CN103655620B - 一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 - Google Patents
一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103655620B CN103655620B CN201310554129.2A CN201310554129A CN103655620B CN 103655620 B CN103655620 B CN 103655620B CN 201310554129 A CN201310554129 A CN 201310554129A CN 103655620 B CN103655620 B CN 103655620B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cutis bufonis
- parts
- toad skin
- hpmc
- gel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 33
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title abstract description 13
- 238000001879 gelation Methods 0.000 title description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 64
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 57
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 24
- AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylazepan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCN1CCCCCC1=O AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims abstract description 18
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N p-menthan-3-ol Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 241000269417 Bufo Species 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 241000269418 Bufo bufo Species 0.000 claims description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 abstract description 3
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 abstract description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 97
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 61
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 59
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229930190011 Bufogenin Natural products 0.000 description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- ATLJNLYIJOCWJE-CWMZOUAVSA-N bufogenin Chemical compound C=1([C@H]2C[C@H]3O[C@@]43[C@H]3[C@@H]([C@]5(CC[C@H](O)C[C@H]5CC3)C)CC[C@@]42C)C=CC(=O)OC=1 ATLJNLYIJOCWJE-CWMZOUAVSA-N 0.000 description 30
- 229950006858 bufogenin Drugs 0.000 description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 28
- SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N Cinobufagin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 27
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N Cinobufagin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@H]5CC[C@H]4[C@@]43O[C@@H]4[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N 0.000 description 26
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 20
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 16
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 7
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 5
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- KBKUJJFDSHBPPA-UHFFFAOYSA-N 5beta-hydroxylcinobufagin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4(O)CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 KBKUJJFDSHBPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- KBKUJJFDSHBPPA-ZNCGZLKOSA-N cinobufotalin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@@]5(O)CC[C@H]4[C@@]43O[C@@H]4[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 KBKUJJFDSHBPPA-ZNCGZLKOSA-N 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- RQKFOGXUTRDQPB-UHFFFAOYSA-N hydron;2,3,5,6-tetramethylpyrazine;chloride Chemical compound Cl.CC1=NC(C)=C(C)N=C1C RQKFOGXUTRDQPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 4
