BR112013031431B1

BR112013031431B1 - Métodos in vitro para o diagnóstico da doença de gaucher e para determinar a eficácia de um composto para o tratamento de doença de gaucher

Info

Publication number: BR112013031431B1
Application number: BR112013031431-1A
Authority: BR
Inventors: Hermann Mascher; Arndt Rolfs
Original assignee: Centogene Gmbh
Priority date: 2011-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2023-02-07
Also published as: EP2718725B1; DK2718725T3; ES2820361T3; JP6514256B2; US20180259538A1; JP2017161528A; IL260078B; EP2718725A1; PL2718725T3; RU2666952C2; EP3742168A1; EP3318881B1; DK3318881T3; IL229607B; CN103582818A; PT2718725T; US20220011321A1; AU2017232226B2; CA2837609C; US11092609B2

Abstract

MÉTODOS IN VITRO PARA O DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE GAUCHER, USO DE ESPECTROMETRIA DE MASSA E KIT. A presente invenção refere-se a um método de diagnóstico in vitro da doença de Gaucher em um paciente incluindo uma etapa de a) detectar um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-Gb1 livre. A presente invenção também se refere a um método para determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente, a um método para determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente testado positivamente como sofrendo de ou estando em risco de desenvolver a doença de Gaucher, e a um método para determinar a eficácia de um composto para o tratamento de doença de Gaucher. A invenção fornece, ainda, o uso de espectrometria de massa para a detecção de um marcador biológico, e um kit para determinar a presença de um marcador biológico em uma amostra de um paciente.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método para diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente, um método para determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente, um método para determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente testado positivamente como sofrendo de ou estando em risco de desenvolver a doença de Gaucher, um método de determinar a eficácia de um composto para o tratamento da doença de Gaucher, uso de espectrometria de massa para a detecção de um marcador biológico, uso de um marcador biológico para a doença de Gaucher, um kit para determinar a presença de um marcador biológico em uma amostra de um paciente e um produto de software, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

Antecedentes da invenção

[002] Doenças lisossômicas de acumulação, também aqui referidas como distúrbios lisossômicos de acumulação ou LSDs, são um grupo de distúrbios metabólicos hereditários raros que resultam de defeitos na função lisossômica. LSDs resultam quando uma organela específica das células do corpo - o lisossomo - funciona mal. Algumas das doenças lisossômicas de acumulação mais importantes são a doença de Gaucher e doença de Fabry.

[003] LSDs são causados por disfunção lisossômica, usualmente em consequência de deficiência de uma única enzima necessária para o metabolismo de lipídeos, glicoproteínas ou os assim chamados mucopolissacarídeos. Individualmente, LSDs ocorrem com frequências de cerca de 1:10,000 a 1:250 000; entretanto, como um grupo a incidência é de cerca de 1 :5,000. A maior parte destes distúrbios é autossômica recessivamente hereditária; entretanto alguns poucos são hereditários ligados ao cromossomo X, como doença de Fabry e síndrome de Hunter (MPS II).

[004] Como outras doenças genéticas, indivíduos tipicamente herdam as doenças lisossômicas de acumulação de seus pais. Embora cada distúrbio resulte de mutações de genes diferentes que se traduzem em uma deficiência na atividade enzimática, eles compartilham uma característica bioquímica comum - quase todos os distúrbios lisossômicos se original de uma acumulação anormal de substâncias no interior do lisossomo.

[005] Doenças lisossômicas de acumulação afetam principal mente crianças que frequentemente morrem em uma idade precoce imprevisível, muitas com poucos meses ou anos. Muitas outras crianças morrem desta doença após anos sofrendo de vários sintomas de seu distúrbio particular.

[006] Os sintomas de doença lisossômica de acumulação variam, dependendo do distúrbio particular e de outras variáveis como idade de início, e podem ser brandos a severos. Podem incluir atraso de desenvolvimento, distúrbios de movimento, ataques, demência, surdez e/ou cegueira. Algumas pessoas como doença lisossômica de acumulação possuem fígados aumentados (hepatomegalia) e baços aumentados (esplenomegalia), problemas pulmonares e cardíacos, e ossos que se desenvolvem anormalmente.

[007] Não existem curas causais para doenças lisossômicas de acumulação e o tratamento é principalmente sintomático, embora transplante de medula e terapia de reposição de enzima (enzyme replacement therapy (ERT)) têm sido usados para algumas indicações com sucesso. Além disso, transplante de sangue do cordão umbilical está sendo realizado em centros especializados para várias destas doenças. Além disso, terapia de redução de substrato (substrate reduction therapy (SRT)), um método usado para reduzir a acumulação de material de estocagem, está sendo agora avaliada para algumas destas doenças. Além do mais, terapia com chaperonas, uma técnica usada para estabilizar as enzimas defeituosas produzidas por pacientes, está sendo examinada para alguns destes distúrbios. Terapia genética constitui outra opção para o tratamento destas doenças.

[008] Até agora, um diagnóstico definitivo da doença de Gaucher pode somente ser feito aplicando teste bioquímico que mede diretamente a insuficiência da enzima beta-glicosidase juntamente com a confirmação genética. Como numerosas mutações diferentes podem ser a causa de uma doença lisossômica de acumulação particular o sequenciamento do gene da beta-glicosidase inteiro é aplicado na doença de Gaucher para confirmar o diagnóstico.

[009] Embora haja tentativas de aplicar métodos de diagnostic baseados em anormalidades bioquímicas associadas como altos níveis de fosfatase alcalina, enzima conversora de angiotensina (ACE) e imunoglobulina, ou, no caso da doença de Gaucher, por análise celular mostrando citoplasma com aspecto de papel enrugado e macrófagos carregados de glicolipídeo, existe uma necessidade não atendida de um teste bioquímico simples que apresente detecção altamente específica e altamente sensível da referida doença lisossômica de acumulação em um estágio precoce, com monitoração da progressão da doença e monitoração precoce da eficácia de terapias aplicadas.

[0010] Assim, a identificação de marcadores biológicos para detecção precoce e diagnóstico da doença de Gaucher é uma grande promessa de melhoria da evolução clínica de pacientes. É especialmente importante para pacientes com sintomas vagos ou sem sintomas ou para detectar pacientes que não respondem a uma terapia.

[0011] Um marcador biológico deve ser tecnicamente viável em muitas mãos, fácil de medir; útil, com uma magnitude relativa consistente entre experimentos/pacientes e controles, ou tratados e não tratados; confiável, preciso, e clinicamente acurado, e classificável como fortemente preditivo ou prognóstico.

[0012] Na doença de Gaucher verificou-se que algumas enzimas lisossômicas, usadas como marcadores biológicos indiretos, são elevadas, incluindo fosfatase ácida resistente a tartarato, hexosaminidase, e uma quitinase humana, quitotriosidase. Assim, existem tentativas de monitorar a redução do acúmulo de células em tecidos pela medição desses marcadores substitutos de células de Gaucher como quitotriosidase e CCL18 (C.E. Hollak et al. 1994, Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease, J. Clin. Invest. 93: 1288-1292; R.G. Boot et al. 2004, Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucher disease: a novel surrogate marker for assessing therapeutic intervention, Blood 103: 33-39). Entretanto, além de outras desvantagens no uso de quitotriosidase como um marcador biológico para doença de Gaucher, a referida enzima se acumula independente de uma ligação direta com a patologia da doença de Gaucher. Além disso, até 35 % de etnicidades dadas mostram um defeito do gene que codifica quitotriosidase resultando em uma atividade de quitotriosidase artificialmente reduzida ou não mensurável.

[0013] O uso de moléculas de armazenamento primário como marcador biológico foi avaliado para glicosil ceramida (Gb1) em plasma de pacientes com doença de Gaucher e comparado com o nível de Gb1 em indivíduos saudáveis (Groener et al. 2008, Plasma glucosylceramide and ceramide in type 1 Gaucher disease patients: correlations with disease severity and response to therapeutic intervention, Biochim Biophys Acta. Jan-Feb;1781(l-2):72-8. Epub 2007 Dec 5). Apesar disso, embora Gb1 medido no referido estudo estivesse aumentado no plasma dos referidos pacientes, o referido aumento de Gb1 não era proeminente e assim a especificidade e a sensibilidade do método foram baixas mostrando que Gb1 não é aplicável como marcador biológico para doença de Gaucher.

[0014] Já em 1989 Rosengren et al. (Rosengren B, Fredman P, Mansson JE, Svennerholm L. 1989, Lysosulfatide (galactosylsphingosine- 3-O-sulfate) from metachromatic leukodystrophy and normal human brain; J Neurochem. 1989 Apr;52(4): 1035-41) mostrou que em lipidoses não só o catabolismo do esfingolipídeo mais importante mas também seu liso- composto é afetado. Mesmo assim, o referido estudo concluiu que os liso- compostos não desempenham um papel chave nos mecanismos patogênicos das esfingolipidoses. Assim, os referidos liso-compostos podem não ser marcadores biológicos adequados para o diagnóstico de esfingolipidoses como a doença de Gaucher.

[0015] É importante notar que até hoje nenhum uso de marcador biológico altamente específico e altamente sensível e nenhum método para o diagnóstico de doença de Gaucher se encontram disponíveis além dos métodos descritos acima, que apresentam um limite de detecção, sensibilidade e/ou especificidade insatisfatórios e assim provaram ser inadequados para aplicação clínica.

[0016] Assim, existe a necessidade de um método rápido, simples e mais importantemente confiável para o diagnóstico da doença de Gaucher.

[0017] À luz do exposto acima, o problema subjacente a presente invenção é prover um método para o diagnóstico da doença de Gaucher.

[0018] Outro problema subjacente à presente invenção é prover um método para determinar o urso e prognóstico da doença de Gaucher.

[0019] Ainda outro problema subjacente a presente invenção é prover um método para determinar bastante rapidamente a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente positivamente testado quanto a estar sofrendo ou estar em risco de desenvolver a doença de Gaucher. Outro problema subjacente à presente invenção é prover um método para determinar a eficácia de um composto para o tratamento da doença de Gaucher.

[0020] Outro problema subjacente a presente invenção é prover um marcador biológico que permita o diagnóstico específico e sensível da doença de Gaucher. Ainda outro problema subjacente a presente invenção é um kit que inclui um composto que interage com um marcador biológico que é específico e sensível para a doença de Gaucher.

[0021] Estes e outros problemas são resolvidos pelo objeto das reivindicações independentes anexas. Modalidades preferidas podem ser retiradas das reivindicações dependentes.

[0022] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um primeiro aspecto que é também a primeira modalidade do primeiro aspecto, por um método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente consistindo de uma etapa de a) de detectar um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[0023] Em uma segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de b) determinar o nível do marcador biológico presente na amostra.

[0024] Em uma terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira e da segunda modalidade do primeiro aspecto, o nível do marcador biológico é indicativo de se o paciente está sofrendo de ou se o paciente está em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0025] Em uma quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade do primeiro aspecto, a amostra do paciente é uma amostra de um paciente que foi anteriormente tratado ou diagnosticado para doença de Gaucher.

[0026] Em uma quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade do primeiro aspecto, a amostra do paciente é uma amostra de um paciente que não foi anteriormente tratado ou um paciente que não foi anteriormente diagnosticado para doença de Gaucher.

[0027] Em uma sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta e da quinta modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de c) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia com base no diagnóstico de se o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0028] Em uma sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta e da sexta modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de d) detectar o marcador biológico em uma amostra do paciente após aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia em uma etapa de c).

[0029] Em uma oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta e da sétima modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de e) determinar o nível do marcador biológico em uma amostra do paciente após aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia em uma etapa de c).

[0030] Em uma nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da oitava modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente a etapa de f) determinar se o nível do marcador biológico determinado na etapa b) é mais baixo do que o nível do marcador biológico determinado na etapa e).

[0031] Em uma décima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da nona modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente a etapa de g) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia baseada na etapa de f).

[0032] Em uma décima primeira modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona e da décima modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente detectar pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0033] Em uma décima segunda modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente determinar o nível do pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0034] Em uma décima terceira modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da décima primeira e da décima segunda modalidade do primeiro aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é selecionado no grupo que inclui quitotriosidase e CCL18.

[0035] Em uma décima quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima terceira modalidade do primeiro aspecto, pelo menos um a marcador biológico adicional é quitotriosidase.

[0036] Em uma décima quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima terceira modalidade do primeiro aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é CCL18.

[0037] Em uma décima sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta e da décima quinta modalidade do primeiro aspecto, o método inclui ainda detectar quitotriosidase e CCL18.

[0038] Em uma décima sétima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta e da décima sexta modalidade do primeiro aspecto, o marcador biológico e/ou pelo menos um marcador biológico adicional é detectado por meio de imunoensaio, análise por espectrometria de massa, arranjo de biochip, ácidos nucleicos funcionais e/ou um derivado fluorescente de liso-GB1 livre.

[0039] Em uma décima oitava modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima sétima modalidade do primeiro aspecto, o marcador biológico é detectado por meio de análise espectrométrica de massa.

[0040] Em uma décima nona modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima oitava modalidade do primeiro aspecto, análise espectrométrica de massa é selecionada no grupo que consiste de SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF e ESI-O- TOF.

[0041] Em uma vigésima modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima nona modalidade do primeiro aspecto, a análise espectrométrica de massa utiliza MS/MS.

[0042] Em uma vigésima primeira modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima modalidade do primeiro aspecto, o método inclui adicionalmente precipitação de proteína e/ou HPLC.

[0043] Em uma vigésima segunda modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima e da vigésima primeira modalidade do primeiro aspecto, o método inclui ainda precipitação de proteína, HPLC e MS/MS.

[0044] Em uma vigésima terceira modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira e da vigésima segunda modalidade do primeiro aspecto, o paciente é um humano.

[0045] Em uma vigésima quarta modalidade do primeiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira, da vigésima segunda e da vigésima terceira modalidade do primeiro aspecto, a etapa de detectar o marcador biológico em uma amostra inclui submeter a amostra a uma etapa de precipitação de proteína, precipitando proteína da amostra, em que a precipitação da proteína da amostra provê um sobrenadante da amostra, submeter o sobrenadante da amostra a HPLC e MS/MS e determinar o montante do marcador biológico e/ou do pelo menos um marcador biológico adicional que está/estão presente(s) no sobrenadante da amostra.

[0046] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um segundo aspecto que é também a primeira modalidade do segundo aspecto, por um método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente incluindo i) adicionar um padrão interno a uma amostra do paciente, em que a amostra do paciente é selecionada no grupo que consiste de plasma, soro e sangue; ii) opcionalmente misturar a amostra contendo o padrão interno; iii) submeter a amostra a uma etapa de precipitação de proteína, pela qual proteína da amostra é precipitada e um sobrenadante da amostra é fornecido; iv) opcionalmente submeter o sobrenadante da amostra a uma primeira etapa de separação que provê um sobrenadante, em que preferivelmente a primeira etapa de separação é uma etapa de centrifugação; v) submeter o sobrenadante da etapa c) ou da etapa d), ou uma parte do mesmo, a uma segunda etapa de separação, em que a segunda etapa de separação consiste em injetar uma parte do sobrenadante em um sistema HPLC-MS/MS e usar uma coluna HPLC com um gradiente de água ácida a acetonitrila/acetona; em que a coluna de HPLC é preferivelmente uma coluna de HPLC selecionada no grupo que inclui coluna de HPLC C8 e C18, e em que a segunda etapa de separação provê uma amostra separada; vi) submeter a amostra separada a MS/MS, em que MS/MS inclui ionização por eletrospray e monitoração de reação múltipla (Multiple Reacting Monitoring); em que o método é preferivelmente um método de acordo com qualquer uma das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda, vigésima terceira e vigésima- quarta modalidade do primeiro aspecto; e inclui adicionalmente uma etapa de a) detectar um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre; e opcionalmente uma etapa b) determinar o nível do marcador biológico presente na amostra.

[0047] Em uma segunda modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do segundo aspecto, o padrão interno inclui D5-propionato de fluticasona e/ou liso-Gb2.

[0048] Em uma terceira modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira e da segunda modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira, da vigésima segunda, da vigésima terceira e da vigésima quarta modalidade do primeiro aspecto, a etapa b) e/ou a etapa e) inclui(em) adicionalmente que o nível do marcador biológico na amostra do paciente seja comparado a um nível de corte.

[0049] Em uma quarta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira, da vigésima segunda, da vigésima terceira e da vigésima quarta modalidade do primeiro aspecto, preferivelmente da terceira modalidade do segundo aspecto, um nível do marcador biológico na amostra do paciente que seja superior ao nível de corte é indicativo de que o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0050] Em uma quinta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da quarta modalidade do segundo aspecto, um nível do marcador biológico na amostra do paciente que seja menor que o nível de corte é indicativo de que o paciente não está sofrendo de ou não está em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0051] Em uma sexta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta e da quinta modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima-segunda, da vigésima-terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, o nível de corte é selecionado de tal forma que a sensibilidade para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente fica preferivelmente entre cerca de 98,5% e 100%, mais preferivelmente 100% e que uma especificidade para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente é preferivelmente de 99,4% a 100%, mais preferivelmente 100%.

[0052] Em uma sétima modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta e da sexta modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima- segunda, da vigésima- terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, a etapa b) e/ou a etapa e) inclui adicionalmente que o nível do marcador biológico no referido paciente seja comparado a um nível do marcador biológico detectado em uma amostra de um controle.

[0053] Em uma oitava modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da sétima modalidade do segundo aspecto, o controle é uma amostra de um paciente positivamente testado como não tendo doença de Gaucher.

