CN103503693B - 一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法。该方法包括:(1)将干耳片用手掰成小片;(2)将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用吸水纸充分吸干水分;(3)将小耳片放入体积分数为75%的酒精中浸泡20-25s并用吸水纸充分吸干;(4)将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用吸水纸充分吸干水分;(5)将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察;(6)挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养即可。本发明分离木耳菌种具有操作简便易行,用时短,所需成本低,菌丝成活率高,菌丝具有生长快、菌丝洁白粗壮、生命力强等优点,该发明应用范围广,适用于各种胶质耳的菌种分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种食用菌的菌种分离方法,具体地说是一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法。
背景技术
木耳[Auricularia auricula(L.ex Hook.)Underw.]又名黑木耳、光木耳、细木耳等,是木耳属中最重要的一种食药兼用大型真菌。木耳的栽培在我国有着悠久的历史,早在2100年前《周礼》上就有记载。木耳肉质细腻,脆滑爽口,蛋白质含量十分丰富,铁比肉类高10倍,钙是肉类的20倍,还含有很多重要氨基酸和微量元素,因此有“素中之荤”的美称。木耳不仅有营养价值,还具有一定的药用价值。传统中医认为,木耳性平、味甘,有凉血、止血功效,还有补气、益智、生血功能,有润肺和洗涤肠胃的作用;现代科学研究表明,木耳具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用,还具有降低血脂、血糖、血液黏度、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射等多种生理功能。
我国是世界上主要的木耳生产国,目前其栽培遍布20多个省(市、区),年产量占世界总产量的90%以上,稳居世界第一,在国际市场上享有较高的声誉。在木耳生产中,要想得到理想的栽培效果,必须有优良的菌种。菌种在制种过程中,由于保存方法不当、没有及时转接和转接代数过多等因素的影响,常会引起菌种退化。菌种分离是防止菌种退化,获得优良菌种的重要手段。
木耳菌种分离常采用三种方法,即耳木分离、组织分离和孢子分离。耳木分离污染严重,又有耳木采集方面的困难;孢子分离获得的菌种不一定能保持亲本特性;组织分离多用鲜耳直接分离或将干耳用水泡湿后再分离。目前采用干耳分离的,或是所用药品毒性大,对人存在危害且影响木耳菌丝的萌发和生长;或是分离步骤繁琐,时间过长且成功率低。
发明内容
针对上述现有方法的一些不足,本发明所解决的是木耳菌种分离方法中存在的操作复杂、时间长、成本高、菌丝分离成功率低等问题。提供的是一种利用干耳片快速分离木耳菌种的新方法,其具有操作简单、分离快速、取材容易(包括药品)、成本低、分离成功率高,菌丝萌发快,洁白浓密,长势强等诸多优点,为广大制种工作者提供一种快速简便的木耳菌种分离新方法。
本发明所采用的技术方案如下:一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法,如下:
步骤一:将干耳片用手掰成小耳片:
首先挑选肉质厚、朵型大、颜色纯正且无病虫害的野生或栽培的干木耳片,掰取远离耳基的平坦部位,掰成长度大小为0.8-1.0cm、宽度大小为0.4-0.6cm的小耳片;
步骤二:将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分:
将无菌水倒入无菌培养皿里,倒入的量培养皿体积的五分之四,将上述掰取的小耳片,放入无菌水中,涮洗5-7s,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸干小耳片表面的水分;
步骤三:将小耳片放入体积分数为75%的酒精中浸泡并用三层吸水纸充分吸干:
将体积分数为75%的酒精倒入无菌培养皿里,倒入的量是培养皿体积的四分之三,用无菌镊子夹起步骤二中的小耳片,放入酒精中,浸泡20-25s,让其与酒精充分接触,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸收小耳片表面的酒精;
