CN103575909A - 一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒 - Google Patents

一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒包括：包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。本发明所述的试剂盒可快速检测马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体，使用安全。

Description

一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及采用ELISA方法检测东部马脑脊髓炎病毒抗体的试剂盒，尤指一种间接ELISA检测IgM抗体的试剂盒，适用于对马科动物血清中的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体进行检测，属于动物检验检疫领域。
背景技术
东部马脑脊髓炎病毒（Eastern equine encephalomyelitis virus，EEEV）是一种经节肢动物传播的病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。病毒可感染马、鸟以及人类，可经Aedes，Coquillettidia和Culiseta属的蚊虫叮咬传播。该病毒在蚊虫和鸟类之间循环传播。马匹感染之后致死率可达到90%。本病的诊断方法包括临床检查，病理学检查，病毒分离和血清学检测。但对于实验室而言，往往并不能得到有关临床方面的信息，仅仅是接到独立的血清，有时仅凭抗体效价很难确定其感染情况。
血凝抑制试验（HI）和病毒中和实验（VN）是诊断疑似病例的标准方法，但在本病的地方流行地区，马匹往往接种过相关疫苗，使得实验室的血清学检测工作复杂化。
研究表明，对于马而言，感染本病后3天就可检出IgM抗体，但中和抗体7天后才能检出。而且IgM抗体可以持续30天左右。但IgG抗体可持续90天以上。因此检测IgM抗体对于马匹早期感染以及鉴别免疫接种抗体有一定意义。研究表明，E2蛋白暴露在病毒的表面，是决定病毒抗原性的主要成份，能够诱导动物产生中和抗体。
由于E2可诱生中和抗体，因此成为疫苗、诊断制剂研究的重点。本研究利用E2蛋白富含抗原表位，具有种特异性这一特点，运用原核高效表达系统进行E2结构蛋白的表达，以期获得大量纯化的E2重组蛋白，建立EEEV特异性IgM间接ELISA诊断方法，可应用到国内疫情监测和进出口马属动物的检测，为我国EEEV检测提供新的检测方法，同时为开发拥有自主知识产权的国产EEEV诊断试剂奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒采用东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白作为包被抗原，可快速、准确地对马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体作出评价。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其包括：包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。该E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照为东部马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清；阴性对照为东部马脑脊髓炎病毒抗体呈阴性的马血清。
进一步地，上述试剂盒中，所述洗涤液为PBST洗涤液（含0.5%Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液）。
所述样品稀释液为1％卵清蛋白溶液，取卵清蛋白1g，溶于100mL1×PBST缓冲液中。
所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
所述底物溶液由5.0mL的TMB（1mg/mL），42.5mL的柠檬酸-醋酸缓冲液（0.1mol/L，pH5.0），和2.5mL尿素过氧化氢（3mg/mL）混合而成。
本发明还提供了上述检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）东部马脑脊髓炎病毒抗原的制备：从东部马脑脊髓炎病毒总RNA中扩增获得了E2基因片段，构建原核表达载体，在基因工程菌中高效表达，并将表达的E2重组蛋白纯化；
（2）将步骤（1）得到的东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白包被于酶标反应板；