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 4
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- -1 cinobufagin Bufadienolides compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 3
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 3
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 3
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009967 tasteless effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000004520 water soluble gel Substances 0.000 description 3
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000269420 Bufonidae Species 0.000 description 2
- VOZHMAYHYHEWBW-NVOOAVKYSA-N Bufotalin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@H]5CC[C@H]4[C@@]3(O)C[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 VOZHMAYHYHEWBW-NVOOAVKYSA-N 0.000 description 2
- VOZHMAYHYHEWBW-UHFFFAOYSA-N Bufotalin Natural products CC(=O)OC1CC2(O)C3CCC4CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 VOZHMAYHYHEWBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010579 first pass effect Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 208000030940 penile carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000008174 penis carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000012109 statistical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010003671 Atrioventricular Block Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010058019 Cancer Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010007247 Carbuncle Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- 241001415432 Duttaphrynus melanostictus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040741 Sinus bradycardia Diseases 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000007271 Substance Withdrawal Syndrome Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010109 chemoembolization Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 230000037336 dry skin Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003777 experimental drug Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 231100000435 percutaneous penetration Toxicity 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
一种蟾皮凝胶剂,其特征在于每100份蟾皮凝胶剂由以下重量份数的组份组成:蟾皮8‑12份、HPMC K4M 1‑3份、HPMC K100M 0.5‑0.7份、薄荷脑0.8‑1.2份、氮酮2‑4份、丙二醇0.8‑1.2份、甘油4‑6份、尼泊金甲酯0.7‑1.2份、水余量。其制备工艺为精密称取处方量蟾皮超微粉加70%乙醇,超声30min,挥干乙醇,至无醇味,加入处方量尼泊金甲酯,将处方量的HPMC溶胀,加入到蟾皮溶液中,加入氮酮、丙二醇、薄荷脑和甘油,混匀静置过夜,即可形成蟾皮凝胶剂。本发明制备工艺简单、设备要求较低、使用安全、病人的顺应性高、毒副作用小、生物利用度高、对皮肤无刺激性和致敏性。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域,尤其涉及一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺。
背景技术
