CN103520724A - Hsd17b13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途。本发明所提供的新用途具体为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。实验证明，使用携带HSD17B13基因的重组腺病毒免疫C57野生型小鼠，可观察到到小鼠肝脏发生了明显的脂肪性变化，并且该肝脏切片的油红染色显示出大量的脂肪聚积，肝脏组织中的甘油三酯和胆固醇含量显著增加。由此可以看出HSD17B13可能参与了脂肪肝的形成过程。本发明对于预防和/或治疗脂肪肝具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途，特别涉及HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
背景技术
HSD17B13是一类固醇类脱氢酶，属于17β-HSD家族，由2007年被克隆出来。人HSD17B13基因在染色体上定位于4q22染色体，含有七个外显子，编码含300个氨基酸的蛋白。17β-HSD属于SDR的一个亚家族，SDR是一个非常庞大的家族，参与哺乳动物的生殖、发育、肥胖等一系列生理与病生理过程。17β-HSD亚家族一共有14个成员，其它成员主要参与性激素的活化与灭活，其异常与前列腺癌和乳腺癌等生殖肿瘤密切相关，而HSD17B13的功能目前尚无任何报道。
脂肪肝，是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。当脂肪含量超过肝湿重5%时（正常为1～2%），或组织学上脂肪变超过30%肝实质时称为脂肪肝。脂肪肝的主要病理生理学特征为肝细胞内脂滴聚集，肝细胞气球样变以及肿胀的线粒体。胰岛素抵抗、内脏脂质沉积、炎症和线粒体功能障碍为脂肪肝发展过程中重要的病理过程。我国目前脂肪肝的发病率已超过18%，脂肪肝已经成为各种慢性肝脏疾病的主要病因，也是隐源性肝硬化的首因，而其发病趋年轻化趋势。
目前临床并无有效的治疗脂肪肝的药物。在临床治疗中，仍以去除病因、积极治疗原发病和坚持合理饮食制度为主，而药物仅起辅助作用。常用药物主要针对降血脂、肝细胞保护等方面，缺乏直接作用于肝脏脂质沉积的有效治疗手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途。
本发明所提供的HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途，具体为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
进一步，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备如下任一产品中的应用也属于本发明的保护范围：
（I）降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量的产品；
（II）降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量的产品。
本发明的再一个目的是提供一种产品。
本发明所提供的产品的活性成分为所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂；所述产品具有如下用途中的至少一种：
（a）预防和/或治疗脂肪肝；
（b）降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量；
（c）降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量。
以上所述患病机体可为具有脂肪肝临床症状的机体，如确诊为脂肪肝的患者。
以上所述产品具体可为药物。
在本发明中，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂，可分为如下两大类：
其一，能够抑制所述HSD17B13蛋白的编码基因的表达，从而降低所述HSD17B13蛋白的表达水平；其二，能够与所述HSD17B13蛋白结合，从而降低所述HSD17B13蛋白促进脂质生成的活性。
进一步，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂，具体可为小干扰核酸、反义寡核苷酸、抗体和活性有机化合物中的一种或几种。
更加具体的，所述小干扰核酸可单独使用，也可与其它活性组分或辅料配合制成药物。所述反义寡核苷酸为长度为14-30bp的单链结构，并且所述反义寡核苷酸与所述HSD17B13蛋白的编码基因中相配对的核苷酸序列具有90％以上的同一性。所述抗体，可为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述HSD17B13蛋白或其编码基因在构建脂肪肝动物模型中的应用，或在制备用于构建脂肪肝动物模型的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述脂肪肝动物模型是指与正常动物相比肝脏组织中甘油三脂含量提高和/或肝脏组织中胆固醇含量提高
本发明是还一个目的是提供一种利用所述HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法。
本发明所提供的利用所述HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法，具体可包括如下步骤：向目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因，得到具有脂肪肝临床症状的转基因动物。
在所述方法中，所述脂肪肝临床症状具体体现在如下：1）油红O染色显示肝脏内脂滴明显增加；2）肝脏组织中甘油三脂含量升高；3）肝脏组织中胆固醇含量升高。以上1）中所述的增加，以及2）和3）中的所述升高均是以未经造模的所述目的动物的相应指标作为参考的。
在本发明中，所述HSD17B13蛋白或其编码基因是通过重组腺病毒载体的形式导入所述目的动物中的；所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒。
