CN103566374A - 聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其制备方法以及聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体及其制备方法，所述载体包含聚乙烯亚胺衍生物和脂质成分，其中聚乙烯亚胺衍生物与脂质成分的质量比为0.05∶1-20∶1，优选1∶1-8∶1；所述载体的粒径为1-100,000nm，优选10-500nm。本发明还涉及聚乙烯亚胺脂质复合纳米药物，其由包载有药物的所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体构成。

Description

聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体,其制备方法以及聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物

技术领域

本发明涉及基因治疗的递送载体领域，具体地，一种脂质体复合载体，其制备方法和包载有药物的所述载体。 

背景技术

基因治疗主要通过向靶细胞或组织中引入外源的DNA或RNA片段以纠正或补偿基因的缺陷或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。在基因治疗中，基因递送技术包括将目的基因、基因片断或短链干扰RNA导入到靶细胞内以达到治疗目的的方式。基因递送技术和用于基因递送的系统(如载体等)是基因治疗的关键，也是基因治疗从实验研究阶段走向临床应用阶段的重要挑战。 

理想的基因递送技术的载体应具备以下特征：(1)靶向特异性；(2)稳定性，容易制备；(3)无毒性；(4)有利于基因高效递送和长期表达。近年来，阳离子脂质体已经成为基因递送技术中非常广泛而具代表性的一种，其属于非病毒载体。 

伴随着研究的深入和市场的扩大，各国研究者也在不断的开发适合市场应用的具有高的基因递送效率、高的生物相容性、高的体内靶向性的新型基因递送载体。 

发明内容

本发明的第一方面提供一种聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体。其是在传统阳离子脂质体的基因递送系统的研究基础上，将脂质体技术与纳米聚合物胶束技术结合而构建的，是一种制备简单、成本低廉、安全性好、转染效率高的非病毒基因递送系统。 

本发明另一方面提供一种制备上述聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体 的方法。 

本发明另一方面提供一种聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物，其由包载有药物的上述聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体构成。 

本发明中的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体包含聚乙烯亚胺衍生物和脂质成分，其中聚乙烯亚胺衍生物与脂质成分的质量比为大约0.05∶1-20∶1，优选大约1∶1-8∶1；粒径为大约1-100,000nm，优选大约10-500nm。 

本发明所述的脂质成分包括胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种或多种，优选选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、卵磷脂或3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇，及其组合。 

本发明中所述的聚乙烯亚胺衍生物可溶于极性有机溶剂如氯仿、二氯甲烷、乙醇等，以及水中，其重均分子量在大约1000-1,000,000道尔顿之间。其优选选自聚乙烯亚胺基三(十二烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十六烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基-油酸，及其组合。 

本发明所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体可以通过聚乙烯亚胺衍生物与脂质成分的复合来制备含聚乙烯亚胺和脂质成分的纳米颗粒。在本发明的一个实施方案中，上述制得到纳米颗粒可以利用聚乙烯亚胺表面的-NH₂或脂质成分如1，2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG所含的功能化基团羧基、氨基等与蛋白或抗体进行偶联，以制备表面修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体。 

本发明中所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的制备方法包括但不限于乳化蒸发法，薄膜分散法、逆向蒸发法、复乳法、离心法等。 

其中乳化蒸发法的步骤包括：将聚乙烯亚胺衍生物和脂质成分共溶于极性有机溶剂中混匀作为有机相，得到的混合物中聚乙烯亚胺衍生物质量浓度约1％-100％，脂质成分的质量浓度约0.1％-60％；水相为含质量浓度约0.1％-20％吐温-80的0.9％的生理盐水或pH在大约6-9之间的缓冲液；将上述得到的水相与有机相混合，水相和有机相的体积比为约1∶6-6∶1，进行超声乳化，然后旋转蒸发除去所述极性有机溶剂。 

其中薄膜分散法的步骤包括：将壳聚糖长链烷基季铵盐(最终质量浓度1％-100％)和脂质成分(最终质量浓度0.1％-60％)共溶于有机溶剂如氯仿中，混匀作为有机相；除去有机溶剂使成薄膜，然后加入水相通过振荡使脂质膜水化，其中使用的水相为0.9％的生理盐水或pH约为6-9的缓冲溶液。 

