CN103550257A

CN103550257A - 一种鲜蟾皮超微粉的制备方法

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Publication number: CN103550257A
Application number: CN201310527414.5A
Authority: CN
Inventors: 陈欢; 陈照荣; 黄绳武
Original assignee: ZHEJIANG BAICAO TRADITIONAL CHINESE MEDICINE PIECES CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG BAICAO TRADITIONAL CHINESE MEDICINE PIECES CO Ltd
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2014-02-05

Abstract

一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，属于中药制剂技术领域。其包括以下工艺步骤：1）取新鲜蟾皮在温度-55～-45℃，压强15～25Pa下连续干燥至少18小时；2）经冷冻干燥的鲜蟾皮在-30～-20℃下进行超微粉碎，超微粉碎直至全部通过10目筛，得到蟾皮超微粉。本发明具有以下有益效果：1）本发明对新鲜蟾皮进行冷冻干燥，由于整个干燥过程在低温下进行，能够最大程度地保持原药材的有效成分，经冷冻干燥后的鲜蟾皮由于体积不被破坏，能够完整地保持粘液性状；2）本发明采用超微粉碎将鲜蟾皮颗粒粒径粉碎至小于细胞粒径，加速有效成分的溶出，减少了繁琐的提取工作，且保留了药物的所有成分，符合中医药整体观。

Description

一种鲜蟾皮超微粉的制备方法

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种鲜蟾皮超微粉的制备方法。

背景技术

蟾皮具有清热解毒，利水消胀，治痈疽，肿毒，瘰疬，肿瘤，疳积腹胀，慢性气管炎等功效。目前，蟾皮在临床上已可见较多应用，但其研究多集中于干蟾皮研究，民间疗法记载有新鲜蟾皮直接或打粉外敷于肿瘤相关穴位以起到治疗作用。但是，没有经过深度加工的蟾皮有效成分利用度低，用量大，疗效不明显。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鲜蟾皮超微粉的制备方法的技术方案。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）取新鲜蟾皮在温度-55～-45℃，压强15～25Pa下连续干燥至少18小时；

2）经冷冻干燥的鲜蟾皮在-30～-20℃下进行超微粉碎，超微粉碎直至全部通过10目筛，得到蟾皮超微粉。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中温度为-52～-48℃。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中压强为18～23Pa。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中超微粉碎采用振动式超微粉碎研磨混炼机。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中超微粉碎时间为至少5分钟。

所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中温度为-26～-24℃。

上述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，设计合理，与现有技术相比至少存在以下有益效果：

1）本发明对新鲜蟾皮进行冷冻干燥，由于整个干燥过程在低温下进行，能够最大程度地保持原药材的有效成分，经冷冻干燥后的鲜蟾皮由于体积不被破坏，能够完整地保持粘液性状；

2）本发明采用超微粉碎将鲜蟾皮颗粒粒径粉碎至小于细胞粒径，加速有效成分的溶出，减少了繁琐的提取工作，且保留了药物的所有成分，符合中医药整体观。

附图说明

图1为试验例1中的紫外扫描图；

图2为试验例1中对照样品的色谱图；

图3为试验例1中鲜蟾皮样品的色谱图；

图4为试验例1中干蟾皮样品的色谱图；

图5为试验例1中华蟾酥毒基的标准曲线；

图6为试验例1中脂蟾毒配基的标准曲线。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：一种鲜蟾皮超微粉的制备方法

1）取新鲜蟾皮在温度-50℃，压强20Pa下连续干燥至少18小时，得到鲜蟾皮；

2）经冷冻干燥的鲜蟾皮在振动式超微粉碎研磨混炼机中温度-25℃下进行超微粉碎至少5分钟，超微粉碎直至全部通过10目筛，得到蟾皮超微粉。

实施例1的步骤1）中鲜蟾皮均采用活体蟾蜍处死后取皮得到或直接由市场购得的新鲜蟾皮，步骤1）中温度可采用-45℃、-48℃、-53℃和-55℃，压强可采用15Pa、18Pa、23Pa或25Pa，步骤2）中温度可采用-30℃、-28℃、-26℃、-24℃和-20℃。