在所述方法中，向所述目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因为：将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4×1010pfu的用量免疫（如静脉注射，具体如尾静脉注射）所述目的动物。本发明是又一个目的是提供一种用于构建脂肪肝动物模型的套药。
本发明所提供的用于构建脂肪肝动物模型的套药，具体可包括重组腺病毒载体和用药说明书；所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒；所述用药说明书记载如下内容：将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4×1010pfu的用量静脉注射所述目的动物。
在以上所述的应用或产品或方法或套药中，所述HSD17B13蛋白具体为由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白。
进一步，所述HSD17B13蛋白的编码基因是如下（1）至（4）中任一所述的DNA分子：
（1）编码序列为序列表中序列2的第25-927位的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子；
（4）与（1）-（3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子。
在本发明中，以上所有的所述重组腺病毒均是利用AdEasy系统包装得到的，具体而言，可按照包括如下步骤：
a1）将所述HSD17B13蛋白的编码基因插入到pAdTrack-CMV质粒的多克隆位点Not I，得到重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13；
a2）用限制性内切酶Pme I酶切所述重组质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13，得到线性化质粒1；
a3）将所述线性化质粒1与骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，得到重组大肠杆菌；
a4）从所述重组大肠杆菌中提取同源重组质粒pAdEasy-HSD17B13；
所述同源重组质粒pAdEasy-HSD17B13为所述重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13和所述骨架质粒pAdEasy-1通过各自携带的两个同源臂发生重组后得到的重组质粒；
a5）用限制性内切酶Pac I酶切所述同源重组质粒pAdEasy-HSD17B13，得到线性化质粒2；
a6）用所述线性化质粒2转染哺乳动物细胞（如HEK293细胞），培养重组细胞，得到所述重组腺病毒。
在本发明中，所述目的动物可为小鼠。
在本发明中，所述目的动物具体为C57BL/6小鼠，更加具体的为8周龄雄性C57BL/6小鼠。
退一步讲，本发明所提供的构建脂肪肝动物模型的方法也可以说是构建同时具有如下性状的动物模型：
与未经造模的所述目的动物相比，1）油红O染色显示肝脏内脂滴明显增加；2）肝脏组织中甘油三脂含量升高；3）肝脏组织中胆固醇含量升高。
实验证明，使用携带HSD17B13基因的重组腺病毒免疫C57野生型小鼠，可观察到到小鼠肝脏发生了明显的脂肪变，并且该肝脏切片的油红染色显示出大量的脂肪聚积，肝脏组织中的甘油三酯和胆固醇含量显著增加。由此可以看出HSD17B13可能参与了脂肪肝的形成过程。因此，HSD17B13基因可能是预防和/或治疗脂肪肝的关键因素。
附图说明
图1为正常人和脂肪肝病人的肝脏脂滴相关蛋白的SDS-PAGE结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为正常人；泳道2为脂肪肝病人。
图2为正常人和脂肪肝病人的肝脏组织在分离脂滴过程中不同组分中HSD17B13蛋白的western blot结果。其中，LD为脂滴蛋白；TM为总膜；Cyto为胞浆蛋白；PNS为去核上清液。
图3为II型糖尿病小鼠（db/db）和对照小鼠（db/m）的肝脏组织切片的油红O染色结果（200×）。
图4为II型糖尿病小鼠（db/db）和对照小鼠（db/m）的肝脏中HSD17B13蛋白的western blot图片及定量分析。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析结果，以对照小鼠（db/m）肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为1。
图5为高脂小鼠（饲喂高脂饲料，HF）和对照小鼠（饲喂正常饲料，Con）肝脏中HSD17B13蛋白的western blot图片及定量分析。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析结果，以对照小鼠（饲喂正常饲料，Con）肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为1。
图6为重组腺病毒Ad-HSD17B13的western blot鉴定结果和RT-PCR检测结果。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13基因水平的相对定量分析结果（RT-PCR），以2MOI腺病毒感染组HSD17B13基因表达水平比上β-actin为1。
图7为对照重组腺病毒Ad-GFP的鉴定结果。
图8为免疫了重组腺病毒Ad-HSD17B13或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠肝脏形态和组织切片油红O染色结果。其中，A为肝脏形态，B为组织切片油红O染色结果。
图9为免疫了重组腺病毒Ad-HSD17B13小鼠（实验组）或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠（对照组）肝脏中HSD17B13mRNA的表达量检测结果（RT-PCR），以HSD17B13mRNA的表达量比上作为内参的β-actin的表达量，即人HSD17B13/β-actin作为指标。