[0054] Em uma nona modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima- segunda, da vigésima-terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, um nível do marcador biológico na amostra do paciente que seja superior a um nível do marcador biológico na amostra de controle é indicativo de que o paciente está sofrendo de e/ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0055] Em uma décima modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava e da nona modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima- segunda, da vigésima-terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[0056] Em uma décima primeira modalidade do segundo aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona e da décima modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima-segunda, da vigésima-terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, preferivelmente da décima modalidade do segundo aspecto, a amostra do indivíduo é selecionada no grupo que consiste de sangue, um produto sanguíneo, urina, saliva, fluido cerebroespinhal, fezes, amostra de tecido e linfa.

[0057] Em uma décima segunda modalidade do segundo aspect que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do segundo aspecto, a amostra do indivíduo é selecionada no grupo que consiste de sangue e um produto sanguíneo.

[0058] Em uma décima terceira modalidade do segundo aspect que é também uma modalidade da décima primeira e da décima segunda modalidade do segundo aspecto, o produto sanguíneo é selecionado no grupo que inclui soro e plasma.

[0059] Em uma décima quarta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda e da décima terceira modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira, da vigésima-segunda, da vigésima-terceira e da vigésima-quarta modalidade do primeiro aspecto, preferivelmente da décima terceira modalidade do segundo aspecto, o método tem um limite de detecção de 0,2 ng/mL.

[0060] Em uma décima quinta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira e da décima quarta modalidade do segundo aspecto e da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima- primeira, da vigésima-segunda, da vigésima-terceira e da vigésima- quarta modalidade do primeiro aspecto, preferivelmente de qualquer uma das décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta e décima quinta modalidades do segundo aspecto, o nível de corte é 5,0 ng /mL.

[0061] Em uma décima sexta modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima primeira e da décima segunda modalidade do segundo aspecto, o sangue é sangue integral.

[0062] Em uma décima sétima modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima sétima modalidade do segundo aspecto, o sangue integral é coletado em um cartão filtrante de sangue seco.

[0063] Em uma décima oitava modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima sétima e da décima oitava modalidade do segundo aspecto, o método tem um limite de detecção de 0,2 ng/mL.

[0064] Em uma décima nona modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da décima sétima, da décima oitava e da décima nona modalidade do segundo aspecto, o nível de corte é 20,0 ng/mL.

[0065] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto que é também a primeira modalidade do terceiro aspecto, por um método para determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente incluindo a etapa de a) determinar em vários pontos no tempo um nível de um marcador biológico presente em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre

[0066] Em uma segunda modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do terceiro aspecto, o paciente foi anteriormente tratado ou diagnosticado para doença de Gaucher.

[0067] Em uma terceira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do terceiro aspecto, o paciente não foi anteriormente tratado ou o paciente não foi anteriormente diagnosticado para doença de Gaucher.

[0068] Em uma quarta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de b) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia baseada no diagnóstico de o paciente estar sofrendo e ou estar em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[0069] Em uma quinta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira e da quarta modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de c) detectar o marcador biológico em uma amostra do paciente após aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia em uma etapa de b).

[0070] Em uma sexta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade de da primeira, da segunda, da terceira, da quarta e da quinta modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de d) determinar um nível do marcador biológico na amostra do paciente após aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia em uma etapa de b).

[0071] Em uma sétima modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta e da sexta modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente as etapas de e) determinar se o nível do marcador biológico determinado na etapa a) é inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa d);

[0072] Em uma oitava modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da sétima modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente a etapa de f) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar uma terapia baseada na etapa de e).

[0073] Em uma nona modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente detectar pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0074] Em uma décima modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da nona modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente determinar o nível do pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0075] Em uma décima primeira modalidade do terceiro aspect que é também uma modalidade da nona e da décima modalidade do terceiro aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é selecionado no grupo que consiste de quitotriosidase e CCL18.

[0076] Em uma décima segunda modalidade do terceiro aspect que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do terceiro aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é quitotriosidase.

[0077] Em uma décima terceira modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do terceiro aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é CCL18.

[0078] Em uma décima quarta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda e da décima terceira modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente detector quitotriosidase e CCL18.

[0079] Em uma décima quinta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira e da décima quarta modalidade do terceiro aspecto, o marcador biológico e/ou pelo menos um marcador biológico adicional é detectado por meio de imunoensaio, análise espectrométrica de massa, arranjo de biochip, ácidos nucleicos funcionais e/ou um derivado fluorescente de liso-GB1 livre.

[0080] Em uma décima sexta modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima quinta modalidade do terceiro aspecto, o marcador biológico é detectado por meio de análise espectrométrica de massa.

[0081] Em uma décima sétima modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do terceiro aspecto, análise espectrométrica de massa é selecionada no grupo que consiste de SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF e ESI-O- TOF.

[0082] Em uma décima oitava modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da décima sétima modalidade do terceiro aspecto, a análise espectrométrica de massa utiliza MS/MS.

[0083] Em uma décima nona modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima e da décima oitava modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente precipitação de proteína e/ou HPLC.

[0084] Em uma vigésima modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava e da décima nona modalidade do terceiro aspecto, o método inclui adicionalmente precipitação de proteína, HPLC e MS/MS.

[0085] Em uma vigésima primeira modalidade do terceiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima e da vigésima primeira modalidade do terceiro aspecto, o paciente é um humano.

[0086] Em uma vigésima segunda modalidade do terceiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira e da vigésima segunda modalidade do terceiro aspecto, a etapa de detectar o marcador biológico na amostra do paciente inclui precipitar proteína de uma amostra do paciente, em que a precipitação de proteína de uma amostra provê um sobrenadante da amostra; submeter um volume do sobrenadante a HPLC e MS/MS e determinar o montante do marcador biológico e/ou do pelo menos um marcador biológico adicional que está/estão presente(s) na amostra do paciente.

[0087] Em uma vigésima terceira modalidade do terceiro aspect que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima primeira, da vigésima segunda e da vigésima terceira modalidade do terceiro aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[0088] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um quarto aspecto que é também a primeira modalidade do quarto aspecto, por um método para determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente positivamente testado quanto a estar sofrendo de ou estar em risco de desenvolver a doença de Gaucher incluindo a etapa de g) determinar em vários pontos no tempo um nível de um marcador biológico presente em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[0089] Em uma segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quarto aspecto, o paciente foi anteriormente tratado ou diagnosticado para doença de Gaucher.

[0090] Em uma terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quarto aspecto, o paciente não foi anteriormente tratado ou o paciente não foi anteriormente diagnosticado para doença de Gaucher.

[0091] Em uma quarta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda e da terceira modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de h) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar pelo menos um tratamento aplicado ao paciente baseado na redução do nível do marcador biológico.

[0092] Em uma quinta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira e da quarta modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente uma etapa de i) detectar o marcador biológico na amostra do paciente, em que a amostra foi retirada antes do início do tratamento após aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar pelo menos um tratamento em uma etapa de b).

[0093] Em uma sexta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta e da quinta modalidade do quarto aspecto, o tratamento é selecionado no grupo que inclui terapia de substituição de enzima, terapia de redução de substrato, terapia com chaperona, terapia genética, transplante de célula tronco de saltos de DNA/RNA (DNA/RNA skipping).

[0094] Em uma sétima modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta e da sexta modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente as etapas de j) determinar se o nível do marcador biológico determinado na etapa a) é inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa c).

[0095] Em uma oitava modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da sétima modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente as etapas de k) aplicar, manter, reduzir, elevar ou não aplicar pelo menos um tratamento aplicado ao paciente com base na etapa d).

[0096] Em uma nona modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente detectar pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0097] Em uma décima modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da nona modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente determinar o nível do pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente.

[0098] Em uma décima primeira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da nona e da décima modalidade do quarto aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é selecionado no grupo que consiste de quitotriosidase e CCL18.

[0099] Em uma décima segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do quarto aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é quitotriosidase.

[00100] Em uma décima terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima primeira modalidade do quarto aspecto, pelo menos um marcador biológico adicional é CCL18.

[00101] Em uma décima quarta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda e da décima terceira modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente detectar quitotriosidase e CCL18.

[00102] Em uma décima quinta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira e da décima quarta modalidade do quarto aspecto, qualquer/o marcador biológico é detectado por meio de imunoensaio, análise espectrométrica de massa, arranjo de biochip, ácidos nucleicos funcionais e/ou um derivado fluorescente de liso-GB1 livre.

[00103] Em uma décima sexta modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima quinta modalidade do quarto aspecto, o marcador biológico é detectado por meio de análise espectrométrica de massa.

[00104] Em uma décima sétima modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima sexta modalidade do quarto aspecto, análise espectrométrica de massa é selecionada no grupo que consiste de SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF e ESI-O- TOF.

[00105] Em uma décima oitava modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da décima sétima modalidade do quarto aspecto, a análise espectrométrica de massa usa MS/MS.

[00106] Em uma décima nona modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima e da décima oitava modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente precipitação de proteína e/ou HPLC.

[00107] Em uma vigésima modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava e da décima nona modalidade do quarto aspecto, o método inclui adicionalmente precipitação de proteína, HPLC e MS/MS.

[00108] Em uma vigésima-primeira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima modalidade do quarto aspecto, o paciente é um humano.

[00109] Em uma vigésima-segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima e da vigésima-primeira modalidade do quarto aspecto, a etapa de detectar o marcador biológico na amostra do paciente inclui precipitar proteína da amostra do paciente, em que a precipitação de proteína da amostra provê um sobrenadante da amostra; submeter um volume do sobrenadante a HPLC e MS/MS e determinar o montante do marcador biológico e/ou pelo menos um marcador biológico adicional que está/estão presente(s) na amostra do paciente.

[00110] Em uma vigésima-terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona, da vigésima, da vigésima-primeira e da vigésima- segunda modalidade do quarto aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[00111] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um quinto aspecto que é também a primeira modalidade do quinto aspecto, por um método de determinação da eficácia de um composto para o tratamento de doença de Gaucher incluindo as etapas de: a) determinar um nível de um marcador biológico em um paciente tendo doença de Gaucher; b) administrar ao referido paciente o referido composto; c) determinar novamente o nível do marcador biológico no referido paciente; d) determinar se o nível do marcador biológico determinado na etapa a) é inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa c), sendo que um nível do marcador biológico determinado na etapa c) inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa a) indica a eficácia do referido composto, e em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[00112] Em uma segunda modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quinto aspecto, o método inclui adicionalmente determinar um nível do marcador biológico em um controle.

[00113] Em uma terceira modalidade do quinto aspecto que é também uma modalidade da primeira e da segunda modalidade do quinto aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[00114] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um sexto aspecto que é também a primeira modalidade do sexto aspecto, pelo uso de espectrometria de massa para a detecção de um marcador biológico, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[00115] Em uma segunda modalidade do sexto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do sexto aspecto, a detecção inclui o uso de HPLC.

[00116] Em uma terceira modalidade do sexto aspecto que é também uma modalidade da primeira e da segunda modalidade do sexto aspecto, a detecção inclui MS/MS.

[00117] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um sétimo aspecto que é também a primeira modalidade do sétimo aspecto, pelo uso de um marcador biológico para doença de Gaucher, preferivelmente em um método de acordo com qualquer uma das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima-primeira, vigésima-segunda, vigésima- terceira e vigésima- quarta modalidades do primeiro aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava e décima nona modalidades do segundo aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima-primeira, vigésima-segunda e vigésima-terceira modalidades do terceiro aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima- primeira, vigésima-segunda e vigésima-terceira modalidades do quarto aspecto e das primeira, segunda e terceira modalidades do quinto aspecto, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[00118] Em uma segunda modalidade do sétimo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do sétimo aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[00119] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um oitavo aspecto que é também a primeira modalidade do oitavo aspecto, por um kit para determinação da presença de um marcador biológico em uma amostra de um paciente, em que o kit inclui a) um parceiro de interação do marcador biológico; b) opcionalmente um suporte sólido incluindo pelo menos um reagente de captura fixado ao mesmo, em que o reagente de captura se liga ao marcador biológico; e c) instruções para utilização do suporte sólido para detectar o marcador biológico, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre.

[00120] Em uma segunda modalidade do oitavo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do oitavo aspecto, o kit é para a) diagnosticar a doença de Gaucher; b) determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente; e/ou c) determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente,

[00121] em que a método aplicado em a), b) e/ou c) é preferivelmente um método de acordo com qualquer uma das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima-primeira, vigésima segunda, vigésima-terceira e vigésima quarta modalidades do primeiro aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava e décima nona modalidades do segundo aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda e vigésima terceira modalidades do terceiro aspecto, das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, décima terceira, décima quarta, décima quinta, décima sexta, décima sétima, décima oitava, décima nona, vigésima, vigésima primeira, vigésima segunda e vigésima terceira modalidades do quarto aspecto e das primeira, segunda e terceira modalidades do quinto aspecto.

[00122] Em uma terceira modalidade do oitavo aspecto que é também uma modalidade da primeira e da segunda modalidade do oitavo aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[00123] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um nono aspecto que é também a primeira modalidade do nono aspecto, por um produto de software contendo a) código que acessa dados atribuídos a uma amostra, os dados incluindo detecção de pelo menos um marcador biológico na amostra, o marcador biológico sendo selecionado no grupo que inclui liso-GB1 livre, quitotriosidase e CCL18; e b) código que executa um algoritmo de classificação que classifica o estado da doença de Gaucher de uma amostra em função da detecção.

[00124] Em uma segunda modalidade do nono aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do nono aspecto, a doença de Gaucher é selecionada no grupo que inclui o tipo I, não neuropático, o tipo II, neuropático crônico e o tipo III, neuropático agudo.

[00125] Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que liso-GB1 livre constitui um marcador biológico que proporciona um método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente, mais especificamente diagnóstico de doença de Gaucher em um paciente com alta especificidade e sensibilidade usando o referido liso-GB1 livre como marcador biológico.

[00126] Os presentes inventores também verificaram surpreendentemente que liso-GB1 livre, que pode ser detectado pelos métodos da presente invenção, circula no sangue de um paciente em uma concentração de aproximadamente 1/1000 de Gb1 total. Além disso, os presentes inventores verificaram surpreendentemente que, diferentemente de Gb1 total, liso-GB1 livre que se encontra presente no sangue de um paciente é útil em um método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente incluindo uma etapa de detectar um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre. Os presentes inventores também verificaram surpreendentemente que o nível de liso-Gb1 livre determinado na amostra de um paciente pelos métodos da presente invenção permite um diagnóstico da doença de Gaucher com alta sensibilidade e alta especificidade.

[00127] Até certo ponto a presente invenção se afasta do ensinamento do estado da arte pelo fato de o método da presente invenção incluir determinar o nível de um liso-composto usando o referido liso-composto como marcador biológico para diagnóstico de esfingolipidoses. Mais especificamente, os presentes inventores surpreendentemente verificaram que a determinação do nível de liso- Gb1 livre em uma amostra de um paciente permite o diagnóstico da doença de Gaucher com alta sensibilidade e alta especificidade.

[00128] É também mérito dos presentes inventores terem reconhecido que uma fração do Gb1 total que é acumulada na doença de Gaucher, está presente como uma molécula em uma forma liso livre do mesmo, isto é liso-GB1 livre, e circula no sangue de um paciente na referida forma liso livre além do Gb1.

[00129] O termo "distúrbio de acumulação lisossômica", também referido como "doença de acumulação lisossômica (lysosomal storage disease)" ou "LSD", neste contexto, preferivelmente refere-se a doenças genéticas e distúrbios metabólicos que resultam de defeitos na função lisossômica. Distúrbios lisossômicos de acumulação são causados por disfunção lisossômica usualmente como consequência de deficiência de uma única enzima necessária para o metabolismo de lipídeos, glicoproteínas ou os assim denominados mucopolissacarídeos. Como outras doenças genéticas, indivíduos herdam doenças lisossômicas de acumulação de seus pais. Embora cada distúrbio resulte de diferentes mutações de genes que se traduzem em uma deficiência na atividade da enzima, todos eles partilham uma característica bioquímica comum - todos os distúrbios lisossômicos se originam de uma acumulação anormal de substâncias no interior do lisossomo.

[00130] O termo "doença de Gaucher" neste contexto, preferivelmente refere-se a uma doença lisossômica de acumulação (LSD), mais especificamente uma esfingolipidose que é caracterizada pela deposição de glicocerebrosídeo em células do sistema monócito- macrófago. Doença de Gaucher é a mais comum das doenças lisossômicas de acumulação (James, William D.; Berger, Timothy G.; et al. 2006. Andrews' Diseases of the Skin: clinical Dermatology. Saunders Elsevier. ISBN 0- 7216-2921-0). É causada por uma deficiência hereditária da enzima glicocerebrosidase. A referida deficiência resulta de mutação(ões) recessiva(s) no gene que codifica glicocerebrosidase, uma hidrolase lisossômica específica (também conhecida como beta- glicosidase, EC 3.2.1.45, PDB lOGS) localizada no cromossomo 1 (lq21) e afeta tanto homens como mulheres. Diferentes mutações na beta- glicosidase determinam a atividade remanescente da enzima, e, em uma grande extensão, o fenótipo.

[00131] Glicocerebrosidase é também aqui referida como β- glicocerebrosidase, beta-glicosidase, beta-glicosidase ácida, glicosil- ceramidase ou D-glicosil-N-acilesfingosina glico-hidrolase. A enzima tem comprimento de 497 aminoácidos, com 55,6 KD tendo atividade de glicosilceramidase, isto é a enzima catalisa a quebra de uma substância gordurosa chamada glicocerebrosídeo por clivagem, isto é hidrólise, de uma ligação beta-glicosídica de glicocerebrosídeo, que é um intermediário no metabolismo de glicolipídeo. Glicocerebrosídeo, também aqui referido como glicosilceramida ou Gb1, é um constituinte da membrana celular de células sanguíneas brancas e vermelhas. Quando a enzima é defeituosa, a substância se acumula, particularmente em células da linhagem de células mononucleares. Isto acontece por que os macrófagos que limpam estas células são incapazes de eliminar o produto residual, que se acumula em fibrilas, e se transforma nas assim denominadas células de Gaucher, que parecem papel amassado no microscópio de luz. Material gorduroso pode acumular no baço, fígado, rins, pulmões, cérebro e medula óssea.

