CN103555694B - 一种纤维素酶的液态发酵生产方法 - Google Patents

一种纤维素酶的液态发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纤维素酶的液态发酵生产方法，其特征在于，包括一次发酵和二次发酵过程。本发明采用二次发酵酶液的方法优化了纤维素酶发酵工艺路线，缩短了在相同发酵时间内比现有发酵工艺获得相同酶活力的发酵时间，使得酶制剂产品质量提高、生产成本降低，更利于实现工业化生产。而且，本发明方法生产工艺简单、操作简便、技术方法容易掌握，且添加剂来源即为经过过滤处理后的自身发酵酶液，不需要另外购进添加剂而增加成本。

Description

一种纤维素酶的液态发酵生产方法
技术领域
本发明涉及纤维素酶发酵领域，特别涉及一种纤维素酶的液态发酵生产方法。
背景技术
纤维素是地球上十分丰富的可再生资源，它占植物干重的35-50％。利用纤维素酶将纤维素降解为低聚糖、双糖或单糖，从而进一步生产其他生物基产品，例如单细胞蛋白、酒精等，对于解决目前面临的能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素酶是一种由三种组分组成的混合酶系，包括葡聚糖内切酶(C1酶)、葡聚糖外切酶(Cx酶)、β-葡萄糖苷酶(BG酶)。目前，纤维素酶的应用已经扩展到医药、遗传、纺织、日用化工、造纸、环境、食品发酵、饲料、工业洗涤、石油开采、资源再生、废水处理、农业、生物能源等各个领域，尤其是在生物能源方面的应用，前景十分广阔。
纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。
目前，纤维素酶的生产方法一般是固态发酵和液态发酵。固态发酵成本低，但易污染杂菌，不易提取，难以进行大规模工业化生产。而液态发酵，属于密闭式发酵，发酵过程中不易污染，且发酵条件易控制，后期分离提取酶液简便，因此便于大规模生产。生产高活性的纤维素酶不仅高产菌株是一个关键因素，优良的发酵工艺路线，包括培养基、发酵时间、发酵温度等也是关键所在。
发明内容
本发明目的在于提供一种纤维素酶的液态发酵生产方法。本发明采用二次发酵酶液的方法优化了纤维素酶发酵工艺路线，缩短了在相同发酵时间内比现有发酵工艺获得相同酶活力的发酵时间，使得酶制剂产品质量提高、生产成本降低，更利于实现工业化生产。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种纤维素酶的液态发酵生产方法，其特征在于，包括一次发酵过程和二次发酵过程，
其中，所述一次发酵过程为：(1)向一次发酵培养基中加入纤维素酶产生菌A进行一次发酵，所述一次发酵培养基以纤维素为底物，当一次发酵液的滤纸酶活为10-20IU/ml时停止发酵，得到一次发酵液，(2)除去一次发酵液中的纤维素酶产生菌A的菌丝残片以及孢子，得到一次酶液；
所述二次发酵过程为：(1)分别向二次发酵的二次发酵培养基中加入一次酶液和纤维素酶产生菌B，从而构成发酵体系，其中，一次酶液的添加量为使所述发酵体系中滤纸酶活为0.03～1IU/ml，(2)在所述发酵体系中进行发酵，以生产纤维素酶。
优选的是，所述纤维素酶产生菌A与所述纤维素酶产生菌B为同一种的菌种。
优选的是，所述纤维素酶产生菌A与所述纤维素酶产生菌B为不同种的菌种。
优选的是，所述纤维素酶产生菌A为桧状青霉，所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉。
优选的是，所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉。
优选的是，所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉Rut C30。
优选的是，所述二次发酵过程中所述一次酶液的添加量为使所述发酵体系中滤纸酶活为0.5～0.7IU/ml。
优选的是，所述一次发酵过程中的步骤(2)中，将一次发酵液在800～1200rpm下离心4～6min后，再用0.22～0.8μm的滤膜过滤，得到所述一次酶液。
优选的是，所述一次发酵过程中的步骤(2)中，将一次发酵液在800～1200rpm下离心4～6min后，再用0.45μm的滤膜过滤后，得到所述一次酶液。
优选的是，所述一次发酵过程中的步骤(1)中，将经纤维素酶产生菌A培养获得的种子液与一次发酵培养基按照体积比为1∶20～1∶100进行接种，在22～28℃条件下发酵72～132h。