（3）试剂盒组装：将步骤（2）制备的包被东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白的酶标反应板与洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液组装成试剂盒。
上述步骤中，E2重组蛋白包被于酶标反应板的具有方法为：将纯化的E2重组蛋白用包被液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）稀释为0.20μg/mL，100μL/孔加入酶标反应板，包被条件为37℃1h，然后于4℃条件下过夜，然后弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，加入1％卵清蛋白，100μL/孔，37℃封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，然后真空包装，存于4℃备用。
本发明的优点是：本发明选择东部马脑脊髓炎病毒保守的E2糖蛋白作为目标，经重组表达获得了E2蛋白，以重组蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法并研制出试剂盒，取得了优异的技术效果：
1）简便快速：可快速的对马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体作出评价。
2）特异：与西部马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清及委内瑞拉马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清不发生交叉反应。
3）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。
4）安全：不接触病毒，不具有生物安全问题。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为EEEV-E2基因片段RT-PCR扩增产物电泳结果，M,DL2000分子量标准;1,阴性对照;2,EEEV-E2基因RT-PCR扩增产物。
图2为pET32a-EEEV-E2菌液PCR扩增产物的电泳结果，M,DL2000分子量标准;1～2,菌液PCR阳性结果；3,菌液PCR阴性结果。
图3为重组蛋白EEEV-E2的SDS-PAGE分析，M，蛋白质分子量；1，重组菌未诱导表达产物；2，重组菌诱导表达菌液上清；3，重组菌诱导表达4h产物；4，重组菌诱导表达6h产物。
图4为重组蛋白EEEV-E2纯化前后的SDS-PAGE分析，M，蛋白质分子量；1、2，His·Bind Kits纯化前蛋白；3，纯化的重组蛋白。
图5为EEEV E2重组蛋白的western blotting鉴定。M，蛋白质分子量标准；1,pET32a空载体表达菌；2,重组表达菌未诱导产物；3,重组表达菌诱导6h表达产物。
具体实施方式
实验材料
TRIZOL，购自Invitrogen公司；
限制性内切酶EcoR I、Hind III，购自TaKaRa公司；
One-step RNA RT-PCR试剂盒，购自TaKaRa公司；
胰蛋白胨及酵母粉:购自Oxiod公司；
IPTG，X-Gal等：购自TaKaRa公司；
T4DNA连接酶：购自TaKara公司；
DNA快速纯化回收试剂盒，Mini-BEST质粒提取试剂盒，DL2000Maker，Ex HSTaq，6×loading buffer，均购自TaKaRa公司；
三羟甲基氨基甲烷（Tris-碱）、甘氨酸：购自上海生物工程公司；
N’N’—二甲基甲叉双丙稀酰胺、丙烯酰胺：购自华美生物工程公司；
BugBuster Protein Extraction Reagent，购自Novagen公司；
HIS.BIND蛋白纯化试剂盒，购自Novagen公司；
山羊抗马IgM二抗辣根过氧化物酶（HRP）标记，KPL公司产品。
底物TMB（Sigma）、BSA（MP Biomedicals）、明胶（MP Biomedicals）、脱脂奶（BD），购自中科科奥生物科技有限公司。
96孔平底聚苯乙烯酶标板，美国corning公司产品。
实施例1包被抗原E2重组蛋白的获得
1、方法
1)EEEV E2编码基因的序列分析
运用DNAMAN6.0，DNASTAR7.0，VECTOR NTI Advance10.0软件包对东部马脑脊髓炎病毒E2蛋白的基本特性（包括分子量，等电点及潜在糖基化位点）进行预测。
2)EEEV E2基因特异性引物的设计与合成
分析GenBank数据库中的EEEV ssp.North American variant株结构蛋白基因E2，通过序列比对，采用Oligo6.0软件，设计了1对包含E2完整基因的引物，命名为EEEV-E21和EEEV-E22，并在引物中引入酶切位点，旨在将E2基因克隆入表达载体pET32a，构建原核表达质粒pET32a-EEEV-E2。
引物编号、长度等见表1，其中斜体下划线表示引入的酶切位点。