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍的干燥皮,有清热解毒、利水消胀之功效,性辛、凉、微毒,主治痈疽、肿毒,据《本草纲目拾遗》记载:蟾皮“贴大毒,能拔毒、收毒”,有明显的镇痛和抗炎、抗肿瘤作用。蟾皮具有确切的抗肿瘤活性,能够直接作用于肿瘤细胞DNA,诱导肿瘤细胞凋亡、抑制多种肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化,还有逆转耐药性、抑制肿瘤血管形成及增强机体免疫力作用。同时,肿瘤形成的主要因素是癌毒之邪,而蟾皮为有毒之品,可以毒攻毒,正合中医治疗肿瘤的原则。我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌、膀胱癌等,具有较好的临床效果。目前已从蟾皮中分离出来的单体化合物有蟾毒灵、华蟾酥毒基等蟾蜍二烯内酯类化合物,现代中药学研究表明蟾皮及其制剂治疗肝癌、肺癌、肠癌、消化道癌症等恶性肿瘤疗效确切。
目前在临床上广泛应用的以蟾皮为来源的抗肿瘤制剂主要有华蟾素注射液、华蟾素胶囊,研究较多的有华蟾素纳米剂型、微球、气雾剂等,如沈阳药科大学研制的华蟾素注射乳剂药效学研究表明该制剂具有明显的抗肿瘤,提高机体免疫力等功效。楼月芬等采用微球技术将干蟾皮提取液制成抗肝癌制剂,进一步提高了肝癌介入治疗的效果。
蟾皮制剂具有抗肿瘤和增强肿瘤患者免疫功能的双重作用在临床已经得到肯定,但由于蟾皮化学成分较为复杂,有效成分与药理作用之间关系研究较少,毒副作用较大,且抗肿瘤机理不明。此外,蟾皮作为药物使用可通过兴奋迷走神经,影响心肌和传导系统,引起窦性心动过缓、房室传导阻滞、室性早搏、心室纤颤,还可导致头晕、恶心、四肢发凉,抽搐,甚至死亡。这些毒副作用大大增加了临床使用风险,所以合理用药,改进工艺,明确药效成分和毒性成分显得尤为重要。
中药外治为体表给药,经皮肤或粘膜吸收后,药力直达病所,可避免口服所致的首关消除及某些毒副作用。中医外治法是祖国医学的重要组成部分,是治疗癌痛的一支“奇兵”。外治宗师吴师机曰:“外治之理,即内治之理,外治之药,即内治之药,所异者法耳。医理药性无二,而法则神奇变化。”中药外治为体表直接给药,经皮肤或粘膜表面吸收后,药力直达病所,起效迅速,且可避免口服经消化道吸收所遇到的多环节灭活作用及一些药物内服带来的某些副作用,特别是晚期癌症患者正气已虚,不耐攻伐,脾胃吸收功能减弱,单靠内服药效果不佳,中药外治更具优势。
蟾皮作为传统抗肿瘤外用中药之一,能够缓解癌性疼痛,改善患者症状,且对皮肤癌、宫颈癌、阴茎癌等体表浅部肿瘤疗效确切,在肿瘤治疗中具有举足轻重的作用。蟾皮外敷用药能够显著稳定瘤体,有效延长肝癌患者的生存期,提高生存质量。临床应用发现蟾皮直接粘附于肿瘤部位,具有抗肿瘤、升高白细胞及增强网状内皮系统的吞噬功能,并且能够局部止痛,对于晚期癌症病人的治疗疗效显著。外用蟾皮抗癌多为蟾皮直接打粉或直接蟾皮外敷,存在使用过程中剂量难以控制,使用困难,病人适应性差,对皮肤有过敏性和刺激性等缺点,并存在重大安全隐患。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷,本发明的目的是提供一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺。
所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于每100份蟾皮凝胶剂由以下重量份数的组份组成:蟾皮8-12份、HPMC K4M 1-3份、HPMC K100M 0.5-0.7份、薄荷脑0.8-1.2份、氮酮2-4份、丙二醇0.8-1.2份、甘油4-6份、尼泊金甲酯0.7-1.2份、水余量。
所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于每100份蟾皮凝胶剂由以下重量份数的组份组成:蟾皮10份、HPMC K4M 2份、HPMC K100M0.6份、薄荷脑1份、氮酮3份、丙二醇1份、甘油5份、尼泊金甲酯1份、水余量。
所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于所述蟾皮含水量为3-4%。
所述的蟾皮凝胶剂制备工艺,其特征在于采用如下步骤:
(1)预处理:选取活蟾蜍取皮,洗净、晾干;
(2)蟾皮干燥:将步骤(1)处理过的蟾皮于冷冻干燥仪中在-45℃至-55℃,压强15-25 Pa的条件下连续冷冻干燥16-24h,至含水量达到3-4%,制得鲜蟾皮;
(3)粉碎处理:将步骤(2)中制得的鲜蟾皮于小型粉碎机中粗粉碎直至全部通过10目筛,然后连续超微粉碎5min,制得蟾皮超微粉;
(4)按处方量精密称取步骤(3)制得的蟾皮超微粉,按固液比(g:ml)=1:4加入70%的乙醇超声30min,挥干乙醇,直至无醇味,制得蟾皮溶液;
(5)往步骤(4)制得的蟾皮溶液中分别依次加入处方量的尼泊金甲酯、用蒸馏水溶胀后的 HPMC K4M及HPMC K100M、氮酮、丙二醇、薄荷脑及甘油,加水定容,混匀后静置12-24h,即可形成蟾皮凝胶剂。
所述的蟾皮凝胶剂制备工艺,其特征在于步骤(2)所述的连续冷冻干燥时间优选为18小时。
所述的蟾皮凝胶制备工艺,其特征在于步骤(3)所述的蟾皮超微粉为粒径小于蟾皮细胞的粒径。
所述的蟾皮凝胶剂制备工艺,其特征在于步骤(5)所述的溶胀后的HPMC K4M是按固液比(g:ml)=1:20进行溶胀的,溶胀后的HPMC K100M是按固液比(g:ml)=1.5:100进行溶胀的。
所述的蟾皮凝胶制备工艺,其特征在于所述溶胀后的HPMC K4M:HPMC K100M=1:0.23-0.5。
本发明的有益效果是:
本发明将蟾皮制成透皮给药制剂—凝胶剂,制备工艺简单,设备要求较低,使用舒适安全,病人的顺应性高。凝胶剂基质具有缓释作用,在一定程度上能够降低药物毒副作用。冷冻干燥能够最大程度保持药材内部有效成分不被破坏,保持最佳药理活性,超微粉碎能够使药物内部有效成分迅速溶出,使药物提取更完全,弥补了普通饮片提取不完全的不足,显著提高药物生物利用度。该剂型剂量可控,透皮吸收迅速,药物吸收干扰因素小,避免药物的肝脏首过作用,血药浓度稳定,能够有效提高药物生物利用度,并可反复敷贴,可随时使用或停止药物治疗,使用方便,对皮肤无刺激性和致敏性。
具体实施方式
本发明下面结合实施例予以进一步详述。
实施例1
选取活蟾蜍取皮,洗净、晾干,将晾干后的蟾皮于冷冻干燥仪中在温度为-45℃、压强为25 Pa的条件下连续冷冻干燥16h,测定蟾皮含水量为3.97%,得鲜蟾皮;将鲜蟾皮于小型粉碎机中粗粉碎直至全部通过10目筛,然后连续超微粉碎5min,制得蟾皮超微粉,蟾皮超微粉的粒径小于蟾皮细胞的粒径,备用。
精密称取处方量蟾皮超微粉8g加32ml70%乙醇,超声提取30min,挥干乙醇,直至无醇味,制得蟾皮溶液,往蟾皮溶液中依次加入尼泊金甲酯0.7g、溶胀后的HPMC K4M1g、溶胀后的HPMC K100M0.5g、氮酮2g、丙二醇0.8g、甘油4g,余量为水,混匀后静置12-24h,即可形成均匀、细腻、深灰色、黏度适中的100g蟾皮凝胶剂。
实施例2
选取活蟾蜍取皮,洗净、晾干,将晾干后的蟾皮于冷冻干燥仪中在温度为-50℃、压强为20 Pa的条件下连续冷冻干燥18h,测定蟾皮含水量为3.185%,得鲜蟾皮;将鲜蟾皮于小型粉碎机中粗粉碎直至全部通过10目筛,然后连续超微粉碎5min,制得蟾皮超微粉,蟾皮超微粉的粒径小于蟾皮细胞的粒径,备用。
