征(ROC)曲线的图；x-轴表示“1-特异性”，y-轴表示灵敏性。游离的溶血-Gb1表示100%的灵敏性和100%的特异性，其中壳三糖苷酶分别具有0.9591或95.91%的最佳的灵敏性。
图2B是显示游离的溶血-Gb1和CCL18的接受者操作特征(ROC)曲线的图；x-轴表示“1-特异性”，y-轴表示灵敏性。游离的溶血-Gb1表示100%的灵敏性和100%的特异性，其中CCL18分别具有0.8658和86.58%的最佳的灵敏性。
图3A：y-轴表示在研究过程中通过本发明的方法确定的作为随时间变化的函数的20名进行治疗(更精确地是ERT)的德国戈谢病患者的血浆的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的水平。每条曲线和每个患者号分别表示在如在x-轴上所示的不同时间点从同一名患者收集的血浆中确定的水平。x-轴表示血浆收集的时间点，其中时间点0表示治疗中对每名患者的第一次测量。对于如在实施例3中所述的在戈谢病患者中游离的溶血-Gb1水平随时间的变化的分析，将非聚集数据(non aggregated data)用于已经分析了不止一份血液样品的那些患者。
图3B是显示通过本发明的方法确定的作为随时间变化的函数的总共24名未治疗的戈谢病患者(10名德国患者，14名以色列患者)的血浆的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的图；未治疗的用在本文中优选意指对戈谢病没有施用治疗，例如，没有施用酶替代疗法。对于如在实施例3中所述的在戈谢病患者中游离的溶血-Gb1水平随时间的变化的分析，将非聚集数据用于已经分析了不止一份血液样品的那些患者。
图3C是显示在开始疗法之前和之后的时间期间通过本发明的方法确定的作为时间与游离的溶血-Gb1的函数的总共9名以色列戈谢病患者的血浆的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的图。x-轴表示以月计的时间，其中“0”表示在开始疗法后的第一个时间点。用“整体”标记的曲线表示基于回归的游离的溶血-Gb1值。
图3D是显示在疗法开始之前和之后的时间期间通过本发明的方法确定的作为随时间变化的函数的以色列和德国戈谢病患者的血浆的以ng/ml计的游离的溶血-Gb1的基于回归的值的图。x-轴表示以月计的时间，其中“0”表示在开始疗法后的第一个时间点。用“整体”标记的曲线表示游离的溶血-Gb1的基于回归的值。
图4是这样的表，其显示被肯定地检测为具有葡糖脑苷脂酶基因的两个常见突变(即N370S和L444P)中的一个(以纯合情况中以及在复合杂合情况中)的患者中的游离的溶血-Gb1的中值水平，其中复合杂合是在特定的基因座具有两个异源的隐性等位基因的情形，所述特定的基因座在杂合状态能够引起遗传病。本领域技术人员将认识到，具有葡糖脑苷脂酶基因的L444P突变的患者还面临更加恶化的预后，在纯合情形中尤其是这样。因此，本发明的实施方案是，本发明所述的方法包括确定戈谢病的严重性。所述确定戈谢病的严重性包括确定来自受试者的样品中存在的生物标记(优选是游离的溶血-Gb1)的水平和/或比较在来自具有不同的葡糖脑苷脂酶基因突变的受试者和/或不具有葡糖脑苷脂酶基因突变的受试者的样品中确定的所述生物标记的所述水平。本发明人已经发现，在来自被肯定地检测为具有脑苷酶基因的纯合L444P突变的患者的样品中，通过本发明所述的方法确定的游离的溶血-Gb1水平为约194ng/ml，并且与在来自被肯定地检测为具有脑苷酶基因的纯合N370S突变的患者的样品中确定的游离的溶血-Gb1水平(其中通过本发明所述的方法确定的游离的溶血-Gb1水平为约159ng/ml)相比是升高的。本发明人还已经发现，在来自被肯定地检测为具有复合的杂合L444P突变的患者的样品中，通过本发明所述的方法确定的游离的溶血-Gb1水平为89ng/ml，并且与在来自被肯定地检测为具有纯合L444P突变的患者的样品中通过本发明所述的方法确定的游离的溶血-Gb1水平(其中通过本发明所述的方法确定的游离的溶血-Gb1水平为约45.4ng/ml)相比显著较低。不希望受到理论限制，本发明人相信通过本发明的方法确定的在来自受试者的样品中的游离的溶血-Gb1水平指示戈谢病的严重性。因此，本发明的另一个实施方案是本发明的方法用于确定对被肯定地检测为患有戈谢病和/或处于发展戈谢病的危险中的受试者施用的至少一种治疗的有效性。括号中所示的数字表示在各个患者组中测量的浓度范围。IQR意指四分位数间距。进行戈谢病治疗的所有患者均进行ERT。