表1EEEV结构蛋白基因E2引物编号、序列、目的片段长度及引入的内切酶
Figure BDA0000408395860000041
以EEEV-E21和EEEV-E22为上下游引物扩增EEEV完整的结构蛋白基因E2，预期扩增产物长度为1279bp，经双酶切克隆至原核表达载体pET32a，构建重组表达质粒pET32a-EEEV-E2，可表达一含607氨基酸、分子量约67kDa、N端带有His-tag的融合蛋白。
3）EEEV E2基因的RT-PCR扩增
EEEV购自军事医学科学院，通过现有技术中已知的RNA提取方法获得总RNA，然后采用一步法扩增包含东部马脑脊髓炎病毒完整的E2蛋白基因片段。反应条件：50℃30min,94℃2min;94℃/30s,55℃/30s,72℃/150s,共33循环。
表2RT-PCR一步法扩增体系
组分 体积
10x one step RNA PCR Buffer 5μL
MgCl2(25mmol/L) 10μL
dNTP MIxture(各10mmol/L) 5μL
Rnase Inhibitor(40U/μL) 1μL
AMV RTase XL(5U/μL) 1μL
AMV-Optimized Taq(5U/μL) 1μL
EEEV-E21(10μmol/L) 2μL
EEEV-E22(10μmol/L) 2μL
EEEV RNA 5μL
Rnase Free dH2O 18μL
总体积 50μL
反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物。EEEV结构蛋白基因E2的RT-PCR结果见图1。电泳结果显示RT-PCR目的片段大小与预期结果一致。
4）pET32a-EEEV-E2原核表达重组质粒的构建
目的基因PCR产物与表达载体质粒pET32a的双酶切，利用限制性内切酶Sac I/HindIII分别对目的基因PCR产物和表达载体质粒pET-32a37℃过夜双酶切。
回收PCR产物和酶切后的目的基因及表达载体DNA参照TaKaRa DNAFrangment Purification KitVer.2.0说明书操作：取适量PCR反应液，加入3倍量的DBBuffer，均匀。将试剂盒中的Spin Colum安置于Collection Tube上，将PCR与DB的混合溶液转移到Spin Colum中，12,000r/min离心1min，弃滤液。将500μL的Rinse A加入Spin Colum中，12,000r/min离心30s，弃滤液。将700μL的Rinse B加入Spin Colum中，12,000r/min离心30s，弃滤液，并重复洗涤一次。最后，将Spin Colum安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Colum膜中央处加入25～30μL灭菌水，室温静至1min，然后12,000r/min离心1min洗脱DNA。
目的基因与载体DNA的连接与转化按顺序加入下列试剂建立10μL的连接体系，将纯化回收后的PCR产物与表达载体1连接：
Figure BDA0000408395860000051
Figure BDA0000408395860000061
离心混匀于管底，16℃连接2h。
从-80℃冰箱取出冰冻的Top10感受态细胞（100μL/管）于冰上融化，轻弹管壁使其混匀。将10μL连接液加入上述盛有感受态细胞的离心管中；轻弹管外壁使其混匀，冰浴30min；42℃水浴热激60s后立即冰浴2min；加入900μL LB培养液，150r/min，37℃培养60min；取100μL菌液涂布于Amp/LB平板，37℃培养过夜，利用抗性筛选重组转化体。
重组表达质粒的鉴定：重组质粒pET32a-EEEV-E2的菌液PCR鉴定结果见图2。电泳结果显示扩增片段的大小与预期结果一致，初步说明得到阳性重组表达质粒。
5)基因工程重组菌的诱导表达
将鉴定后的重组表达质粒pET32a-EEEV-E2转化E.coli Rosseta感受态细胞，涂布于Amp/LB平板，37℃培养过夜，利用氨苄抗性筛选重组转化菌。挑取阳性重组菌的单菌落，接种于3mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃活化过夜后，1:100稀释到相应抗性的LB中，37℃、230r/min振摇培养至对数生长期（OD600=0.6～1.0），加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、230r/min振摇诱导培养2～6h。分别于诱导前和诱导后不同时间取出1.5mL，5000r/min离心5min收集菌体，弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检查表达情况。重组蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加，在诱导后4h表达量即达到高峰。薄层扫描结果表明，pET32a-EEEV-E2表达量可达到45%，结果见图3。