精密称取处方量蟾皮超微粉10g加40ml70%乙醇,超声提取30min,挥干乙醇,直至无醇味,制得蟾皮溶液,往蟾皮溶液中依次加入尼泊金甲酯1g、溶胀后的HPMC K4M2g、溶胀后的HPMC K100M0.6g、氮酮3g、丙二醇1g、甘油5g,余量为水,混匀后静置12-24h,即可形成均匀、细腻、深灰色、黏度适中的100g蟾皮凝胶剂。
实施例3
选取活蟾蜍取皮,洗净、晾干,将晾干后的蟾皮于冷冻干燥仪中在温度为-55℃、压强为15 Pa的条件下连续冷冻干燥24h,测定蟾皮含水量为2.864%,得鲜蟾皮;将鲜蟾皮于小型粉碎机中粗粉碎直至全部通过10目筛,然后连续超微粉碎5min,制得蟾皮超微粉,蟾皮超微粉的粒径小于蟾皮细胞的粒径,备用。
精密称取处方量蟾皮超微粉12g加48ml70%乙醇,超声提取30min,挥干乙醇,直至无醇味,制得蟾皮溶液,往蟾皮溶液中依次加入尼泊金甲酯1.2g、溶胀后的HPMC K4M3g、溶胀后的HPMC K100M0.7g、氮酮4g、丙二醇1.2g、甘油6g,余量为水,混匀后静置12-24h,即可形成均匀、细腻、深灰色、黏度适中的100g蟾皮凝胶剂。
试验例
蟾皮凝胶剂处方前研究
实验药品和试剂:蟾皮(浙江百草中药饮片公司,产地为江苏,经本校中药资源与鉴定教研室张水利教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargrizans Cantor和黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider混合药材,批号20120521),华蟾酥毒基对照品(中国食品药品检定研究院提供,110803-200605),脂蟾毒配基对照品(中国食品药品检定研究院提供,110718-200507),甲醇(天津市四友精细化学品有限公司,120215,色谱纯),乙腈(天津市四友精细化学品有限公司,091010,色谱纯),甘油(浙江杭州大方化学试剂厂,20050812),乙醇(杭州长征化学试剂有限公司,20101201),环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,11072821),生理盐水(中国广州百特医疗用品有限公司生产,GS1105064),水为高纯水,其它试剂均为分析纯。
实验器材:天美公司LC2000梯度系统;LC2130输液泵(日本原装进口),配梯度洗脱和在线脱气装置;LC2030紫外检测器;手动进样器7725i;色谱工作站T2000P;400克摇摆式高速万能粉碎机(型号OFY-400,温岭市林大机械有限公司);振动式超微粉碎研磨混炼机(XDW-6B1,济南达微机械有限公司);WQL粒度仪(LKY-2,上海精密科学仪器有限公司);真空冷冻干燥机(FD-1-50,北京博医康实验仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(HN101-2,南通沪南科学仪器有限公司);烘干法水分测定仪(DHS 20-A,上海精密科学仪器有限公司);电子天平(FA2004,常州市幸运电子设备有限公司);数控超声波清洗器(KQ5200DE,昆山市超声仪器有限公司);数显恒温水浴锅(HH-4,常州澳华仪器有限公司)。
实验动物和材料
细胞株:小鼠S180腹水型肿瘤细胞,由浙江省医科院提供。动物:健康ICR小鼠,SPF级,雌雄各半,年龄:4-6周,体重18-22g。购自中科院上海实验动物中,合格证 SCXK(沪)2007 -0005。
方法和结果
蟾皮冷冻干燥工艺:蟾皮冷冻干燥工艺主要影响因素为冷冻干燥时间,冷冻干燥后物料含水量约为3-5%,本实验以冷冻后药物水分含量不超过4%为指标,采用单因素考察冷冻干燥时间。精密称取蟾皮100g置于冷冻干燥仪中(温度:-50±5℃,压强:20±5Pa),分别干燥6h、12h、18h、24h测定药物水分含量。结果见表1。
表1 冷冻干燥时间考察
实验结果:蟾皮在冷冻干燥仪中(温度:-50±5℃,压强:20±5Pa)连续干燥18h后含水量符合要求,冷冻干燥后蟾皮称鲜蟾皮。
产品烘干干燥工艺:蟾皮烘干工艺主要影响因素为烘干时间和烘干温度,为最大程度保持药材性状不被破坏,本实验选择45℃为烘干温度,以干燥后药物水分含量不超过4%为指标,采用单因素考察烘干时间,结果见表2。
表2 烘干干燥时间考察
实验结果:蟾皮在电热鼓风干燥箱干中(温度:45±5℃)连续干燥24h后含水量符合要求,烘干干燥后蟾皮下称干蟾皮。
蟾皮超微粉碎工艺:超微粉碎技术是通过物理作用将传统中药饮片加工成微米级的现代科学技术,经超微粉碎后的饮片粒径可小于饮片细胞粒径,使细胞破膜,加速其有效成分的溶出,提高药物的生物利用度。蟾皮细胞粒径不大于120μm。取已干燥的鲜蟾皮(含水量:3.185%)和干蟾皮(含水量:3.541%)置于小型粉碎机中,粗粉碎直至全部通过10目筛,连续超微粉碎5min,粉碎后粒径小于鲜蟾皮和干蟾皮细胞粒径的颗粒数目为98.43%和95.22%。
干蟾皮和鲜蟾皮含量测定
色谱条件:色谱柱:kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)(瑞典);流动相:乙腈(A)-水(B)(48︰52);流速:1 mL·min-1;检测波长:296nm;柱温:30℃;进样量:10μL。
溶液配制:对照品溶液的制备:精密称取华蟾素毒基1.4mg,脂蟾毒配基3.2mg置于10mL容量瓶中,甲醇定容,作为对照品储备液。供试品溶液的制备:分别精密称取鲜蟾皮和干蟾皮超微粉各40mg,加入甲醇20mL,称定重量,加热回流提取60min,室温冷却,甲醇补足失重,过滤,取滤液(0.45μm),过膜,作为供试品储备液。
方法学考察
专属性考察:精密移取对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取3.5mL置于10mL容量瓶中,作为稀释后对照品溶液;取供试品溶液;取溶剂甲醇进样,每次进样10μL,按上述色谱条件测定。结果显示,在此色谱条件下,溶剂不干扰药物的测定。
标准曲线绘制:取上述对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取0.2、0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0mL置于10mL容量瓶中,过膜,进样10μL。以样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,华蟾酥毒基线性回归方程Y=4714.3964X-253.3696,R=0.9987,脂蟾毒配基线性回归方程Y=33255.0527X-28.2238,R=0.9996,可见华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分别在0.056~4.48μg/mL,0.256~10.24μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系。
