CN105463085A - 一种检测戈谢病gba基因突变的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物。检测方法包括样品采集、PCR扩增以及测序。本发明可用于检测戈谢病相关的基因突变位点，特异性好，灵敏度高；家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代戈谢病的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前景。

Description

一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

戈谢病(Gaucherdisease，GD)是溶酶体糖脂贮积症中最常见、发病率最高的一种，为常染色体隐性遗传，最早由法国医生Gaucher报道。GBA基因编码葡糖脑苷脂酶，位于1q21染色体上。GD是由GBA基因变异，造成溶酶体中的酸性β-葡糖苷又称葡糖脑苷脂(Glucocerebrosidase，GC)无法正常水解为神经酰胺，因而释放的β-葡萄糖脑苷脂被网状内皮系统(脾、肝、骨髓)的巨噬细胞吞入并贮存于其溶酶体中形成典型的戈谢细胞，正常的骨髓基质被特征性戈谢细胞(电镜下可见胞浆中有特异的管状脑苷脂包涵体)取代，导致细胞失去原有的功能，引起肝脾逐渐增大等一系列症状。

GD属于罕见疾病，在世界各地广泛流行，发病率为1/(10-40)万，在我国发病率为1/(20-50)万。任何年龄自出生至80岁均可发病，自1948年首次报道以来，各地均有病例发生。临床上根据神经系统病变的严重程度将GD分为三类:Ⅰ型为最普遍的发病形式，在成人中发现较多，不涉及神经系统病变，Ⅰ型GD进展缓慢，脾切除后可长期存活，智力正常，惟生长发育落后。Ⅱ和Ⅲ型主要在婴幼儿和青少年中发病，涉及神经系统病变。Ⅱ型GD多于发病后1年内死于继发感染，少数可存活2年以上。Ⅲ型GD多由于神经系统症状较重，常死于病发症。

目前DNA技术可诊断定位于人类染色体1q21的GBA基因，基因长度为7.6kb，含有11个外显子，在此基因的下游16kb处有一高度同源的假基因。目前鉴定的致病突变位点大约有300多个，常见的是N370S(c.1226A>G)和L444P(c.I448T>C)两种突变。近来国外学者对GD的基因型研究已确定了42种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基因融合与基因转化等。其中最常见的错义突变导致合成的GC催化功能及稳定性降低。目前已经发现一些基因型与表现型存在相关性，例如N370S等位基因多与Ⅰ型GD患者相关；L444P等位基因多与神经型相关，L444P纯合子多表现为Ⅲ型，而L444P与其他基因结合时通常表现为Ⅱ型。其他基因型如F213I、D409H、G202R可能与GD神经系统损害表型有密切相关性。但是现在还很难将临床病征确切的归因于某一种基因型。

虽然GD的基因型-表现型的相关性十分复杂，但是一些基因型与患者症状有关。通过对GBA基因的检测，有助于诊断GD。Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用Sanger测序法对GBA序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。

为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液基因组DNA。由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。

溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，对于PCR的设定退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以只有在保证特异性的情况下，设计引物的Tm值尽量接近，使PCR的退火温度保持一致，从而达到PCR条件的统一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测GBA基因的突变位点，特异性好，灵敏度高。

本发明的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物；其中，PCR引物如下：

GBA-3/4-F：CATGTCTTCATCAGACCTCA；

GBA-3/4-R：GCTCTATGTCATCTTGTCCC；

GBA-5/6-F：CTCTCCTATTGACTCGGACTAC；

GBA-5/6-R：GATCCCACATCCTTGCTG；

GBA-7-F：GCTGGGATTACAGGTGTGAG；

GBA-7-R：GTCATTTGGATGCTGGATTT；

GBA-8-F：AAAATCTCCCCAAACCTC；

GBA-8-R：AAGGAAAGGGAAGATAGG；

GBA-9Fy：GACCCTTACCTACACTCTCTGG；

GBA-9Ry：CTGACCCTGCTTTTCTGC；

GBA-10/11-F：GTGGGTGACTTCTTAGATGAGG；

GBA-10/11-R：GTGCCCTCTTTAGTCACAGAC。

所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂和反应缓冲液。

本发明的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)采集待测血液样本，提取DNA；

(2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。

所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、62℃30s、72℃40s，15个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃10min。