步骤四:将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分:
将无菌水倒入无菌培养皿里,倒入的量大约是培养皿体积的五分之四,将步骤三中的小耳片,放入无菌水中,涮洗小耳片5-7s,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸收小耳片表面的水分;
步骤五:将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察:
将步骤四中的小耳片,插入到平板PDA培养基中,插入的部分为小耳片的1/5-1/4,每个培养皿插入3个小耳片,3个小耳片呈等边三角形排列,用封口膜封口后,放入恒温培养箱中,25℃避光倒置培养,定期观察;
步骤六:挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养:
待步骤五中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时,选取黄豆粒大小的菌丝块,接种于斜面PDA培养基中,25℃恒温避光培养,待要长满斜面时,放于4℃冰箱中保存;
其中上述各步骤都是在无菌条件下进行操作的。
所述的PDA培养基中琼脂的含量为8-10g/L。
本发明主要具有如下优点:
1、本发明操作简单易行,所需材料少,不仅科技人员便于应用,非专业人员也容易掌握;
2、本发明分离木耳菌种的菌丝具有生长快、菌丝粗壮、生命力强、菌丝洁白等优点;
3、本发明所采用的上述消毒方式无毒害,无污染,无残留,时间短,效率高,木耳菌丝成活率高达90%以上;
4、本发明方法应用范围广,适用于各种胶质耳的菌种分离。
具体实施方式
1、干耳片来源
(1)购买自黑龙江省亚布力农户人工栽培的干木耳;(2)从黑龙江省伊春市凉水林场采摘的野生木耳,回来洗净,自然阴干;(3)本实验室代料栽培的木耳,成熟后采摘,自然阴干,所用菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为黑木耳DL202CCTCC M2011138。每种木耳分离10个平板,每个平板接3个耳片,统计成活率。
2、PDA培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂8-10g,水1000ml,pH自然。马铃薯洗净去皮切成小块,称取200g,加水1000ml,煮沸30min或高压蒸煮20min,纱布过滤,再加20g葡萄糖和10g琼脂充分搅拌溶解。溶解后趁热用纱布过滤,分装三角瓶和试管,每500ml三角瓶约装200ml左右,用封瓶膜封口;每试管约装5-10ml,121℃灭菌20min,取出后,试管需要趁热摆斜面,冷却后贮存备用。
3、前期灭菌准备
将一包质量好的面巾纸(三层)、4个尖头镊子分别用牛皮纸包好,培养皿(直径d=l0cm)用旧报纸包好,10个一包;将1000ml自来水分装到三角瓶里,用封瓶膜封口,将准备好的这些物品进行高压蒸汽灭菌,121℃灭菌20min,取出后,放入60℃烘箱烘干,备用;配制75%酒精,备用。
4、组织分离实验
(1)倒PDA平板:把无菌培养皿放在超净工作台里,打开紫外对台子进行灭菌,将灭好菌的PDA培养基在电炉上融化,待冷却到50℃左右时,不烫手为宜,进行倒平板,每个皿倒20ml左右培养基,冷却,备用。
(2)将干耳片用手掰成小片:首先用酒精棉擦拭双手,挑选优质的耳片,将准备好的干耳片材料用干净的面巾纸擦除表面的浮灰,用手掰取远离耳基的平坦部位,掰成长度大小为0.8-1.0cm,宽度大小为0.4-0.6cm,分别用干净的面巾纸包上,放入超净工作台中,备用;之所以选择掰取而不是剪取小耳片,主要是前期试验表明:掰取比剪取的小耳片菌丝更容易萌发和生长,可能是掰取这一过程对干耳片内部的菌丝破坏程度更小一些;其次,选择远离耳基的平坦部位,这样掰取的小耳片形状更规则,更有利于后续的步骤,而且该部位的生命活力相对来说更强;除此之外,掰取的小耳片过大或过小都不利于分离工作的进行,过大则后续插入培养基中吸水膨大时,体积增大则污染几率增大;过小则不利于镊子夹取,给操作带来不便。
(3)将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用无菌面巾纸充分吸干水分:在超净工作台里,将无菌水倒入无菌培养皿里,倒入的量大约是培养皿体积的4/5,用无菌镊子夹起一块掰取的小耳片,放入无菌水中,手轻轻甩动镊子涮洗小耳片5s,放入无菌面巾纸上,用面巾纸将小耳片包裹住,两手用力挤压面巾纸,充分吸收小耳片表面的水分;第一次涮洗的目的是清洗小耳片表面的灰尘和除去一些附着的杂菌,采用涮洗而不是流水冲洗的方式,可使操作更简便,大大缩短了时间,而且这种无菌水涮洗,不会增加额外的杂菌;用三层无菌吸水纸充分吸干水分,这一关键步骤可使溶在水中的杂菌被除去,为下一步骤打下良好基础。