图5A是显示作为随保留时间(以分钟计)变化的函数的来自健康受试者的样品的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度(以cps计)的HPLC-质谱色谱图。物质的保留时间用于本文时优选被表示在x-轴上，并且是在注入溶质(例如，本发明所述的生物标记和/或内标)的时间与所述溶质的最大峰值洗脱的时间之间经过的时间。本领域技术人员将认识到，依据本文所述的方法的物质保留时间是所述溶质的特有特征，并且可以用于鉴定目的。将包含作为内标的溶血-Gb2的内标工作液加入到样品中，如实施例1所述。重要的是理解通过向要进行本发明所述的方法的样品加入IS，即，对所述样品进行掺加(spiking)，样品中IS的浓度是已知的，并且通过确定所述HPLC-质谱色谱图中的内标的峰下面积，即，峰面积，可以因此计算峰面积与物质(例如，IS和/或生物标记)的浓度之间的关系。更精确地，本领域技术人员将认识到，HPLC-质谱色谱图(诸如图5A、图5B或图5C中所显示的HPLC-质谱色谱图)中所示的物质的峰面积表示进行HPLC-质谱分析的所述物质的量的量度。此外，使用游离的溶血-Gb1的峰面积(其量通过本发明的方法确定)和IS(例如，游离的溶血-Gb2)的峰面积的比，以及利用所述方法和所述游离的溶血-Gb1和/或IS产生的校准曲线，本领域技术人员将能够计算物质在来自进行HPLC-质谱分析的受试者的样品中的量，例如，在进行本发明的方法的样品中的游离的溶血-Gb1的量。因此，这随后允许确定游离的溶血-Gb1的水平。
图5B是显示来自戈谢病患者的样品的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的HPLC-质谱色谱图，其中按照基本上如实施例1所述的本发明的方法确定了17,1ng/ml的游离的溶血-Gb1的水平。将在来自受试者的样品中的生物标记的所述水平与5ng/ml的临界水平比较，与所述临界水平相比，在来自受试者的样品中的所述生物标记的水平升高指示受试者患有戈谢病，其中选择这样的临界水平以致按照本发明的方法诊断受试者中的戈谢病的灵敏性为100%，并且按照本发明的方法诊断戈谢病的特异性为100%。
图5C是显示来自戈谢病患者的样品的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的HPLC-质谱色谱图，其中按照基本上如实施例1所述的本发明的方法确定319ng/ml的游离的溶血-Gb1的水平。将在来自受试者的样品中的生物标记的所述水平与5ng/ml的临界水平比较，与所述临界水平相比，在来自所述受试者的样品中的所述生物标记水平的升高指示受试者患有戈谢病，其中选择这样的临界水平以致按照本发明的方法诊断受试者中的戈谢病的灵敏性为100%，并且按照本发明的方法诊断戈谢病的特异性为100%。
实施例
在下文所述的实施例中，使用人血浆作为来自受试者的样品。然而，本领域技术人员将认识到，取决于所用的来自受试者的样品的类型，例如，包括唾液、液体、血浆、血清、全血、干血滤纸卡上的血液或另一种血液制品，本发明的方法必须按照样品类型调整，此外，必须按照下述实施例中所述的方法为每种样品类型确定临界水平。本发明人已经发现，如果人血清样品和人血浆样品来源于同一受试者并且在相同的时间点采集,并且其中所述样品平行测量，则在所述方法中如下文所述使用人血清样品替代人血浆样品将产生相同的根据对游离的溶血-Gb1的检测的结果以及由此产生相同的确定的游离的溶血-Gb1水平；并且，更特别地，将产生相同的临界水平。不希望受到限制以及以示例性实施例的方式，通过使用来自人患者的唾液，方法可以根据样品的pH值进行调整；或者，如果使用全血或收集在干血滤纸卡上的血液作为来自受试者的样品，则临界水平可以确定为20ng/ml。
实施例1：检测人血清中游离的溶血-Gb1的方法
仪器
为了检测来自受试者的血浆样品中的游离的溶血Gb-1，使用下述仪器：
试剂
为了检测来自受试者的血浆样品中的游离的溶血Gb-1，使用下述试剂：
就值依赖于温度(例如，pH值)来说，在25℃的温度确定所述值。
缩写“p.a.”用在本文意指“分析用”。
术语“纯(purum)”用在本文中优选意指具有以上指定值的纯度的化学化合物的商业级别。
当用在本文中时，ASTM-I是指通过包括反渗透和紫外(UV)氧化的纯化方法得到的水等级标准纯度。
制备校准标准液(Calibration Standards)
在5mL MeOH中溶解1.70mg溶血-Gb1(由Matreya配送)而制备溶血-Gb1储液。
随后制备溶液V1-A-534，其为12μL溶血-Gb1储液和5mLDMSO/MeOH(1:1;v/v)的混合物，如下文所示：
然后，通过将溶液V1-A-534或高度浓缩的校准标准液掺加到溶剂MeOH/水(1:1;v/v)而制备校准标准液。
详细的掺加方案如下文所示：
对于校准，使用具有0.400-100ng/mL之间的七个浓度水平的校准标准液，即，校准标准液Std3A-534,Std4A-534,Std5A-534,Std6A-534,Std7A-534,Std8A-534和Std9A-534。
制备对照样品
通过将溶液V1-A-534或高度浓缩的对照样品掺加到空白基质中而制备对照样品。
详细的掺加方案如下文所示：
空白基质
使用健康受试者的人血浆作为空白基质。本领域技术人员将理解，所述来自健康受试者的血浆包含天然水平的游离的溶血-Gb1。根据本发明的方法，所述游离的溶血-Gb1的天然水平为约1.4ng/ml。因此，清楚的是，除了用浓缩的溶液或高度浓缩的对照样品掺加得到的游离的溶血-Gb1水平之外，通过掺加空白基质(所述空白基质包含所述天然水平的游离的溶血-Gb1)制备的对照样品还包含所述天然水平的游离的溶血-Gb1。因此，对照样品中的游离的溶血-Gb1水平如下：
QC-A1-534 1ng/mL+空白基质中的天然浓度
QC-B1-534 5ng/mL+空白基质中的天然浓度
QC-C1-534 50ng/mL+空白基质中的天然浓度
本领域技术人员将认识到，用作空白基质的健康受试者的人血浆可以从本领域技术人员已知的任何商业来源购得。重要的是注意到，如果意外地将非健康受试者的血浆，即，将具有戈谢病的受试者的血浆用作空白基质，这将导致通过本发明所述的方法确定的对照样品中异常高的游离的溶血-Gb1的水平，并且因此将被立即认识到，因为所述方法的限差(tolerance)被确定为进行本发明所述的方法的对照的估测水平的上下15%的范围内。
研究样品
制备内标
在2mL DMSO/MeOH(1/1;vol/vol)中溶解1.00mg溶血-Gb2(由Matreya配送)制备内标(IS1)储液。
然后，将内标工作液制备成410μL IS1储液和500mL乙醇的混合物。乙醇可以购自任何商业来源，其中所述乙醇为具有适用于本文所述的方法的等级的无水乙醇。本领域技术人员将认识到，如果将100μL所述内标工作液添加到样品中，则包含在50μl样品中的蛋白必须要沉淀。
样品和溶液的储存
对照样品或研究样品立即一起保存在-20℃或者将等分试样转移到新的玻璃小瓶中，然后在相同条件下保存。
浓缩的溶液(储液，V1-A-534等)以及内标储液冷冻在-20℃以下，直到下一次掺加。
在使用之前内标工作液保存在2℃-8℃。
本发明人已经发现，在上述提及的溶液中，游离离离离-Gb1是稳定的。更精确地，如果在37℃储存2天之前或之后在样品中确定游离离离离-Gb1水平，则发现通过本发明所述的方法确定的戈谢病患者的血浆和/或血清样品的游离离离离-Gb1水平是相同的。因此，本发明的溶液和样品可以以本领域技术人员公知的多种方式运输，其中优选使用转运患者材料的冷链，但这不必是必需的。本领域技术人员还知晓用于溶液和样品的适当存储的方法以及各自的条件，其中，例如，所述溶液和样品可以储存数周。
分析用的样品制备
用于分析批次的所有样品按下述制备用于分析：
冷冻的样品在取自环境温度的水浴中在大约20-25℃解冻。解冻后，将样品混合。
将50μL样品转移到样品小瓶中。
向所述样品中添加100μL内标工作液(在EtOH中)。
然后，将这样获得的混合物用DVX-2500多管涡旋装置以2500rpm混合约30秒。
将这样得到的混合物以4000rpm离心2分钟以进行相分离。
将足够用于注射目的的体积(约100μL)上清液转移到适当的(锥形)自动取样仪小瓶中。
方法
色谱和自动取样仪参数
然后对如上所述制备的用于分析的样品进行下述方法：
用在此处的ACE3C8柱(ACE C8柱Nr.ACE-112-0502)购自AdvancedChromatography Technologies,Aberdeen。
本领域技术人员将理解，其中显示“±”范围的参数表示可以在序列(sequence)之间调整的参数。用在本文中时，序列优选是一批确定数目的样品，优选最多250，顺序分析的，其中包括流速和温度的参数保持不变。在序列之间进行的调整和校准为本领域技术人员所知，并且包括柱交换。
在指定界限内的这些调整是微小的变化，并且记录在测量站的原始研究数据中。
检测
然后，对这样制备的样品进行检测方法，其参数如下述所述：
本领域技术人员将认识到，使用质谱分析来检测来自受试者的样品中的游离的溶血-Gb1和/或确定游离的溶血-Gb1的水平的方法也可以利用允许特异性检测和/或定量在所述来自受试者的样品中的游离的溶血-Gb1的其他转变和碎片(fragments)。
结果评价和计算
为了评估和计算使用上述指定方法获得的结果，应用下述流程。
舍入方式
输入到色谱数据系统(CDS)中以及从其中重新获得的浓度数据被舍入至5个有效数字。在电子制表软件中进行进一步的计算至完全的计算准确性，并随后舍入到要报道的有效数字/小数位。因此，可能存在由于舍入引起的中间结果偏差。准确性和变异系数(CV)将分别以一个小数位和两个小数位报道。
关于舍入方式要注意：如果次一位的数字等于或大于“5”，则所报道的最后一位将进位。
回归和统计学
基于校准标准液，使用数据处理软件通过峰面积比(来自受试者的样品中包含的游离溶血-物质的峰面积/内标的峰面积)建立校准曲线拟合。使用内标方法评估游离的溶血-物质的浓度。将使用权重因数1/conc.的二次回归模型(y=ax2+bx+c)用来计算每个待评估批次中每个分析物的浓度。浓度通过下式计算：
基于此，使用程序“Lotus123”计算平均值、精度结果(关于CV)和准确性(下文所示的式)。
在例如下述文献中描述了适当的统计学模型。
Green,J.R.,Statistical Treatment of Experimental Data(实验数据的统计学处理)(Elsevier,New York,1977),第210页及其后
Lothar Sachs,Angewandte Statistik-Anwendung statistischer Methoden(Springer,Berlin,Heidelberg,New York,Tokyo1984)
软件
数据获取、数据处理、统计学和计算使用
软件1.4.2或更高版本(AB SCIEX,USA/Canada)以及Lotus1-2-397或更高版本(Lotus Corp,USA)进行。
手册
实施例2:研究参与者的遗传检测和分类
在患者同意参与本研究后，对患者进行遗传检测，以检测葡糖脑苷脂酶基因的突变。因此，按照Seeman等(Seeman等，1995)对5-10ml EDTA血液进行测序。除了葡糖脑苷脂酶基因之外，另外测序其他适当的基因，特别是在对照中。此外，对壳三糖苷酶基因测序，以检测上文提及的24bp的重复。利用年龄和性别匹配的对照患者的测试样品来控制所述遗传检测。
检测了253名受试者。
根据上述遗传检测的结果，将参与本研究的患者分成下述组：
1.)患有戈谢病的患者：诊断的黄金标准为检测到葡糖脑苷脂酶基因内的两个致病性突变，不管是纯合的还是复合杂合的(该组在附图中命名为“戈谢”)；
2.)作为葡糖脑苷脂酶基因内一个突变的杂合携带者的患者(典型地为受影响的患者的亲戚)(该组在附图中命名为“杂合体”)；
3.)作为对照的具有其他溶酶体贮积症的患者(该组在附图中命名为“其他LSD”)；这包括患有神经鞘磷脂酶缺乏(sphingomyelinasedeficiency)(尼曼-皮克病A/B)、克拉伯病和尼曼-皮克病C1的患者；所有诊断通过检测两种致病性突变得到证实。
4.)年龄和性别匹配的健康对照(该组在附图中命名为“对照”)。
下表1a显示将患者按照上述遗传检测的结果分类成上述各组。
表1a:通过遗传分析结果分类的受试者
232名德国患者的性别分布以及21名以色列患者的性别分布显示在表1b中。
表1b:按照性别分类的232名德国受试者和21名以色列人
下表1c显示232名德国患者的年龄分布以及基于上述遗传检测结果和所述患者的性别的对所述患者的分类。
表1c:253名受试者的患者特征
按照实施例1所述的方法确定所述253名受试者的样品中的游离的溶血-Gb1的水平。依赖于通过遗传分析的分类的来自所述患者的样品中的游离的溶血-Gb1的水平显示在图1A中。图1B显示依赖于基于遗传分析和患者性别分类的来自所述患者的样品中的游离的溶血-Gb1的水平。
根据上述遗传检测获得的结果分类为戈谢病患者的患者中的葡糖脑苷脂酶基因的突变类型和突变类型的分布显示在下表2中。
表2:在德国戈谢病群体中检测的突变分布(166个等位基因)
壳三糖苷酶活性测量
基本上如Hollak等(Hollak CE,van Weely S,van Oers MH,Aerts JM.Marked elevation of plasma chitotriosidase activity.A novel hallmark ofGaucher disease(血浆壳三糖苷酶活性的显著升高。一种新型的戈谢病标记).J Clin Invest.(临床研究杂志)1994年3月;93(3):1288-92)所述，通过在37℃用100μl作为底物的在McIlvain缓冲液(0.1M柠檬酸/0.2M磷酸钠,pH5.2)中的0.022mM荧光底物4-甲基伞形糖基-fl-D-NN,N'-三乙酰基壳三糖(4MU-壳三糖苷;Sigma Aldrich,ST.Louis,MO,USA)温育10μl的EDTA血浆来检测壳三糖苷酶活性。在戈谢病患者中，在温育之前，将样品在去矿物质化的水中稀释50倍(50x)。30分钟后，用200μl0.5M甘氨酸/NaOH缓冲液(pH10.5)通过在室温下混合而终止反应。壳三糖苷酶进行的底物水解产生荧光分子4-甲基伞形酮，使用荧光计(Tecan Group Ltd.,
Switzerland)在366nm激发和在446nm发射对其定量，并且与标准的4-甲基伞形酮校准曲线进行比较。壳三糖苷酶活性表示为每毫升温育的血清每小时被水解的底物的纳摩尔数。
CCL18的定量
血浆中的CCL18用购自R&D Systems,Minneapolis,MN,USA的DuoSet ELISA显色试剂盒(DuoSet ELISA Development kit)按照供应商的使用说明进行量化。该方法的灵敏性为5pg/ml。
实施例3:利用游离的溶血-Gb1作为生物标记诊断戈谢病
上述实施例1所述的方法用来产生来源于253名受试者的485份血液样品的HPLC-质谱色谱图。显示来自两名戈谢病患者和一名健康对照人的三份样品的游离的溶血-Gb1和IS的峰值强度的示例性HPLC-质谱色谱图显示在图5A、图5B和图5C中。
用于将患者分类成“戈谢”组的黄金标准是基于依据实施例2所述的遗传检测对葡糖脑苷脂酶基因的完整编码区域以及内含子-外显子-边界的测序，所述测序导致检测纯合突变或复合的杂合性。
确定来自患者的样品中的壳三糖苷酶或CCL18的水平的结果分别可在58或44名戈谢病患者中得到。所述结果如实施例2所述获得。
为了比较不同生物标记的诊断值，并且为了计算生物标记之间的相关性，首先通过使用治疗前戈谢病患者的每种标记的最早测量水平和对于特定患者的非戈谢病的最高水平(如果多于一份血液样品可用)来聚集通过上述方法获得的数据。
利用配对样品统计技术来比较两种生物标记。该方法利用AUC与Mann-Whitney U-统计学的数学等价性(Delong E.R.,Delong D.M.,Clarke-Pearson D.L.(1988)Comparing the areas under two or morecorrelated receiver operating characteristic curves:a nonparametricapproach(比较两个以上相关的接受者操作特征曲线下面积：一种非参数方法),Biometrics,44,837-45.)。
利用接受者操作特征(ROC)曲线分析(Metz C.E.(1978)Basicprinciples of ROC analysis(ROC分析的基本原理),Semin Nucl Med,8,283-98;Zweig M.H.,Campbell G.(1993)Receiver-operating characteristic(ROC)plots:a fundamental evaluation tool in clinical medicine(接受者操作特征(ROC)图：临床医药的基础评估工具),Clin Chem,39,561-77)，评估通过上述实施例1所述的方法获得的不同生物标记(游离的溶血-Gb1、壳三糖苷酶和CCL18)的水平的准确性从而区分患有戈谢病的患者和不患有戈谢病的患者。壳三糖苷酶活性和CCL18的测量按照本文实施例2所述进行。
使用PASW Statistics18,Release Version18.0.2(
SPSS,Inc.,2009,Chicago,IL,www.spss.com)来计算ROC曲线。ROC曲线和线性混合模型的比较使用用于Windows的SAS System的SAS软件，版本9.2进行(
2008SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)。
比较壳三糖苷酶和游离的溶血-Gb1的水平的准确性的ROC-曲线显示在图2A中，并且比较CCL18和游离的溶血-Gb1的水平的准确性的ROC-曲线分别显示在图2B中。
图2A和图2B中显示的ROC-曲线中所示的结果还显示本发明所述方法取决于游离的溶血-Gb1的不同临界水平的特异性和灵敏性。下表3相应地显示本发明所述的方法取决于游离的溶血-Gb1的不同临界水平的灵敏性和特异性。
表3:在德国受试者(n=232)中，取决于游离的溶血-Gb1的临界水平的诊断戈谢病的方法的灵敏性和特异性
因此，比较通过本发明所述的方法确定的来自受试者的样品中的生物标记水平和临界水平，优选地允许高特异性和高灵敏性的诊断的临界水平，因此允许诊断所述受试者中的戈谢病，其中与临界水平相比，在来自受试者的样品中生物标记水平升高指示所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中，并且其中与临界水平相比，在来自所述受试者的样品中较低的生物标记水平指示受试者不患有戈谢病或不处于发展戈谢病的危险中。
表4中报道了不同生物标记的曲线下面积(AUC)和95%的置信区间。
表4：不同生物标记关于诊断戈谢病的灵敏性和特异性。
因此，在表3中，使用在使用各种生物标记的各种方法中具有最高AUC的临界水平来比较在来自受试者的样品中诊断戈谢病的方法中所用的所示生物标记的灵敏性和特异性。所示的为各种方法的理想的临界水平。如本文实施例2所述进行对壳三糖苷酶活性和CCL18的测量。按照本发明的方法确定游离的溶血-Gb1。理想的临界水平为5ng/ml。
本领域技术人员将认识到，使用游离的溶血-Gb1作为诊断戈谢病的生物标记的本发明的方法明显地优于使用CCL18或壳三糖苷酶的方法。由于至少6%的高加索人群体和多至例如35%的拉美人群体(包括患有戈谢病的那些群体)缺乏壳三糖苷酶活性的，因此这是特别真实的。
因此，高于5.0ng/mL的按照本申请的方法在来自受试者的样品中确定的游离的溶血-Gb1的水平允许以100%的灵敏性和特异性诊断所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中。
实施例4:分析生物标记随时间的变化
联系本实施例所用的方法和患者是实施例1-3中所述的那些方法和患者。
为了分析在患有戈谢病的患者中生物标记的水平怎样随时间变化，对这些患者进行非聚集数据分析，所述患者分析了多于一份血液样品。时间点零设置为治疗下对每名患者的第一次测量。
个体患者的随时间变化的游离的溶血-Gb1水平显示在图3A、图3B和3C中。
为了检测指示成功治疗的游离的溶血-Gb1水平的时间依赖性减少的显著性，将疗法开始后的游离的溶血-Gb1水平与疗法开始之前的游离的溶血-Gb1水平用线性混合模型进行比较。未治疗的患者没有表现出游离的溶血-Gb1的随时间的显著减少。
因此，将游离的溶血-Gb1水平的值对数化，以克服值分布的偏度。为了说明在起始值以及在变化率方面患者之间的不均匀性，使用随机截取和斜率模型。在所有模型中，所观察到的不均匀性是统计学显著的。仅报道了线性时间减少的p-值。
集中时间的值和结合了时间的平方项(squared term)的那些值来检测壳三糖苷酶和CCL18的时间与标记水平之间的曲线性关系。对于游离的溶血-Gb1，平方项不改善模型，并且不结合在最终模型中。
作为治疗，德国患者平均用40U/kg体重治疗，其中单位是指ERT中重组葡糖脑苷脂酶的单位。治疗开始后，游离的溶血-Gb1的减少特别强(6个月后<0.0001)。但是随时间的减少也是显著的(<0.0001)。在治疗12个月后，游离的溶血-Gb1的减少在60%的范围内。
本说明书、权利要求书、序列表和/或附图公开的本发明的特征可以独立地或以其任意组合作为其多种形式实现本发明的材料。
Claims (16)
1.用于诊断受试者中的戈谢病的体外方法，所述方法包括下述步骤：
a)在来自所述受试者的样品中检测生物标记，其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中游离的溶血-Gb1是如在所述受试者中存在的溶血-Gb1而不是由于处理来自所述受试者的样品产生的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，所述方法还包括下述步骤：
b)确定在所述样品中存在的所述生物标记的水平。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物标记的水平指示所述受试者是否患有戈谢病或指示所述受试者是否处于发展戈谢病的危险中。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种另外的生物标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种另外的生物标记选自由壳三糖苷酶和CCL18组成的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述生物标记和/或所述至少一种另外的生物标记通过免疫测定、质谱分析、生物芯片阵列、功能性核酸和/或游离的溶血-Gb1的荧光衍生物检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物标记通过质谱分析检测。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括将所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平与临界水平比较。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，如果所述生物标记在来自所述受试者的样品中的水平高于所述临界水平，则这指示所述受试者患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述临界水平为5.0ng/ml，并且其中所述样品为血清样品或血浆样品。
12.用于确定受试者中的戈谢病病程的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在若干个时间点确定在来自所述受试者的样品中存在的生物标记的水平，其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
13.确定施用于被肯定地检测为患有戈谢病或处于发展戈谢病的危险中的受试者的至少一种治疗的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在若干个时间点确定在来自所述受试者的样品中存在的生物标记的水平，
其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
14.确定用于治疗戈谢病的化合物的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)确定生物标记在患有戈谢病的受试者中的水平；
b)给所述受试者施用所述化合物；
c)再次确定所述生物标记在所述受试者中的水平；
d)确定在步骤a)中确定的所述生物标记的水平是否低于在步骤c)中确定的所述生物标记的水平。
其中，如果在步骤c)中确定的所述生物标记的水平低于在步骤a)中确定的所述生物标记的水平，则这指示所述化合物的有效性，并且其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
15.质谱法在检测生物标记中的用途，其中所述生物标记为游离的溶血-Gb1。
16.用于确定生物标记在来自受试者的样品中的存在的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
a)所述生物标记的相互作用配偶体；
b)任选地固体载体，所述固体载体包含至少一种与其连接的捕获剂，其中所述捕获剂结合所述生物标记；和
c)对于使用所述试剂盒检测所述生物标记的使用说明，
其中所述生物标记是游离的溶血-Gb1。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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