本发明的有益效果是本发明方法由于一次酶液发酵获得过程中纤维素酶产生菌A对纤维素的水解作用，产生了可溶性的寡糖、双糖和单糖，这些可溶性糖为二次酶液获得过程中所述发酵体系中的纤维素酶产生菌B的菌丝的生长提供了碳源和能源，同时为纤维素酶的表达提供了诱导性物质。因此，既使得了纤维素酶产生菌B的菌丝的快速生长，也使得纤维素酶产生菌B产酶时间提前，与现有常规发酵方法相比较，在相同发酵时间时提高了酶活或者获得相同酶活力时缩短了发酵时间，使得酶制剂产品质量提高、生产成本降低，更利于实现工业化生产。一次发酵液要经过离心和过滤去除其中的纤维素酶产生菌A的菌丝以及孢子，从而不会影响到二次酶液的发酵，还能提高纤维素酶的发酵效率。总之，本发明方法生产工艺简单、操作简便、技术方法容易掌握，且添加剂来源即为经过过滤处理后的自身发酵酶液，不需要另外购进添加剂而增加成本。
附图说明
图1为本发明所述纤维素酶的液态发酵生产方法的流程图。
图2为用30ml二次发酵培养基时本发明所述产纤维素酶的液态发酵方法与常规发酵方法发酵效果对比图。
图3为用5L二次发酵培养基时本发明所述产纤维素酶的液态发酵方法与常规发酵方法发酵效果对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
纤维素酶活力测定
本发明涉及的酶活力测定为滤纸酶活。
本发明涉及的各种酶活力同意定义为：在50±0.1℃，pH4.8的条件下，1ml酶液水解底物1min产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，用IU/ml表示。
所述的酶活检测方法均根据国际方法IUPAC进行。
滤纸酶活力的测定方法：1ml粗酶液，在50±0.1℃，pH4.8的条件下，水解50±1mg滤纸1h所产生的还原糖的量，用DNS法测定还原糖的生成量。
实施例2
1)实验组：本发明所述纤维素酶液态发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30以及桧状青霉9-3作为纤维素酶液态发酵的生产菌，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h菌种种子液；
一次发酵：(1)将青霉与木霉种子液分别按照体积比为1∶20的接种量接种发酵培养基，将青霉在30℃条件下发酵120h，将木霉在26℃条件下发酵120h，分别得到青霉一次发酵液和木霉一次发酵液，(2)将两种一次发酵液分别在1200rpm离心5min后经0.45μm的滤膜过滤除去杂质(残留菌丝、孢子等)获得青霉一次酶液和木霉一次酶液，用IUPAC方法测定滤纸酶活，4℃保存备用；
二次发酵：(1)将编号为1、2、3和4的4个250ml锥形瓶内的各30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，按照0.03IU/ml的酶活力分别向1和2号锥形瓶中添加青霉一次酶液和木霉一次酶液，按照与添加青霉一次酶液和木霉一次酶液的体积相同的量分别向3和4号锥形瓶中添加青霉一次发酵液和木霉一次发酵液，(2)在4个锥形瓶中分别按体积比为1∶20接种木霉菌种种子液，制得发酵体系。将配制好的4个1锥形瓶的发酵体系在26℃条件下发酵72-120h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
2)对照组：常规纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
酶液发酵过程：将250ml锥形瓶内的30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，添加与实验组一次酶液体积相同的发酵培养基为对照，按照体积比为1∶20的接种量接种到30rnl发酵培养基上，在26℃条件下发酵72-120h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
结果如表1所示，添加经过滤处理的酶液，能达到相同发酵时间提高酶活力或达到相同酶活力时缩短发酵时间的作用，而未经过滤处理的酶液不仅没有上述作用，反而对产酶有所抑制。
实施例3
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种到种子培养基，28℃培养18-24h；
一次发酵：将培养的菌种里氏木霉按照体积比为1∶20的接种量接种到发酵培养基，在26℃条件下发酵120h，1200rpm离心5min得到一次发酵液，将一次发酵液离心后经0.22μm、0.45μm以及0.8μm的滤膜过滤除去杂质(残留菌丝、孢子等)获得一次酶液，将所得一次酶液取100μl涂布PDA平板，28℃培养4～6天，以不经过滤只经过离心的发酵液为对照，结果显示：经0.22μm、0.45μm过滤后的酶液均无菌落，而0.8μm过滤后的酶液有少量菌落，未经过滤的酶液菌丝长满平板。由于酶液属于黏稠性液体，0.22μm滤膜过滤时，滤膜容易堵，且过滤后的酶液其酶活力有所损失，0.8μm的滤膜过滤不能完全去除一次酶液中的菌丝残片、孢子等，所以优选0.45μm的滤膜。
实施例4
实验组：本发明所述纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
一次发酵：将种子液按照体积比为1∶20的接种量接种发酵培养基，在26℃条件下发酵120h，1200rpm离心5min得到一次发酵液，将一次发酵液离心后经0.45μm的滤膜过滤除去杂质(残留菌丝、孢子等)，用IUPAC方法测定滤纸酶活，4℃保存备用；
二次发酵：将250ml锥形瓶内的30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，按照0.03IU/ml体系添加一次酶液，按照体积比为1∶20的接种量接种发酵培养基，在26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
3)对照组：常规纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
酶液发酵过程：将250ml锥形瓶内的30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，添加与实验组一次酶液体积相同的发酵培养基为对照，按照体积比为1∶20的接种量接种到30rnl发酵培养基上，在26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
结果如附图2所示，在相同发酵时间提高酶活16.6％，而达到相同酶活力时发酵时间缩短了24h。
实施例5
1)实验组：本发明所述纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种到种子培养基，28℃培养18-24h；
一次发酵：将培养的菌种里氏木霉按照体积比为1∶20的接种量接种到发酵培养基，在26℃条件下发酵120h，1200rpm离心5min得到一次发酵液，将一次发酵液离心后经0.45μm的滤膜过滤除去杂质(残留菌丝、孢子等)获得一次酶液，用IUPAC方法测定一次酶液的滤纸酶活，4℃保存备用；
二次发酵：将250ml锥形瓶内的各30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，按照0.03IU/ml体系添加一次酶液，按照体积比为1∶20的接种量接种到5L发酵培养基，控制溶氧在20-30％，控制pH在5.0-5.5，并在25-26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
2)对照组：常规纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
酶液的发酵：将种子液按照体积比为1∶20的接种量接种到5L发酵培养基，控制溶氧在20-30％，控制pH在5.0-5.5，并在25-26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到纤维素酶液。
结果如附图3所示，在相同发酵时间提高酶活21.4％，达到相同酶活力时发酵时间缩短了24h。
实施例6
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
一次发酵：将种子液按照体积比为1∶20的接种量接种发酵培养基，在26℃条件下发酵120h，1200rpm离心5min得到一次发酵液，将一次发酵液离心后经0.45μm的滤膜过滤除去杂质(残留菌丝、孢子等)，用IUPAC方法测定滤纸酶活，4℃保存备用；
