CN103535352A

CN103535352A - 一种制备植物促根剂的方法

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Publication number: CN103535352A
Application number: CN201310444657.2A
Authority: CN
Inventors: 李兴林; 韩广建; 曹爱佳; 张国运; 曹雪飞; 赵娜; 韩杨; 贾士儒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2014-01-29

Abstract

一种制备植物促根剂的方法。属于生物技术领域。香菇多糖对动植物具有多种有益作用。采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过酸性液体培养基、珍珠岩固体培养基初步筛选耐酸菌丝突变体；经过多次酸性培养基继代培养和典型的拮抗测试复筛获得耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系；优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养；从发酵液收集滤液，经热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H₂0₂脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→Sephadex G-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。这种方法可快速、低成本、大规模生产质量稳定的香菇多糖。

Description

一种制备植物促根剂的方法

技术领域

一种制备植物根系促生剂的方法。该方法属于生物技术领域。采用这一技术，可以快速、大规模生产质量稳定的香菇多糖、并降低其生产成本。生产的根系促生剂能有效促进植物根系的旺盛生长，而对植物的其他器官影响较小，并且不受该物质高浓度的抑制，明显优于其他植物激素或生长调节剂。可以广泛应用于农林、食品和环境等领域。

背景技术

香菇多糖对动植物具有多种有益作用，一般采用从子实体中提取，生长周期长、分离成本高。因而，香菇多糖的生产和应用受到很大的限制。采用耐酸菌丝实施深层开放式培养大规模生产，以可以克服这些缺陷。

发明内容

采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过酸性液体培养基(pH1.0-4.0)、珍珠岩固体培养基初步筛选耐酸菌丝突变体；经过多次酸性培养基继代培养和典型的拮抗测试复筛获得耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系；优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养；从发酵液收集滤液，经热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H202脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→SephadexG-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。这种方法可快速、低成本、大规模生产质量稳定的香菇多糖。

具体实施方式

1采用香菇子实体等来制备高活性菌丝

1)供试培养基

(1)PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，pH自然。选择质量好的马铃薯洗净后，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分。切成小块(约1.0cm×1.5cm至2.0cm×3.0cm)。称取马铃薯200g，加水约1L，温火煮沸并保持30min，马铃薯块变软时用4层纱布过滤，滤汁内加入琼脂和葡萄糖，在文火上使琼脂融化，加水补足1L，分装后加琼脂经120℃高压湿热灭菌20min。

(2)液体种子培养基(w／v)：马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，初始pH6.0。

(3)摇瓶基础培养基(w／v)：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂P0₄0.2％，MgS0₄0.1％，初始pH2.5。

2)香菇菌丝培养

(1)菌种活化

将保存于试管斜面培养基上的香菇菌种用接种铲切出0.5cm×0.5cm大小的菌块接种于倒平板的PDA培养基上，25℃恒温培养6d。

(2)液体种子培养

将已活化的斜面菌种切割成0.5cm×0.5cm大小菌块，接种于液体种子培养基中，每个250mL三角瓶接5块菌块，10个大小均一的玻璃珠，培养基装液量100mL，于25℃，150r／min培养6d，制备成发酵种子液。

(3)摇瓶发酵培养

将摇瓶菌种在25℃静置24h后，用匀浆器将其匀浆。250mL三角瓶装培养基100mL，液体菌种接种量为10％，于25℃，150r／min培养12d。

3)菌种分离及纯化

香菇菌种分离就是把香菇菌丝体从混杂的微生物环境中单独分离出来，并进行纯培养。可采用孢子分离法和组织分离法。

孢子分离得到的菌丝具菌龄短，生活力强等优点，并具有双亲遗传特性，是选育高新菌株和杂交育种的材料，但由于其染菌率过高，因而，目前香菇生产上最常使用的1种分离方法为组织分离法。即就是利用香菇子实体组织，分离培养出香菇的纯菌种。具体做法为选择个体典型，朵多，盖厚无病虫危害，最好是用未成熟的菌蕾作为分离材料。用75％酒精冲洗种菇表面进行消毒，再用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸干。用消过毒的刀片在菇柄中部纵切一刀，用手掰开菌盖，在菌盖与菌柄交界处取米粒大小的小块组织，移接到PDA斜面培养基上，加上棉塞，在25℃条件下培养。