精密度试验:精密移取上述对照品储备液1mL置于25mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取3.5mL置于10mL容量瓶中,过膜,进样10μL。结果见表3。
表3 精密度试验(n=6)
结果显示:脂蟾毒配基和华蟾毒配基相对峰面积相对标准偏差(RSD)均小于2%,表明仪器的精密度良好。
重复性试验:精密称取同一批鲜蟾皮平行6份,按上述供试品制备方法制备,所得样品按选定色谱条件连续进样6次,分别测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量。结果见表4。
表4 重复性试验(n=6)
结果显示:脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差(RSD)均小于3%,表明该方法重现性良好。
稳定性试验:精密称取鲜蟾皮40mg,按上述供试品处理方法制备供试品溶液。分别于0、2、4、8、16、24 h 时注入液相色谱仪,测定供试品溶液中脂蟾毒配基和华蟾毒配基含量,考察其稳定性。结果见表5。
表5 稳定性试验(n=6)
结果显示:脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差(RSD)均小于 2%,表明供试品溶液至少在 24 h 内稳定。
干蟾皮和鲜蟾皮含量测定方法:分别精密称定三批干蟾皮和鲜蟾皮超微粉各80mg,按上述供试品溶液的制备项下制备,在上述色谱条件下进样10μL,测定峰面积。结果表6及表7。
表6 干蟾皮含量测定结果(n=3)
表7 鲜蟾皮含量测定结果
由上表可知,鲜蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量按干燥品计算不小于 0.2%,干蟾皮两者总量按干燥品计算不小于0.1%,可见鲜蟾皮成分含量显著高于干蟾皮含量,可能原因为常规烘干工艺中温度对鲜蟾皮中有效成分影响较大,故通过含量测定初步确定低温冷冻干燥后蟾皮做为该制剂的主药。
干蟾皮和鲜蟾皮凝胶剂对S180腹水型实体瘤小鼠抑瘤作用研究:通过鲜蟾皮和干蟾皮超微粉碎含量测定,初步确定鲜蟾皮为主药,然而单一成分评价中药制剂疗效与中药多组分多靶点的作用特点相背离,而蟾皮对S180腹水型实体瘤荷瘤小鼠具有较强的肿瘤抑制率,故本发明通过药效学试验进一步评价药物疗效,结合含量测定与药效学研究以确定最终制剂的主药。
S180荷瘤小鼠模型建立:于液氮罐中取出S180腹水型肿瘤细胞株1支,置于37℃电热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化,取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培养基,常规离心,制成瘤细胞混悬液,台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠背部,取0.2mL(约1×106-2×106个瘤细胞)接种于皮下,传代3次。选择接种8天的S180荷瘤小鼠,脱颈处死,抽取小鼠腹腔内腹水,用生理盐水适当稀释后,计数,调整浓度至2×107,用无菌注射器吸取瘤细胞混悬液注射在小鼠背臀部,每只0.2mL。
试验分组和给药:接种后的ICR小鼠40只,称重记录体重,按体重和性别随机分为四组,每组10只,每只均单笼饲养。第一组:鲜蟾皮凝胶剂1mL/20g,3mg/20g;第二组:干蟾皮凝胶剂1mL/20g,3mg/20g;第三组:阴性组空白凝胶剂;第四组:阳性组环磷酰胺0.5mg/20g。
数据收集:凝胶剂连续背部涂抹给药15天,给药面积控制在肿瘤接种部位2*2cm2处,阳性药环磷酰胺腹腔注射,在此期间观察记录小鼠的一般情况(饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、中毒表现和死亡情况等),定期称荷瘤小鼠重量,停药后第二天记录体重,处死后解剖,剥取肿瘤组织、脾脏、胸腺,电子天平称重。
检测指标:抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%
统计学处理:运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用 ±S表示,两组间计量资料比较采用t检验,两组间率的比较采用χ2检验(Fisher’s精确检验)。
在观察期间小鼠的一般情况总体良好,由于肿瘤接种于小鼠背臀部,该部位血管分布较少,肿瘤生长相对缓慢,故对小鼠活动能力基本无影响,实验过程中无小鼠死亡。在接种后5至7天,肉眼可观察到各组小鼠长出肿瘤。记录给药前后小鼠体重变化、平均瘤重和抑瘤率,实验数据以 ±S表示,组间比较用t检验,p<0.05为有显著性差异,p<0.01为有极显著性差异,结果见表1-10。比较各组小鼠给药后的抑瘤率情况,干蟾皮和鲜蟾皮凝胶剂与阴性组相比有极显著性差异P<0.01,且鲜蟾皮凝胶剂组和干蟾皮凝胶剂组相比具有显著性差异P<0.05,故本课题选择鲜蟾皮做为凝胶剂主药。结果见表8。
表8 蟾皮凝胶剂对小鼠S180实体瘤的影响
注:与模型组相比*P<0.05,**P<0.01;
与干蟾皮凝胶剂相比△P<0.05,△△P<0.01
蟾皮凝胶剂处方筛选及制备工艺研究
试验动物:健康SD大鼠,雄性,体重(200±20)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2008-0016。
方法和结果
蟾皮凝胶剂处方研究:蟾皮凝胶剂的组成主要包括主药蟾皮、基质、透皮促进剂等。其中成型基质的种类和用量直接影响制剂的成型性,透皮促进剂的筛选对药物透过量起到决定性作用,本发明考察了以卡波普、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠为基质的水溶性凝胶剂,以黏度、涂展性及均匀度为观察指标。同时,以药物主要成分为指标,考察了氮酮、丙二醇和薄荷脑等透皮促进剂的种类和用量,确定制剂优化后处方。
蟾皮溶剂系统选择:蟾皮超微粉能快速分散于水与乙醇,乙醇为无色透明液体,易挥发,在制剂中常作为溶剂,防腐剂使用,研究表明蟾皮抗肿瘤作用中起效成分主要为脂溶性华蟾酥毒基、脂蟾毒配基,本发明以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为混合指标成分,测定蟾皮超微粉在水中以及不同浓度乙醇中的含量。
精密称取蟾皮超微粉0.15g,置于50mL锥形瓶中,分别用1、2、3、4、5号溶剂定容至10mL,超声10min,过滤,取滤液2mL,甲醇定容至10mL,于296nm处测定吸光度。结果见表9。
表9 蟾皮溶剂系统的选择结果列表
实验结果可见90%和70%乙醇对有效成分的溶解能力相当,经济学角度考虑采用70%乙醇作为潜溶剂。