试验例1

一、实验材料

（一）实验药品和试剂

新鲜蟾皮（浙江百草中药饮片公司，产地为江苏，经浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室张水利教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargrizans Cantor和黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider混合药材，批号20120521）

华蟾酥毒基对照品（中国食品药品检定研究院提供，110803-200605）

脂蟾毒配基对照品（中国食品药品检定研究院提供，110718-200507）

甲醇（天津市四友精细化学品有限公司，120215，色谱纯）

乙腈（天津市四友精细化学品有限公司，091010，色谱纯）

甘油（浙江杭州大方化学试剂厂，20050812）

乙醇（杭州长征化学试剂有限公司，20101201）

环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，11072821）

生理盐水（中国广州百特医疗用品有限公司生产，GS1105064）

水为高纯水

其它试剂均为分析纯

（二）实验器材

天美公司LC2000梯度系统、LC2130输液泵（日本原装进口），配梯度洗脱和在线脱气装置、LC2030紫外检测器、手动进样器7725i、色谱工作站T2000P、400克摇摆式高速万能粉碎机（型号OFY-400，温岭市林大机械有限公司）、振动式超微粉碎研磨混炼机（XDW-6B1，济南达微机械有限公司）、WQL粒度仪（LKY-2，上海精密科学仪器有限公司）、真空冷冻干燥机（FD-1-50，北京博医康实验仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（HN101-2，南通沪南科学仪器有限公司）、烘干法水分测定仪（DHS 20-A，上海精密科学仪器有限公司）、电子天平（FA2004，常州市幸运电子设备有限公司）、数控超声波清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-4，常州澳华仪器有限公司）。

（三）实验动物和材料

1.细胞株

小鼠S180腹水型肿瘤细胞，由浙江省医科院提供。

2.动物

健康ICR小鼠，SPF级，雌雄各半，年龄：4-6周，体重18-22g。购自中科院上海实验动物中，合格证 SCXK（沪）2007 -0005。

二、方法和结果

（一）蟾皮冷冻干燥工艺

蟾皮冷冻干燥工艺主要影响因素为冷冻干燥时间，冷冻干燥后物料含水量约为3-5%，本实验以冷冻后药物水分含量不超过4%为指标，采用单因素考察冷冻干燥时间。

精密称取新鲜蟾皮100g置于冷冻干燥仪中（温度：-50±5℃，压强：20±5Pa），分别干燥6h、12h、18h、24h测定药物水分含量。考察结果见表1。

表1

实验结果：蟾皮在冷冻干燥仪中（温度：-50±5℃，压强：20±5Pa）连续干燥18h后含水量符合要求，冷冻干燥后蟾皮下称鲜蟾皮。

（二）蟾皮烘干干燥工艺

蟾皮烘干工艺主要影响因素为烘干时间和烘干温度，为最大程度保持药材性状不被破坏，本实验选择45℃为烘干温度，以干燥后药物水分含量不超过4%为指标，采用单因素考察烘干时间。考察结果见表2。

表2

实验结果：新鲜蟾皮在电热鼓风干燥箱干中（温度：45±5℃）连续干燥24h后含水量符合要求，烘干干燥后蟾皮下称干蟾皮。

（三）蟾皮超微粉碎工艺

超微粉碎技术是通过物理作用将传统中药饮片加工成微米级的现代科学技术，经超微粉碎后的饮片粒径可小于饮片细胞粒径，使细胞破膜，加速其有效成分的溶出，提高药物的生物利用度。蟾皮细胞粒径不大于120μm。

冷冻干燥蟾皮粉碎时间考察

经相关文献报道，蟾蜍皮肤毒腺分泌细胞，腹侧皮肤长径在117.3～489.6μm，短径63.8～32.5μm，背侧皮肤长径133.9～248.6μm，短径76.5～16.57μm。要求药物微粒大小一般在0.5～10μm，所以选择10μm为超微粉碎临界粒径。当药物粒径小于10μm时，蟾蜍皮肤毒腺分泌细胞基本破裂。实验蟾皮在冷冻干燥后，置于振动式超微粉碎研磨混炼机中-25℃下进行超微粉碎，得到蟾皮超微粉。采用WQL粒度仪测定粒径分布，实验将蟾皮药材在在粉碎后7min时，药物颗粒粒径有95.57%达到10μm以下，蟾皮药材细胞基本完全破碎，实验结果见表3。符合做成混悬剂的粒径大小要求。