6）亲和层析纯化His-EEEV-E2融合蛋白
大肠杆菌的裂解：使用Novagen的BugBuster Protein Extraction Reagent，可以温和的破碎大肠杆菌细胞壁来释放表达蛋白。操作步骤如下：
收集菌泥沉淀，称量菌体湿重。按照每克菌体湿重加入5mLBugBuster试剂和5μL（即5×25单位）Benzonase核酸酶（用于降解核酸和降低抽提物粘度）室温重悬菌体，吹打或轻柔漩涡混匀，将混匀物置于水平摇床上室温下孵育10～20min。将孵育后的细胞抽提物离心，分别收集上清和不溶性沉淀。上清为可溶性蛋白，沉淀即为包涵体。
将包涵体沉淀重悬于BugBuster试剂中（仍按照1:5的体积），吹打或漩涡彻底均匀。
加入6倍体积1:10稀释的BugBuster试剂，漩涡1min，离心收集包涵体。
再将包涵体沉淀重悬于1:10稀释的BugBuster试剂，漩涡均匀1min，离心，收集包涵体沉淀。同条件重复重悬、混匀、离心一次，收集包涵体沉淀。
重悬包涵体沉淀于含有6mol/L盐酸胍的1×结合缓冲液中，充分涡旋混匀，冰浴孵育1h，彻底溶解蛋白。16,000g离心30min以除去不溶性成份，0.45微米滤膜过滤上清，再进行后续蛋白的纯化操作。
包涵体蛋白的纯化
树脂的准备与平衡：His·Bind Kits试剂盒中使用的树脂是IDA琼脂糖（His·BindResin）。将一支Novagen加样柱套在色谱柱上，首先向空色谱柱中加2～3mL灭菌去离子水，使液体浸湿滤芯部分，能够正常流动。将小瓶His·Bind树脂轻柔颠倒彻底重悬树脂。用一扩口吸头将所需悬液的量加入色谱柱中（1mL悬液含0.5mL树脂，完全沉降后柱床体积为0.5mL），待树脂在重力作用下自然沉降。当树脂沉降、保存液的液面将至树脂表面时，按以下顺序清洗、离子化和平衡色谱柱：①3倍体积的灭菌去离子水；②5倍体积的1×离子化缓冲液；③3倍体积的1×结合缓冲液。
柱层析：待结合缓冲液下降至树脂表面，小心加入制备好的包涵体溶液，并缓慢滴加10倍体积的1×结合缓冲液（含6mol/L盐酸胍变性剂）。然后缓慢加入6倍体积的1×漂洗缓冲液（含6mol/L盐酸胍变性剂）。再缓慢加入6倍体积的1×洗脱缓冲液（含6mol/L盐酸胍变性剂）洗脱结合蛋白。洗脱可按需要分段收集。将蛋白收集液进行SDS-PAGE，检测蛋白的洗脱效果以及洗脱蛋白的纯度和浓度。结果显示得到了高纯度的E2重组蛋白，见图4，经分光光度计测定，蛋白浓度为0.476mg/mL。
EEEV-E2重组蛋白的超滤（除盐、浓缩）
纯化后的蛋白存在于含有6mol/L盐酸胍变性剂的溶液中，采用超滤的方法进行蛋白的除盐和浓缩：将蛋白样品用50mmol/L Tris-HCl缓冲液（PH8.0）进行4倍稀释（参考蛋白的浓度），将稀释好的蛋白样品分装到超滤管（Vivaspin500，10K）中，每管0.5mL样品，14,000r/min，4℃离心10min。向第一次过滤后的超滤管内再加入0.5mLTris-Cl缓冲液，14,000r/min，4℃离心10min。向第二次过滤后的超滤管内再加入0.5mL Tris-Cl缓冲液，14,000r/min，4℃离心10min。如次反复稀释、离心共3～5次，最后一次适当延长离心时间，将蛋白样品适当浓缩。收集除盐浓缩后的蛋白样品，用少量缓冲液冲洗滤膜，收集残余蛋白，与样品合并。最后，混匀超滤后的蛋白样品，测定浓度，分装，作好标记，冻存于－80℃。该E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
实施例2、E2重组蛋白抗原的抗原性分析
1、材料
马EEEV IgM阳性血清，由美国NVSL提供
2、方法
Western Blotting鉴定
电转印将基因工程诱导菌和对照菌全菌体蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，按如下操作进行电转印：裁剪大小与凝胶面积一致的Whatman增厚滤纸2张和NC转印膜1张，并将NC膜在转移缓冲液中平衡15min。在半干转印槽的阳极上制备“三明治”，从负极到正极依次放置增厚滤纸1、凝胶、NC膜、增厚滤纸2，放置时用玻棒轻轻滚动赶除气泡，并倒上少量转印缓冲液保持湿润；固定好阴极平板，合上安全盖，连接电泳仪，恒流20mA转印40min。
免疫检测转印结束后，取出NC膜在蒸馏水中漂洗一下，然后放到装有封闭液的平皿中，在脱色摇床上室温孵育1.5h进行封闭。倾去封闭液，用洗涤液PBST洗膜3次，每次5min。然后将NC膜转入适量的一抗溶液（以封闭液1:40稀释的IgM阳性血清）中，室温下振荡1～2h；PBST洗膜3次，每次5min。再将NC膜转入适当稀释的酶标二抗溶液（以封闭液1：1000稀释的HRP-Anti-horse IgM），室温振荡1～1.5h；PBST洗膜3次，每次5min。使用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色反应，待条带清晰后迅速用蒸馏水终止反应。结果见图5。图中显示纯化的融合蛋白在66kDa处出现清晰的特异性反应条带，而对照菌没有反应，表明E2重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并保留了与EEEV IgM阳性血清反应的抗原性。