(4)将小耳片放入体积分数为75%的酒精中浸泡并用无菌面巾纸充分吸干:在超净工作台里,将体积分数为75%的酒精倒入无菌培养皿里,倒入的量大约是培养皿体积的3/4,用无菌镊子夹起步骤(3)中的小耳片,放入酒精中,浸泡20s,中间可以不时的翻转小耳片,让其与酒精充分接触,取出,放入无菌面巾纸上,用面巾纸将小耳片包裹住,两手用力挤压面巾纸,充分吸收小耳片表面的酒精。现在存在的消毒方式主要有三种,第一种是用升汞消毒,众所周知,升汞虽然消毒效果较好,但是其毒性大,对人存在危害,而且较大的毒性严重影响木耳菌丝的萌发率;第二种也是使用75%酒精消毒,但通常浸泡时间长,有的2-3min,有的5-6min,过长的浸泡时间以及前后操作方式的不当,常导致木耳菌丝的萌发率低而污染率高;第三种是用火焰灼烧木耳,这一方法在操作时,如果时间过短则无法彻底消毒,时间过长则会将木耳灼伤、烤焦,影响木耳菌丝的活力。
(5)将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用无菌面巾纸充分吸干水分:同步骤(3)。
(6)将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察:用无菌镊子夹起步骤(5)中的小耳片,插入到准备好的平板PDA培养基中,插入的部分为小耳片的1/5-1/4,每个培养皿插入3个小耳片,它们近似呈等边三角形排列,用封口膜封口后,放入恒温培养箱中,25℃避光倒置培养,定期观察。其中PDA培养基中琼脂的含量为8-10g/L,前期试验结果表明,琼脂的含量为8-10g/L时,培养基基质较柔软,木耳菌丝在上面更易着床、萌发和生长;选择将小耳片插入到培养基中而不是平铺,可以使小耳片吸收培养基中的水分和养分,为菌丝萌发创造适宜的条件;3个小耳片近似呈等边三角形排列,既可节省培养基又便于观察。
(7)挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养:待步骤(6)中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时,在超净工作台中,用无菌接种钩挑取黄豆粒大小的菌丝块,接种于斜面PDA培养基中,25℃恒温避光培养,待要长满斜面时,放于4℃冰箱中保存即可。
Claims (1)
1.一种利用干耳片快速分离木耳菌种的方法,其特征在于,步骤如下:
步骤一:将干耳片用手掰成小耳片:
首先挑选肉质厚、朵型大、颜色纯正且无病虫害的野生或栽培的干木耳片,掰取远离耳基的平坦部位,掰成长度大小为0.8-1.0cm、宽度大小为0.4-0.6cm的小耳片;
步骤二:将小耳片第一次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分:
将无菌水倒入无菌培养皿里,倒入的量是培养皿体积的五分之四,将掰取的小耳片,放入无菌水中,涮洗5-7s,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸干小耳片表面的水分;
步骤三:将小耳片放入体积分数为75%的酒精中浸泡并用三层吸水纸充分吸干:
将体积分数为75%的酒精倒入无菌培养皿里,倒入的量是培养皿体积的四分之三,用无菌镊子夹起步骤二中的小耳片,放入酒精中,浸泡20-25s,让其与酒精充分接触,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸收小耳片表面的酒精;
步骤四:将小耳片第二次在无菌水中涮洗并用三层吸水纸充分吸干水分:
将无菌水倒入无菌培养皿里,倒入的量是培养皿体积的五分之四,将步骤三中的小耳片,放入无菌水中,涮洗小耳片5-7s,取出,放入三层无菌吸水纸上,充分吸收小耳片表面的水分;
步骤五:将小耳片插入平板PDA培养基中恒温培养、观察:
将步骤四中的小耳片,插入到平板PDA培养基中,插入的部分为小耳片的1/5-1/4,每个培养皿插入3个小耳片,3个小耳片呈等边三角形排列,用封口膜封口后,放入恒温培养箱中,25℃避光倒置培养,定期观察;
步骤六:挑取萌发出的菌丝接种至斜面PDA培养基中进行纯化培养:
待步骤五中的小耳片萌发长出洁白致密的菌丝时,选取黄豆粒大小的菌丝块,接种于斜面PDA培养基中,25℃恒温避光培养,待要长满斜面时,放于4℃冰箱中保存;
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