剂型选择:蟾皮作为传统抗肿瘤外用中药之一,能够缓解癌性疼痛,且对皮肤癌、宫颈癌、阴茎癌等体表浅部肿瘤疗效确切。临床应用发现蟾皮直接粘附于肿瘤部位,具有抗肿瘤、升高白细胞及增强网状内皮系统的吞噬功能,并且能够局部止痛,对于晚期癌症病人的治疗疗效显著。外用蟾皮抗癌多为蟾皮直接打粉或直接蟾皮外敷,存在使用过程中剂量难以控制,使用困难,病人适应性差,对皮肤有过敏性和刺激性等缺点,并存在重大安全隐患。本发明将蟾皮制成外用透皮给制剂凝胶剂,剂量可控,透皮吸收迅速,药物吸收受干扰的因素小,避免药物的肝脏首过作用,血药浓度稳定,能够有效提高药物生物利用度,并可反复敷贴,可随时使用或停止药物治疗,使用方便,对皮肤无刺激性和致敏性,同时凝胶剂基质具有缓释作用,在一定程度上能够降低蟾皮毒性。
空白基质筛选:本发明考察了以卡波普、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠为基质的水溶性凝胶剂,以黏度、载药量、基质颜色、气味、涂展性及均匀度为观察指标,凝胶剂中加入适量的甘油以起到保湿、润滑等功效。
卡波普水凝胶:将处方量卡波普940P(Carbopol 940P)粉末均匀撒在蒸馏水表面,放置过夜使卡波普粉末完全分散均匀。以适量的三乙醇胺调节卡波普水溶液 pH,并且缓慢搅拌,当pH值调节到7左右,加入处方量甘油,搅拌均匀后可形成无色、无味、透明、细腻、均匀的水凝胶。考察不同浓度的Carbopol 940P形成的水凝胶形状外观。结果见表10。
表10 不同浓度的Carbopol 940P形成的水凝胶形状外观
结果表明:卡波普制剂在完成时成型性较好,但透皮预实验显示,在体外透皮24h后,卡波普940P与皮肤贴合性较差。
羟丙基甲基纤维素水凝胶:相关研究表明加入羟丙甲基纤维素(HPMC)的分子量越大,可以增加水凝胶黏度,通过对两者混合剂量的考察,确定加入比例,取处方量HPMC K4M和HPMC K100M,均匀分散于80℃左右热水中,逐渐冷却至室温,加入处方量甘油缓慢搅拌均匀,静置过夜,便可形成无色、无味、均匀、透明、细腻的水凝胶。结果见表11。
表11 不同比例的羟丙基甲基纤维素K4M和K100M形成的水凝胶形状外观
结果表明:羟丙基甲基纤维素水凝胶和卡波普940P水凝胶成型性均较好,但透皮预实验发现24h后羟丙甲基纤维素水凝胶较卡波普940P水凝胶皮肤贴合性好,皮肤滞留时间长。
聚乙烯醇水凝胶:取适量聚乙烯醇1788(PVA1788)均匀分散于蒸馏水中,充分溶胀后,水浴加热 80℃使其完全溶解,加入处方量甘油缓慢搅拌使其混合均匀。室温下放冷,形成水凝胶,观察其外观形状。结果见表12。
表12 不同浓度的聚乙烯醇形成的水凝胶形状外观
通过对PVA1788的筛选,结果显示该辅料不适合做为蟾皮凝胶剂基质。
羧甲基纤维素钠水凝胶:取处方量羧甲基纤维素钠(CMC-Na)均匀分散于蒸馏水表面,待分散均匀后,水浴加热至 80℃缓慢搅拌使其溶解,加入处方量甘油。室温下放冷,缓慢搅拌可得到均匀、细腻、透明、无味的水凝胶。结果见表13。
表13 不同浓度的CMC-Na 形成的水凝胶形状外观
通过对CMC-Na的筛选,结果显示该辅料不适合做为蟾皮凝胶剂基质。
载药量考察:本处方药物具有很强的药理活性,小剂量即可达到很强的药理活性,根据初步药效学实验,确定药物混合的加入量为 2%、5%、8%、10%、20%,称取药物粉末适量于小烧杯中,以少量70%的乙醇溶液溶解,超声30min。称取适量羟丙基甲基纤维素,均匀分散于药物溶液中,逐渐放冷至室温,加入处方量甘油搅拌均匀。结果见表14。
表14 不同载药量考察结果
结果表明,选择10%做为最佳载药量。
防腐剂选择:由于蟾皮凝胶剂为水溶性凝胶剂,室温下长期放置容易发生霉变,因此需要加入适量的防腐剂。本实验选用0.1%尼泊金甲酯做为防腐剂,该防腐剂不与主药发生任何反应,无明显析出,对制剂成型无影响,且防腐效果显著。
体外透皮试验:皮肤的角质层是药物透皮吸收的主要屏障,为了增加药物的透过量以达到治疗要求,人们已经采取了许多物理和化学办法改善皮肤的渗透性。选择合适的方法测定药物的经皮吸收,是本试验透皮促进剂筛选的关键,本发明采用改良Franz体外扩散池,通过控制实验条件,模拟体内环境,预测药物进入体内的动力学过程,计算其透过量,以正确评价药物疗效。
体外经皮渗透实验方法的建立:色谱条件:色谱柱:kromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)(瑞典);流动相:乙腈(A)-水(B)(48︰52);流速:1 mL·min-1;检测波长:296nm;柱温:30℃;进样量:10μL。对照品溶液的制备:精密称取华蟾素毒基0.77mg,脂蟾毒配基0.75mg置于50mL容量瓶中,20%乙醇生理盐水溶液定容,作为对照品储备液。供试品溶液的制备:精密称取蟾皮凝胶剂0.8g,加入20%乙醇生理盐水溶液20mL,称定重量,加热回流提取60min,室温冷却,甲醇补足失重,过滤,取上述滤液1mL置于5mL容量瓶中,20%乙醇生理盐水溶液定容至刻度,过膜,作为供试品储备液。
专属性考察:精密移取对照品储备液2mL置于50mL容量瓶中,20%乙醇生理盐水溶液定容;取上述供试品溶液;取溶剂20%乙醇生理盐水溶液进样,每次进样10μL,按上述色谱条件测定。考察结果显示,在此色谱条件下,溶剂不干扰药物的测定。
标准曲线的绘制:取上述对照品储备液2mL置于10mL容量瓶中,20%乙醇生理盐水溶液定容,精密移取0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL置于5mL容量瓶中,过膜,进样10μL。以样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,华蟾酥毒基线性回归方程Y=7362.7603X-33.1968,R=0.9991,脂蟾毒配基线性回归方程Y=10387.0899X-168.1937,R=0.9990。可见华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分别在0.0616~0.9856μg/mL,0.06~0.96μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系。
精密度试验:取上述对照品储备液2mL置于10mL容量瓶中,20%乙醇生理盐水溶液定容,精密移取0.7mL置于5mL容量瓶中,过膜,进样10μL。结果见表15。
表15 精密度试验结果(n=6)
结果表明:脂蟾毒配基和华蟾毒配基相对标准偏差(RSD)均小于2%,表明仪器的精密度良好。
重复性试验:精密称取同一批蟾皮凝胶剂平行6份,按上述供试品制备方法制备,所得样品按选定色谱条件连续进样6次,分别测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量。结果见表16。
表16 重复性试验结果(n=6)
结果表明,脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差(RSD)均小于4%,表明该方法重现性良好。
稳定性试验:精密称取蟾皮凝胶剂0.8g,按上述供试品处理方法制备供试品溶液,分别于0、2、4、8、16、24 h 时注入液相色谱仪,测定供试品溶液中脂蟾毒配基和华蟾毒配基含量,考察其稳定性。结果见表17。
表17 稳定性试验结果
结果表明,华蟾毒配基和脂蟾毒配基浓度相对标准偏差(RSD)均小于 4%,说明供试品溶液在 24 h 内稳定性较好。