实施例3、试剂盒的配制和使用
1、试剂盒的组成见表3。
表3试剂盒配制组成
Figure BDA0000408395860000081
其中，包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板的制备方法为：将实施例1纯化的E2重组蛋白用包被液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）稀释为0.20μg/mL，100μL/孔加入酶标反应板，包被条件为37℃1h，然后于4℃条件下过夜，然后弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，排干反应板，加入1％卵清蛋白，100μL/孔，37℃封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，排干反应板，然后真空包装，存于4℃备用。
阳性对照为东部马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清，用样品稀释液稀释至用本方法检测的OD值为1.0+/-0.1的范围内。阴性对照为东部马脑脊髓炎病毒抗体呈阴性的马血清，用样品稀释液作1:100稀释。
所述洗涤液为PBST洗涤液（含0.5%Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液）。
所述样品稀释液为1％卵清蛋白溶液，取卵清蛋白1g，溶于100mL1×PBST缓冲液中。
所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
所述底物溶液由5.0mL的TMB（1mg/mL），42.5mL的柠檬酸-醋酸缓冲液（0.1mol/L，pH5.0），和2.5mL的尿素过氧化氢（3mg/mL）混合而成]
2、试剂盒的使用方法
1）用样品稀释液100倍稀释被测样品（例如：10μL样品加990μL样品稀释液）。不稀释阳性和阴性对照。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在添加到包被板前混匀。
2）使用前所用试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或振荡予以混合。浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，并摇动使沉淀盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10倍稀释。
3）取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。在A1孔内分别加入100μL没有稀释的阴性对照。在B1的孔内分别加入100μL没有稀释的阳性对照。在其余孔内分别加入100μL已稀释好的样本。
4）37℃下孵育1小时（湿盒内）。
5）吸取各孔的液体弃入废液筒。用大约350μLl洗涤液洗涤板孔，重复4次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。注意应避免包被板孔干燥。在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上。
6）稀释酶标二抗，酶标二抗用样品稀释液作1:2000稀释。每孔加入100μL稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗。
7）37℃下孵育45min（湿盒内）。重复上面的步骤5）。
8）每孔加入100μL底物液，室温下孵育15分钟。每孔加入100μL终止液，使反应终止。测量并且记录样本和对照的OD值（450nm）。
9）结果判定。符合下列条件，实验方能有效：阳性对照的值必须大于或等于0.5，阴性对照值必须小于或等于0.250。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，试验应重做，并应全面的仔细核对各组份。EEEV IgM抗体的临界值为计算为阴性对照＋0.3。如果测定的OD值低于临界值，样品应判为EEEV IgM抗体阴性。如果测定的OD值高于临界值，样品应判为EEEV抗体阳性。
实施例4、试剂盒对临床样品的检测
1、材料
马EEEV IgM阳性血清，由美国NVSL提供；
2000年以来184份进口马阴性血清进行检测
2、间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