菌种的纯化及扩大培养：菌种分离培养3d～4d后，选取菌丝萌发早，长势旺的菌落，转管扩大培养。经扩大培养菌种一般在8d～12d可长满管。香菇菌种肉眼观察PDA斜面上菌丝生长洁白，羽毛状沿着培养基表面延伸，至此得到试管菌种(即母种)。

4)耐酸性香菇诱变菌丝筛选

(1)紫外辐照处理

在培养了6d的香菇菌丝中，挑选萌发快，扩散快，洁白粗壮的菌丝，用打孔器在菌丝的尖端组织处，取出数个菌丝块，然后用接种铲转接于另一块经灭菌的PDA平板培养基中心，于25℃恒温培养2d后，进行香菇菌丝的紫外诱变。

诱变前，开启紫外灯20～30min，使波长稳定，恒温箱25℃培养。将菌株分为9组(3次重复)，设紫外线照射0.5、1、5、10、15、20、25、30min和出发菌株(CK)。长在固体培养基上的菌丝在25℃的培养箱中培养48h后取出，选择长势一致的菌丝立即进行辐照处理。选用紫外线灯20W，辐射强度90μW／cm²，照射距离30cm，常规方法照射。处理后用黑布包裹，置于恒温箱25℃下继续培养。用十字交叉法测菌丝日均长速，并观察记录菌丝长势。

(2)诱变菌丝拮抗性试验

将经过辐照处理的菌丝在25℃恒温箱中继续培养3～4d左右，观察菌丝恢复生长情况，选择菌丝长速、色泽变化或菌丝形态变化的菌株进行拮抗试验，挑取经过不同辐照处理的菌丝接种于空白培养基的一端，另一端接种对照菌丝，置于25℃恒温箱中培养6d，观察拮抗线产生情况。

用紫外线照射处理后有明显变化的菌丝和对照菌株的菌丝各一块，同时接入同一培养皿PDA培养基两端，相距1cm左右，如中央产生了明显拮抗线的，说明了菌株已产生了变异，不产生拮抗线的则表明菌株没有发生变异。

(3)耐酸性诱变菌株筛选

耐酸香菇菌株的初筛：分别将筛选后的变异菌株及出发菌株同时接种到液体种子培养基中，每个处理设置3次重复，(观察菌丝在pH=4.0、3.0、2.0、1.5、1.0下)于25℃，150r／min恒温培养8d后的生长情况，进行香菇耐酸性菌株的初选。

耐酸香菇菌株的复筛：将初步筛选出的耐酸性菌株分别接种到选择性培养基上，在pH=4.0、3.0、2.0、1.5、1.0下于25℃恒温继续培养，进行香菇耐酸性菌株的复筛。

选择性培养基组成与液体种子培养基组成相同，初筛的耐酸性香菇菌丝种子液及出发菌株种子液，分别每次取100μL，接种到含有10g无菌珍珠岩的选择性平板培养基上，在平板的五个不同位置接种，每个菌株设5个重复，定期观察。

经过诱变、珍珠岩固体培养基筛选、拮抗反应和测定液体培养下菌丝生物量、胞外多糖含量等，初步确定了三个耐酸突变体Atm-01、02和03。

在低pH培养基中对三个突变体分别培养12天，三个重复；测定的菌丝生物量、胞外多糖含量，结果表1。由表1可知，Atm-02表现最佳，所以，以此为材料进行以下实验。

对培养的Atm-02定期取样，测定的菌丝生物量、胞外多糖含量，结果表2。由表可知，菌丝在培养12天是菌丝生物量和胞外多糖均达到峰值，可以终止发酵。

表1起始pH对三个耐酸突变体的菌丝生物量和胞外多糖的影响

表2Atm-02发酵液中菌丝生物量和胞外香菇多糖的含量变化

2耐酸性香菇菌丝液体深层开放式培养

1)培养基成分优化

(1)最适碳源选择

以2％葡萄糖为标准，分别以等量的糊精、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、果糖代替基础培养基中的葡萄糖作为碳源，培养基的其它组成成分及含量与基础培养基相同。每处理重复3次，以香菇菌丝生物量和胞外多糖含量为指标，对试验结果进行统计分析。

(2)最适氮源选择

以0.5％酵母浸粉为标准，分别用等量的牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸钾(KNO₃)、硝酸铵(NH₄NO₃)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)代替基础培养基中的酵母浸粉作为氮源，培养基的其它组成成分及含量与基础培养基相同。每处理重复3次，以香菇菌丝生物量和胞外多糖含量为指标，对试验结果进行统计分析。