[00132] A doença de Gaucher tem três subtipos clínicos comuns. - Tipo I não neuropático, também aqui designado como tipo I, é a forma mais comum da doença, ocorrendo em aproximadamente 1 em 50 000 nascimentos vivos. Ocorre mais frequentemente entre pessoas da raça judaica Ashkenazi. Sintomas podem aparecer cedo na vida ou na fase adulta e incluem fígado aumentado e baço fortemente dilatado (em conjunto hepatoesplenomegalia); o baço pode romper e causar complicações adicionais. Fraqueza esquelética e doença- óssea podem ser importantes. Dilatação do baço e substituição de medula óssea causam anemia, trombocitopenia e leucopenia. O cérebro não é afetado patologicamente, mas pode haver dano a pulmão e, raramente, ao rim. Doentes neste grupo usualmente apresentam facilmente equimoses (devido a baixos níveis de plaquetas) e têm fadiga devido ao baixo número de células vermelhas no sangue. Dependendo do início e gravidade da doença, pacientes do tipo I podem viver bem como adultos. Muitos portadores da doença têm uma forma fraca da doença ou podem não apresentar quaisquer sintomas. - Neuropatia crônica tipo II, também aqui designada como tipo II, pode começar a qualquer momento na infância ou mesmo na idade adulta, e ocorre em aproximadamente 1 em 100 000 nascimentos vivos. É caracterizada por sintomas neurológicos lentamente progressivos, mas mais brandos quando comparados com os da versão aguda ou tipo III. Os principais sintomas incluem um baço e/ou fígado dilatados, ataques, coordenação deficiente, irregularidades esqueléticas, distúrbios de movimento de olhos, distúrbios de sangue incluindo anemia e problemas respiratórios. Pacientes vivem frequentemente até os primeiros anos da adolescência e idade adulta. - Neuropatia aguda tipo III, também aqui designada como tipo III, começa tipicamente 6 meses após o nascimento e tem uma taxa de incidência de aproximadamente 1 em 100 000 nascimentos vivos. Sintomas incluem fígado e baço dilatados extensivamente e progressivamente, dano ao cérebro extenso e progressivo, distúrbios de movimento de olhos, espasticidade, ataques, rigidez de membros, e deficiência de sucção e deglutição. Crianças afetadas morrem usualmente por volta dos 2 anos de idade.

[00133] Estes subtipos têm sido criticados por não levar em conta o espectro completo de sintomas observáveis. Existem também variações de heterozigotos compostos que aumentam consideravelmente a complexidade de prever o curso da doença.

[00134] Nos tipos II e III de doença de Gaucher, glicocerebrosídeo se acumula no cérebro devido à produção de lipídeos complexos durante o desenvolvimento do cérebro e a formação da bainha de nervos de mielina.

[00135] Sintomas podem incluir baço e fígado dilatados, mau funcionamento do fígado, distúrbios esqueléticos e lesões de ossos que podem ser dolorosas, complicações neurológicas severas, inchamento de linfonodos e (ocasionalmente) das articulações adjacentes, abdômen distendido, tom de pele marrom, anemia, baixo nível de plaquetas no sangue e depósitos gordurosos amarelos sobre o branco do olho (esclera). Pessoas muito seriamente afetadas podem também ser mais susceptíveis à infecção.

[00136] Terapia: Terapia de reposição de enzima também aqui designada como ERT (Enzyme Replacement Treatment), é a terapia de escolha. Entretanto um transplante bem-sucedido de medula óssea poderia curar as manifestações não neurológicas da doença, porque introduz uma população de monócitos com beta-glicosidase ativa. É importante mencionar que este procedimento tem risco significativo e é raramente aplicado em pacientes com doença de Gaucher. Cirurgia para remover o baço (esplenectomia) pode ser muito raramente exigida se o paciente está extremamente anêmico ou quando o órgão aumentado afeta o conforto do paciente. Transfusão de sangue pode beneficiar alguns pacientes anêmicos. Outros pacientes podem necessitar de cirurgia de substituição de articulação para melhorar a mobilidade e qualidade de vida. Outras opções de tratamento incluem antibióticos para infecções, antiepilépticos para ataques, bisfosfonatos para lesões dos ossos, e transplantes de fígado.

[00137] ERT é baseada em administração intravenosa crônica de uma glicocerebrosidase recombinante (imiglucerase, Genzyme;velaglucerase, Shire; taliglucerase, Protalix) (G.A. Grabowski et al., 1995, Enzyme therapy in type I Gaucher's disease: comparative efficacy of mannose-terminated glucocerebrosidase from natural and recombinant sources, Ann. Intern. Med. 122 (33- 39)). Para pacientes do tipo I e a maioria dos pacientes do tipo III, ERT com glicocerebrosidase recombinante intravenosa (como, por exemplo, imiglucerase) pode reduzir significativamente o tamanho do fígado e do baço, reduzir anormalidades esqueléticas, e reverter outras manifestações.

[00138] Mais recentemente terapia de redução de substrato também aqui designada como SRT (substrate reduction therapy), foi desenvolvida como um tratamento alternativo para doença de Gaucher (F.M. Platt et al. 1994, N-butyl-deoxynojirirnycin is a novel inhibitor of glycosphingolipid biosynthesis, J. Biol. Chem. 269, 8362-8365). Inibição parcial de síntese de glicoesfingolipídeo com N-butil-deoxinojirimicina (miglustat, Actelion) é empregada em um esforço para contrabalançar uma capacidade catabólica reduzida em pacientes de doença de Gaucher. SRT pode ser eficaz para interromper o tipo II, pois ele pode passar pela barreira de sangue para o cérebro. Não existe atualmente tratamento eficaz para o severo dano ao cérebro que pode ocorrer em pacientes com tipos II e III de doença de Gaucher.

[00139] Tanto ERT como SRT geralmente resultam em notáveis melhorias clínicas como redução na hepatoesplenomegalia, correções de anormalidades hematológicas, estabilização ou melhoria de deterioração no esqueleto.

[00140] Glicocerebrosídeo, também aqui designado como glicosilceramida ou Gb1, significa qualquer cerebrosídeo no qual o grupo cabeça do monossacarídeo é glicose.

[00141] Será entendido por um especialista na arte que o termo "liso- Gb1" neste contexto, preferivelmente em conexão com os vários métodos, preferivelmente significa que a molécula está presente em sua forma amino livre. Mais precisamente, liso-Gb1 neste contexto, preferivelmente difere de Gb1 pelo fato de nenhuma porção de ácido graxo estar ligada ao grupo amino primário da porção esfingosina da molécula.

[00142] Liso-Gb1 é também aqui designada como glicosilesfingosina ou liso-glicocerebrosídeo e tem a fórmula:

[00143] Será entendido por um técnico no assunto que o termo "liso- GB1 livre" neste contexto preferivelmente refere-se a liso-Gb1 que está como tal presente em uma amostra do paciente, como sangue, e, preferivelmente, não é resultado de uma manipulação da amostra do referido paciente. Tal manipulação de amostra pode ser a descrita por Groener et al. (Groener et al. 2008, Plasma glucosylceramide and ceramide in type 1 Gaucher disease patients: Correlations with disease severity and response to therapeutic intervention, Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908): 72 ~ 78). De acordo com isto, liso-GB1 livre que está presente como tal no sangue de um paciente do qual a amostra é retirada, mais particularmente, não é um liso-Gb1 que é gerado por tratamento químico, bioquímico ou físico de uma amostra contida no sangue e de amostra, respectivamente, de preferência, fora do corpo do paciente. Será também entendido por um especialista da arte que liso-GB1 livre neste contexto, está preferivelmente presente em adição a Gb1 e é um composto produzido pelas atividades metabólicas do paciente. Assim, Gb1, que é a molécula que é acumulada em conexão com doença de Gaucher, que está presente em uma amostra do paciente tem, quando comparada com a molécula em uma forma liso livre, isto é liso-GB1 livre presente no sangue do paciente, pelo menos uma porção de ácido graxo ligada ao grupo amino primário da porção esfingosina liso-Gb1.

[00144] O termo "amostra" como preferivelmente aqui usado significa uma quantidade limitada de material de um paciente, em que o material do referido paciente é parte de ou foi retirado do paciente e/ou do corpo do paciente e em que o referido material é selecionado no grupo contendo fluidos corporais como sangue, um produto sanguíneo, urina, saliva, fluido cerebroespinhal e linfa, bem como fezes ou qualquer qualidade de tecido e ou material de células que é parte de um paciente e/ou do corpo de um paciente. Será reconhecido por um especialista na arte, que a presença de e/ou nível de um marcador biológico da invenção na referida amostra tenciona ser similar a e representar a presença e/ou o nível do marcador biológico em um montante maior do material daquele paciente. Mais precisamente e como um exemplo ilustrativo, não limitativo, um nível de um marcador biológico da invenção determinado em uma amostra de alguns ml de sangue de um paciente também representa um nível do referido marcador biológico no sangue do corpo do paciente. Além disso, em uma modalidade do método da invenção, para diagnosticar doença de Gaucher em um paciente, uma amostra do paciente contém o material do referido paciente em uma forma, por exemplo, processada, fixada e/ou preservada tal que a referida amostra é adequada para uso no método da invenção, sendo que tal processamento, fixação e/ou preservação preferivelmente não gera liso-Gb1. O material do paciente em uma amostra pode assim ser diluído, por exemplo, com um solvente adequado para o método da invenção como metanol e/ou água, pode ser seco, por exemplo, em um papel de filtro, pode ser redissolvido depois de ter sido seco, por exemplo, com um solvente adequado para o método da invenção como metanol e/ou água, ou uma substância pode ser adicionada ao mesmo, substância essa que evita a coagulação do sangue, como, por exemplo, EDTA ou heparina. Será ainda entendido por um especialista da arte que o método da invenção inclui que o referido material do paciente seja separado em componentes individuais do referido material do paciente e/ou que componentes individuais do referido material do paciente sejam extraídos do material do referido paciente, por exemplo, sangue é separado em plasma ou soro e componentes celulares do sangue ou proteína é precipitada da amostra. Será imediatamente entendido que após tal processamento, fixação e/ou preservação a amostra é submetida aos métodos da invenção para detecção e/ou determinação do nível de um marcador biológico contido na referida amostra sendo que tal processamento,fixação e/ou preservação preferivelmente não gera liso-Gb1.

[00145] Em uma modalidade do método da presente invenção em que sangue integral é coletado em um cartão filtrante de sangue seco preferivelmente aproximadamente 3 μL de sangue integral são coletados em um local do referido cartão filtrante de sangue seco tendo um diâmetro de 3 mm. Um especialista na arte reconhecerá que o volume exato assim coletado pode variar dependendo do hematócrito do paciente específico.

[00146] Os níveis de glicosilceramida e seu precursor ceramida foram usados na arte anterior para correlacionar sua presença no plasma com a gravidade da doença de Gaucher tipo I e a resposta à aplicação de terapia (Groener et al., 2008, Plasma glucosylceramide and ceramide in type 1 Gaucher’s disease patients: Correlations with disease severity and response to therapeutic intervention Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908): 72 ~ 78). Assim, foi verificado que o nível de Gb1 era diferente, embora os níveis de ceramida não fossem significativamente diferentes no plasma de pacientes tratados e não tratados com doença de Gaucher tipo I.

[00147] No estudo relatado por Groener et al. (supra) a relação Gb1/ceramida foi usada para discriminar entre pacientes com doença de Gaucher e pacientes sadios. Gb1 e ceramida foram medidos com cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) essencialmente como descrito em Groener et al. (J.E.M. Groener et al., 2007, HPLC for simultaneous quantification of total ceramide, glucosylceramide, and ceramide trihexoside concentrations in plasma, Clin. Chern. 53, 742747). Em relação a isso, é importante entender que Gb1 presente no plasma consiste principalmente de uma porção açúcar e uma porção ceramida, a porção ceramida consistindo de uma esfingosina e uma porção de ácido graxo. De acordo com o método da arte anterior lipídeos são extraídos e ceramida e glicosilceramida são desacilados por hidrólise alcalina formando assim a forma liso, isto é liso-Gb1 (T. Taketomi et al., 1996, Rapid method of preparation of liysoglycosphingolipids and their confirmation by delayed extraction matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight spectrometry, J. Biochem. (Tokyo) 120, 573-579). Subsequentemente, a assim produzida liso-Gb1 é rotulada com uma tinta fluorescente por derivatização com O-ftaldialdeído (OPA) no grupo amino primário. Em seguida as bases esfingoides derivatizadas foram separadas por HPLC de fase reversa e detectadas com um detector de fluorescência. Assim o referido método da arte anterior é capaz de detectar Gb1 total consistindo de liso-GB1 livre e Gb1 e não é capaz de distinguir o nível de liso-Gb1 livre do nível de Gb1 na amostra de um paciente. O nível do referido Gb1 total após clivagem das várias porções de ácidos graxos do grupo NH2 do Gb1 fica usualmente em uma faixa de 5 a 30 μg por mL de plasma ou soro. Assim é evidente que no método de Groener et al. (Groener et al., supra) o Gb1 total que pode ser preparado e obtido, respectivamente, de uma amostra, preferivelmente uma amostra de sangue, de um paciente é usado como um marcador biológico em vez do liso-GB1 livre contido no sangue, e portanto, também na amostra sem execução de clivagem de porção/porções de ácido graxo, preferivelmente clivagem efetuada por um operador manuseando a amostra. Até agora, a presente invenção refere-se à detecção de liso- GB1 livre em vez de Gb1 total como ensinado na arte anterior. É uma modalidade dos métodos da presente invenção detectar e/ou determinar o nível de liso-Gb1 livre em uma amostra de um paciente sendo o liso-GB1 livre e/ou o nível de liso-Gb1 livre determinado separado de e/ou à parte de Gb1 ou do nível de Gb1 que pode estar presente no sangue de um paciente. Em outra modalidade, Gb1 e/ou um nível de Gb1 é detectado/determinado adicionalmente à detecção e/ou determinação de um nível de liso-Gb1 livre.

[00148] Importantemente, cada amina primária circulando no plasma e sendo suficientemente lipofílica para ser extraída concomitantemente com Gb1 usando solvente orgânico de acordo com o referido método da arte é rotulada e assim é capaz de perturbar a detecção de liso-Gb1.

[00149] Embora Gb1 total medido como liso-Gb1 no referido estudo da arte anterior estivesse aumentado no plasma dos referidos pacientes, o referido aumento de Gb1 total não era proeminente e assim a especificidade e a sensibilidade do método foram baixas mostrando que Gb1 não é adequado como marcador biológico para doença de Gaucher.

[00150] Relativamente a isto é importante notar que de acordo com o conhecimento dos inventores os dados descritos aqui nos Exemplos referentes à presente invenção representam a primeira análise sistemática de especificidade e sensibilidade de uma comparação direta de marcadores biológicos para doença de Gaucher da arte anterior, isto é, quitotriosidase e CCL18, e de liso-GB1 livre.

[00151] Provendo uma sensibilidade e/ou especificidade >99,0 % liso-GB1 livre determinado pelos métodos da presente invenção é um marcador biológico adequado para aplicação clínica relativa à doença de Gaucher. Atualmente, o marcador biológico da presente invenção e usos do mesmo excedem claramente o desempenho de marcadores biológicos conhecidos da arte anterior, mais especificamente, o de quitotriosidase e CCL18. Será imediatamente entendido que o método aplicado por Groener et al. (Groener et al., supra) é também inferior quando comparado com os métodos da presente invenção pois a especificidade e a sensibilidade do referido método da arte anterior é mais baixa e o diagnóstico de doença de Gaucher baseado em tal método da arte anterior usando Gb1 total em vez de liso-GB1 livre não é adequado para aplicação clínica segura do mesmo, isto é o método não tem sensibilidade e especificidade suficientes para diagnosticar doença de Gaucher com um prognóstico confiável estatisticamente seguro.

[00152] Quitotriosidase: Já foi verificado que células de Gaucher secretam quitotriosidase e que quitotriosidase no plasma de pacientes sintomáticos com doença de Gaucher é elevada em média a várias centenas de vezes (Hollak et al. 1994, Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease, J Clin Invest. 93: 1288-1292). Portanto, quitotriosidase do plasma é usada como um marcador substituto para manifestações de doença de Gaucher e é usada para diagnose, determinação precoce do início da doença, e monitoração da eficácia terapêutica (Hollak et al. 1994, Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. J Clin Invest.; 93: 1288-1292; Mistry et al. 1997, A practical approach to diagnosis and management of Gaucher’s disease Baillieres Clin Haematol. 10: 817-838; Cox et al. 2000, Novel oral treatment of Gaucher’s disease with N- butyldeoxynojirimycin (OGT 918) to decrease substrate biosynthesis, Lancet.; 355: 1481-1485; Hollak et al. 2001, Clinically relevant therapeutic endpoints in type I Gaucher disease, J Inherit Metab Dis.; 24: 97-105).

[00153] Entretanto, níveis de quitotriosidase no plasma não refletem um sintoma clínico particular, mas são um reflexo da carga corporal total de células de Gaucher (Aerts et al. 1997, Plasma and metabolic abnormalities in Gaucher’s disease, Baillieres Clin Haematol.;10: 691-709); além disso não estão refletindo a carga da doença ocasionada pela patologia óssea e o dano ao cérebro. O nível de quitotriosidase não está diretamente ligado à fisiopatologia da doença de Gaucher. Adicionalmente, após o tratamento o nível de quitotriosidase muda extremamente lentamente tornando a quitotriosidase inadequada para avaliar rapidamente a eficácia do tratamento ao qual o paciente é ou foi submetida, bem como uma reincidência da doença independentemente da causa da doença.