应用试剂盒检测30份进口马阴性血清，每份血清重复2孔，按照已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出OD450nm值，计算出30份血清的OD450nm值的平均值和标准方差，阴阳性临界值等于阴性血清OD450nm值的平均值+3×标准方差，从而算出阴阳性临界值。根据统计学原则，OD450nm值>X+3SD时，可以在99.9%的水准上判定为阳性，故可得出实验结果的判断标准。
表4EEEV-E2-ELISA检测30份阴性马血清的结果
Figure BDA0000408395860000101
经上表数据可计算出阴性血清OD450nm平均值=0.172，标准差=0.040，所以阴阳性临界值=阴性样本OD450nm平均值+3×标准方差（3SD）=0.172+3×0.040=0.292，为了判断方便，把临界值定为0.3。在规定的实验条件下，血清样本作1:100稀释，其OD450nm值大于临界值，即待检血清样本OD450nm值>0.3，判为阳性；若待检血清样本OD450nm值<0.3，判为阴性；当OD450nm值等于0.3，判为可疑样本，需要重复检测，并根据样本来源及背景综合判定。
3.间接ELISA方法的特异性试验
将6种其他马虫媒病阳性血清包括西部马脑脊髓炎IgM阳性血清、委内瑞拉马脑脊髓炎IgM阳性血清、西尼罗热阳性血清、非洲马瘟阳性血清、水泡性口炎印第安纳型阳性血清以及水泡性口炎新泽西型阳性血清作1:100稀释，同时作EEEV IgM阳性血清作对照，每份血清重复2孔，作ELISA测定，结果见表5。
表5特异性试验结果
Figure BDA0000408395860000112
结果表明，这6种马虫媒病的阳性血清的OD450nm值均小于0.3，为阴性，说明与纯化的EEEV E2重组蛋白抗原没有交叉反应。从交叉反应的试验结果可看出，本方法的特异性良好。
4.间接ELISA方法对已知阴阳性血清的检测
本发明建立的试剂盒对2份EEEV阳性血清和184份进口马阴性血清进行检测，与预期结果一致。从此结果也可以看出，进口血清中尚无东部马脑脊髓炎病毒抗体。
Figure IDA0000408395960000011
Figure IDA0000408395960000031

Claims (10)

1.一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST洗涤液。
5.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为1％卵清蛋白溶液。
6.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
7.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为由5.0mL的浓度为1mg/mL TMB，42.5mL的浓度为0.1mol/L，pH5.0柠檬酸-醋酸缓冲液，和2.5mL的浓度为3mg/mL尿素过氧化氢组成的混合溶液。
8.一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
（1）东部马脑脊髓炎病毒抗原的制备：从东部马脑脊髓炎病毒总RNA中扩增获得了E2基因片段，构建原核表达载体，在基因工程菌中高效表达，并将表达的E2重组蛋白纯化，该E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
（2）将步骤（1）得到的东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白包被于酶标反应板；
（3）试剂盒组装：将步骤（2）制备的包被东部马脑脊髓炎病毒E2重组蛋白的酶标反应板与洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液组装成试剂盒。
9.根据权利要求8所述检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，E2重组蛋白包被于酶标反应板的具体方法为：将纯化的E2重组蛋白用包被液稀释为0.20μg/mL，100μL/孔加入酶标反应板，包被条件为37℃1h，然后于4℃条件下过夜，然后弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，加入1％卵清蛋白，100μL/孔，37℃封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，然后真空包装，存于4℃备用，其中，所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。
10.权利要求1-7任一所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒在检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体中的应用。
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