回收率试验:精密称取脂蟾毒配基和华蟾毒配基对照品适量,加入到已知浓度脂蟾毒配基和华蟾毒配基含量的供试品凝胶剂中,在已知色谱条件下,测定脂蟾毒配基和华蟾毒配基的含量,计算回收率。结果见表18、表19。
表18华蟾毒配基加样回收率试验结果 (n=6)
表19 脂蟾毒配基加样回收率试验结果(n=6)
结果表明,脂蟾毒配基和华蟾毒配基浓度相对标准偏差(RSD)均小于 3%,该方法准确性良好。
离体皮肤制备:取雄性大鼠(体重200±20g),大鼠尾静脉注射空气针处死,剃除腹部绒毛,取腹部皮肤,将取下的腹部皮肤平铺于干净的玻璃板上,角质层朝下。小心剔除皮下的脂肪组织及粘连物,用生理盐水反复冲洗干净,置于-20℃冰箱中保存备用。实验时取出,室温下自然解冻。每次实验前目视检查皮肤的完整性,不能有任何破损。
实验装置:采用改良Franz扩散池,该扩散池由上下两只筒状玻璃管对合而成,夹于其间的贴片将上下分为两室。上室为扩散室,下室为接收室,在接收室的右部连一取样管,供进样、取样及排除气泡用。
体外经皮渗透实验方法:采用改良Franz装置(接受池体积为17.0mL,接受池有效接触面积为 1.54cm2),固定装置,在接受室中加入预温32℃的20%乙醇生理盐水。于冰箱中取出离体鼠皮,以生理盐水洗净,用滤纸吸干表面水分,将1g供试凝胶剂于皮肤角质层面,然后将其夹在接受室与供给室之间,贴药面朝向供给室,皮肤面朝向接受室。然后置于温度32℃±0.5℃恒温水浴中,电磁恒速搅拌,搅拌速度300r·min-1。分别于 1、2、4、8、12、24h取出1mL接受液,同时立即补充同体积预温32℃的20%乙醇生理盐水。接受液微孔滤膜(0.45μm)滤过,弃去初滤液,收集续滤液,进样测定,按以下公式计算累计渗透量:Q=CnV/A Cn=C1+C2+-----+Cj,Q 为累积渗透量,A 为接受池面积,V 为接受液体积,j 为接受液取样时间。
一元渗透促进剂对诱皮行为影响:通过体外透皮试验,研究凝胶剂透皮吸收特性及不同浓度的氮酮、丙二醇、薄荷脑对其透皮效果的影响,为本制剂成型工艺的可行性提供依据。
氮酮对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基体外经皮渗透行为的考察:分别在基质中添加1%、3%、5%的氮酮,搅拌均匀制成凝胶剂,依照处方前研究的色谱条件进行体外经皮渗透实验,计算各个时间点累积渗透量。结果见表20。
表20 不同浓度的氮酮对蟾皮凝胶体外经皮累积透过量 (n=3)
结果可见:在考察范围内随着氮酮浓度升高,各时间点的透过量显著升高。
丙二醇对华蟾素毒基和脂蟾毒配基体外经皮渗透行为的考察:分别在基质中添加1%、3%、5%的丙二醇,搅拌均匀制成凝胶剂,依照处方前的色谱条件进行体外透皮实验,计算各个时间点累积渗透量。结果见表表21。
表21 丙二醇对蟾皮凝胶体外经皮累积透过量(n=3)
结果可见:在考察范围内随着丙二醇浓度升高,各时间点的透过量显著升高。
薄荷脑对华蟾素毒基和脂蟾毒配基体外经皮渗透行为的考察:分别在基质中添加1%、3%、5%的薄荷脑,搅拌均匀制成凝胶剂,依照处方前的色谱条件进行体外经皮渗透实验,计算各个时间点累积渗透量。结果见表22。
表22薄荷脑对蟾皮凝胶剂体外透皮累积透过量剂 (n=3)
结果可见:在考察范围内随着薄荷脑浓度升高,各时间点的透过量显著升高。
多元渗透促进剂对透皮行为影响:选用L9(34)正交试验表,以累计渗透量为指标,选取氮酮、丙二醇、薄荷脑三个因素对其影响,因素水平见表23。
表23 正交试验因素水平
分别在基质中加入三元透皮促进剂搅拌均匀制成凝胶剂,进行体外透皮试验,计算24h累积渗透量。
由表24、25、26的数据直观分析可知,三种透皮促进剂对蟾皮凝胶剂体外透皮累积透过量的影响程度为:薄荷脑(C)>丙二醇(B)>氮酮(A)。方差分析结果表明,因素B、C对实验结果影响显著,因素A影响较小,体外透皮累积透过量为指标,确定最佳处方为为A2B1C1即氮酮3%,丙二醇1%,薄荷脑1%。
表24
表25
注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
表26
蟾皮凝胶剂质量标准研究
方法和结果
形状:本品为深灰色半固体,质地均匀,细腻,黏度适宜,涂展性好,气微腥。
酸碱度:人体皮肤表面呈偏酸性,其 pH 值介于5.5-7.0之间,皮脂具有中和酸碱的能力,对酸性和碱性物质有缓冲作用,取蟾皮凝胶剂1 g,加入20 mL蒸馏水,超声 30min,使其完全分散,室温下放置 30 min,取上清液测pH,测得其 pH 介于 6.0-7.0 之间。
鉴别:精密称取华蟾酥毒基1.4mg和脂蟾毒配基1.1mg甲醇定容至10mL,配制成混合对照品。精密取三批蟾皮凝胶剂和空白凝胶剂各1g,加甲醇10mL,称重,分散,回流1h,放冷,补足失重,过滤,取滤液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-三氯甲烷-丙酮(4:3:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液显色,待溶液挥干后,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度好。
黏度:外用制剂对黏度有一定的要求,应用黏度计测定蟾皮凝胶剂的黏度。按中国药典2010年版(二部)附录VIG黏度测定法第二法,室温下用旋转黏度计测定三批凝胶剂的黏度,计算RSD值。三批样品的黏度结果见表27。
表27
含量测定:取三批蟾皮凝胶剂,依照处方前的供试品制备方法处理,平行制备 6份供试品溶液。按处方前的色谱条件进样10μL,测定峰面积。结果见表28。
表28
结果表明,即每lg凝胶所含华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量分别不得低于190μg和180μg,两者总量不低于370μg。
体外透皮试验:依照蟾皮凝胶处方筛选中多元渗透促进剂对透皮行为影响进行试验,24h累积透过量见表29。
表29
采用本发明配方及制备工艺制得的三批样品经过一系列质量评价后,实验结果表明该凝胶剂各项理化性质稳定且符合要求。对有效成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行含量测定。所测得的药物含量均一稳定,测定方法简单易行。
Claims (6)
1.一种蟾皮凝胶剂,其特征在于每100份蟾皮凝胶剂由以下重量份数的原料制成:蟾皮8-12份、HPMC K4M 1-3份、HPMC K100M 0.5-0.7份、薄荷脑0.8-1.2份、氮酮2-4份、丙二醇0.8-1.2份、甘油4-6份、尼泊金甲酯0.7-1.2份、水余量,所述蟾皮含水量为3-4%;
所述蟾皮凝胶剂采用以下步骤制备:
(1)预处理:选取活蟾蜍取皮,洗净、晾干;
(2)蟾皮干燥:将步骤(1)处理过的蟾皮于冷冻干燥仪中在-45℃至-55℃,压强15-25Pa的条件下连续冷冻干燥16-24h,至含水量达到3-4%,制得鲜蟾皮;
(3)粉碎处理:将步骤(2)中制得的鲜蟾皮于小型粉碎机中粗粉碎直至全部通过10目筛,然后连续超微粉碎5min,制得蟾皮超微粉;