表3

取已干燥的鲜蟾皮（含水量：3.185%）和干蟾皮（含水量：3.541%）置于小型粉碎机中，粗粉碎直至全部通过10目筛，连续超微粉碎5min，粉碎后粒径小于鲜蟾皮和干蟾皮细胞粒径的颗粒数目为98.43%和95.22%。

（四）干蟾皮和鲜蟾皮含量测定

1.色谱条件

色谱柱：kromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）（瑞典）；

流动相：乙腈（A）-水（B）（48︰52）；

流速：1 mL·min-1；

检测波长：296nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

2.溶液配制

2.1对照品溶液的制备

精密称取华蟾素毒基1.4mg，脂蟾毒配基3.2mg置于10mL容量瓶中，甲醇定容，作为对照品储备液。

2.2供试品溶液的制备

分别精密称取鲜蟾皮和干蟾皮超微粉各40mg，加入甲醇20mL，称定重量，加热回流提取60min，室温冷却，甲醇补足失重，过滤，取滤液（0.45μm），过膜，作为供试品储备液。

3.最大波长的选择

精密称取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品适量，用甲醇配制成对照品溶液，以甲醇为空白，分别在200-500nm波长范围内进行扫描，结果对照品溶液296nm波长附近有最大吸收，故选择测定波长为296nm。结果见图1。

4.方法学考察

4.1专属性考察

精密移取对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取3.5mL置于10mL容量瓶中，作为稀释后对照品溶液；取2.2供试品溶液；取溶剂甲醇进样，每次进样10μL，按上述色谱条件测定。结果显示，在此色谱条件下，溶剂不干扰药物的测定。结果见图2、图3和图4。

4.2标准曲线的绘制

取上述对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取0.2、0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0mL置于10mL容量瓶中，过膜，进样10μL。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，华蟾酥毒基线性回归方程Y=4714.3964X-253.3696，R=0.9974，脂蟾毒配基线性回归方程Y=33255.0527X-28.2238，R=0.9996，可见华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分别在0.056～4.48μg/mL，0.256～10.24μg/mL范围内，峰面积与浓度存在良好的线性关系。见图5和图6。

4.3精密度试验

精密移取上述对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中，甲醇定容，精密移取3.5mL置于10mL容量瓶中，过膜，进样10μL。结果见表4。

表4

结果显示：脂蟾毒配基和华蟾毒配基相对峰面积相对标准偏差（RSD）均小于2%，表明仪器的精密度良好。

4.4重复性试验

精密称取同一批鲜蟾皮平行6份，按2.2项下供试品制备方法制备，所得样品按选定色谱条件连续进样6次，分别测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量。结果见表5。

表5

结果显示：脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差（RSD）均小于3%，表明该方法重现性良好。

4.5稳定性试验

精密称取鲜蟾皮40mg，照2.2供试品处理方法制备供试品溶液。分别于0、2、4、8、16、24 h 时注入液相色谱仪，测定供试品溶液中脂蟾毒配基和华蟾毒配基含量，考察其稳定性。结果见表6。

表6

结果显示：脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差（RSD）均小于 2%，表明供试品溶液至少在 24 h 内稳定。

4.6回收率试验

精密称取脂蟾毒配基和华蟾毒配基对照品适量，加入到已知浓度脂蟾毒配基和华蟾毒配基含量的供试品中，在以上色谱条件下，测定脂蟾毒配基和华蟾毒配基的含量，计算回收率。结果见表7、表8。

表7

表8

结果显示：脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差（RSD）均小于 2%，表明该方法准确性良好。

5.干蟾皮和鲜蟾皮含量测定方法

分别精密称定三批干蟾皮和鲜蟾皮超微粉各80mg，按2.2供试品溶液的制备项下制备，在上述色谱条件下进样10μL，测定峰面积。结果表9（干蟾皮）、10（鲜蟾皮）。

表9

表10

由上表可知，鲜蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量按干燥品计算不小于 0.2%，干蟾皮两者总量按干燥品计算不小于0.1%，可见鲜蟾皮成分含量显著高于干蟾皮含量，可能原因为常规烘干工艺中温度对鲜蟾皮中有效成分影响较大。