(3)无机盐选择

无机盐离子有促进香菇菌体生长及胞外多糖合成的作用。基础培养基所用的自来水足以满足香菇菌所需的Ca²⁺、Mn²⁺、Al^３+、Fe²⁺、Zn²⁺等离子的需要，所以选择KH₂PO₄、MgSO₄作为无机盐使用。

(4)生长因子选择

叶酸、维生素C、维生素B₁，对此3种生长因子进行对比试验，选择最适生长因子。每个处理重复3次，将基础培养基作空白试验，以香菇菌丝生物量和胞外多糖含量为指标，对试验结果进行统计分析。

2)发酵培养条件优化

(1)温度对发酵的影响

250mL三角瓶装培养基100mL，液体菌种接种量为10％，温度分别设为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，每个处理重复3次，150r／min培养12d。

(2)装液量对发酵的影响

250mL三角瓶的装液量分别装入60mL、80mL、100mL、120mL、140mL、160mL的发酵培养基，每个处理重复3次，于25℃，150r／min培养12d。

(3)转速对发酵的影响

250mL三角瓶装培养基100mL，摇瓶转速分别设为80r／min、100r／min、120r／min、140r／min、160r／min、180r／min、200r／min，每个处理重复3次，于25℃培养12d。

(4)种子液接种量对发酵的影响

深层发酵培养中的接种量分别设为(v／v)2％、6％、10％、14％、18％，每个处理重复3次，于25℃，150r／min培养12d。

3)开放式深层培养结果

未高温灭菌培养基的开放培养结果表明，通过单因素实验，优化后香菇菌丝深层培养的培养基为：蔗糖30～40g／L，牛肉浸膏9.0g/L，KH₂PO₄和MgSO₄分别为4.0g／L和2.0g/L，维生素B₁0.15g／L；香菇菌丝的优化培养条件为：温度26℃，培养基装液量100mL／250mL三角瓶，摇瓶转速180r／min，种子液接种量为10％。

在上述条件下，Atm-02的开放式培养(pH为2.0)结果显示，胞外多糖最高产量可达到172±23mg/100mL发酵液。

3香菇多糖的分离纯化

1)粗多糖纯化工艺流程：

发酵液热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H₂O₂脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→Sephadex G-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)。

2)具体过程为：

a.脱蛋白：采用Sevag法，用蒸馏水将粗多糖溶解(100mL)，去除不溶部分，可溶部分加入Sevag试剂(样品：Sevag为2：1；氯仿：正丁醇为4：1)，磁力搅拌器搅拌30min，4000r／min离心5min，转移至分液漏斗静置10min，待其分层后，去除有机层与两层间的蛋白质层。同法重复几次直至有机层没有白色絮状沉淀为止。

b.脱色：采用30％H₂O₂脱色，多糖溶液在pH=8下滴加H₂O₂至淡黄色或无色，在50℃下保温2h。

c.透析：浓缩脱色的多糖溶液，装入透析袋(截留分子量为1.2-1.4kDa)中用蒸馏水透析，每8h换一次水，室温透析2d至离子强度不变为止。将透析液减压浓缩，冻干。

d.DEAE-52柱层析

DEAE-52柱的装填：50g Cellulose DE-52用蒸馏水充分溶胀，用0.5mol／L HCI浸泡1h，抽滤，水洗至中性，然后用0.5mol／1NaOH浸泡1h，抽滤后水洗至中性，再用0.5mol／L HCl浸泡1h，水洗至中性，既得Cellulose DE-52。湿法装柱(2.4×40cm)，要求装填致密均匀。

DEAE-52柱层析：准确称取脱蛋白、脱色、透析完的多糖样品100mg，溶于10mL蒸馏水中，上柱，依次用蒸馏水、0.03mol／L、0.3mol／LNaCl溶液洗脱，控制流速为1mL／min，分部收集洗脱液，每管收集1.5mL，洗至无糖组分流出，用葸酮-硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖的含量。合并含糖量高的主峰部分，浓缩、透析、冻干。

e..多糖的Sephadex G-100凝胶柱层析

Sephadex G-100的装填：将凝胶填料用0.1mol／LNaOH与0.5mol／LNaCl混合液浸泡0.5h，蒸馏水洗至中性。湿法装柱(2.4×40cm)，要求装填致密均匀。