二次发酵：将250ml锥形瓶内的各30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，添加0.03IU/ml、0.67IU/ml、1IU/ml的一次酶液，按照体积比为1∶20的接种量接种发酵培养基，在26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
4)对照组：常规纤维素酶发酵方法
菌种活化：在纤维素酶产生菌中，选取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作为生产菌株，经传代活化后，在PDA斜面保存于4℃备用；
菌种培养：用无菌水将斜面孢子洗下，血球计数板调整孢子浓度为107个/ml，按照体积比为3∶100的接种量接种种子培养基，28℃培养18-24h获得种子液；
酶液发酵过程：将250ml锥形瓶内的各30ml里氏木霉发酵培养基在115℃、101Mpa的条件下灭菌、冷却后，添加与实验组一次酶液体积相同的发酵培养基为对照，按照体积比为1∶20的接种量接种到30ml发酵培养基上，在26℃条件下发酵24-132h，1200rpm离心5min得到二次酶液。
根据表2数据，得出在添加酶量使发酵培养基酶活力为0.67IU/mL时所所得二次酶液的酶活力最高为11.53。
实施例6说明在相同发酵条件下同种产纤维素酶菌种液态发酵过程中向二次发酵体系中添加不同酶活力的一次酶液后，二次发酵过程获的酶活分别为：10.27、11.53、10.43，说明了在相同发酵条件下同种产纤维素酶菌种液态发酵过程中向二次发酵体系中添加滤纸酶活为20IU/30ml的一次酶液后，二次发酵过程获得酶活最高。
纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。由于一次酶液发酵获得过程中纤维素酶。本发明所述方法的一次酶液中利用产纤维素酶的水解作用将纤维素分解成可溶性的寡糖、双糖和单糖，这是所有纤维素酶都能做到的，而这些可溶性糖为二次酶液获得过程中所述发酵体系中的纤维素酶产生菌的的生长提供了碳源和能源，同时为纤维素酶的表达提供了诱导性物质，加速了二次酶液中酶量的产生。所以依次类推，本发明方法不仅试用于具有代表性的里氏木霉RUT-C30以及桧状青霉9-3，也试用于其他种类的纤维素酶产生菌。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (3)

1.一种纤维素酶的液态发酵生产方法，其特征在于，包括一次发酵过程和二次发酵过程，
其中，所述一次发酵过程为：(1)向一次发酵培养基中加入纤维素酶产生菌A进行一次发酵，所述一次发酵培养基以纤维素为底物，当一次发酵液的滤纸酶活为10-20IU/ml时停止发酵，得到一次发酵液，(2)除去一次发酵液中的纤维素酶产生菌A的菌丝残片以及孢子，得到一次酶液；
所述一次发酵过程中的步骤(2)中，将一次发酵液在800～1200rpm下离心4～6min后，再用0.22～0.8μm的滤膜过滤，得到所述一次酶液；
所述一次发酵过程中的步骤(1)中，将经纤维素酶产生菌A培养获得的种子液与一次发酵培养基按照体积比为1∶20～1∶100进行接种，在22～28℃条件下发酵72～132h；
所述二次发酵过程为：(1)分别向二次发酵的二次发酵培养基中加入一次酶液和纤维素酶产生菌B，从而构成发酵体系，其中，一次酶液的添加量为使所述发酵体系中滤纸酶活为0.03～1IU/ml，(2)在所述发酵体系中进行发酵，以生产纤维素酶；
所述二次发酵过程中所述一次酶液的添加量为使所述发酵体系中滤纸酶活为0.5～0.7IU/ml；
所述纤维素酶产生菌A与所述纤维素酶产生菌B为同一种的菌种，且所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉；
或者
所述纤维素酶产生菌A与所述纤维素酶产生菌B为不同种的菌种，其中，所述纤维素酶产生菌A为桧状青霉，所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉。
2.如权利要求1所述的纤维素酶的液态发酵生产方法，其特征在于，所述纤维素酶产生菌B为里氏木霉Rut C30。
3.如权利要求1所述纤维素酶的液态发酵生产方法，其特征在于，所述一次发酵过程中的步骤(2)中，将一次发酵液在800～1200rpm下离心4～6min后，再用0.45μm的滤膜过滤后，得到所述一次酶液。
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