[00154] Além disso, o uso de quitotriosidase no plasma como um marcador de célula de Gaucher é dificultado pelo fato que pacientes, incluindo os com doença de Gaucher, podem ser deficientes em atividade de quitotriosidase devido a uma duplicação de 24 par de bases (pb) no gene da quitotriosidase. Obviamente estes indivíduos não podem ser monitorados pela medição de atividade de quitotriosidase em plasma (Hollak et al. 1994, Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease, J Clin Invest.; 93: 12881292; Boot et al. 1998, The human chitotriosidase gene. Nature of inherited enzyme deficiency, J Biol Chem.; 273: 25680-25685). A frequência da duplicação 24-pb no gene da quitotriosidase depende da etnicidade e pode aumentar até perto de 35% (Prof. Guiliani, Brasil, dados não publicados).

[00155] CCL18: Os macrófagos carregados com glicosilceramida ou células de Gaucher são a fonte principal de CCL18. O nível de CCL18 no plasma de pacientes com doença de Gaucher é significativamente aumentado (Boot, R.G. et al. 2004. Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucher disease: a novel surrogate marker for assessing therapeutic intervention. Blood 103:33-39.). Portanto houve tentativas de usar o nível de CCL18 no plasma como um marcador substituto para monitorar o sucesso de uma terapia aplicada. Entretanto, níveis elevados de CCL18 foram também encontrados associados com várias doenças, como diferentes tipos de câncer e inflamações de articulações, pulmões e pele. Por exemplo, ascites de pacientes tendo carcinoma ovariano contêm um nível significativamente elevado de CCL18 em comparação com pacientes sem carcinoma ovariano (Budd- Chiari syndrome) (Schutyser, E. et al. 2002. Identification of biologically active chemokine isoforms from ascitic fluid and elevated levels of CCL18/pulmonary and activation-regulated chemokine in ovarian carcinoma. J Biol. Chem. 277: 24584-24593.). CCL18 desempenha um papel na supressão de tumor, pois atrai e ativa células imunes específicas. Além disso, crianças tendo leucemia linfocítica aguda apresentam níveis elevados de CCL18, enquanto crianças tendo leucemia mieloide aguda não apresentam níveis elevados de CCL18 no soro (Struyf, S. et al. 2003. ARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163: 2065- 2075). Novamente níveis elevados de CCL18 no plasma não refletem um sintoma clínico particular, mas são um reflexo da carga corporal total de células de Gaucher. Como pode ser visto acima CCL18 apresenta uma especificidade extremamente baixa para o diagnóstico de doença de Gaucher e é assim principalmente aplicado como um marcador substituto "auxiliar" para pacientes deficientes em atividade de quitotriosidase.

[00156] Com referência ao uso de quitotriosidase e CCL18 deve ser notado que quitotriosidase falha em testar positivo em 10-30% de todos os pacientes, isto é, pacientes são testados negativos embora sofrendo de doença de Gaucher e assim também a aplicação de uma terapia será renunciada. Além disso, nestes casos o marcador não pode mais ser usado como um marcador de follow-up para monitorar, por exemplo, ERT. Se há suspeita de que o paciente foi afetado pela deficiência de quitotriosidase, CCL18 é usado como um marcador biológico para diagnosticar a doença de Gaucher, sendo que um método usando CCL18 como marcador biológico apresenta especificidade e sensibilidade relativamente baixas, isto é, diagnostica falsos positivos ou falsos negativos em cerca de 25% de todos os pacientes.

[00157] O termo "estado da doença de Gaucher" neste contexto, preferivelmente refere-se ao estado da doença no paciente. Exemplos de tipos de doença de Gaucher incluem, mas não são limitados a risco de um paciente sofrer ou desenvolver doença de Gaucher, estágio da doença em um paciente e eficácia de tratamento da doença. Outros estados e graus de cada estado são conhecidos na arte. Em uma modalidade da presente invenção estados de doença de Gaucher compreendem estados severo, leve ou saudável de doença de Gaucher.

[00158] O termo "diagnosticar" neste contexto, preferivelmente significa determinar a presença ou a ausência de uma doença ou distúrbio em um paciente e/ou determinar se um paciente está em risco de desenvolver uma doença, um distúrbio ou sintomas relacionados com uma doença ou distúrbio, bem como prever o estado de uma doença.

[00159] O termo "detectar" no contexto da presente invenção significa métodos que incluem detectar a presença ou ausência de uma substância em uma amostra e/ou qualificar o tipo da referida substância. Detectar pode ser efetuado por métodos conhecidos na arte e os adicionalmente aqui descritos, incluindo, mas não limitados a, medição direta da enzima glicosidase, por exemplo, por sequenciamento do código de gene para glicosidase. Qualquer método adequado pode ser usado para detectar um ou mais dos marcadores biológicos aqui descritos. Estes métodos incluem, sem limitação, espectrometria de massa (por exemplo, HPLC-MS/MS), fluorescência (por exemplo, imunoensaio tipo sanduíche), HPLC-fluorescência ou HPLC-UV, preferivelmente após derivatização de liso-GB1 livre.

[00160] Um marcador biológico, neste contexto, é preferivelmente qualquer composto biológico, como uma proteína ou um fragmento da mesma, um peptídeo, um polipeptídeo, um proteoglicano, uma glicoproteína, uma lipoproteína, um carboidrato, um lipídeo, um ácido nucleico, um produto químico orgânico ou inorgânico, um polímero natural, e uma pequena molécula, que está diferencialmente presente em uma amostra de um paciente de um estado fenotípico (por exemplo, tendo a doença) quando comparado com outro estado fenotípico (por exemplo, não tendo a doença) e que pode ser isolado de, ou medido em uma amostra do paciente. Além disso, o marcador biológico pode ser uma molécula inteira intacta, ou pode ser uma porção da mesma que é preferivelmente detectada por análise de espectrometria de massa, um anticorpo, outra proteína que se liga especificamente ao marcador biológico, ácido nucleico funcional que se liga especificamente ao marcador biológico e/ou a um rótulo fluorescente. Um marcador biológico é, além disso, considerado como informativo se um aspecto mensurável do marcador biológico é associado com um dado estado do paciente, como um estado particular de doença de Gaucher. Tal aspecto mensurável pode incluir, por exemplo, a presença, ausência, ou o nível do marcador biológico em uma amostra do paciente e/ou sua presença como parte de um perfil de marcadores biológicos. Um aspecto mensurável pode também ser uma relação de dois ou mais aspectos mensuráveis de marcadores biológicos, podendo os marcadores biológicos ser ou não de identidade conhecida, por exemplo. Um perfil de marcadores biológicos compreende pelo menos dois de tais aspectos mensuráveis, podendo os aspectos mensuráveis corresponder à mesma ou a diferentes classes de marcadores biológicos como, por exemplo, um ácido nucleico e um carboidrato. Um perfil de marcador biológico pode também incluir pelo menos três, quatro, cinco, dez, vinte, trinta ou mais aspectos mensuráveis. Em uma modalidade, um perfil de marcador biológico inclui centenas, ou mesmo milhares de aspectos mensuráveis. Em outra modalidade, o perfil do marcador biológico inclui pelo menos um aspecto mensurável de pelo menos um marcador biológico e pelo menos um aspecto mensurável de pelo menos um padrão interno.

[00161] Em uma modalidade do método de acordo com a presente invenção um padrão interno é adicionado a uma amostra de um paciente. Será reconhecido que pela referida adição de padrão interno, também aqui designado como IS (internal standard), à amostra, isto é spiking da amostra, a ser submetida ao método de acordo com a presente invenção, a concentração de IS na amostra é conhecida, e, por exemplo,, com a determinação da área sob o pico, isto é a área do pico, do padrão interno em, por exemplo, um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa, a relação entre uma área de pico e uma concentração de uma substância, por exemplo, de IS e/ou do marcador biológico, que é no presente caso liso-GB1 livre, pode assim ser calculada, por exemplo,, calculando a razão da área de pico de liso-GB1 livre para a área de pico de IS. Um especialista na arte reconhecerá que várias moléculas podem ser usadas como IS. Entretanto um IS tendo uma estrutura química similar à da molécula do marcador biológico, por exemplo, liso-GB1 livre, é preferível. De acordo com isto, os atuais inventores escolheram em uma modalidade, liso-Gb2 que difere de liso- Gb1 por conter uma porção açúcar adicional e que, além disso, não está presente como tal na natureza. Em uma modalidade preferida, a molécula usada como IS pode ser distinguida de liso-GB1 livre no método da presente invenção. Em outra modalidade preferida é selecionada como uma molécula que é rara ou não está presente na natureza. Em uma modalidade da presente invenção, em que o padrão interno é adicionado a uma amostra de um paciente, é preferido que seja adicionado dissolvido em um solvente, por exemplo, etanol, antes da referida adição à amostra. Em outra modalidade preferida o solvente é selecionado de modo que o referido solvente seja capaz de causar precipitação de proteína, preferivelmente à precipitação de proteína de acordo com o método da presente invenção.

[00162] Em algumas modalidades da presente invenção a precipitação de proteína e/ou estágio de precipitação de proteína é parte do método da presente invenção. Será entendido que precipitação neste contexto, preferivelmente significa a formação de um sólido em uma solução, isto é, por exemplo, a formação de um precipitado de proteína em uma amostra, por exemplo, soro, de um paciente. Quando precipitação, por exemplo, precipitação de proteína, ocorre em uma amostra, o sólido formado é chamado precipitado, ou quando compactado por uma centrífuga, um pélete. O líquido que permanece sobre o sólido é, em qualquer caso, denominado sobrenadante. A presente invenção contempla diferentes métodos de precipitação e/ou separação do referido sobrenadante e referido precipitado ou pélete, incluindo entre outros, deposição ou sedimentação e centrifugação. Um especialista na arte conhecerá outros métodos para precipitação de proteína e/ou separação de um sobrenadante de um precipitado de proteína, entretanto o referido especialista reconhecerá que se um método, preferivelmente um método da invenção, for aplicado onde proteína precipitada desativará um dispositivo como uma coluna ou coluna de HPLC usada com referência à presente invenção, a proteína precipitada será preferivelmente separada do solvente e/ou da amostra.

[00163] Em algumas modalidades da presente invenção um nível de um marcador biológico da presente invenção, por exemplo, liso-GB1 livre, determinado por um método da presente invenção em uma amostra é comparado a um nível do mesmo ou de outro marcador biológico da presente invenção determinado por um método da presente invenção em outra amostra, por exemplo, do mesmo paciente, de outro paciente, de um controle e/ou do mesmo ou de diferentes pontos no tempo, e/ou a um nível de corte, e/ou a um nível de um controle e ou a um nível de um IS. Em relação a isso "comparar" ou "comparado a" neste contexto, preferivelmente significa a comparação matemática de dois ou mais valores dos níveis do(s) marcador(es) biológico(s). Assim, será imediatamente evidente se um dos referidos valores é superior, inferior ou igual, se pelo menos dois desses valores são comparados um com o outro.

[00164] Em algumas modalidades da presente invenção o nível do marcador biológico é também determinado em um controle. Neste contexto, um controle é preferivelmente uma amostra de um paciente em que o estado da doença de Gaucher do referido paciente é conhecido. Em uma modalidade, um controle é uma amostra de um paciente sadio. Em outra modalidade um montante do referido marcador biológico é adicionado à referida amostra de um paciente sadio antes de se determinar o nível do referido marcador biológico na referida amostra de um paciente sadio contendo o referido marcador biológico adicionado com um método da presente invenção. Em outra modalidade o controle é uma amostra de pelo menos um paciente tendo um estado conhecido da doença de Gaucher, o referido estado conhecido da doença de Gaucher incluindo severo, brando ou saudável, por exemplo, um paciente de controle. Em outra modalidade preferida, o controle é uma amostra de um paciente que não está sendo tratado por doença de Gaucher. Em ainda outra modalidade preferida, o controle é uma amostra de um único paciente ou um pool de amostras de diferentes pacientes e/ou de amostras retiradas do(s) paciente(s) em diferentes pontos de tempo.

[00165] O termo "nível" ou "nível de um marcador biológico" neste contexto, preferivelmente significa a concentração de uma substância, preferivelmente de um marcador biológico da invenção e mais preferivelmente de liso-GB1 livre, em uma amostra ou um paciente. Será entendido por um especialista que em certas modalidades as referidas amostras não são necessariamente submetidas a um método da invenção como uma amostra não processada, o método consistindo em determinar um nível do referido marcador biológico, isto é a referida amostra pode ser submetida, a uma etapa de precipitação de proteína, separação, por exemplo, centrifugação e/ou HPLC e subsequentemente submetida a uma etapa de determinação do nível do marcador biológico, por exemplo, usando análise espectrométrica de massa.Deve ser ainda notado que sempre que o termo "um" nível de um marcador biológico é usado com referência a um nível do marcador biológico da invenção que deve ser determinado de acordo com a presente invenção, deve-se entender como "o" nível do marcador biológico da presente invenção que deve ser determinado pelos métodos da presente invenção e que está contido em uma amostra submetida ao(s) método(s) da invenção.

[00166] O nível de um marcador biológico é diferente entre diferentes estado da doença de Gaucher, se o nível médio ou mediano do marcador biológico nos diferentes grupos for calculado como estatisticamente significativo. Testes comuns para significância estatística incluem, entre outros, teste t, ANOVA, Wilcoxon, Mann- Whitney, razão de chances e Ruskal-Wallis. Marcadores biológicos, sozinhos ou em combinação, proporcionam medidas de risco relativo de que um paciente pertença a um estado fenotípico ou outro. Assim, marcadores biológicos da presente invenção são úteis, em uma modalidade da presente invenção, como marcadores para doença, eficácia terapêutica de um fármaco ou de um tratamento.

[00167] O termo "determinar o nível" de um marcador biológico neste contexto, preferivelmente significa métodos que incluem quantificar um montante de pelo menos uma substância em uma amostra de um paciente e/ou quantificar um montante da referida substância contida em uma parte do corpo do paciente, como saliva, sangue, linfa, soro, plasma ou licor e/ou quantificar um montante da referida substância no paciente, a substância sendo selecionada no grupo que inclui um marcador biológico.

[00168] Deve ser entendido por um especialista na arte que detectar e/ou determinar o nível de liso-Gb1 livre em uma amostra do paciente, preferivelmente implica em que o Gb1 presente no sangue de um paciente não esteja quimicamente convertido, transformado ou derivatizado de forma a que liso-GB1 livre não possa ser detectado e/ou que o nível do mesmo não possa ser determinado separadamente e/ou à parte de Gb1. O especialista na arte reconhecerá que Gb1 presente em uma amostra de um paciente que seja submetido a uma etapa de desacetilação, por exemplo, por hidrólise em hidróxido de sódio metanólico, resultará em clivagem da porção de ácido graxo proveniente de Gb1 e assim resultará indesejavelmente em uma forma quimicamente convertida, transformada ou derivatizada de Gb1 que não pode ser diferenciada de liso-GB1 livre. É assim mérito dos presentes inventores reconhecer que liso-GB1 livre separado de Gb1 é útil em um método para diagnóstico da doença de Gaucher.

[00169] Em uma modalidade preferida dos métodos da presente invenção o método é para detectar e/ou determinar o nível de liso-Gb1 livre em uma amostra de um paciente, em que Gb1 presente na amostra do paciente não é submetido a uma etapa que resulte em desacetilação de Gb1, preferivelmente não é submetido a uma etapa que resulte em clivagem de uma porção de ácido graxo do Gb1 contido na amostra. Em outra modalidade preferida do método da presente invenção Gb1 presente na amostra do paciente não é quimicamente convertido, transformado ou derivatizado. Em ainda outra modalidade preferida do método da presente invenção liso-GB1 livre presente na amostra do paciente é separado de Gb1 presente na amostra do paciente antes de uma etapa que resultaria na clivagem de uma porção de ácido graxo do Gb1 e/ou antes de uma etapa em que Gb1 é quimicamente convertido, transformado ou derivatizado. Em ainda outra modalidade preferida, uma etapa de detecção ou determinação do nível de um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre, é realizada após a separação usando HPLC por aplicação de análise espectrométrica de massa.

[00170] Um paciente é considerado um indivíduo saudável em relação à doença de Gaucher, se o paciente não sofre de sintomas associados com a doença de Gaucher. Além disso, em uma modalidade dos métodos da invenção um paciente será considerado saudável se ele não tem nenhuma mutação das partes funcionais do gene da cerebrosidase e/ou nenhuma mutação do gene da cerebrosidase resultando em uma redução de ou deficiência da enzima glicocerebrosidase ou da atividade da mesma, resultando em sintomas associados com doença de Gaucher. As referidas mutações serão detectadas se uma amostra do paciente for submetida a um teste genético para tais mutações, como aqui descrito. Em outra modalidade da presente invenção uma amostra de um indivíduo saudável é usada como amostra de controle ou como matriz em branco nos métodos da presente invenção. Uma matriz em branco, neste contexto, é preferivelmente uma amostra de um indivíduo saudável. Apesar disso será entendido que essa matriz em branco pode conter um nível nativo de liso-GB1 livre.

[00171] Em uma modalidade da presente invenção o nível de um marcador biológico é indicativo de paciente sofrendo de ou estando em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio. O nível do marcador biológico determinado pelo método de acordo com a presente invenção é comparado com um nível de controle do marcador biológico, em que o resultado da referida comparação permite diagnosticar uma doença.