本发明中所述的脂质成分包含构成普通脂质体和阳离子脂质体的脂类，如选自胆固醇、卵磷脂、二油酰脂酰乙醇胺(DOPE)、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺，及其组合。 

本发明所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体可以包载有药物以制备聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物。 

所述的药物包括有机药物、水溶性药物、水不溶性药物、基因DNA/siRNA、探针和诊断试剂，如治疗基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗叶酸类(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤类(如巯嘌呤)、抗嘧啶类(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸还原酶抑制药(如羟基脲)、脱氧核糖核苷酸多聚酶抑制药(如环胞苷)、直接影响和破坏DNA结构及其功能的药物(如氮芥、环磷酰胺、氮甲、顺铂、丝裂霉素、喜树碱)，及其组合。 

本发明所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体可以用一些特定功能的蛋白进行表面修饰；所用的蛋白修饰剂选自表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”三肽序列(RGD)，以及单克隆抗体曲妥珠 

单抗(Trastuzumab)，及其组合。使用以上物质对载体进行表面修饰的方法包括直接对所述复合纳米载体的表面修饰或先制备含活性成分的前体物质再进行组装等方法。 

如此得到的EGF抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体对EGF受体高表达的肿瘤细胞，如肿瘤细胞SMMC-7721和MCF-7等，具有靶向性。EGF抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的制备方法优选为先制备在水相中浓度为约0.1-5mg/mL的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的 纳米粒，然后使用偶联剂将EGF抗体偶联到纳米粒的表面，其中所用的聚乙烯亚胺衍生物、脂质成分和EGF抗体的质量浓度分别为约1％-100％，0.1％-60％，和0.1％-39％。 

本发明所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体可以用于对药物和基因的递送、缓释、控释、逆转肿瘤细胞的耐药特性及对疾病的诊断和治疗。本发明的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体作为基因转染的非病毒载体时，与商业可获得的阳离子脂质体 

2000相比，具有更低的细胞毒性和更高的基因转染效率。 

具体实施方式

实施例1：聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的制备 

称取聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵(PQA)(季铵盐取代度为90.0％，重均分子量为1,000Da)15.0mg，DOPE 12.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液I，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温真空干燥24h后，再用pH＝7.4的5.0mL PBS缓冲溶液II超声水化10分钟(薄膜法)；或将溶液I和溶液II共混乳化，超声10分钟，待形成稳定的乳液后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏至二氯甲烷挥发完全；得PQA/DOPE纳米粒。 

所得的聚乙烯亚胺脂质体复合纳米载体是一种阳离子高分子脂质体载体。类似的可用其他脂质成分代替DOPE制备聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体。 

实施例2：转铁蛋白抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的制备 

以转铁蛋白抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体PQA/DOPE为例，具体的实验过程如下： 

如实施例1所述制备质量浓度为1.0mg/mL的聚乙烯亚胺脂质体复合纳米载体PQA/DOPE溶液50mL(pH＝7.4的PBS缓冲液)备用；80mg转铁蛋白溶于2mL pH＝7.4的PBS缓冲液中备用；将上述二备用溶液混合。 1.065mg SPDP(N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫)-丙酸酯)溶于80μl无水乙醇，在搅拌下将SPDP滴加入上述溶液中，25℃反应40分钟。离心超滤4次除去未反应的SPDP和其它小分子物质，得转铁蛋白修饰的聚乙烯亚胺脂质体复合纳米载体PQA/DOPE。 

实施例3：EGF抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的方法。 

配置溶有EGF抗体(质量浓度为1.0mg/mL)的PBS溶液(pH＝7.4，浓度0.1mol/L)备用；配置如实施例1所制备的质量浓度为1.0mg/mL的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体(PQA/DOPE溶液)备用；将EGF抗体溶液和PQA/DOPE纳米溶液按体积比为1：1进行混合，加入EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)(1.0mg/mL)和NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)(0.5mg/mL)，混合均匀，反应10-48小时，之后透析，除去未反应的EDC和NHS，冻干后备用。1mg聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体可连接有0.08mg EGF抗体。 