图10为免疫了重组腺病毒Ad-HSD17B13小鼠（实验组）或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠（对照组）肝脏中HSD17B13蛋白的表达检测结果（western blot）。其中，A为western blot图片，G3表示给予Ad-GFP后第3天（对照组），B3表示给予Ad-HSD17B13后第3天（实验组）；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析结果，以对照组小鼠的肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为1。
图11为免疫了重组腺病毒Ad-HSD17B13小鼠（实验组）或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠（对照组）血清和肝脏中甘油三酯（TG）和胆固醇（CHO）含量的测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
AdEasy包装系统质粒：穿梭质粒pShuttle-CMV（购自Stra-tagene公司，＃240007）和骨架质粒pAdEasy-1（购自Merck公司，T240005）。这两个质粒均含有可发生同源重组的两个同源臂。
HEK293细胞：购自ATCC CRL-1573。
C57BL/6小鼠；雄性，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
Pac I内切酶购自Merck公司，R0547S；PmeⅠ内切酶购自NEB公司，R0560S。
实施例1、正常人和脂肪肝病人的脂滴相关蛋白的差异蛋白质组学研究
本实施例中，离体肝脏组织样本来自：正常人和脂肪肝病人。其中，正常人的肝脏组织样本来自于为健康的自愿者（未患肝病及其他疾病）；脂肪肝病人的肝脏组织样本来自于临床确诊为脂肪肝的患者，由北京大学第一医院提供。
一、肝脏脂滴纯化
1．将肝脏组织样本浸泡在预冷的4℃PBS中，用小剪刀仔细去除包膜和结缔组织，剪成1mm×1mm×1mm小块，转移至10ml预冷低渗液A中。
预冷低渗A液：20mM甘氨酸，250mM蔗糖，pH7.8，双蒸水配制。各浓度均为相应组分的终浓度。
2.用玻璃匀浆器进行匀浆20下。
3.过200目筛网，收集到单细胞悬液。
4.用氮泵破碎细胞（500PSI，15min，冰浴），收集到10ml样品。
5.低速离心去核（3000rpm，4℃离心10分钟）。
6.离心后样品分三层，最上层为细胞碎片，中间层为去核上清，沉淀为细胞核。用移液器小心移取中间层置于新的50ml离心管，如不小心将沉淀吸起，可以重复步骤5。
7.取去核上清液（PNS）。同时取200μl上清于1.5ml EP管中，标记为PNS，备用。
8.准备SW40管，取9ml PNS（约离管口3cm）加入SW40管，再用1ml枪缓慢靠壁加入2ml B液（SW40管已加满）。
B液：20mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸），100mM氯化钾，2mM氯化镁，pH7.4，双蒸水配制。各浓度均为相应组分的终浓度。
9.超速离心。天平配平，放入吊篮，10000rpm，1h，4℃离心。
10.离心完毕后脂滴将在梯度溶液的最上方，浓缩成一条白带，而在最下方的沉淀为总膜；
11.用200μl枪小心将最上层脂滴转移至1.5ml EP管（每个SW40管约能吸出300μl）。用1ml管小心吸走B液，取200μlB液下层液体，即为胞浆蛋白（cytosol），至1.5ml EP管，标记为Cyto。去上清，将沉淀用200μlB液重悬至1.5ml EP管，涡旋，即为总膜，标记为TM。
12．用B液）洗涤脂滴三遍，用200μl B液重悬至1.5ml EP管，标记为LD。
13.抽提蛋白。往每个EP管（标记为PNS、Cyto、TM和LD的共四个EP管）中加入300μl氯仿，指弹混匀，加1ml丙酮，指弹混匀，14000rpm离心15分钟。
14.此时上层液体为溶解在有机溶剂中的脂质，白色沉淀即为脂滴蛋白，上层有机溶剂用玻璃容器收取，-80℃保存，剩下室温开盖放置，待有机溶剂挥发，根据蛋白量加入一定量的上样缓冲液。
15.蛋白样品100℃变性5分钟，用于后续检测。
二、差异蛋白质组学研究
1.银染
①上样：配制1.0mm10%SDS-PAGE胶。将正常肝脏以及脂肪肝纯化后的脂滴蛋白（以上标记为LD的样品）进行上样，上样量为5μg，20mA恒流跑至指示剂离胶板下缘0.5cm。
②固定：用含10%（体积分数）冰醋酸和40%（体积分数）乙醇的固定液固定30分钟。
③致敏：在致敏液中致敏30分钟，水洗3次，每次3分钟。其中，致敏液配方如下：100ml溶液中含体积分数30%乙醇，0.314g硫代硫酸钠，11.28g三水乙酸钠。
④银染：在银染液中银染20分钟，水洗一遍。其中，银染液配方如下：100ml溶液中含0.25g硝酸银和40μl体积分数37%甲醛。
⑤显色：用显色液进行显色，其间换两遍显色液。其中，显色液配方如下：10g碳酸钠，40μl体积分数37%甲醛，加水至200mL。
⑥终止：等到显色对比度到达最佳时候时，用终止液终止染色。其中，终止液配方如下：1.28g EDTA加水至100mL。
SDS-PAGE染色结果如图1所示，从图中可以看出，与正常人肝脏相比，脂肪肝脂滴蛋白样品在33KDa位置处有一显著上调的条带。
2.对差异条带进行切胶制样（胶内酶解）
①将所选择的凝胶条带（正常人和脂肪肝患者肝脏组织样本在33KDa位置的条带）用手术刀片切下，置于EP管中，并记录条带号及相应的位置，把条带切成3-4mm3大小。
②用脱色液（浓度为30mM的K3Fe(CN)6水溶液与浓度为100mM的Na2S2O3水溶液按照体积比1：1的比例混合）脱色，银色褪去后，再用浓度为25mM的NH4HCO3水溶液洗到透明。
③加乙腈（ACN）200μl脱水至胶粒完全变白，吸干，真空抽干5分钟。
④加浓度为10mM的二硫苏糖醇（DTT）水溶液50μl，56℃水浴1小时。
⑤冷却到室温后吸干，快速加浓度为55mM的碘代乙酰胺（IAM）水溶液50μl，置于暗处45分钟。
⑥依次用浓度为25mM的NH4HCO3水溶液、体积分数为50%的乙腈水溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，吸干，真空抽干5分钟；
⑦将浓度为0.1μg/μl的酶解液（promega，V5111,溶解于25mM的碳酸氢铵中）以浓度为25mM的NH4HCO3水溶液稀释20倍，每EP管加酶液量以完全润湿胶粒为准，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，在冰上放置30分钟，待溶液完全被胶块吸收，吸走多余酶液，加浓度为25mM的NH4HCO3水溶液30～45μl，置于37℃水浴，消化过夜。
⑧用5%（体积分数）甲酸水溶液终止反应，使溶液pH<4，振荡混匀，离心。真空干燥，加入0.1%（体积分数）甲酸水溶液20μl溶解多肽，上机进行质谱检测。
所用仪器为LTQ线性离子阱质谱仪（购自Thermo Fishier Scientific,Waltham,MA），所获得的质谱数据用NCBI所公布的人的数据库进行检索。所使用的相关软件为SEQUEST algorithm(Ver.2.8),和Thermo Electron Bio Works(Rev.3.3.1)，相关参数设置如下：XCorr g1.5(+1ions)，2.0(+2ions)，2.5(+3ions)；Delta CN g0.08；Spg500；Rspe5。
结果如表1所示，可见，与正常人肝脏相比，脂肪肝脂滴蛋白样品在33KDa位置处显著上调的条带很可能为HSD17B13（丰度最高）。
表1银染胶切带回收质谱结果
| 基因名称 | 分子量 | 基因信息编号 | 肽段数 | |
| 1 | HSD17B13 | 29604.7 | 210032112 | 50 |
| 2 | HSD17B11 | 32935.6 | 142976729 | 13 |
| 3 | 视黄醇脱氢酶16 | 35673.2 | 150247226 | 8 |
三、western blot验证
配制10%的SDS-PAGE胶，将步骤一纯化后的四个样品（PNS、cyto、TM和LD）上样（保证蛋白总量相等），进行电泳，转膜，一抗采用兔来源的抗HSD17B13抗体（购自abcam公司，产品目录号为ab122036），按照1：1000（体积比）进行孵育，4℃过夜，二抗采用HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006），室温孵育1小时，洗膜，发光检测。
western blot结果如图2所示，从图中可以看出，脂肪肝脂滴组分HSD17B13蛋白表达显著上调，提示HSD17B13蛋白可能在肝脏糖脂代谢调节中有重要作用。
实施例2、II型糖尿病小鼠和高脂小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达检测
为了进一步确认HSD17B13蛋白表达与肝脏组织中脂质沉积之间存在正向关系，本发明的发明人对表现出脂肪肝临床症状的II型糖尿病小鼠和高脂小鼠肝脏组织中的脂质沉积情况和HSD17B13蛋白的表达量进行了检测。
一、II型糖尿病小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达检测
II型糖尿病小鼠（db/db）：遗传背景为C57BL/KsJ，购自上海南方模式生物研究中心。该小鼠表现出脂肪肝临床症状。
对照小鼠（db/m）：遗传背景为C57BL/KsJ，购自上海南方模式生物研究中心。该小鼠无脂肪肝临床症状表现。
db/db和db/m两种小鼠之间的区别与关系：1966年美国Jackson实验室于C57BL/Ks（db/db）品系小鼠发现糖尿病突变基因（db），它是位于小鼠4号染色体的瘦素受体（Leptin receptor）基因发生突变所致。db/db小鼠主要表现为下丘脑缺陷，它不能产生饱感，即对饱感物质（瘦素）缺乏反应，从而合成代谢大于分解代谢，引起脂肪的堆积而肥胖，逐渐发展为严重的糖尿病伴有明显的高糖血症。该小鼠具有和人类2型糖尿病相似的临床症状，多饮、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂代谢异常等综合征，而dm/m则不出现代谢异常，是db/db的常用对照。
取II型糖尿病小鼠（db/db）和对照小鼠（db/m）的肝脏组织样本，一方面制作组织切片，用油红O（染脂肪）染色，直观观察脂质沉积情况；另一方面，进行westernblot检测肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达情况。具体操作如下：
1、组织切片油红O染色
具体的操作如下：
（1）组织切片用4%多聚甲醛固定10分钟；（2）蒸馏水洗；（3）60％异丙醇浸洗；（4）油红O染液10分钟；（5）60％异丙醇分色至背景无色；（6）蒸馏水洗；（7）Mayer苏木精复染；（8）自来水洗（蓝化）1～3分钟；（9）蒸馏水洗；（10）甘油明胶封片。（11）油红O0.5g溶于100ml异丙醇。
结果如图3所示。从图中可以看出，db/db鼠肝脏出现明显的脂质沉积（红色为被染上的脂滴，可见大面积被染成红色的区域）。
2、western blot
首先，参照实施例1步骤一中制备肝脏脂滴（LD）的方法制备上样蛋白；染着参照实施例1步骤三中的方法进行western blot，所用抗体为实施例1中的一抗和二抗，其中作为一抗的兔来源的抗HSD17B13抗体（购自abcam公司，产品目录号为ab122036）可以同时识别人HSD17B13和鼠HSD17B13。
同时以elF5为内参，一抗为兔源抗elF5抗体（购自santa cruz，产品目录号为sc-292173），二抗为HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006）。
将所得western blot图谱用作图软件IMAGE J进行灰度分析，以HSD17B13的灰度值比上作为内参的elF5的灰度值，即鼠HSD17B13/elF5作为指标，然后将对照组进行归一化处理，即将对照组各样品的比值求平均值，然后将各样品比上该平均值作为最后相对定量结果，用Graph pad5.0做柱状图。
western blot图谱如图4中A所示，从图中可以看出，II型糖尿病小鼠（db/db）肝脏组织中HSD17B13蛋白的目的条带信号明显比对照小鼠（db/m）的目的条带信号更强。进一步的定量分析结果如图4中B所示，从图中可以看出，II型糖尿病小鼠（db/db）肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达量为对照小鼠（db/m）的近2倍。
二、高脂小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达检测
1、高脂小鼠动物模型的制备
给SPF级4周龄雄性C57BL/6小鼠（体重20-22g）饲喂MD45%的高脂饲料，得到高脂小鼠动物模型。饲料配方及具体操作参考“周云枫,李沙,苏文等.不同脂肪含量的高脂纯化配方饲料对大、小鼠代谢综合征发生的影响.基础医学与临场,2012(3):273-277.”一文进行。
同时以饲喂正常饲料的SPF级4周龄雄性C57BL/6小鼠（体重20-22g）小鼠为对照。
2、western blot
首先，参照实施例1步骤一中制备肝脏脂滴（LD）的方法制备上样蛋白；染着参照实施例1步骤三中的方法进行western blot，所用抗体为实施例1中的一抗和二抗，其中作为一抗的兔来源的抗HSD17B13抗体（购自abcam公司，产品目录号为ab122036）可以同时识别人HSD17B13和鼠HSD17B13。
同时以elF5为内参，一抗为兔源抗elF5抗体（购自santa cruz，产品目录号为sc-292173），二抗为HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006）。
将所得western blot图谱用作图软件IMAGE J进行灰度分析，以HSD17B13的灰度值比上作为内参的elF5的灰度值，即鼠HSD17B13/elF5作为指标，然后将对照组进行归一化处理，即将对照组各样品的比值求平均值，然后将各样品比上该平均值作为最后相对定量结果，用Graph pad5.0做柱状图。
western blot图谱如图5中A所示，从图中可以看出，高脂小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的目的条带信号明显比对照小鼠（饲喂正常饲料）的目的条带信号更强。进一步的定量分析结果如图5中B所示，从图中可以看出，高脂小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达量为对照小鼠（饲喂正常饲料）的2倍多。
实施例3、构建表达HSD17B13蛋白的重组腺病毒
本实施例将利用AdEasy系统包装表达HSD17B13蛋白的重组腺病毒，具体如下：
一、HSD17B13重组腺病毒（Ad-HSD17B13）的制备
1、HSD17B13全长序列的克隆
HSD17B13蛋白的氨基酸序列见序列表的序列1，其编码序列如序列表的序列2自5’末端第25-927位核苷酸所示。分析序列2所示的HSD17B13基因，在其编码区两侧附近区域设计引物，并在下游引物加上His标签，最终引物序列如下：
上游引物：5’-GC ATGAACATCATCCTAGAAATCC-3’（该序列的第3-24位为序列2的第25-46位）；
下游引物：5’-GC TCA ATGGTGATGGTGATGATG TTTCATTTTGATTTTGT-3’（下划线处为序列2的第908-924位的反向互补序列）。
以离体的人肝脏（取自北京大学第一医院）cDNA为模板（也可以以人工合成的序列表中序列2所示DNA片段为模板），采用上述引物，用高保真pfu DNA聚合酶进行RT-PCR。PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，回收900bp左右的条带。对所得产物进行测序，表明其序列为“GC+序列2的第25-924位+CAT CATCACCATCACCATTGAGC”。
2、重组穿梭质粒的构建
①用T4连接酶将步骤1所得扩增片段与pEASY-T3（购自全式金公司）进行连接，得到连接产物进行转化扩增，提取TA克隆获得的重组质粒，命名为pEASY-HSD17B13；经测序重组质粒pEASY-HSD17B13为在pEASY-T3中插入“GC+序列2的第25-924位+CAT CATCACCATC ACCATTGAGC”后得到的重组质粒。
②用限制性内切酶Not I酶切重组质粒pEASY-HSD17B13，回收目的片段（大小约为910bp），将其与同样经过Not I酶切的pAdTrack-CMV质粒的载体骨架相连，得到重组质粒，命名为pAdTrack-CMV-HSD17B13（又称重组穿梭质粒）。经测序，重组质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13为在pAdTrack-CMV质粒的酶切位点Not I处插入“GGGAATT CGATT GGATC GCCCTT+GC+序列2自5’末端第25-924位核苷酸+CATCATCACCATC ACCATTGAGC+AAGGGC GATCCCA ATCAC TAGTG AATTC”后得到的重组质粒。
3、重组腺病毒的制备
（1）共转化
①用PmeⅠ内切酶酶切步骤2构建的重组质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13，用琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化的效率，并将其回收。
②将1-5μl（约1μg）线性化的pAdTrack-CMV-HSD17B13、1μl（约100ng）病毒骨架质粒pAdEasy-1和40μl大肠杆菌BJ5183（购自Merck公司，ST200157）电转感受态混匀，冰上冷却。
③将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm，5ms）。
④电击结束取出样品，加入1ml LB培养基（1L配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0，双蒸水配制），37℃低速振荡40min，然后涂布LB平板（每毫升培养基含25-50mg卡那霉素），37℃培养16-20hr。
⑤次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落），接种于3ml LB培养基（每毫升培养基含25-50mg卡那霉素），37℃培养10-15hr。
⑥碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为候选的阳性克隆。
⑦将候选的阳性克隆进行Pac I单酶切，然后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，显示一条大片段（约30kb）和一条小片段（约3.0或者4.5kb）的为阳性克隆。
⑧取1-5μl阳性克隆转化大肠杆菌DH5α（购自Merck公司，D0351），扩增重组菌并纯化质粒，得到重组病毒质粒，将其命名为pAdEasy-HSD17B13。重组病毒质粒pAdEasy-HSD17B13为重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13和骨架质粒pAdEasy-1通过两个同源臂发生重组后得到的质粒。
（2）重组病毒质粒感染HEK293细胞
①HEK293细胞培养：感染24小时前，接种2×106个HEK293细胞于25cm2培养瓶，使生长密度约50-70%。
②用限制性内切酶Pac I单酶切步骤（1）纯化的重组病毒质粒pAdEasy-HSD17B13（约4μg DNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再用20μl ddH2O溶解。
③将步骤②得到的线性化重组病毒质粒和脂质体（Lipofectamine2000，购自Invitrogen公司，11668-027）分别稀释于500μl无血清培养基再混合，置于室温下15-30min，得到Lipofectamine-DNA混合物。
④以无血清培养基轻轻洗涤步骤①的培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。
⑤将步骤③得到的Lipofectamine-DNA混合物加入步骤④的培养瓶，37℃孵箱放置4hr。
⑥弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基（含体积分数10%FCS），37℃孵箱培养；培养过程中观察细胞生长情况，约2周后可观察到细胞病变出现，此时进行以下步骤4或步骤6。
4、重组腺病毒Ad-HSD17B13的扩增
①收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清（病毒上清）保存于-80℃。
②75cm2培养瓶中接种HEK293细胞，至密度达到90%，加入适量病毒上清感染细胞；3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。
③以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次；4℃下7000g离心5min，得到病毒裂解上清液；病毒纯化至少需要30瓶75cm2培养瓶细胞的上清液。
④CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml；转移至12ml超速离心管（用于SW41转头）中，覆盖约2ml矿物油；平衡后，4℃下32000rpm离心18-24hr，用注射器抽吸离心出的密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒带（乳白色病毒条带）。
⑤病毒透析去盐：配置透析液（配方：10mM Tris pH8.0，2mM MgCl2，5%(w/v)蔗糖），灭菌处理；将抽吸出的病毒4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，得到目的病毒液（Ad-HSD17B13），保存于-80℃。
5、病毒滴度测定（TCID50）
按照如下方法对步骤4获得的病毒保存液Ad-HSD17B13进行滴度测定，实验重复三次，结果取平均值。
（1）细胞准备
①收集一瓶HEK293细胞，计数。
②用含有2%血清的DMEM培养基准备20ml密度为105/ml的细胞。
③用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。
（2）进行病毒滴度测定（TCID50）
①第1管中加入0.9ml含有2%血清的DMEM培养基，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。
②上下吸打5次混匀。
③换用新枪头，从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。反复稀释至最高稀释度。
④最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml含有2%血清的DMEM培养基监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。
⑤10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。
⑥计算每一排中出现阳性的孔数。
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。
⑦滴度可以用KARBER统计法精确算出：对于100μl的稀释液，滴度计算公式如下：T=101+d（s-0.5）
式中，d=log10稀释度=1（对于10倍的稀释度而言）；
s=阳性比率之和（从第1个10倍稀释度开始）。
结果显示：步骤4得到的病毒保存液Ad-HSD17B13的滴度为1011.2TCID50/ml。
（3）将TCID50/ml转换为PFU/ml
由于TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7，所以可按照如下公式将TCID50/ml转换为PFU/ml：
T=1×10a TCID50/ml=1×10(a-0.7)PFU/ml
两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。
经转换，结果显示：步骤4得到的病毒保存液Ad-HSD17B13的滴度为3.2×1010PFU/ml。
6、对重组腺病毒Ad-HSD17B13的鉴定
（1）western blot
配制10%的SDS-PAGE胶，分别取2、10、20、40、100MOI腺病毒感染的HEK293细胞，36h后，收集细胞，裂解后的细胞蛋白进行电泳，转膜，一抗采用兔来源的抗HSD17B13抗体（购自abcam公司，产品目录号为ab122036），按照1：1000（体积比）进行孵育，4℃过夜，二抗采用HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006），室温孵育1小时，洗膜，发光检测。同时以对照腺病毒（Ad-GFP）作为阴性对照，对照腺病毒（Ad-GFP）的制备方法见下文。
同时以elF5为内参，一抗为兔源抗elF5抗体（购自santa cruz，产品目录号为sc-292173），二抗为HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006）。
western blot结果如图6中A所示，从图中可以看出，重组腺病毒Ad-HSD17B13成功表达HSD17B13蛋白。
（2）RT-PCR
分别取2、10、20、40、100MOI腺病毒感染的HEK293细胞，36h后，收集细胞，提取总RNA。利用购自美国Fermentas公司的逆转录试剂盒，按照说明书进行逆转录成cDNA。接着，按照如下进行实时PCR检测HSD17B13mRNA的表达水平：
所用仪器Agilent Technologies，MX3000P。
循环参数为：95℃5分钟；95℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃7分钟。
人HSD17B13引物序列如下：
上游：5’-ATCCAGCCGATCTTCTCAGC-3’（序列2的第398-417位）；
下游：5’-TTCCCAAGGCCTGAAGTTCT-3’（序列2的第627-646位的反向互补序列）；
以人β-actin为内参，其引物序列如下：
上游：5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’；
下游：5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3’。
HSD17B13基因实时定量分析结果如图6中B所示。以2MOI腺病毒感染组HSD17B13基因表达水平比上β-actin为1。
二、对照腺病毒（Ad-GFP）的制备
1、共转化
用pAdTrack-CMV（该载体上有GFP）代替pAdTrack-CMV-HSD17B13，其它同步骤一中3（1）。将得到对照重组病毒质粒，将其命名为pAdEasy-GFP。对照重组病毒质粒pAdEasy-GFP为重组穿梭质粒pAdTrack-CMV和骨架质粒pAdEasy-1通过两个同源臂发生重组后得到的质粒。
2、对照重组病毒质粒感染HEK293细胞
用对照重组病毒质粒pAdEasy-GFP代替重组病毒质粒pAdEasy-HSD17B13，其它同步骤一中3（2）。
3、对照重组腺病毒的扩增
用步骤2得到的培养液制备对照病毒液，方法同步骤一的4。将得到的对照重组病毒命名为Ad-GFP。并按照步骤一中5的方法进行滴度测定。
4、对照重组腺病毒的鉴定
对照重组腺病毒Ad-GFP的荧光检测结果如图7所示，在包装11天后，在细胞中观察到明显的绿色荧光，说明包装成功。
实施例4、利用实施例3构建的重组腺病毒Ad-HSD17B13免疫小鼠
一、分组给药
将雄性8周龄C57BL/6（体重25g）小鼠分两组，每组5只，分别给药如下：
对照组：尾静脉注射100μl生理盐水稀释后的Ad-GFP病毒液（含1.0×109pfu）。
实验组：尾静脉注射100μl生理盐水稀释后的Ad-HSD17B13病毒液（含1.0×109pfu）。
折合病毒免疫量为：4×107pfu病毒/g小鼠体重。
二、免疫效果检测
免疫结束后的第三天，对各组小鼠进行以下几方面的检测：
1、肝脏形态观察
分别对对照组和实验组小鼠的肝脏形态进行观察，结果显示实验组小鼠肝脏体积略增大，包膜紧张光滑，边缘变钝，切面外发，质地柔软，色黄，有油腻感，呈典型的脂肪肝表型。而对照组小鼠肝脏形态正常。具体如图8中A所示。
2、肝脏组织切片油红O染色
分别对照组和实验组小鼠的肝脏组织进行冰冻切片，然后用油红O（染脂肪）染色，直观观察肝脏组织中脂质沉积情况。具体操作如下：（1）切片用4%多聚甲醛固定10分钟；（2）蒸馏水洗；（3）60％异丙醇浸洗；（4）油红O染液10分钟；（5）60％异丙醇分色至背景无色；（6）蒸馏水洗；（7）Mayer苏木精复染；（8）自来水洗（蓝化）1～3分钟；（9）蒸馏水洗；（10）甘油明胶封片；（11）油红O0.5g溶于100ml异丙醇。
结果如图8中B所示，从图中可以看出，实验组小鼠肝脏中脂滴数目显著增加，脂滴增大，出现脂肪肝（大面积被染成红色的区域）。
3、RT-PCR检测
分别对对照组和实验组小鼠的肝脏组织中人HSD17B13mRNA进行RT-PCR检测，具体如下：
（1）总RNA的提取
1）每50mg组织使用1ml Trizol，低温组织匀浆后，室温孵育5分钟；2）加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育5分钟；3）12000g，4℃离心10分钟；4）小心吸取中间层水相（最上层为脂肪层）至新EP管；5）加入等体积70%乙醇，混匀后加入离心柱；6）12,000g，4℃离心1分钟。弃掉收集管中的液体；7）用1ml预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12,000g，4℃离心5分钟；8）用1ml预冷的无水乙醇洗涤沉淀，12,000g，4℃离心5分钟；弃上清，短暂离心，用枪头小心吸去残留液体。室温空气中干燥约5分钟，加入适量三蒸水。
（2）RNA的逆转录
利用购自美国Fermentas公司的逆转录试剂盒，按照说明书进行逆转录成cDNA。
（3）实时PCR检测相应基因的表达水平
所用仪器Agilent Technologies，MX3000P。
循环参数为：95℃5分钟；95℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃7分钟。
人HSD17B13引物序列如下：
上游：5’-ATCCAGCCGATCTTCTCAGC-3’（序列2的第398-417位）；
下游：5’-TTCCCAAGGCCTGAAGTTCT-3’（序列2的第627-646位的反向互补序列）；
以鼠β-actin为内参，其引物序列如下：
上游：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’；
下游：5’-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3’。
结果如图9所示，从图中可以看出，对照组小鼠肝脏组织中没有检测到人HSD17B13mRNA的表达（人HSD17B13/β-actin的比值为0），而实验组小鼠肝脏组织中检测到高含量的HSD17B13mRNA，其人HSD17B13/β-actin的比值高达7000。
4、Western blot检测
采用Western blot方法检测对照组和实验组小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达量。具体如下：
首先，参照实施例1步骤一中制备肝脏脂滴（LD）的方法制备上样蛋白；染着参照实施例1步骤三中的方法进行western blot，所用抗体为实施例1中的一抗和二抗，其中作为一抗的兔来源的抗HSD17B13抗体（购自abcam公司，产品目录号为ab122036）可以同时识别人HSD17B13和鼠HSD17B13。
同时以elF5为内参，一抗为兔源抗elF5抗体（购自santa cruz，产品目录号为sc-292173），二抗为HRP偶联的山羊抗兔抗体（购自santa cruz，sc2006）。
将所得western blot图谱用作图软件IMAGE J进行灰度分析，以HSD17B13的灰度值比上作为内参的elF5的灰度值，即鼠HSD17B13/elF5作为指标，然后将对照组进行归一化处理，即将对照组各样品的比值求平均值，然后将各样品比上该平均值作为最后相对定量结果，用Graph pad5.0做柱状图。
western blot结果如图10中A所示，从图中可以看出，实验组小鼠肝脏组织中检测到大量的HSD17B13蛋白（人HSD17B13+鼠HSD17B13）表达。相比之下，对照组小鼠中检测到较低量的HSD17B13蛋白（仅为鼠HSD17B13）表达。进一步的定量分析结果如图10中B所示，实验组小鼠肝脏组织中HSD17B13蛋白的表达量约为对照组小鼠的2倍。
5、肝脏组织中甘油三酯和胆固醇含量的测定
本发明的发明人进一步采用试剂盒对对照组和实验组小鼠肝脏组织和血清中的甘油三酯（TG）和胆固醇（CHO）的含量进行了测定。其中，测定甘油三酯（TG）含量采用的试剂盒为购自南京建成生物工程研究所，产品目录号为F001-2；测定胆固醇（CHO）含量采用的试剂盒为购自南京建成生物工程研究所，产品目录号为F002-2。具体操作参见试剂盒说明书进行。
结果如图11所示（每组中5只小鼠的平均值），两组小鼠血清甘油三酯和胆固醇含量无显著差异。而肝脏甘油三酯和胆固醇含量，与对照组（Ad-GFP）相比，经过重组腺病毒Ad-HSD17B13处理的小鼠表现出显著上调。
本实施例中实验组小鼠的所有病理特点均与临床脂肪肝相一致。可见，按照本实施例中所述方法，对实验组小鼠用重组腺病毒Ad-HSD17B13进行免疫，可构建脂肪肝动物模型。
另外，本实施例的结果也进一步提示HSD17B13蛋白对脂肪肝的发生具有促进作用，抑制该蛋白的表达可能改善脂肪肝。
Claims (10)
1.HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
2.HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备如下任一产品中的应用：
（I）降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量的产品；
（II）降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量的产品。
3.一种产品，其活性成分为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂；所述产品的用途为如下中的至少一种：
（a）预防和/或治疗脂肪肝；
（b）降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量；
（c）降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量。
4.HSD17B13蛋白或其编码基因在构建脂肪肝动物模型中的应用，或在制备用于构建脂肪肝动物模型的产品中的应用。
5.一种利用HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法，包括如下步骤：向目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因，得到具有脂肪肝临床症状的转基因动物。
6.根据权利要求5所示的方法，其特征在于：所述HSD17B13蛋白或其编码基因是通过重组腺病毒载体的形式导入所述目的动物中的；
所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：向所述目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因为：将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4.0×1010pfu的用量免疫所述目的动物。
8.用于构建脂肪肝动物模型的套药，包括重组腺病毒载体和用药说明书；
所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒；
所述用药说明书记载如下内容：将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4.0×1010pfu的用量静脉注射所述目的动物。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或产品或方法或套药，其特征在于：所述HSD17B13蛋白为由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或产品或方法或套药，其特征在于：所述HSD17B13蛋白的编码基因是如下（1）至（4）中任一所述的DNA分子：
（1）编码序列为序列表中序列2的第25-927位的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子；
（4）与（1）-（3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子。
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