Sephadex G-100凝胶柱层析：将上述用DEAE-52分离得到的中性多糖、酸性多糖各5mg溶于10mL蒸馏水中，上样，进行Sephadex G-100凝胶柱层析，依次用蒸馏水、0.05mol／LNaHCO₃溶液洗脱，流速为0.6mL／min，分部收集，每管收集2mL，葸酮-硫酸法跟踪检测。

f.纸层析鉴定

称取15mg多糖样品溶于0.86mL蒸馏水中，再加入0.14mL72％H₂SO₄，密封，121℃水解45min，BaCO₃中和，离心取上清液点样(8μL)在新华1#滤纸，上行法展层，展开剂为正丁醇：乙酸：水=4：1：5，氨性硝酸银显色。

g.紫外光谱分析

将多糖样品溶于0.1mol／L的NaOH溶液，配制成1mg／mL的溶液，将上述样品溶液在200～400nim波长处进行紫外扫描。

h.红外光谱分析

采用KBr压片法：称取多糖样品1mg，与100mg KBr混合，研细均匀，放于模具中，在油压机上用(5-10)×10⁷Pa压力压成透明薄片，在4000-400cm^-1区间进行红外光谱扫描，扫描次数：32，分辨率为4cm^-1。

发酵液经分离提纯达到多级成分：发酵液、粗多糖、脱蛋白多糖以及中性或酸性多糖，其理化性质见表3。其中单一成分的多糖有含量最高的是中性多糖和酸性多糖，经过上述纸层析等分析表明，获得的中性多糖和酸性多糖为单一分子。中性多糖与酸性多糖的官能团也明显有差异(见表4)，其中，中性多糖很少含葡萄糖(见表5)，它是促根生长的主要多糖。

表3香菇多糖部分理化性质

表4香菇多糖(中性多糖、酸性多糖)官能团的红外光谱分析

表5中性多糖水解所得各单糖的保留时间与峰面积

4香菇多糖对植物生长的影响

(1)挑选较饱满的甘草种子，浸入1％NaOCl溶液5min进行消毒，蒸馏水冲洗三次；消毒后的种子置于塑料筐(30cm×15cm)，双层纱布包裹，每天用蒸馏水润湿种子。

(2)6天后，筛选已经发芽且牙长一致的种子，栽入含有2kg无菌珍珠岩塑料筐中，每框40颗，均匀分布，框子提前用乙醇消毒。每天定量浇水，浇入除去有机部分的1／5MS培养基^[74](每周浇1～2次)。

(3)选择3-4片叶期健壮甘草苗若干，使用喷壶均匀喷药，喷嘴与植物间保持距离为10cm，间隔5d，连续喷药两次，每次药量50mL／600cm²，珍珠岩层保持一定的水层，对照区喷蒸馏水。药后将处理植株置于20～30℃日光温室中培养。

试剂制备：

应用四种试剂进行试验，每个试验重复三次：100mL发酵液(FF，培养12d后的发酵液)；100mL0.5％粗多糖溶液(PPSS)；100mL0.5％脱蛋白多糖溶液(DPPSS)；100mL0.5％中性多糖溶液(NPSS)。

(4)七周后，收集甘草苗，分别测量茎长、茎干重、根长、根干重等指标。

测定结果见表6。由表6可知，发酵成分对根茎的生长有明显的促进作用。提纯的脱蛋白多糖和中性香菇多糖对根的促生作用比对茎更为明显。而去掉蛋白后的中性多糖仍然具有明显的促根作用，尤其是表现在促进根的伸长上，表明了中性多糖是促根生长的主要因子。

接着对发酵液和脱蛋白多糖进行稀释后处理甘草，再次分别测量茎长、茎干重、根长、根干重等指标，结果见表7。表7表明，当脱蛋白多糖稀释到60000倍时仍然能很好地促进根的生长，而对茎的促进作用已经很微弱了。

表6不同发酵成分提高乌拉尔甘草根长、根重的比例(与对照相比，％)

表7不同浓度的发酵液和脱蛋白多糖对乌拉尔甘草的促生作用

注：所有值均表示成均值±三次重复值的标准偏差(SD)。依据LSD检验(P≤0.05)，本表格中同一列不同的上标字母表示这些数据之间存在显著性差异。

Claims

1.采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过pH1.0-4.0液体培养基振荡培养、pH1.0-4.0培养液浸湿珍珠岩固体培养基培养，初步筛选出耐酸菌丝体。

2.初选耐酸菌丝体经过1-5次的pH1.0-4.0培养基的继代培养和典型的拮抗测试，复筛出耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系。

3.优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养耐酸突变体。

4.从发酵液中收集滤液，经热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H₂O₂脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→Sephadex G-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。