[00172] Mais especificamente, comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente com o nível de controle do marcador biológico inclui comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente com um nível de corte, em que se um nível do marcador biológico na amostra do paciente é elevado, aumentado ou superior comparado com o nível de corte, isto é indicativo de que o paciente está sofrendo de ou em risco de desenvolver a doença de Gaucher e/ou, em que se um nível do marcador biológico na amostra do paciente é reduzido ou inferior comparado ao nível de corte isto é indicativo de que o paciente não está sofrendo de ou não está em risco de desenvolver a doença de Gaucher. Está também dentro da presente invenção que comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente a um nível de controle permite determinar a gravidade da doença de Gaucher, em que se um nível do marcador biológico na amostra do paciente é elevado, aumentado ou superior comparado ao nível de controle, isto é indicativo de que o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver doença de Gaucher de estado ou progressão mais severos; e em que se um nível do marcador biológico na amostra do paciente é reduzido ou inferior comparado ao nível de controle, isso é indicativo de que o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver doença de Gaucher de estado ou progressão menos severos. Em outra modalidade da presente invenção em que comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente ao nível do controle inclui comparar um nível do marcador biológico no referido paciente a um nível do marcador biológico detectado em uma amostra de um controle, em que se um nível do marcador biológico na amostra do paciente é elevado, aumentado ou superior comparado ao da amostra do controle, isto é indicativo de que o paciente está sofrendo de e/ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher; e/ou um nível do marcador biológico na amostra do paciente é elevado, aumentado ou superior comparado ao da amostra de controle isto é indicativo que o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver doença de Gaucher de um estado ou progressão mais severos. O referido controle é, preferivelmente selecionado no grupo que inclui indivíduos saudáveis, pacientes sofrendo da doença de Gaucher ou estando em risco de sofrer de sintomas da Doença de Gaucher, pacientes positivamente testados para uma mutação ou uma combinação de mutações do gene da cerebrosidase, em que a mutação ou a combinação de mutações do gene da cerebrosidase são indicativos de uma perspectiva do paciente desenvolver doença de Gaucher de um estado ou progressão mais severos ou menos severos. Em outra modalidade da presente invenção esse nível de controle é determinado em uma amostra de um controle, em que opcionalmente liso-GB1 livre é adicionado à amostra do controle em uma quantidade específica antes de determinar o nível de liso-Gb1 livre na amostra do controle.

[00173] É mérito dos presentes inventores que pudesse ser estabelecido um método para diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente, em que o método consiste em detectar um marcador biológico em uma amostra de um paciente, em que o marcador biológico é liso- GB1 livre, preferivelmente incluindo ainda determinar um nível do marcador biológico na amostra do paciente, e mais preferivelmente incluindo ainda comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente a um nível de corte, que apresenta alta sensibilidade, isto é uma sensibilidade de pelo menos 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% e alta especificidade de pelo menos 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%,99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100%. Em outra modalidade da presente invenção os métodos de acordo com a presente invenção permitem diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente independente de um estado de progressão de doença de Gaucher no paciente. Mais especificamente, os métodos da presente invenção permitem diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente tendo um estado precoce da doença de Gaucher bem como em um paciente tendo um estado avançado ou progredido da doença de Gaucher.

[00174] O poder de um método de diagnosticar corretamente a doença de Gaucher é comumente medido pela sensibilidade do método, pela especificidade do método ou pela área sob uma curva de características de operação do receptor (também referida aqui como "curva ROC"). Uma curva ROC é um gráfico de taxa de verdadeiros positivos contra a taxa de falsos positivos para os diferentes níveis de corte possíveis de um método de diagnóstico. Uma curva ROC mostra a relação entre sensibilidade e especificidade. Sensibilidade é a percentagem de verdadeiros positivos que são previstos por um teste para serem positivos, enquanto especificidade é a percentagem de verdadeiros negativos que são previstos por um teste para serem negativos. Uma curva ROC provê a sensibilidade de um teste em função de 1-especificidade. Quanto maior a área sob a curva ROC mais poderoso o valor de previsão do teste. Assim, um aumento na sensibilidade será acompanhado por uma redução na especificidade. Quanto mais próximo à curva seguir pelo eixo esquerdo e, em seguida pela borda superior do espaço ROC, mais preciso o teste. Inversamente, quanto mais próximo à curva chegar da diagonal de 45 graus do gráfico ROC, menos acurado o teste. Portanto, a área sob o ROC é uma medida da acurácia do teste. A acurácia do teste depende de quão bem o teste separa o grupo que está sendo testado em aqueles com e sem a doença em questão. Uma área sob a curva (também aqui referida como "AUC") de 1 representa um método perfeito, enquanto uma área de 0,5 representa um método menos útil. Assim, métodos diagnósticos preferidos da presente invenção possuem um AUC superior a 0,50, métodos mais preferidos possuem um AUC superior a 0,9 e os métodos mais preferidos possuem um AUC superior a 0,998.

[00175] Outras medidas úteis e adequadas para a utilidade de um método são valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Um valor preditivo positivo é a percentagem de positivos reais que testam como positivo. Um valor preditivo negativo é a percentagem de negativos reais que testam como negativo. Métodos para qualificar o estado da doença de Gaucher em um paciente que usa marcadores biológicos da arte anterior, por exemplo, quitotriosidase e/ou CCL18 mostram uma sensibilidade e especificidade tipicamente não superior a 90%.

[00176] Uma pessoa com habilidade na arte reconhecerá que embora a especificidade e a sensibilidade dos métodos de acordo com a presente invenção sejam tão altos como descrito acima e foram determinados como descrito nos Exemplos a seguir, casos individuais não podem ser excluídos quando um paciente tendo doença de Gaucher será testado falso negativo ou quando um paciente não tendo a doença de Gaucher será testado falso positivo com um método da invenção. Levando em contas esses casos quando da determinação da especificidade e da sensibilidade do método de acordo com a presente invenção, a especificidade e a sensibilidade serão inferiores do que os valores acima descritos. Apesar disso, o especialista na arte também reconhecerá que essa alta especificidade e essa alta sensibilidade como foi indicado acima nunca foram descritas anteriormente para um método de diagnóstico da Doença de Gaucher. Portanto é importante notar que embora a sensibilidade e a especificidade do método da presente invenção possa variar se grupos de pacientes diferentes daquele reportado na parte de Exemplos, por exemplo, variando o número de pacientes, são submetidos aos métodos da presente invenção, é uma convicção firme dos inventores que nenhum método conhecido na arte anterior usando marcadores biológicos alcançará uma especificidade superior e uma sensibilidade superior em comparação com os métodos de acordo com a presente invenção. Isto é especialmente verdadeiro já que o limite de detecção dos métodos da presente invenção permite determinar o nível de liso-Gb1 livre em muitos indivíduos saudáveis. Assim, um paciente doente testado falso negativo com a aplicação dos métodos da presente invenção é testado falso negativo pela razão de que o nível do marcador biológico em uma amostra do referido paciente doente testado como falso negativo é tão alto quando o nível do marcador biológico em uma amostra de um indivíduo saudável. Em particular é importante notar que o referido paciente testado como falso negativo não é testado negativo pela razão de que o nível do marcador biológico era baixo demais para ser determinado pelo método da presente invenção.

[00177] Um "limite de detecção" de uma substância como liso-GB1 livre, neste contexto, preferivelmente é um nível da substância determinado por um método para determinar um nível da substância, em que um nível de menos que ou inferior ao referido limite de detecção não pode ser determinado pelo referido método. É, assim, imediatamente claro que um "nível de corte" e um "limite de detecção", neste contexto, são preferivelmente não necessariamente iguais, embora ambos reflitam um certo nível da substância, por exemplo de um marcador biológico da presente invenção. Será imediatamente entendido que em contraste com nível de corte será selecionado preferivelmente de forma que seletividade e sensibilidade do método sejam tão altos quanto possíveis. Em contraste com isso um limite de detecção representa um nível absoluto do marcador biológico da presente invenção que reflete o nível mínimo do marcador biológico que pode ser detectado com um método para determinar o nível do referido marcador biológico. É, assim, imediatamente claro que um limite de detecção depende do método para determinar um nível da substância e da substância cujo nível se quer determinar com o método. Um especialista entenderá imediatamente que um alto limite de detecção, por exemplo, superior a um nível ideal de corte possivelmente resultaria em uma baixa sensibilidade do método já que a percentagem de verdadeiros positivos que são previstos por um teste para ser positivo também depende de se um nível do marcador biológico pode ser determinado para os referidos verdadeiros positivos. Em outras palavras, se o limite de detecção for superior a um nível de corte ideal, verdadeiros positivos tendo um nível do marcador biológico ligeiramente superior ao nível de corte podem não ser distinguidos de verdadeiros negativos tendo um nível do marcador biológico inferior ao do nível de corte já que nenhum nível do marcador biológico pode ser determinado para ambos, verdadeiros positivos tendo um nível do marcador biológico ligeiramente superior ao nível de corte e negativos tendo um nível do marcador biológico inferior ao nível de corte. É, portanto, imediatamente claro, que um baixo limite de detecção é vantajoso. É, assim, também mérito dos inventores mostrar que um limite de detecção inferior proporciona um método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente incluindo uma etapa de determinar um nível de um marcador biológico presente na amostra com seletividade e sensibilidade superior. Um "nível de corte ideal" neste contexto, preferivelmente é o nível de corte aqui descrito, sendo que o método que utiliza o referido nível de corte ideal tem as mais altas seletividade e sensibilidade.

[00178] É uma modalidade dos métodos de acordo com a presente invenção incluir uma etapa de validação do referido método diagnosticando uma doença ou distúrbio, preferivelmente doença de Gaucher em um paciente pelo método da presente invenção; uma etapa de diagnóstico da doença ou distúrbio, preferivelmente doença de Gaucher, em um paciente por um teste genético, incluindo sequenciamento de um gene, preferivelmente sequenciamento de um gene cuja mutação é conhecida de um especialista na arte como causadora da doença ou distúrbio, mais preferivelmente sequenciamento do gene da cerebrosidase no caso de doença de Gaucher; e comparação dos resultados do referido método e do referido teste genético. Um indivíduo saudável neste contexto, preferivelmente é considerado como saudável em relação a uma doença ou distúrbio se o referido paciente não está sofrendo de sintomas associados com a referida doença ou distúrbio e se o resultado de um teste genético revela ausência de mutações de um gene cuja mutação é conhecida de um especialista na arte como causadora da doença ou do distúrbio. Entende-se também como um indivíduo saudável um paciente sendo positivamente testado para não ter a doença de Gaucher.

[00179] O termo "qualificar o estado da doença de Gaucher" em um paciente neste contexto, preferivelmente significa classificação de um perfil de marcador biológico de um paciente selecionado no grupo que inclui identificar ou detectar a presença ou ausência da doença de Gaucher no paciente, prever o início de ou o risco de desenvolvimento da doença de Gaucher no paciente, determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente, determinar e/ou prever a gravidade da doença de Gaucher em um paciente, determinar se um paciente sofre de um estado precoce da doença de Gaucher ou um estado avançado ou progredido da doença de Gaucher ou determinar se um nível de um marcador biológico em um paciente mudou significativamente ao longo do tempo.

[00180] O termo "gerenciamento do tratamento do paciente" ou "gerenciamento do paciente" neste contexto, preferivelmente refere-se ao comportamento do clínico ou do médico após a determinação do estado da doença de Gaucher. Por exemplo, se o resultado do método de acordo com a presente invenção é inconclusivo ou existe uma razão para que seja necessária uma confirmação do estado, o médico pode pedir novos testes, como teste para a função da glicocerebrosidase e/ou sequenciamento do gene que codifica a glicocerebrosidase. Alternativamente, se o estado indica que o tratamento da doença de Gaucher é apropriada, o médico pode marcar o paciente para tratamento da doença de Gaucher. Da mesma forma, se o estado é negativo ou se os resultados mostram que o tratamento teve sucesso, pode ser que nenhum gerenciamento adicional seja necessário. Apesar disso, uma pessoa com habilidade na arte reconhecerá imediatamente que além da terapia genética, qualquer terapia aplicada, por exemplo, ERT e/ou SRT tem de ser aplicada pelo resto da vida a um paciente com doença de Gaucher. Além disso, é uma modalidade da presente invenção que gerenciar o tratamento de um paciente inclui titular uma dose de um fármaco aplicado como tratamento para doença de Gaucher, por exemplo, unidades de enzima recombinante aplicada em ERT, administrado a um paciente. Em algumas modalidades dos métodos da presente invenção em que um nível de um marcador biológico presente em uma amostra de um paciente é determinado em vários pontos no tempo, ou é comparado a outros níveis do marcador biológico, a um nível de corte e/ou a um nível do referido marcador biológico em um controle, um especialista aplicará ou não aplicará a terapia, ou corrigirá uma terapia já aplicada para tratar ou não tratar, ou continuar tratando a doença de Gaucher.

[00181] Está incluída na presente invenção que um especialista aplicará uma dosagem e/ou manterá uma dosagem ou corrigirá uma dosagem, por exemplo, aplicará uma dosagem ou uma dosagem superior, isto é elevará uma dosagem, se essa comparação do nível de um marcador biológico mostrar, por exemplo, que o nível do referido marcador biológico é superior, por exemplo, a um nível de corte, isto é o paciente é diagnosticado como tendo a doença de Gaucher; ou que um nível determinado no mesmo paciente num tempo anterior é inferior ou igual, isto é uma terapia aplicada não é suficiente, isto é não resulta em uma redução no nível. Por outro lado um especialista aplicará ou não aplicará uma dosagem ou manterá ou reduzirá uma dosagem, por exemplo, não aplicará nenhuma dosagem ou aplicará uma dosagem inferior, isto é reduzirá uma dosagem, se essa comparação do nível de um marcador biológico mostra por exemplo, que o nível do referido marcador biológico é inferior, por exemplo, a um nível de corte, isto é o paciente é diagnosticado como não tendo a doença de Gaucher; ou que um nível determinado no mesmo paciente num tempo anterior é superior, isto é uma terapia aplicada é suficiente, isto é realmente resulta em uma redução no nível. Em uma modalidade da presente invenção um nível relativamente alto de liso-GB1 livre baseado nessa comparação é indicativo para aplicação de uma alta dosagem de enzima recombinante aplicada em ERT e/ou um nível relativamente baixo de liso-GB1 livre baseado nessa comparação é indicativo para aplicação de uma baixa dosagem de enzima recombinante aplicada em ERT. Não obstante será imediatamente entendido que um especialista considerará a história do paciente, isto é um especialista gerenciando o tratamento de um paciente que sofre de doença de Gaucher e sendo tratado de forma que um nível de marcador biológico seja inferior do que um nível de corte, por exemplo, não decidirá parar o tratamento ao invés de reduzir uma dosagem e aumentar o tempo entre outras aplicações dos métodos da presente invenção.

[00182] O curso da doença de Gaucher pode ser determinado pelo método de acordo com a presente invenção determinando um nível do marcador biológico na amostra do paciente em diferentes pontos no tempo no curso da doença. É importante notar que uma única aplicação de um método para diagnóstico da doença de Gaucher de acordo com a presente invenção permite diagnosticar a doença de Gaucher e em certas modalidades inclui uma etapa de gerenciamento do tratamento do paciente baseado no diagnóstico de se o paciente está sofrendo de ou em risco de desenvolver a doença de Gaucher. Se um paciente cuja amostra é, assim, submetida ao método da presente invenção é testado positivo para estar sofrendo de ou em risco de desenvolver a doença de Gaucher um médico especialista saberá como decidir em relação ao gerenciamento do tratamento do paciente, isto é, como o paciente será tratado, por exemplo, aplicar uma certa dose de enzima em relação a uma ERT. Será imediatamente entendido que independente da decisão de um médico especialista em como gerenciar o tratamento, o especialista pode decidir por pelo menos uma aplicação adicional do método de acordo com a presente invenção em um ponto no tempo posterior. É, assim, uma modalidade da presente invenção que os níveis do marcador biológico determinado em diferentes pontos de tempo, em que diferentes pontos de tempo significa pelo menos dois pontos de tempo, possam ser comparados. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, os presentes inventores verificaram que o nível do marcador biológico da presente invenção em amostras de um paciente particular pode ser correlacionado à gravidade da doença do referido paciente no ponto no tempo que a amostra do paciente é retirada. Será, assim, imediatamente entendido que um nível elevado do marcador biológico determinado na amostra de um ponto no tempo posterior comparado ao nível do marcador biológico determinado na amostra de um ponto no tempo anterior é indicativo de um estado mais grave do paciente no ponto de tempo posterior comparado ao estado do paciente no ponto de tempo anterior. Um nível reduzido do marcador biológico determinado na amostra de um ponto no tempo posterior comparado ao nível do marcador biológico determinado na amostra de um ponto no tempo anterior é indicativo de um estado menos grave do paciente no ponto de tempo posterior comparado ao estado do paciente no ponto de tempo anterior. Assim, em um aspecto, a presente invenção provê um método para determinar o curso da doença de Gaucher em um paciente incluindo uma etapa de determinar em vários pontos no tempo um nível de um marcador biológico presente em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente sendo positivamente testado para estar sofrendo ou estando em risco de desenvolver a doença de Gaucher incluindo a etapa de determinar em vários pontos no tempo um nível de um marcador biológico presente em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre. Será imediatamente entendido por um especialista na arte que os métodos da presente invenção proporcionam, assim, a seleção de uma terapia e/ou ajuste das doses e/ou dosagem de uma terapia selecionada com base nos resultados do método da invenção. Se por exemplo o paciente está agendado para tratamento da doença de Gaucher o método de diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a cada 3 meses e níveis do marcador biológico assim determinados serão comparados para determinar a eficácia do(s) tratamento(s) e/ou terapia/terapias aplicados ao paciente. Se o paciente atinge um estado, em que um nível estável do marcador biológico é mantido ao longo do tempo, a frequência de aplicação do método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente de acordo com a presente invenção pode ser reduzida para cada 6 meses. Se a dosagem da terapia é alterada, por exemplo, as unidades de enzima recombinante aplicadas em ERT são reduzidas ou aumentadas, a frequência de aplicação do método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente de acordo com a presente invenção pode voltar para cada três meses. Por comparação dos níveis do marcador biológico determinados nas amostras do paciente o médico especialista reconhecerá se o nível do marcador biológico aumenta, reduz ou se um nível estável do marcador biológico é mantido ao longo do tempo. Assim, o médico especialista pode decidir reduzir a dosagem da terapia, por exemplo, as unidades de enzima recombinante aplicadas em ERT; aumentar a dosagem da terapia; ou manter a dosagem da terapia de acordo com a comparação dos níveis do marcador biológico determinados com o método de acordo com a presente invenção. Uma redução de cerca de 60% do nível de liso-Gb1 livre em um período de 12 meses é indicativo de sucesso de uma terapia para doença de Gaucher, em que redução neste contexto, preferivelmente significa que o nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método da presente invenção determinado ao final de um período de tempo é comparado ao nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método da presente invenção determinado no início do referido período de tempo. Assim, o médico especialista pode decidir reduzir a dosagem da terapia aplicada ou manter a dosagem da terapia. Se a redução do nível de liso-Gb1 livre é significativamente mais fraca o médico especialista pode decidir aumentar a dosagem da terapia. É também um mérito dos presentes inventores ter reconhecido que a redução do nível de liso-Gb1 livre se correlaciona com a eficácia da terapia. Quanto mais forte a redução do nível do liso-GB1 livre em um período de tempo, por exemplo, 12 meses, mais bem-sucedida é a terapia, como, por exemplo terapia de ERT, SRT ou baseada em chaperona. É assim outra modalidade da presente invenção que o método da presente invenção seja para comparar a eficácia de uma terapia ou de pelo menos duas terapias aplicadas a um paciente.

[00183] Um especialista na arte reconhecerá assim que a progressão, isto é o curso da Doença de Gaucher, bem como a eficácia da terapia num paciente podem ser monitorados por determinação frequente do nível de liso-Gb1 livre em amostras do paciente.

[00184] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar a eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente que foi positivamente testado quanto a estar sofrendo de ou em risco de desenvolver a doença de Gaucher incluindo uma etapa de determinar em vários pontos no tempo um nível de um marcador biológico presente em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre. Com base no que foi descrito acima em relação a gerenciar o tratamento de um paciente, um especialista na arte entenderá imediatamente que a eficácia de um tratamento ou da combinação de pelo menos dois tratamentos pode ser comparada aplicando os métodos da presente invenção. Assim, é possível testar e comparar vários novos fármacos, formas de dosagem, dosagens ou tratamentos para a Doença de Gaucher pelo método da presente invenção.

[00185] É uma modalidade da presente invenção que o método para diagnóstico da Doença de Gaucher de acordo com a presente invenção seja independente de se o paciente foi ou não anteriormente tratado por doença de Gaucher. Assim, uma amostra do paciente pode ser uma amostra de um paciente que tenha sido anteriormente tratado por doença de Gaucher bem como uma amostra de um paciente que não tenha sido anteriormente tratado por doença de Gaucher. É, assim, outra modalidade da presente invenção que o método da presente invenção inclua uma etapa de gerenciamento do tratamento do paciente e/ou determinação de um nível do marcador biológico na amostra do paciente após o gerenciamento do paciente. O referido tratamento do paciente pode ser baseado no diagnóstico de se o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher; na detecção do marcador biológico em uma amostra do paciente após gerenciamento do paciente; ou na determinação do nível do marcador biológico na amostra do paciente após gerenciamento do paciente. Não obstante, um especialista na arte entenderá que uma amostra de alguns pacientes que não têm doença de Gaucher ou de alguns pacientes tratados com sucesso por doença de Gaucher mostrará um nível de liso- Gb1 livre inferior ao limite de detecção.

[00186] Sem desejarem estar ligados por qualquer teoria, os presentes inventores assumem que o nível de liso-Gb1 livre presente em uma amostra de um paciente se correlaciona ainda com a gravidade da doença em um paciente que sofre da doença de Gaucher. Com relação a isso, os presentes inventores verificaram, avaliando os resultados aqui fornecidos (por exemplo, mostrados na Fig.4 deste relatório), que embora, em princípio, o nível de liso-Gb1 livre seja diferente em indivíduos particulares, e mais especificamente possa ser diferente em indivíduos particulares tendo a(s) mesma(s) mutação(ões), que quanto maior seja o nível de liso-Gb1 livre, maior é a gravidade do curso da doença de Gaucher em termos de uma média estatística de acordo com um escore clínico. Assim, o nível de liso-Gb1 livre se correlaciona com a gravidade da doença de Gaucher na medida em que em pacientes positivamente testados para mutações distintas do gene de glicocerebrosidase conhecidas por causar geralmente um curso brando (por exemplo, mutação. N370S) ou um curso mais severo (por exemplo, mutação L444P) da doença de Gaucher, o nível de liso-Gb1 livre determinado nos referidos pacientes foi estatisticamente correlacionado com a gravidade geralmente relacionada a essa mutação.

[00187] Assim, outra modalidade dos diferentes aspectos da presente invenção refere-se a um método para determinar a gravidade da doença de Gaucher em um paciente incluindo uma etapa de a) determinar o nível do marcador biológico presente em uma amostra do paciente em que o marcador biológico é liso-GB1 livre e uma etapa de b) determinar a gravidade da doença de Gaucher, por exemplo comparando o nível de liso-Gb1 livre em um paciente, preferivelmente determinado por um método da presente invenção com o de um escore clínico.

[00188] Em relação a isso, é importante notar que se um nível de liso-Gb1 livre é determinado em amostras dos pacientes que sofrem de doença de Gaucher apresentando a mutação L444P no sequencia- mento do gene da cerebrosidase (homozigoto e heterozigoto composto) submetidos a um método da presente invenção um nível médio de liso- GB1 livre é superior ao nível médio do liso-GB1 livre determinado em amostras dos paciente que sofrem da doença de Gaucher apresentando a mutação N370S no sequenciamento do gene da cerebrosidase, aplicando o mesmo método (Fig.4). A mutação L444P é conhecida por causar um curso mais severo da doença de Gaucher - isto é especialmente verdadeiro no caso em que o paciente é homozigótico em relação à referida mutação. Correspondendo a isso um nível mais alto de liso-GB1 livre é determinado em liso-Gbl homozigótica em comparação com a mutação N370S homozigótica (194 ng/mL e 159 ng/mL, respectivamente, ver Fig.4). Além disso, pacientes tendo uma mutação heterozigótica composta L444P tem um nível de liso-Gb1 livre significativamente menor do que os homozigóticos (89 ng/mL e 45,4 ng/mL, respectivamente). Um especialista na arte conhecerá escores clínicos para categorizar a gravidade da doença de Gaucher ou de sintomas ou da totalidade de sintomas da mesma. É, assim, uma modalidade do método da presente invenção que o curso da doença de Gaucher em um paciente seja previsto e mais particularmente que a gravidade da doença de Gaucher seja determinada com base no nível do marcador biológico determinado de acordo com o método da presente invenção.

[00189] É uma modalidade da presente invenção que níveis de quitotriosidase determinados em pacientes que não têm mutação do gene de quitotriosidase, em particular que não têm duplicação de 24-pb como aqui descrito, servem como base para correlacionar a gravidade da doença de Gaucher em que o nível médio de quitotriosidase determinado em uma amostra dos referidos pacientes como aqui descrito é correlacionado com a gravidade da doença de Gaucher. Assim, por exemplo, um nível de quitotriosidase inferior a 200 nmolMU/h/mL é correlacionado com um estado da doença de Gaucher de um paciente que não sofre da doença de Gaucher. Com referência a isso é importante notar que um paciente tratado por doença de Gaucher pode também apresentar um nível de quitotriosidase inferior a 200 nmolMU/h/mL. Um nível de mais de 2000 nmolMU/h/mL é correlacionado a um estado "totalmente desenvolvido" ou "severo" da doença de Gaucher e um nível de quitotriosidase de 200 a 2000 nmolMU/h/mL é correlacionado a um estado "brando" da doença de Gaucher.

[00190] Em conexão com isso é importante notar que um nível de quitotriosidase de 200 a 1000 nmolMU/h/mL pode também ser encontrado em uma amostra de um paciente que sofre de outra LSD como Niemann-Pick tipo C ou doença de Krabbe, fazendo com que o uso de quitotriosidase para diagnóstico da doença de Gaucher seja inadequado. Assim, as considerações feitas acima com referência ao uso de um nível de quitotriosidase para correlação com a gravidade da doença de Gaucher tipicamente se aplicam somente para pacientes em que a presença ou ausência da doença de Gaucher e/ou de outra LSD conhecidas por apresentarem níveis elevados de quitotriosidase foi provada por análise mutacional.

[00191] Se um nível de liso-Gb1 livre é determinado de acordo com os métodos da presente invenção nos referidos pacientes que não possuem mutação do gene da quitotriosidase, em particular que não possuem uma duplicação de 24- pb como aqui descrito, o referido nível de liso-Gb1 livre determinado em uma amostra de cada um dos referidos pacientes é correlacionado ao nível de quitotriosidase dos referidos pacientes e/ou ao grau de gravidade da doença de Gaucher e/ou do estado da doença de Gaucher do referido paciente. Assim, um grau de gravidade da doença de Gaucher e/ou do estado da doença de Gaucher, incluindo saudável, brando e severo é determinado e mais preferivelmente é correlacionado a níveis de quitotriosidase e/ou faixas de níveis de quitotriosidase como indicado acima.

[00192] Um especialista na arte reconhecerá que o nível do marcador biológico da presente invenção determinado em uma amostra de um paciente em que o referido nível do marcador biológico é correlacionado com a gravidade da doença de Gaucher como descrito acima, será indicativo para aplicação de certa terapia e/ou dose ou dosagem da referida terapia. Por exemplo, se o nível do marcador biológico determinado de acordo com os métodos da invenção é correlacionado com estado "grave" ou "completamente desenvolvido" da doença de Gaucher o paciente é agendado para tratamento da doença de Gaucher e o método para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a cada 3 meses e níveis do marcador biológico assim determinados serão comparados para determinar a eficácia do(s) tratamento(s) e/ou terapia/terapias aplicados ao paciente. Se o paciente atingir um estado, em que o nível do marcador biológico é correlacionado com uma doença de Gaucher "branda" ou em que um nível de marcador biológico estável for mantido ao longo do tempo, a frequência de aplicação dos métodos para diagnóstico da doença de Gaucher em um paciente de acordo com a presente invenção poderá ser reduzida para a cada 6 meses.

[00193] Em outro aspecto a presente invenção é relacionada a um método de determinação da eficácia de uma composição para o tratamento da doença de Gaucher. Esse método pode incluir as etapas de determinar um nível de liso-Gb1 livre em um paciente tendo doença de Gaucher; administrar ao referido paciente o referido composto em um montante suficiente para determinar a eficácia do referido composto; redeterminar o nível de liso-Gb1 livre no referido paciente; comparar o nível de liso-Gb1 livre determinado antes e depois da administração da referida composição, sendo que um nível menor de liso-Gb1 livre determinado após a administração da referida composição comparado ao nível de liso-Gb1 livre determinado após a administração da referida composição indica a eficácia do referido composto para tratamento da doença de Gaucher.

[00194] A presente invenção é agora adicionalmente ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos dos quais outras características, modalidades e vantagens podem ser retiradas.

[00195] Mais especificamente,

[00196] a Fig. 1 A é um diagrama de caixa (boxplot) indicando níveis de liso-Gb1 livre em ng/mL de plasma;

[00197] a Fig. IB é um diagrama de caixa indicando níveis de liso- Gb1 livre em ng/mL de plasma grupados por gênero dos pacientes;

[00198] a Fig. 2A é um gráfico mostrando curvas de características de operação do receptor (receiver operating characteristics (ROC)) de liso-Gb1 livre e quitotriosidase;

[00199] a Fig. 2B é um gráfico mostrando curvas de características de operação do receptor (ROC) de liso-Gb1 livre e CCL18;

[00200] a Fig. 3 A é um diagrama mostrando liso-Gb1 livre em ng/mL de plasma em função do tempo para um total de 20 pacientes alemães com doença de Gaucher;

[00201] a Fig. 3B é um diagrama mostrando liso-Gb1 livre em ng/mL de plasma em função do tempo para um total de 24 pacientes com doença de Gaucher não tratados (10 pacientes alemães, 14 israelenses);

[00202] a Fig. 3C é um diagrama mostrando liso-Gb1 livre em ng/mL de plasma em função do tempo para um total de 9 pacientes israelenses com doença de Gaucher antes e após o início da terapia;

[00203] a Fig. 3D é um diagrama mostrando valores baseados em regressão de liso-Gb1 livre em ng/mL de plasma em função do tempo para pacientes com doença de Gaucher para pacientes israelenses e alemães antes e após o início da terapia;

[00204] a Fig. 4 é uma tabela mostrando o nível mediano de liso-Gb1 livre para duas mutações frequentes;

[00205] a Fig. 5A é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa mostrando intensidade de pico de liso-Gb1 livre e IS de um indivíduo saudável;

[00206] a Fig. 5B é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa mostrando intensidade de pico de liso-Gb1 livre e IS de um paciente com Doença de Gaucher;

[00207] a Fig. 5C é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa mostrando intensidade de pico de liso-Gb1 livre e IS de um paciente com Doença de Gaucher;

Breve Descrição das Figuras

[00208] A Fig. 1A é um diagrama de caixa indicando níveis de liso- Gb1 livre; o eixo y demonstra os níveis logaritmizados de liso-Gb1 livre em ng/mL determinados em plasma de pacientes pelo método de acordo com a presente invenção, em que o eixo x indica grupos de pacientes que foram agrupados como descrito no Exemplo 2. O diagrama de caixa representa os percentis 25 e 75 de cada grupo de pacientes na base e no topo da caixa, respectivamente; a faixa perto do meio da caixa representa o percentil 50 (isto é a mediana) de cada grupo; Os "bigodes" (whiskers) representam um desvio padrão acima e abaixo da média dos dados; Quaisquer dados não incluídos entre os whiskers são mostrados como um caso isolado (outlier) com um pequeno círculo ou estrela. A linha horizontal representa o nível de corte de 5 ng/mL.

[00209] A Fig.1B é um diagrama de caixa indicando os níveis de liso- Gb1 livre como indicado na Fig.1A adicionalmente agrupados por gênero dos pacientes; o eixo y representa os níveis logaritmizados de liso-Gb1 livre em ng/mL determinados em plasma de pacientes pelo método de acordo com a presente invenção, em que o eixo x representa grupos de pacientes, que foram agrupados como descrito no Exemplo 2 e adicionalmente pelo gênero dos pacientes. O diagrama de caixa representa os percentis 25 e 75 de cada grupo de pacientes na base e no topo da caixa, respectivamente; a faixa perto do meio da caixa representa o percentil 50 (por exemplo, a mediana) de cada grupo; Os "bigodes" (whiskers) representam um desvio padrão acima e abaixo da média dos dados; Quaisquer dados não incluídos entre os bigodes são mostrados como um caso isolado com um pequeno círculo ou estrela. A linha horizontal representa o nível de corte de 5 ng/mL.

[00210] A Fig. 2A é um gráfico mostrando curvas de características de operação do receptor (ROC) de liso-GB1 livre e quitotriosidase; o eixo x representa a "1 -especificidade" e o eixo y representa a sensibilidade. Liso-Gb1 livre demonstra uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100%, sendo que quitotriosidase tem no máximo uma sensibilidade de 0,9591 ou 95,91%, respectivamente.

[00211] A Fig. 2B é um gráfico mostrando curvas de características de operação do receptor (ROC) de liso-Gb1 livre e de CCL18; o eixo x representa a "1 -especificidade" e o eixo y representa a sensibilidade. Liso-Gb1 livre demonstra uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100%, sendo que CCL18 tem no máximo uma sensibilidade de 0,8658 ou 86,58%, respectivamente.

[00212] Fig. 3 A O eixo y representa níveis de liso-Gb1 livre em função do tempo determinados pelo método de acordo com a presente invenção em ng/mL de plasma de 20 pacientes alemães com doença de Gaucher que foram submetidos a terapia, mais precisamente ERT, durante o curso do estudo. Cada curva e cada número de paciente, respectivamente, representa níveis determinados em plasma coletado do mesmo paciente em diferentes pontos no tempo indicados no eixo x. O eixo x representa os pontos no tempo de coleta de plasma, em que o ponto no tempo zero indica a primeira medição sob terapia para cada paciente. Para a análise da alteração do nível de liso-Gb1 livre ao longo do tempo em pacientes com doença de Gaucher como descrito no Exemplo 3 dados não agregados foram usados para aqueles pacientes para os quais mais de uma amostra de sangue foi analisada.

[00213] A Fig. 3B é um diagrama que mostra liso-Gb1 livre em função do tempo determinados pelo método de acordo com a presente invenção em ng/mL de plasma de um total de 24 pacientes com doença de Gaucher não tratados (10 pacientes alemães e 14 israelenses); Não tratado neste contexto, preferivelmente significa que nenhum tratamento, por exemplo, terapia de reposição de enzima, foi aplicado em relação à doença de Gaucher. Para a análise da alteração do nível de liso-Gb1 livre ao longo do tempo em pacientes com doença de Gaucher como descrito no Exemplo 3 dados não agregados foram usados para aqueles pacientes para os quais mais de uma amostra de sangue foi analisada.