(4)按处方量精密称取步骤(3)制得的蟾皮超微粉,按固液比(g:ml)=1:4加入70%的乙醇超声30min,挥干乙醇,直至无醇味,制得蟾皮溶液;
(5)往步骤(4)制得的蟾皮溶液中分别依次加入处方量的尼泊金甲酯、用蒸馏水溶胀后的 HPMC K4M及HPMC K100M、氮酮、丙二醇、薄荷脑及甘油,加水定容,混匀后静置12-24h,即可形成蟾皮凝胶剂。
2.根据权利要求1所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于每100份蟾皮凝胶剂由以下重量份数的原料制成:蟾皮10份、HPMC K4M 2份、HPMC K100M0.6份、薄荷脑1份、氮酮3份、丙二醇1份、甘油5份、尼泊金甲酯1份、水余量。
3.根据权利要求1所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于步骤(2)所述的连续冷冻干燥时间优选为18小时。
4.根据权利要求1所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于步骤(3)所述的蟾皮超微粉为粒径小于蟾皮细胞的粒径。
5.根据权利要求1所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于步骤(5)所述的溶胀后的HPMCK4M是按固液比(g:ml)=1:20进行溶胀的,溶胀后的HPMC K100M是按固液比(g:ml)=1.5:100进行溶胀的。
6.根据权利要求5所述的一种蟾皮凝胶剂,其特征在于所述溶胀后的HPMC K4M:HPMCK100M=1:0.23-0.5。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310554129.2A CN103655620B (zh) | 2013-11-11 | 2013-11-11 | 一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310554129.2A CN103655620B (zh) | 2013-11-11 | 2013-11-11 | 一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103655620A CN103655620A (zh) | 2014-03-26 |
CN103655620B true CN103655620B (zh) | 2016-08-17 |
Family
ID=50295181
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310554129.2A Active CN103655620B (zh) | 2013-11-11 | 2013-11-11 | 一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103655620B (zh) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102210712B (zh) * | 2011-06-02 | 2013-04-17 | 陈彦 | 一种蟾皮提取物干粉吸入剂及其制备方法、应用 |
-
2013
- 2013-11-11 CN CN201310554129.2A patent/CN103655620B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102210712B (zh) * | 2011-06-02 | 2013-04-17 | 陈彦 | 一种蟾皮提取物干粉吸入剂及其制备方法、应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103655620A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20110059124A1 (en) | The quality control method and application of a kind of ganoderma lucidum spore oil fat emulsion | |
CN100457139C (zh) | 一种双黄连注射液的制备方法及其成分检测方法 | |
CN104474551B (zh) | 褪黑素磷脂复合物、其透皮给药制剂及其制备方法 | |
CN108143883A (zh) | 一种绵萆薢总皂苷的提取方法及应用 | |
CN101439083B (zh) | 一种具有清风热、通鼻窍的中药软胶囊剂的检测方法 | |
CN102357231B (zh) | 一种复方藤果痔疮栓制剂的检测方法 | |
CN101559202A (zh) | 一种莪术油外用贴膜及其制备方法 | |
CN103655620B (zh) | 一种蟾皮凝胶剂及其制备工艺 | |
CN110478379A (zh) | 一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法 | |
CN109419823A (zh) | 红豆杉植物提取物及其在制备治疗类风湿性关节炎外用药物中的应用 | |
CN101926921A (zh) | 短葶山麦冬总皂苷及其制备方法 | |
CN108066339A (zh) | 一种帕瑞昔布钠的药物组合物 | |
CN101574387B (zh) | 垂盆草制剂的检测方法 | |
CN104383547B (zh) | 天山雪莲提取物磷脂复合物、口腔崩解片及其制备方法 | |
CN103432191B (zh) | 一种能促进血管新生的当归补血复方微囊及其制备方法 | |
CN102670698B (zh) | 千斤拔提取物在制备防治糖尿病药物中的应用 | |
CN101890003B (zh) | 一种双唑泰乳膏剂的制备方法 | |
CN104436201A (zh) | 一种双重肝靶向长循环绞股蓝皂苷脂质体的制剂及其制备方法 | |
CN107714835A (zh) | 一种提高祖师麻甲素生物利用度的祖师麻总香豆素巴布剂 | |
Mu et al. | Transdermal permeation research of ethanol extracts from Lycopodium clavatum | |
CN108355138A (zh) | 一种氮酮在药物透皮促渗中的应用 | |
CN103495156B (zh) | 一种重组人胰岛素缓释片及其制备方法 | |
CN102204871A (zh) | 一种减肥用组合物 | |
CN106109609A (zh) | 一种花粉祛痒止痛凝胶剂及其制作方法 | |
CN101926883A (zh) | 一种治疗口腔溃疡的中药组合物的制备方法及质量控制方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |