CN103503693B - 一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法。该方法包括：(1)将干耳片用手掰成小片；(2)将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用吸水纸充分吸干水分；(3)将小耳片放入体积分数为75％的酒精中浸泡20-25s并用吸水纸充分吸干；(4)将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用吸水纸充分吸干水分；(5)将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察；(6)挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养即可。本发明分离木耳菌种具有操作简便易行，用时短，所需成本低，菌丝成活率高，菌丝具有生长快、菌丝洁白粗壮、生命力强等优点，该发明应用范围广，适用于各种胶质耳的菌种分离。

Description

一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法

技术领域

本发明涉及一种食用菌的菌种分离方法，具体地说是一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法。

背景技术

木耳[Auricularia auricula(L.ex Hook.)Underw.]又名黑木耳、光木耳、细木耳等，是木耳属中最重要的一种食药兼用大型真菌。木耳的栽培在我国有着悠久的历史，早在2100年前《周礼》上就有记载。木耳肉质细腻，脆滑爽口，蛋白质含量十分丰富，铁比肉类高10倍，钙是肉类的20倍，还含有很多重要氨基酸和微量元素，因此有“素中之荤”的美称。木耳不仅有营养价值，还具有一定的药用价值。传统中医认为，木耳性平、味甘，有凉血、止血功效，还有补气、益智、生血功能，有润肺和洗涤肠胃的作用；现代科学研究表明，木耳具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用，还具有降低血脂、血糖、血液黏度、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射等多种生理功能。

我国是世界上主要的木耳生产国，目前其栽培遍布20多个省(市、区)，年产量占世界总产量的90％以上，稳居世界第一，在国际市场上享有较高的声誉。在木耳生产中，要想得到理想的栽培效果，必须有优良的菌种。菌种在制种过程中，由于保存方法不当、没有及时转接和转接代数过多等因素的影响，常会引起菌种退化。菌种分离是防止菌种退化，获得优良菌种的重要手段。

木耳菌种分离常采用三种方法，即耳木分离、组织分离和孢子分离。耳木分离污染严重，又有耳木采集方面的困难；孢子分离获得的菌种不一定能保持亲本特性；组织分离多用鲜耳直接分离或将干耳用水泡湿后再分离。目前采用干耳分离的，或是所用药品毒性大，对人存在危害且影响木耳菌丝的萌发和生长；或是分离步骤繁琐，时间过长且成功率低。

发明内容

针对上述现有方法的一些不足，本发明所解决的是木耳菌种分离方法中存在的操作复杂、时间长、成本高、菌丝分离成功率低等问题。提供的是一种利用干耳片快速分离木耳菌种的新方法，其具有操作简单、分离快速、取材容易(包括药品)、成本低、分离成功率高，菌丝萌发快，洁白浓密，长势强等诸多优点，为广大制种工作者提供一种快速简便的木耳菌种分离新方法。

本发明所采用的技术方案如下：一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法，如下：

步骤一：将干耳片用手掰成小耳片：

首先挑选肉质厚、朵型大、颜色纯正且无病虫害的野生或栽培的干木耳片，掰取远离耳基的平坦部位，掰成长度大小为0.8-1.0cm、宽度大小为0.4-0.6cm的小耳片；

步骤二：将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分：

将无菌水倒入无菌培养皿里，倒入的量培养皿体积的五分之四，将上述掰取的小耳片，放入无菌水中，涮洗5-7s，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸干小耳片表面的水分；

步骤三：将小耳片放入体积分数为75％的酒精中浸泡并用三层吸水纸充分吸干：

将体积分数为75％的酒精倒入无菌培养皿里，倒入的量是培养皿体积的四分之三，用无菌镊子夹起步骤二中的小耳片，放入酒精中，浸泡20-25s，让其与酒精充分接触，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸收小耳片表面的酒精；

步骤四：将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分：

将无菌水倒入无菌培养皿里，倒入的量大约是培养皿体积的五分之四，将步骤三中的小耳片，放入无菌水中，涮洗小耳片5-7s，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸收小耳片表面的水分；

步骤五：将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察：

将步骤四中的小耳片，插入到平板PDA培养基中，插入的部分为小耳片的1/5-1/4，每个培养皿插入3个小耳片，3个小耳片呈等边三角形排列，用封口膜封口后，放入恒温培养箱中，25℃避光倒置培养，定期观察；

步骤六：挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养：

待步骤五中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时，选取黄豆粒大小的菌丝块，接种于斜面PDA培养基中，25℃恒温避光培养，待要长满斜面时，放于4℃冰箱中保存；

其中上述各步骤都是在无菌条件下进行操作的。

所述的PDA培养基中琼脂的含量为8-10g/L。

本发明主要具有如下优点：

1、本发明操作简单易行，所需材料少，不仅科技人员便于应用，非专业人员也容易掌握；

2、本发明分离木耳菌种的菌丝具有生长快、菌丝粗壮、生命力强、菌丝洁白等优点；

3、本发明所采用的上述消毒方式无毒害，无污染，无残留，时间短，效率高，木耳菌丝成活率高达90％以上；

4、本发明方法应用范围广，适用于各种胶质耳的菌种分离。

具体实施方式

1、干耳片来源

(1)购买自黑龙江省亚布力农户人工栽培的干木耳；(2)从黑龙江省伊春市凉水林场采摘的野生木耳，回来洗净，自然阴干；(3)本实验室代料栽培的木耳，成熟后采摘，自然阴干，所用菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为黑木耳DL202CCTCC M2011138。每种木耳分离10个平板，每个平板接3个耳片，统计成活率。

2、PDA培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂8-10g，水1000ml，pH自然。马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加水1000ml，煮沸30min或高压蒸煮20min，纱布过滤，再加20g葡萄糖和10g琼脂充分搅拌溶解。溶解后趁热用纱布过滤，分装三角瓶和试管，每500ml三角瓶约装200ml左右，用封瓶膜封口；每试管约装5-10ml，121℃灭菌20min，取出后，试管需要趁热摆斜面，冷却后贮存备用。

3、前期灭菌准备

将一包质量好的面巾纸(三层)、4个尖头镊子分别用牛皮纸包好，培养皿(直径d=l0cm)用旧报纸包好，10个一包；将1000ml自来水分装到三角瓶里，用封瓶膜封口，将准备好的这些物品进行高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，取出后，放入60℃烘箱烘干，备用；配制75％酒精，备用。

4、组织分离实验

(1)倒PDA平板：把无菌培养皿放在超净工作台里，打开紫外对台子进行灭菌，将灭好菌的PDA培养基在电炉上融化，待冷却到50℃左右时，不烫手为宜，进行倒平板，每个皿倒20ml左右培养基，冷却，备用。

(2)将干耳片用手掰成小片：首先用酒精棉擦拭双手，挑选优质的耳片，将准备好的干耳片材料用干净的面巾纸擦除表面的浮灰，用手掰取远离耳基的平坦部位，掰成长度大小为0.8-1.0cm，宽度大小为0.4-0.6cm，分别用干净的面巾纸包上，放入超净工作台中，备用；之所以选择掰取而不是剪取小耳片，主要是前期试验表明：掰取比剪取的小耳片菌丝更容易萌发和生长，可能是掰取这一过程对干耳片内部的菌丝破坏程度更小一些；其次，选择远离耳基的平坦部位，这样掰取的小耳片形状更规则，更有利于后续的步骤，而且该部位的生命活力相对来说更强；除此之外，掰取的小耳片过大或过小都不利于分离工作的进行，过大则后续插入培养基中吸水膨大时，体积增大则污染几率增大；过小则不利于镊子夹取，给操作带来不便。

(3)将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用无菌面巾纸充分吸干水分：在超净工作台里，将无菌水倒入无菌培养皿里，倒入的量大约是培养皿体积的4/5，用无菌镊子夹起一块掰取的小耳片，放入无菌水中，手轻轻甩动镊子涮洗小耳片5s，放入无菌面巾纸上，用面巾纸将小耳片包裹住，两手用力挤压面巾纸，充分吸收小耳片表面的水分；第一次涮洗的目的是清洗小耳片表面的灰尘和除去一些附着的杂菌，采用涮洗而不是流水冲洗的方式，可使操作更简便，大大缩短了时间，而且这种无菌水涮洗，不会增加额外的杂菌；用三层无菌吸水纸充分吸干水分，这一关键步骤可使溶在水中的杂菌被除去，为下一步骤打下良好基础。

(4)将小耳片放入体积分数为75％的酒精中浸泡并用无菌面巾纸充分吸干：在超净工作台里，将体积分数为75％的酒精倒入无菌培养皿里，倒入的量大约是培养皿体积的3/4，用无菌镊子夹起步骤(3)中的小耳片，放入酒精中，浸泡20s，中间可以不时的翻转小耳片，让其与酒精充分接触，取出，放入无菌面巾纸上，用面巾纸将小耳片包裹住，两手用力挤压面巾纸，充分吸收小耳片表面的酒精。现在存在的消毒方式主要有三种，第一种是用升汞消毒，众所周知，升汞虽然消毒效果较好，但是其毒性大，对人存在危害，而且较大的毒性严重影响木耳菌丝的萌发率；第二种也是使用75％酒精消毒，但通常浸泡时间长，有的2-3min，有的5-6min，过长的浸泡时间以及前后操作方式的不当，常导致木耳菌丝的萌发率低而污染率高；第三种是用火焰灼烧木耳，这一方法在操作时，如果时间过短则无法彻底消毒，时间过长则会将木耳灼伤、烤焦，影响木耳菌丝的活力。

(5)将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用无菌面巾纸充分吸干水分：同步骤(3)。

(6)将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察：用无菌镊子夹起步骤(5)中的小耳片，插入到准备好的平板PDA培养基中，插入的部分为小耳片的1/5-1/4，每个培养皿插入3个小耳片，它们近似呈等边三角形排列，用封口膜封口后，放入恒温培养箱中，25℃避光倒置培养，定期观察。其中PDA培养基中琼脂的含量为8-10g/L，前期试验结果表明，琼脂的含量为8-10g/L时，培养基基质较柔软，木耳菌丝在上面更易着床、萌发和生长；选择将小耳片插入到培养基中而不是平铺，可以使小耳片吸收培养基中的水分和养分，为菌丝萌发创造适宜的条件；3个小耳片近似呈等边三角形排列，既可节省培养基又便于观察。

(7)挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养：待步骤(6)中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时，在超净工作台中，用无菌接种钩挑取黄豆粒大小的菌丝块，接种于斜面PDA培养基中，25℃恒温避光培养，待要长满斜面时，放于4℃冰箱中保存即可。

Claims (1)

1.一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一：将干耳片用手掰成小耳片：

首先挑选肉质厚、朵型大、颜色纯正且无病虫害的野生或栽培的干木耳片，掰取远离耳基的平坦部位，掰成长度大小为0.8-1.0cm、宽度大小为0.4-0.6cm的小耳片；

步骤二：将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分：

将无菌水倒入无菌培养皿里，倒入的量是培养皿体积的五分之四，将掰取的小耳片，放入无菌水中，涮洗5-7s，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸干小耳片表面的水分；

步骤三：将小耳片放入体积分数为75％的酒精中浸泡并用三层吸水纸充分吸干：

将体积分数为75％的酒精倒入无菌培养皿里，倒入的量是培养皿体积的四分之三，用无菌镊子夹起步骤二中的小耳片，放入酒精中，浸泡20-25s，让其与酒精充分接触，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸收小耳片表面的酒精；

步骤四：将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分：

将无菌水倒入无菌培养皿里，倒入的量是培养皿体积的五分之四，将步骤三中的小耳片，放入无菌水中，涮洗小耳片5-7s，取出，放入三层无菌吸水纸上，充分吸收小耳片表面的水分；

步骤五：将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察：

将步骤四中的小耳片，插入到平板PDA培养基中，插入的部分为小耳片的1/5-1/4，每个培养皿插入3个小耳片，3个小耳片呈等边三角形排列，用封口膜封口后，放入恒温培养箱中，25℃避光倒置培养，定期观察；

步骤六：挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养：

待步骤五中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时，选取黄豆粒大小的菌丝块，接种于斜面PDA培养基中，25℃恒温避光培养，待要长满斜面时，放于4℃冰箱中保存；

其中上述各步骤都是在无菌条件下进行操作的；平板PDA培养基和斜面PDA培养基中琼脂的含量为8-10g/L。