[00214] A Fig. 3C é um diagrama que mostra liso-Gb1 livre em função do tempo com o liso-Gb1 livre sendo determinado pelo método de acordo com a presente invenção em ng/mL de plasma de um total de 9 pacientes israelenses com doença de Gaucher durante um tempo anterior e posterior ao início da terapia. O eixo x indica o tempo em meses, sendo que "0" indica o primeiro ponto no tempo após o início da terapia. A curva rotulada com "total" indica os valores baseados em regressão de liso-Gb1 livre.

[00215] Fig. 3D é um diagrama que mostra os valores baseados em regressão de liso-Gb1 livre em função do tempo determinados pelo método de acordo com a presente invenção em ng/mL de plasma de um paciente israelense e um alemão com doença de Gaucher durante um tempo anterior e posterior ao início da terapia. O eixo x indica o tempo em meses, sendo que "0" indica o primeiro ponto no tempo após o início da terapia. A curva rotulada com "total" indica os valores baseados em regressão de liso-Gb1 livre.

[00216] A Fig. 4 é uma tabela que mostra o nível mediano de liso- GB1 livre em pacientes positivamente testados para uma de duas mutações frequentes do gene da glicocerebrosidase, a saber N370S e L444P na situação homozigótica, bem como heterozigótica composta, em que heterozigosidade composta é a condição de se ter dois alelos recessivos heterogêneos em um local particular que podem causar doença genética em um estado heterozigótico. Um especialista na arte reconhecerá que pacientes tendo uma mutação L444P do gene da glicocerebrosidase também enfrenta um prognóstico mais maligno, que é particularmente verdadeiro na situação homozigótica. Assim, é uma modalidade da presente invenção que o método de acordo com a presente invenção inclua determinar a gravidade da doença de Gaucher. A referida determinação da gravidade da doença de Gaucher inclui determinar um nível do marcador biológico, preferivelmente liso- GB1 livre, presente na amostra do paciente e/ou comparar o referido nível do referido marcador biológico determinado em amostras de pacientes tendo diferentes mutações do gene da glicocerebrosidase e/ou não tendo nenhuma mutação do gene da glicocerebrosidase. Os presentes inventores verificaram que em uma amostra de um paciente positivamente testado para uma mutação L444P homozigótica do gene da cerebrosidade, o nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método de acordo com a presente invenção é de cerca de 194 ng/mL e é elevado comparado ao nível de liso-Gb1 livre determinado em uma amostra de um paciente sendo positivamente testado para mutação N370S homozigótica do gene da cerebrosidase, em que o nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método de acordo com a presente invenção é de cerca de 159 ng/mL). Os inventores também verificaram que em uma amostra de um paciente positivamente testado para mutação L444P heterozigótica composta o nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método de acordo com a presente invenção é de 89 ng/mL e é significativamente inferior comparado ao nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método de acordo com a presente invenção em uma amostra de um paciente positivamente testado para mutação L444P homozigótica em que o nível de liso-Gb1 livre determinado pelo método de acordo com a presente invenção é de cerca de 45,4 ng/mL. Sem desejarem estar ligados a teoria os presentes inventores acreditam que o nível de liso-Gb1 livre em uma amostra de um paciente determinado por um método da presente invenção é indicativo para gravidade da doença de Gaucher. É, assim, outra modalidade da presente invenção que o método da presente invenção seja para determinação da eficácia de pelo menos um tratamento aplicado a um paciente sendo positivamente testado quanto a estar sofrendo de e/ou estar em risco de desenvolver a doença de Gaucher. Os números indicados em colchetes indicam as faixas de concentração medidas no grupo respectivo de pacientes. IQR significa faixa interquartílica. Todos os pacientes que foram submetidos a uma terapia para doença de Gaucher foram submetidos a ERT.

[00217] A Fig. 5A é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa que mostra intensidade de pico em cps de liso-Gb1 livre e IS de uma amostra de um indivíduo saudável em função do tempo de retenção em minutos. O tempo de retenção de uma substância neste contexto, preferivelmente é indicado no eixo x e é o tempo decorrido entre o tempo de injeção de um soluto, por exemplo, um marcador biológico de acordo com a presente invenção e/ou um padrão interno, e o tempo de eluição do pico máximo do referido soluto Um especialista na arte reconhecerá que o tempo de retenção de uma substância de acordo com os métodos aqui descritos é uma característica única do referido soluto e pode ser usado para fins de identificação. Solução de trabalho de padrão interno incluindo Liso-Gb2 como padrão interno foi adicionada à amostra como descrito no Exemplo 1. É importante entender que com a referida adição de IS à amostra, isto é, spiking da amostra, a ser submetida ao método de acordo com a presente invenção, a concentração de IS na amostra é conhecida e com a determinação da área sob o pico, isto é a área do pico, do padrão interno no referido cromatograma de HPLC- espectrometria de massa, a relação entre uma área de pico e uma concentração de uma substância, por exemplo, de IS e/ou de um marcador biológico, pode assim ser calculada. Mais precisamente, um especialista na arte reconhecerá que uma área de pico de uma substância descrita em um cromatograma de HPLC - espectrometria de massa, como o cromatograma de HPLC - espectrometria de massa descrito na Fig.5A, Fig.5B ou Fig.5C, representa uma medida de uma quantidade da referida substância submetida a uma análise por HPLC- espectrometria de massa. Além disso, um especialista na arte será capaz de calcular o montante da substância em uma amostra de um paciente submetida a uma análise por HPLC-espectrometria de massa, por exemplo, o montante de liso- Gb1 livre em uma amostra submetida ao método da presente invenção, usando uma razão da área de pico de liso-Gb1 livre, cujo montante deve ser determinado pelo referido método para a área de pico de IS, por exemplo, liso-Gb2 livre; bem como curvas de calibração geradas com o referido método e o referido liso-Gb1 livre e/ou IS. Isto permite que subsequentemente se determine o nível de liso-Gb1 livre.

[00218] A Fig. 5B é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa que mostra intensidade de pico de liso-Gb1 livre e IS de uma amostra de um paciente com doença de Gaucher, em que um nível de 17,1 ng/mL de liso-Gb1 livre foi determinado de acordo com o método da presente invenção como essencialmente descrito no Exemplo 1. Comparando o referido nível do marcador biológico na amostra do paciente a um nível de corte de 5 ng/mL, que foi selecionado de forma que uma sensibilidade para diagnosticar doença de Gaucher em um paciente de acordo com os métodos da presente invenção é de 100% e que uma especificidade para diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente de acordo com os métodos da presente invenção é de 100%, um nível elevado do marcador biológico na amostra do paciente comparado ao nível de corte é indicativo de que o paciente está sofrendo da doença de Gaucher.

[00219] Fig. 5C é um cromatograma de HPLC- espectrometria de massa que mostra intensidade de pico de liso-Gb1 livre e IS de uma amostra de um paciente com doença de Gaucher, em que um nível de 319 ng/mL de liso-Gb1 livre foi determinado de acordo com o método da presente invenção como essencialmente descrito no Exemplo 1. Comparando o referido nível do marcador biológico na amostra do paciente a um nível de corte de 5 ng/mL, que foi selecionado de forma que uma sensibilidade para diagnosticar doença de Gaucher em um paciente de acordo com os métodos da presente invenção é de 100% e que uma especificidade para diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente de acordo com os métodos da presente invenção é de 100%, um nível elevado do marcador biológico na amostra do paciente comparado ao nível de corte é indicativo de que o paciente está sofrendo da doença de Gaucher.

Exemplos

[00220] Nos Exemplos descritos a seguir plasma humano foi usado como amostra de um paciente. Não obstante, um especialista na arte reconhecerá que dependendo do tipo de amostra de paciente usada, por exemplo, incluindo saliva, licor, plasma, soro, sangue integral, sangue em um cartão de filtro de sangue seco ou outro produto sanguíneo, o método da presente invenção tem de ser ajustado ao tipo de amostra e, além disso, um nível de corte tem de ser determinado para cada tipo de amostra de acordo com o método descrito nos exemplos a seguir. Os presentes inventores verificaram que o uso de uma amostra de soro humano no método descrito abaixo em vez de uma amostra de plasma humano levará a resultados iguais de acordo com uma detecção de e um assim determinado nível de liso-Gb1 livre, se a amostra de soro humano e a amostra de plasma humano forem derivadas do mesmo paciente, e forem retiradas no mesmo ponto no tempo; sendo as amostras medidas em paralelo; e, mais particularmente, levará ao mesmo nível de corte. Sem ele querer ser preso e em forma de exemplos ilustrativo, com o uso de saliva de um paciente humano, um método pode ser adaptado dependendo do valor de pH da amostra; ou um nível de corte pode ser determinado, sendo de 20 ng/mL se for utilizado sangue integral ou sangue coletado em um cartão de filtro de sangue seco como amostra de um paciente.

Exemplo 1: Método para detecção de liso-Gb1 livre em soro humano Equipamento

[00221] Para detectar liso-Gb1 livre em uma amostra de plasma de um paciente o seguinte equipamento foi usado.

Reagentes

[00222] Para detectar liso-GB1 livre em uma amostra de plasma de um paciente os seguintes reagentes foram usados.

[00223] Na medida em que valores dependem da temperatura (por exemplo, o valor de pH) esses valores foram determinados em uma temperatura de 25° C.

[00224] A abreviação "p.a." neste contexto significa "pró-análise".

[00225] O termo "purum" neste contexto, preferivelmente significa um grau comercial de um composto químico tendo uma pureza do valor especificado acima.

[00226] ASTM-I neste contexto refere-se a uma pureza padrão grau água obtida por métodos de purificação incluindo Osmose Reversa e Oxidação por Ultravioleta (UV).

Preparação de Padrões de Calibração

[00227] Uma solução de estoque de Liso-Gb1 foi preparada dissolvendo 1,70 mg de Liso-Gb1 (como distribuída por Matreya) em 5 mL de MeOH.

[00228] Subsequentemente uma solução Vl -A-534 foi preparada como uma mistura de 12 μL de solução de estoque de Liso-Gb1 e 5 mL DMSO/MeOH (1 : 1 ; v/v) como mostrado a seguir:

[00229] Su bsequentemente os Padrões de Cali bração foram preparados adicionando solução Vl-A-534 ou Padrões de calibração mais concentrados ao solvente MeOH/água (1 :1 ; v/v).

[00230] Um esquema de mistura detalhado será apresentado a seguir.

[00231] Para calibração, padrões de calibração tendo sete níveis de concentração entre 0,400 e 100 ng/mL foram usados, a saber, padrões de calibração Std3A-534, Std4A-534, Std5A-534, Std6A-534, Std7A- 534, Std8A-534 e Std9A-534.

Preparação de Amostras de controle

[00232] Amostras de controle foram preparadas adicionando solução Vl-A-534 ou uma amostra de controle mais concentrada em uma matriz em branco (blank matrix).

[00233] Um esquema de mistura detalhado será apresentado a seguir.

Matriz em branco

[00234] Como matriz em branco, plasma humano de um indivíduo saudável foi usado. Um especialista na arte reconhecerá que o referido plasma de um indivíduo saudável conterá um nível original de liso-Gb1 livre. O referido nível original de liso-Gb1 livre é de aproximadamente 1,4 ng/mL, de acordo com os métodos da presente invenção. É, portanto, óbvio, que amostras de controle preparadas por mistura com a matriz em branco, a matriz em branco contendo o referido nível original do referido liso-Gb1 livre, também contêm o referido nível original de liso-Gb1 livre além do nível de liso-Gb1 livre obtido por mistura com uma solução concentrada ou amostra de controle mais concentrada. Assim, o nível de liso-Gb1 livre nas amostras de controle é o seguinte: QC-Al-534 1 ng/mL + concentração original na matriz em branco QC-B1 -534 5 ng/mL + concentração original na matriz em branco QC-C1 -534 50 ng/mL + concentração original na matriz em branco

[00235] Um especialista na arte reconhecerá que plasma humano de um indivíduo saudável, usado como matriz em branco, pode ser comprado em qualquer fonte comercial conhecida do especialista na arte. É importante notar que se acidentalmente plasma de um indivíduo não saudável, isto é um paciente tendo doença de Gaucher, é usado como matriz em branco, isto resultará em níveis anormalmente altos de liso-Gb1 livre nas amostras de controle determinados pelo método de acordo com a presente invenção, sendo, assim imediatamente reconhecido, uma vez que a tolerância do método é estabelecida dentro de uma faixa de 15% acima ou abaixo dos níveis estimados dos controles submetidos ao método de acordo com a presente invenção.

Amostras de estudo Preparação de Padrão interno

[00236] A solução de estoque de padrão interno (IS 1) foi preparada dissolvendo 1,00 mg de Liso-Gb2 (como distribuído por Matreya) em 2 mL de DMSO / MeOH (1/1 ; vol/vol).

[00237] Subsequentemente a Solução de Trabalho de Padrão Interno foi preparada como uma mistura de 410 μL de solução de estoque ISl e 500 mL de etanol. O etanol pode ser comprado de qualquer fonte comercial, sendo que o etanol é etanol absoluto tendo um grau adequado para os métodos aqui descritos. Uma pessoa com habilidade na arte reconhecerá que proteínas contidas em 50 μL de uma amostra têm de precipitar se 100 μL da referida Solução de Trabalho de Padrão Interno são adicionados à amostra.

Armazenagem de Amostras e Soluções

[00238] Amostras de controle ou amostras de estudo foram imediatamente armazenadas abaixo de -20°C, de uma vez, ou alíquotas foram transferidas para novos frascos de vidro antes da armazenagem nas mesmas condições.

[00239] Soluções concentradas (soluções de estoque, Vl -A-534 etc.) bem como soluções de estoque de padrão Interno foram congeladas abaixo de -20°C até a próxima mistura.

[00240] Soluções de trabalho de padrão interno foram armazenadas entre 2°C e 8°C até utilização.

[00241] Os presentes inventores verificaram que liso-GB1 livre é estável nas soluções acima mencionadas. Mais precisamente, o nível de liso-Gb1 livre de amostras de plasma e/ou soro de um paciente com doença de Gaucher determinadas pelos métodos de acordo com a presente invenção mostraram ser iguais, se o nível de liso-Gb1 livre foi determinado nas referidas amostras antes e após estocagem a 37°C por 2 dias. Assim, as soluções e amostras da presente invenção podem ser transportadas de várias maneiras bem conhecidas de um especialista na arte, sendo que o uso de uma cadeia fria para transporte de material de paciente é preferida, mas não necessariamente exigida. Um especialista na arte também conhecerá métodos e suas respectivas condições para estocagem apropriada de soluções e amostras, em que, por exemplo, as referidas soluções e amostras podem ser armazenadas por várias semanas.

Preparação de Amostra para Análise

[00242] Todas as amostras usadas em uma batelada analítica são preparadas para análise como a seguir:

[00243] Amostras congeladas foram descongeladas a aproximadamente 20 a 25°C em banho de água em condições ambientes. Após descongelamento, as amostras foram misturadas.

[00244] 50 μL de uma amostra foram transferidos para um frasco de amostra.

[00245] 100 μL de solução de trabalho de padrão interno (em EtOH) foram adicionados à amostra.

[00246] A mistura assim obtida foi subsequentemente misturada usando um dispositivo vortex multitubos DVX-2500 a 2500 rpm por cerca de 30 segundos.

[00247] A mistura assim obtida foi centrifugada para separação de fases a 4000 rpm por 2 minutos.

[00248] Um volume do sobrenadante adequado para fins de injeção (aprox. 100 μL) foi transferido para frascos de autoamostragem (cônicos) apropriados.

Métodos Parâmetros cromatográficos e de autoamostragem

[00249] As amostras preparadas para análise como descrito acima foram subsequentemente submetidas ao método descrito a seguir:

[00250] A coluna ACE 3 C8 (coluna ACE C8 Nr. ACE-1 12-0502) aqui usada foi comprada na Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen.

[00251] Será apreciado por um especialista na arte que parâmetros onde uma faixa "±" é indicada representam parâmetros que podem ser ajustados entre sequências. Uma sequência neste contexto, preferivelmente é uma batelada de número definido de amostras, preferivelmente 250 no máximo, analisadas sequencialmente, em que parâmetros, incluindo vazão e temperatura, permanecem inalterados.Ajustes e calibrações realizados entre sequências são conhecidos dos especialistas na arte e incluem troca da coluna.

[00252] Estes ajustes dentro dos limites especificados são alterações menores e são registrados dentro dos dados brutos do estudo na estação de medição.

Detecção

[00253] As amostras assim preparadas foram subsequentemente submetidas ao método de detecção cujos parâmetros são descritos a seguir: Modo de ionização na MS Ionização por eletrospray (ESI) Polaridade na MS: positiva Modo de detecção na MS: Monitoramento de múltiplas reações (MRM) Temp. do vaporizador: 500OC ± 50OC Voltagem de ionização: 5,5 kV Dissociação induzida por colisão (CAD) com gás: baixa Gás 1 : Pressão = 310 KPa (45 psi) Gás 2: Pressão = 413 KPa (60 psi) Curtain gas: pressão = 275 KPa (40 psi) Posição lateral: 5 unidades Posição vertical: 4 unidades Resolução do quadrupolo unidade> unidade Transições 462,4 > 282,2 m/z liso-Gb1 624,5 >282,2 m/z liso-Gb2 (Padrão interno) DP (potencial de desagregação) 40 V CXP (potencial de saída da célula de colisão) 8 V

[00254] Um especialista na arte reconhecerá que métodos para detectar liso-GB1 livre e/ou determinar o nível de liso-GB1 livre em uma amostra de um paciente, usando análise espectrométrica de massa, pode também empregar outras transições e fragmentos que permitem detecção específica de e/ou quantificação de liso-Gb1 livre na referida amostra do paciente.

Avaliação e Cálculo de Resultados

[00255] Para avaliar e calcular resultados obtidos com os métodos acima especificados o seguinte protocolo foi aplicado.