（五）干蟾皮和鲜蟾皮凝胶剂对S180腹水型实体瘤小鼠抑瘤作用研究

通过鲜蟾皮和干蟾皮超微粉碎含量测定，本试验已初步确定鲜蟾皮为主药，然而单一成分评价中药制剂疗效与中药多组分多靶点的作用特点相背离，而蟾皮对S180腹水型实体瘤荷瘤小鼠具有较强的肿瘤抑制率，故本试验通过药效学试验进一步评价药物疗效，结合含量测定与药效学研究以确定最终制剂的主药。

1.S180荷瘤小鼠模型建立

于液氮罐中取出S180腹水型肿瘤细胞株1支，置于37℃电热恒温水浴箱内，轻轻摇动令其尽快融化，取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培养基，常规离心，制成瘤细胞混悬液，台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠背部，取0.2mL（约1×10⁶-2×10⁶个瘤细胞）接种于皮下，传代3次。选择接种8天的S180荷瘤小鼠，脱颈处死，抽取小鼠腹腔内腹水，用生理盐水适当稀释后，计数，调整浓度至2×10⁷，用无菌注射器吸取瘤细胞混悬液注射在小鼠背臀部，每只0.2mL。

2.实验分组和给药

接种后的ICR小鼠40只，称重记录体重，按体重和性别随机分为四组，每组10只，每只均单笼饲养。凝胶剂作为蟾皮超微粉载体。

第一组：鲜蟾皮凝胶剂1mL/20g，3mg/20g

第二组：干蟾皮凝胶剂1mL/20g，3mg/20g

第三组：阴性组空白凝胶剂

第四组：阳性组环磷酰胺0.5mg/20g

3.数据收集

凝胶剂连续背部涂抹给药15天，给药面积控制在肿瘤接种部位2*2cm2处，阳性药环磷酰胺腹腔注射，在此期间观察记录小鼠的一般情况（饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、中毒表现和死亡情况等），定期称荷瘤小鼠重量，停药后第二天记录体重，处死后解剖，剥取肿瘤组织、脾脏、胸腺，电子天平称重。

4.检测指标

抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%。

5.统计学处理

运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用

±S表示，两组间计量资料比较采用t检验，两组间率的比较采用χ2检验(Fisher’s精确检验)。

在观察期间小鼠的一般情况总体良好，由于肿瘤接种于小鼠背臀部，该部位血管分布较少，肿瘤生长相对缓慢，故对小鼠活动能力基本无影响，实验过程中无小鼠死亡。在接种后5至7天，肉眼可观察到各组小鼠长出肿瘤。记录给药前后小鼠体重变化、平均瘤重和抑瘤率，实验数据以 ±S表示，组间比较用t检验，p<0.05为有显著性差异，p<0.01为有极显著性差异，结果见表1-10。比较各组小鼠给药后的抑瘤率情况，干蟾皮和鲜蟾皮凝胶剂与阴性组相比有极显著性差异P<0.01，且鲜蟾皮凝胶剂组和干蟾皮凝胶剂组相比具有显著性差异P<0.05,故本试验选择鲜蟾皮做为凝胶剂主药。结果见表11。

表11

注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01；

与干蟾皮凝胶剂相比^△P<0.05，^△△P<0.01

本试验鲜蟾皮凝胶剂和干蟾皮凝胶剂对S180腹水型实体瘤小鼠抑瘤作用显著，且鲜蟾皮凝胶剂抑瘤率显著高于干蟾皮凝胶剂，与两者含量差异相符，药效与含量呈现正相关性，可见鲜蟾皮在含量和疗效上都优于干蟾皮。

Claims

1.一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

2.如权利要求1所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中温度为-52～-48℃。

3.如权利要求1所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中压强为18～23Pa。

4.如权利要求1所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中超微粉碎采用振动式超微粉碎研磨混炼机。

5.如权利要求1所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中超微粉碎时间为至少5分钟。

6.如权利要求1所述的一种鲜蟾皮超微粉的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中温度为-26～-24℃。