使用以上方法可类似地制备其它抗体修饰的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体。 

实施例4：聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物 

称取聚乙烯亚胺基-油酸(重均分子量为2,000Da)15mg，卵磷脂15mg，胆固醇8.0mg，溶于3ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液I，然后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温真空干燥24h；称取3.0mg长春新碱溶于5mlPBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，摇匀使长春新碱充分溶解得水溶液II；然后将上述5.0ml长春新碱溶液II加入茄形瓶中，在超声的条件让脂质薄膜充分水化，超声10min后，过凝胶分离柱分离游离的药物得包载有长春新碱的聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物。使用此方法制备的包载有长春新碱聚乙烯亚胺脂质体纳米载体的包封率可达90.0％以上，且在Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中具有良好的缓控释功能。 

用类似方法也可分别制得由包载了其它水溶性药物的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体构成的聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物，只须将 需要的水溶性物质溶于相应的水溶液II既可。 

实施例5：聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物 

本实施例为制备载基因聚乙烯亚胺脂质纳米粒的探讨。 

配制质量浓度为1mg/mL的PQA/DOPE溶液备用；配置质量浓度为1.0g/L的绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒的溶液备用；在室温下，将二者按质量比为3∶1进行混合，孵育20-30分钟后得到载有基因的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的溶液。 

实施例6：聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物的转染实验。 

转染的方法包括以下步骤： 

(1)转染前24h，将生长状态良好的乳腺癌MCF-7细胞常规消化后种板，无抗生素全培养基培养过夜，在转染时细胞融合度应达到80％； 

(2)播种细胞24h之后，移除培养孔中的全培养基，洗后，每孔加入无血清的培养基使细胞处于饥饿状态； 

(3)将实施例5的聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物及阳性对照加入细胞培养版中，前后晃动培养板使其充分混匀； 

(4)将细胞培养版置于37℃细胞培养箱中培养24-48h； 

(5)24h之后取出培养版置于荧光显微镜下进行观察拍照，并将转染后的细胞常规消化并清洗后，用流式细胞仪进行定量分析或用化学发光仪进行定量。 

结果表明，实施例5所制备的所制备的包载绿色荧光蛋白质粒的聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物在293T(市购)和NIH-3T3(市购)细胞中的转染效率与阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000相当，但前者与后者相比在L929细胞(小鼠成纤维细胞)具有更低的细胞毒性。 

尽管本发明的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体、聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述 的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。 

Claims (9)

1.一种聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，包含聚乙烯亚胺衍生物和脂质成分，其中聚乙烯亚胺衍生物与脂质成分的质量比为0.05∶1-20∶1，所述载体的粒径为1-100,000nm。

2.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其中所述质量比为1∶1-8∶1。

3.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其中所述粒径为10-500nm。

4.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其中所述的脂质成分选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，及其组合。

5.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其中所述的聚乙烯亚胺衍生物选自聚乙烯亚胺基三(十二烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十六烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基-油酸，及其组合。

6.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体，其中所述载体用选自表皮生长因子，血管内皮生长因子，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽，以及曲妥珠单抗，及其组合，的蛋白修饰剂进行表面修饰。

7.权利要求1所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

a)将聚乙烯亚胺衍生物和脂质成分溶于极性有机溶剂中，混匀得到含有质量浓度1％-100％的聚乙烯亚胺衍生物和质量浓度0.1％～60％的脂质成分的有机相；

b)制备水相，其为含质量浓度0.1％～20％吐温-80的0.9％的生理盐水或pH为6-9的缓冲液；

c)将水相与有机相按体积比1∶6-6∶1混合进行超声乳化；

d)旋转蒸发除去极性有机溶剂。

8.一种聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物，其由包载有药物的权利要求1-6所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米载体构成。

9.权利要求8所述的聚乙烯亚胺脂质复合纳米基因药物，其中所述药物选自治疗基因、RB基因、p53基因、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、顺铂、丝裂霉素、喜树碱、阿霉素、光辉霉素、长春碱、依托泊苷，及其组合。