Procedimento de arredondamento

[00256] Dados de concentração alimentados e retirados do sistema de dados cromatográficos (chromatographic data system (CDS)) foram arredondados para cinco dígitos significativos. Outros cálculos da planilha foram realizados até acurácia computacional total e subsequentemente arredondados até os dígitos significativos / casas decimais a serem reportados. Assim, podem ocorrer desvios de resultados intermediários causados por arredondamento. Acurácia e coeficientes de variação (CV) serão reportados com uma ou duas casas decimais, respectivamente.

[00257] Nota referente ao procedimento: de arredondamento: O último dígito reportado seria arredondado se o dígito subsequente fosse igual ou maior do que "5".

Regressão e Estatística

[00258] Com base nos Padrões de Calibração o ajuste da curva de calibração foi estabelecido usando o software de processamento de dados por meio de razões de áreas de pico (área de pico de liso-substância livre contida na amostra do paciente / área de pico do Padrão Interno). Concentrações de liso-substância livre foram avaliadas usando um método de Padrão Interno. Um modelo de regressão quadrática (y = ax2 + bx + c) usando o fator de ponderação 1/conc. Será usado para calcular a concentração de cada analito em cada batelada a ser avaliada. As concentrações foram calculadas por meio da seguinte fórmula:

[00259] Com base na mesma, valores médios, resultados de precisão (em termos de CVs) e acurácias (fórmula mostrada abaixo) serão calculados usando o programa "Lotus 123".

[00260] Modelos estatísticos apropriados são descritos em por exemplo, Green, J.R., Statistical Treatment of Experimental data (Tratamento estatístico de dados experimentais) (Elsevier, New York, 1977), page 210 ff.

[00261] Lothar Sachs, Angewandte Statistik - Anwendung statistischer Methoden (Aplicação de métodos estatísticos) (Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1984)

Software

[00262] Aquisição de dados, processamento de dados, estatísticas e cálculos foram realizados usando o software Analyst® 1.4.2 ou superior (AB SCIEX, USA/Canada) bem como o Lotus 1-2-3 97 ou superior (Lotus Corp, USA). Manuais Manual Arbeiten mit SmartSuite 97 (Trabalhando com SmartSuite 97) (Lotus Development Corp.,1997) Documentação de software usada Documentação do software Analyst® (AB SCIEX, USA/Canada): Manual do operador &Adendo do Manual do Operador "New Functionality in Analyst 1.2" (Nova Funcionalidade do Analyst 1.2) e Sistema online de ajuda do Analyst 1.4 (ou superior)

Exemplo 2: Teste genético e classificação de participantes do estudo

[00263] Após consentimento dos pacientes em participar do estudo, estes foram submetidos a um teste genético para mutações do gene glicocerebrosidase. Assim, 5 a 10 mL de sangue em EDTA foram sequenciados de acordo com Seeman et al. (Seeman et al., 1995). Onde apropriado, outros genes, além do gene da glicocerebrosidase foram sequenciados, particularmente nos controles.

[00264] Além disso, o gene da quitotriosidase foi sequenciado para detecção da duplicação de 24pb como mencionado acima. O referido teste genético foi controlado usando amostras de teste de pacientes de controle com sexo e idade iguais. 253 pacientes foram testados.

[00265] De acordo com o resultado do teste genético acima descrito, pacientes participantes do estudo foram classificados nos seguintes grupos: 1) pacientes tendo doença de Gaucher: padrão-ouro para o diagnóstico foi a detecção de duas mutações patogênicas no gene da glicocerebrosidase, homozigótico ou heterozigótico composto (o grupo é denominado nas figuras como "Gaucher"); 2) pacientes sendo portadores heterozigóticos de uma mutação no gene da glicocerebrosidase (tipicamente parentes dos pacientes afetados) (o grupo é denominado nas figuras como "heterozigótico") 3) pacientes com outros distúrbios lisossômicos de acumulação como controle (o grupo é denominado nas figuras como "outros LSD"); isto inclui pacientes com deficiência de esfingomielinase (Niemann Pick A/B), doença de Krabbe e Niemann Pick C1; todos os diagnósticos foram comprovados pela detecção de duas mutações patogênicas 4) controles saudáveis da mesma idade e gênero (o grupo é denominado nas figuras como "controle"). A Tabela 1a a seguir mostra a classificação dos pacientes nos grupos acima descritos de acordo com os resultados do teste genético acima descrito.Tabela 1a: Pacientes classificados pelos resultados de análise genética

[00266] A distribuição por gênero dos 232 pacientes alemães, bem como dos 21 pacientes israelenses, são mostradas na Tabela 1b.Tabela 1b: 232 pacientes alemães e 21 israelenses classificados por gênero

[00267] A tabela 1c a seguir mostra a distribuição por idade dos 232 pacientes alemães e a classificação dos referidos pacientes com base nos resultados do teste genético descrito acima bem como o gênero dos referidos pacientes.Tabela 1c: Características de 253 pacientes

[00268] O nível de liso-Gb1 livre em amostras dos referidos 253 pacientes foi determinado de acordo com o método descrito no Exemplo 1. O nível de liso-Gb1 livre nas amostras dos referidos pacientes dependente da classificação por análise genética é mostrado na Fig.1A. A Fig. 1B mostra o nível de liso-Gb1 livre em amostras dos referidos pacientes dependendo da classificação baseada em análises genéticas e no gênero dos pacientes.

[00269] O tipo de mutação e a distribuição dos tipos de mutações do gene da glicocerebrosidase em pacientes classificados como pacientes com doença de Gaucher de acordo com os resultados obtidos no teste genético descrito acima são mostrados na Tabela 2 abaixo.Tabela 2: Distribuição de mutações detectadas na população de alemães com Gaucher (166 alelos)

Medição da atividade da quitotriosidase

[00270] Atividade da quitotriosidase foi medida como essencialmente descrito em Hollak et al. (Hollak CE, van Weely S, van Oers MH, Aerts JM. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease (Elevação notável da atividade de quitotriosidase no plasma. Uma nova característica da doença de Gaucher). J Clin Invest. 1994 Mar;93(3): 1288-92) incubando 10 μL de plasma ou soro em EDTA com 100 μL de substrato fluorogênico a 0,022 mM 4- metil-umbeliferil- fl-D-N,N‘- triacetilquitotriose (4 MU-quitotriosídeo; Sigma Aldrich, ST. Louis, MO, USA) como substrato em tampão McIlvaine (ácido cítrico 0,1 M /fosfato de sódio 0,2 M, pH 5,2) a 37°C. Em pacientes com doença de Gaucher, amostras foram diluídas 50x em água desmineralizada antes da incubação. Após 30 min, a reação foi interrompida com 200 μL de tampão glicina 0,5 M/NaOH (pH 10,5) com mistura em temperatura ambiente. A hidrólise do substrato por quitotriosidase produz a molécula fluorescente 4-metil-umbeliferona, que foi quantificada com um fluorímetro (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland), excitação a 366 nm e emissão a 446 nm, e comparada com uma curva de calibração padrão de 4-metil-lumbeliferona. Atividade de quitotriosidase foi expressa como nanomols de substrato hidrolisado por hora por mililitro de soro incubado.

Quantificação de CCL18

[00271] CCL18 em plasma foi quantificado com um kit DuoSet ELISA Development comparado da R&D Systems, Minneapolis, MN, USA de acordo com as instruções do fabricante. A sensibilidade do método foi de 5 pg mL.

Exemplo 3: Diagnóstico de doença de Gaucher usando liso-GB1 livre como marcador biológico

[00272] Os protocolos descritos no Exemplo 1 acima foram usados para gerar cromatogramas de HPLC - espectrometria de massa de 485 amostras de sangue derivadas dos 253 pacientes. Cromatogramas de HPLC - espectrometria de massa mostrando intensidade de pico de liso- GB1 livre e IS de três amostras de dois pacientes com doença de Gaucher e de uma pessoa saudável, como controle, são apresentados, como exemplos, em Fig.5A, Fig.5B e Fig.5C.

[00273] Padrão-ouro para a classificação de pacientes no grupo "Gaucher", foi baseado no sequenciamento da área de codificação completa, bem como das fronteiras íntron-éxon do gene da glicocerebrosidase, de acordo com o teste genético descrito no Exemplo 2, resultando na detecção de ou uma mutação homozigótica ou uma heterozigosidade composta.

[00274] Os resultados da determinação dos níveis de quitotriosidase ou CCL18 em amostras de pacientes foram disponíveis para 58 ou 44 pacientes de doença de Gaucher, respectivamente. Os referidos resultados foram obtidos como descrito no Exemplo 2.

[00275] Para comparar o valor diagnóstico dos diferentes marcadores biológicos e para o cálculo de correlações entre os marcadores biológicos, os dados obtidos pelo método descrito acima foram primeiramente agregados usando para todos os marcadores o primeiro nível medido para pacientes de doença de Gaucher antes da terapia e o nível mais alto para não-Gauchers para um paciente particular se mais de uma amostra de sangue estivesse disponível.

[00276] Técnicas estatísticas de amostras pareadas foram usadas para a comparação de dois marcadores biológicos. O método explora a equivalência matemática de AUC com a estatística U de Mann-Whitney (Delong E.R., Delong D.M., Clarke-Pearson D.L. (1988) Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach, Biometrics, 44, 837-45.).

[00277] A acurácia de níveis dos diferentes marcadores biológicos (liso-Gb1 livre, quitotriosidase e CCL18) obtidos pelo método descrito no Exemplo 1 acima foram avaliados para discriminar pacientes com doença de Gaucher de pacientes sem doença de Gaucher usando análise da curva de características de operação do receptor (Receiver Operating Characteristic (ROC)) (Metz C.E. (1978) Basic principles of ROC analysis, Semin Nucl Med, 8, 283-98; Zweig M.H., Campbell G. (1993) Receiver- operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine, Clin Chem, 39, 561-77). Medição de atividade de quitotriosidase e CCL18 foi efetuada como descrito no Exemplo 2.

[00278] As curvas ROC foram calculadas usando PASW Statistics 18, Release Version 18.0.2 ((c) SPSS, Inc., 2009, Chicago, IL,www.spss.com). As comparações de curvas ROC e modelos lineares mistos foram feitas usando software SAS, Versão 9.2 de SAS System for Windows. (© 2008 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

[00279] As curvas ROC comparando acurácia de níveis de quitotriosidase e liso-Gb1 livre são mostradas na Fig.2A e as curvas ROC comparando acurácia de níveis de CCL18 e liso-Gb1 livre são mostradas na Fig.2B, respectivamente.

[00280] Os resultados apresentados nas curvas ROC mostradas na Fig.2A e Fig.2B mostram também a especificidade e a sensibilidade do método de acordo com a presente invenção dependendo de diferentes níveis de corte de liso-Gb1 livre. A Tabela 3 abaixo mostra, assim, a sensibilidade e a especificidade do método de acordo com a presente invenção dependendo de diferentes níveis de corte de liso-Gb1 livre.Tabela 3: Sensibilidade e especificidade do método para diagnosticar doença de Gaucher dependendo do nível de corte de liso-GB1 livre em pacientes alemães (n=232)

[00281] Comparação do nível do marcador biológico em uma amostra de um paciente determinado pelo método de acordo com a presente invenção com o nível de corte, preferivelmente um nível de corte que permite um diagnóstico tendo alta especificidade e alta sensibilidade, permite, assim, diagnosticar a doença de Gaucher no referido paciente, sendo que um nível elevado do marcador biológico na amostra do paciente em comparação com o nível de corte é indicativo de um paciente sofrendo de ou estando em risco de desenvolver a doença de Gaucher e um nível baixo do marcador biológico na amostra do paciente comparado com o nível de corte é indicativo de um paciente não sofrendo de ou não estando em risco de desenvolver a doença de Gaucher.

[00282] A área sob a curva (area under the curve) (AUC) e os limites do intervalo de confiança de 95% para os diferentes marcadores biológicos são mostrados na tabela 4.Tabela 4: Sensibilidade e especificidade para diferentes marcadores biológicos para diagnosticar Gaucher.

[00283] Assim, na tabela 3, a sensibilidade e a especificidade dos marcadores biológicos apresentados, usados em um método para diagnosticar doença de Gaucher em uma amostra de um paciente, são comparadas usando um nível de corte tendo a AUC mais alta no respectivo método usando o respectivo marcador biológico. É apresentado o nível de corte ideal do respectivo método. Medição de atividade de quitotriosidase e CCL18 foi efetuada como descrito no Exemplo 2. Liso-Gb1 livre foi determinado de acordo com o método da presente invenção. O nível de corte ideal é 5 ng/mL.

[00284] Um especialista na arte reconhecerá que o método de acordo com a presente invenção usando liso-Gb1 livre como um marcador biológico para diagnosticar a doença de Gaucher é claramente vantajoso em relação a métodos usando CCL18 ou quitotriosidase. Isto é especialmente verdadeiro, pois pelo menos 6% da população caucasiana e até 35% por exemplo, da população latino- americana, incluindo os com doença de Gaucher, são deficientes em atividade de quitotriosidase.

[00285] Assim, níveis de liso-Gb1 livre determinados em uma amostra de um paciente de acordo com o método da presente aplicação superiores a 5,0 ng/mL permitem diagnosticar que o paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver doença de Gaucher com uma sensibilidade e uma especificidade de 100%.

Exemplo 4: Análise de alteração de marcadores biológicos ao longo do tempo

[00286] O método e pacientes usados em conexão com este Exemplo foram aqueles descritos nos Exemplos 1 a 3.

[00287] Para analisar como os níveis de marcadores biológicos se alteraram ao longo do tempo em pacientes tendo doença de Gaucher, dados não agregados foram analisados para aqueles pacientes para os quais mais de uma amostra de sangue foi analisada. Um ponto no tempo zero foi definido para a primeira medição com terapia para cada paciente.

[00288] Os níveis de liso-Gb1 livre ao longo do tempo para pacientes individuais são mostrados em Fig.3A, Fig.3B e 3C.

[00289] Para testar a significância de uma redução ao longo do tempo de níveis de liso-Gb 1 livre indicativos de uma terapia de sucesso, níveis de liso-Gb 1 livre após início da terapia foram comparados a níveis de liso-Gb 1 livre antes do início da terapia usando modelos lineares mistos. Pacientes não tratados não demonstraram nenhuma redução significativa de liso-Gb 1 livre ao longo do tempo.

[00290] Assim, os valores de liso-Gb 1 livre foram logaritmizados para superar a assimetria na distribuição dos valores. Para levar em conta a heterogeneidade entre pacientes nos valores de partida bem como na taxa de alteração foram usados modelos aleatórios de interseção e inclinação. Em todos os modelos a heterogeneidade observada foi estatisticamente significativa. Somente valores-p para redução linear no tempo são reportados.

[00291] Os valores para tempo e aqueles valores que incorporaram um termo quadrático para o tempo foram centrados para testar uma relação curvilínea entre tempo e nível de marcador para Quitotriosidase e para CCL18. Para liso-Gb 1 livre o termo quadrático não melhorou o modelo e não foi incorporado ao modelo final.

[00292] Como terapia, pacientes alemães foram tratados com 40U/kg de peso corporal em média, em que unidades se referem a unidades de glicocerebrosidase recombinante em ERT. A redução de liso-Gb 1 livre é especificamente intensa após início da terapia (após 6 meses <0,0001). Mas também a redução ao longo do tempo é significativa (<0.0001). Há uma redução de liso-Gb1 livre após 12 meses de tratamento em uma faixa de 60% em média.

[00293] As características da presente invenção divulgadas no relatório, as reivindicações, a listagem de sequências e/ou os desenhos podem, tanto separadamente como em qualquer combinação dos mesmos ser material para realizar a invenção em várias formas da mesma.

Claims

1. Método in vitro para diagnosticar a doença de Gaucher em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) detectar um marcador biológico em uma amostra do paciente, em que o marcador biológico é liso-GB1 livre, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que compreende amostra de sangue, amostra de soro, amostra de plasma e amostra de filtro de sangue seco, e em que a liso-Gb1 é de fórmula (I):

b) determinar o nível do marcador biológico presente na amostra, c) comparar o nível do marcador biológico na amostra do paciente com um nível de corte, em que, se o nível do marcador biológico na amostra do paciente for maior que o nível de corte, isto é indicativo de que o paciente está sofrendo ou está em risco de desenvolver a doença de Gaucher, em que o nível de corte é de 20 ng/mL se a amostra for uma amostra de sangue ou amostra de filtro de sangue seco, e o valor de corte é de 5,0 ng/mL se a amostra for uma amostra de soro ou amostra de plasma, e em que o marcador biológico é detectado por meio de análise espectrométrica de massa.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que liso-Gb1 livre é liso-Gb1 como presente no paciente e não o resultado de manipulação da amostra do paciente.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar pelo menos um marcador biológico adicional na amostra do paciente, em que pelo menos um marcador biológico adicional é selecionado a partir do grupo que compreende quitotriosidase e CCL18.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador biológico adicional é detectado por meio de imunoensaio, análise espectrométrica de massa, arranjo de biochip, ácidos nucleicos funcionais e/ou um derivado fluorescente de liso-Gb1 livre.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra de sangue total ou uma amostra de filtro de sangue seco.

6. Método para determinar a eficácia de um composto para o tratamento de doença de Gaucher, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) determinar o nível de um marcador biológico em uma amostra de um paciente tendo doença de Gaucher; b) determinar novamente o nível do marcador biológico em uma amostra do referido paciente após o referido composto ter sido administrado ao referido paciente; c) determinar se o nível do marcador biológico determinado na etapa a) é inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa b), em que, se o nível do marcador biológico determinado na etapa b) for inferior ao nível do marcador biológico determinado na etapa a), isto indica a eficácia do referido composto, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que compreende amostra de sangue, amostra de soro, amostra de plasma e amostra de filtro de sangue seco, e em que o marcador biológico é liso-GB1 livre, em que liso- Gb1 é de fórmula (I):