所述步骤(2)中的PCR反应体系为：PCR扩增反应试剂10μL，ddH₂O6μL，上下游引物各1μL，样品DNA2μL。

有益效果

本发明可用于检测与戈谢病相关的基因突变位点，特异性好，灵敏度高；可用于临床作为戈谢病早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，降低误诊率和避免延误治疗；家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干预，可降低后代戈谢病的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是GBAexon6W814R突变型(A)与野生型(B)基因的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.样本抽提

(1)抽取200μL的全血，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

(2)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm(13400×g)离心30秒，倒掉废液。

(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(9)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm(13400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

2.实验过程

(1)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应体系每管20μL分装于反应管中。

(2)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：

试剂名称	用量(uL)
		premix Taq	10
上游引物(5uM)	1
		上游引物(5uM)	1
ddH2O	6
		模板	2

PCR反应条件，见下表：

3.测序分析

4.Sanger测序的具体步骤如下：

4.1测序PCR：

4.1.1试剂配制：按下表进行，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。

BigDye体系：

酶纯化体系：

原料	1X	需要体积量(ul/管)
			CIP	0.1ul	-
Exo I	0.5u l	-
			去离子水	1.4ul	-

4.2PCR产物纯化

4.2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。

4.2.2取9ulPCR产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。

4.2.3将混匀样品按照如下反应条件上PCR仪，进行酶纯化扩增。

37℃→95℃→4℃

50'5'+∞

4.2.4纯化好的样品用于下一步测序反应，如当日不用放冷冻保存。

4.3测序反应

4.3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。

4.3.2每反应体系5ul，BigDye混合液和5P引物固定加1ul，模板一般加2ul，最大量为3ul(根据PCR产物电泳结果调整，)，用水补足5ul。

4.3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul引物加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的BigDye混合液，最后加入模板。

4.3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。

4.3.5按照如下反应条件上PCR仪，进行测序反应。

95℃→95℃→56℃→60℃→4℃

4'15”20”2'+∞

25个循环。

4.4.测序反应后乙醇纯化，上机。

4.4.1将扩增完的PCR产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mMEDTA，然后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。

4.4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。

4.4.3加入50ul的20℃预冷75％乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。

4.4.4300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。

4.4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和Hi-Di^TM各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静置15min.使测序产物完全溶解。

4.4.6将Hi-Di^TM溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至PCR扩增仪上，95℃预变性5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。

数据分析：应用sequencinganalysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的标准序列进行比对，确认样本的基因序列。

5.临床标本比对：前期临床标本检测30例，试剂盒检测结果符合率90％。

因此，使用本发明试剂盒，采用测序技术，对GBA基因突变进行检测。可以通过特异性引物和带荧光标记的ddNTP，检测出与戈谢病相关的基因突变位点。可以用于临床可戈谢病的早期发现、早期明确诊断的辅助性指标，以及戈谢病病人的早期筛选方法。

Claims (5)

1.一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物；其中，PCR引物如下：

GBA-3/4-F：CATGTCTTCATCAGACCTCA；

GBA-3/4-R：GCTCTATGTCATCTTGTCCC；

GBA-5/6-F：CTCTCCTATTGACTCGGACTAC；

GBA-5/6-R：GATCCCACATCCTTGCTG；

GBA-7-F：GCTGGGATTACAGGTGTGAG；

GBA-7-R：GTCATTTGGATGCTGGATTT；

GBA-8-F：AAAATCTCCCCAAACCTC；

GBA-8-R：AAGGAAAGGGAAGATAGG；

GBA-9Fy：GACCCTTACCTACACTCTCTGG；

GBA-9Ry：CTGACCCTGCTTTTCTGC；

GBA-10/11-F：GTGGGTGACTTCTTAGATGAGG；

GBA-10/11-R：GTGCCCTCTTTAGTCACAGAC。

2.根据权利要求1所述的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂和反应缓冲液。

3.一种如权利要求1所述的检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)采集待测血液样本，提取DNA；

(2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中GBA基因扩增的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。

4.根据权利要求3所述的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、62℃30s、72℃40s，15个循环；95℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃10min。

5.根据权利要求3所述的一种检测戈谢病GBA基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR反应体系为：PCR扩增反应试剂10μL，ddH₂O6μL，上下游引物各1μL，样品DNA2μL。