CN103497975B - 伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法 - Google Patents

伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法 Download PDF

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本发明公开了一种伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法；所述伏立诺他能够促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein；本发明还涉及前述伏立诺他促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，包括如下步骤：在海绵共生土曲霉发酵的过程中添加伏立诺他。本发明在摇瓶水平上，于第4天添加终浓度为900μM的伏立诺他，24天后，(+)-Terrein的产量达到5.58g/L，较未添加时的产量为4.31g/L，提高了49.8%，(+)-Terrein的产量有较为显著的提高；本发明方法简单，容易实现，效率高，效果显著，有较好的应用前景。

Description

伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法
技术领域
本发明涉及一种提高真菌代谢产物产量的方法，具体是伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法。
背景技术
(+)-Terrein（土曲霉酮）是由6-羟基蜂蜜曲菌素经过后修饰而成的环戊烯酮类化合物，1935年首次从土曲霉中分离得到。(+)-Terrein有着良好的生物活性，如抗细菌和真菌、抑制杂草生长、抑制肿瘤细胞血管新生素的分泌、促进成骨细胞与钛支架融合、抑制黑色素合成、抑制皮肤角质增生、抑制牙髓细胞炎症反应还有乳腺癌细胞毒性等等。其在农业、美容、医药等方面广泛的应用前景使得我们有必要提高其单位产量为后续更深入的研究提供原料基础。
目前报道中，通过传统的揺瓶发酵培养优化，在Aspergillus terreus PF26中(+)-Terrein的产量能达到3.71g/L(Ying Yin,et al.Medium optimization for the high yield production of single(+)-Terrein by Aspergillus terreus strain PF26derived from marine sponge Phakellia fusca2012,47(5):887-891)；在优化后的培养基的基础上添加聚酮合成途径的促进剂柠檬酸钠使得揺瓶上(+)-Terrein的产量能提高到5.38g/L(Yin Y,et al.Enhanced production of(+)-Terrein in fed-batch cultivation of Aspergillus terreus strain PF26with sodium citrate.World Journal of Microbiology and Biotechnology2013;29(3):441-446.)，但有必要进一步提高其产量。表观遗传修饰剂能够调节基因的转录水平从而影响代谢，本发明从促进土曲霉基因的转录水平着手，添加表观遗传修饰剂至土曲霉的发酵液中以期提高(+)-Terrein产量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种伏立诺他的用途及促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及到一种伏立诺他作为促进剂的用途，所述伏立诺他能够促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein。
第二方面，本发明还涉及前述伏立诺他促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，包括如下步骤：在海绵共生土曲霉发酵的过程中添加伏立诺他。
优选地，包括如下步骤：发酵海绵共生土曲霉，向发酵液中添加伏立诺他，即可促进(+)-Terrein的合成。
优选地，所述海绵共生土曲霉为土曲霉（Aspergillus terreus）PF26CGMCC NO.5208。
优选地，所述发酵使用的培养基的制备方法包括如下步骤：每1L纯水对应取如下质量的各组分：28.41g葡萄糖、23.18g麦芽糖、20.00g甘露醇、8.52g麦芽提取物、10.00g谷氨酸钠、10.00g氯化铵、3.90g硫酸钠，之后将所述组分溶于1L纯水中，即得。
优选地，所述发酵采用摇瓶发酵，在发酵的第4天，添加伏立诺他。
优选地，所述添加伏立诺他具体为，发酵液中伏立诺他的终浓度为900μM。
优选地，所述添加伏立诺他具体为：称取适量的伏立诺他，溶解于DMSO中，使得伏立诺他的浓度为0.18M，之后采用无菌滤膜过滤，得到伏立诺他母液，之后添加于发酵液中。
优选地，所述无菌滤膜的孔径为0.22μm。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
（1）本发明在摇瓶水平上，于第4天添加终浓度为900μM的伏立诺他，24天后，(+)-Terrein的产量达到5.58g/L，较未添加时的产量为4.31g/L，提高了49.8%，(+)-Terrein的产量有较为显著的提高。
（2）本发明方法简单，容易实现，效率高，效果显著，有较好的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1不同的表观遗传修饰剂对土曲霉产(+)-Terrein的影响图；
图2不同浓度伏立诺他时对土曲霉产(+)-Terrein的影响图；
图3为不同时间添加900μM的伏立诺他时对土曲霉产(+)-Terrein的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中涉及(+)-Terrein的具体为土曲霉Aspergillus terreus菌株PF26，分离自中国南海永兴岛Phakellia fusca海绵，其保藏信息为：该菌株已于2011年8月31日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.5208；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例1、确定添加的表观修饰剂的种类
选择阿扎胞苷和伏立诺他作为候选促进剂。
培养基的配制：28.41g葡萄糖、23.18g麦芽糖、20.00g甘露醇、8.52g麦芽提取物、10.00g谷氨酸钠、10.00g氯化铵、3.90g硫酸钠溶于1L纯水。
阿扎胞苷母液的配制：准确称量阿扎胞苷并将其溶解于DMSO中，浓度为0.10M，采用0.22μm的无菌滤膜对其过滤得无菌阿扎胞苷母液。
伏立诺他母液的配制：准确称量伏立诺他并将其溶解于DMSO中，伏立诺他的浓度为0.18M，采用0.22μm的无菌滤膜对其过滤得无菌伏立诺他母液。
以上述培养基对土曲霉进行发酵，菌种接种量为4×106个孢子/mL，250mL三角瓶中装液量为100mL，28℃、180rpm的恒温摇床中培养，pH自然，于培养的第2天向发酵液中分别添加终浓度为500μM（500μL母液）的阿扎胞苷和伏立诺他。
采用HPLC法测定(+)-Terrein含量，图1所示为海绵共生土曲霉在添加不同种类的表观修饰剂后(+)-Terrein的产量，由图1可知：对照组、添加阿扎胞苷组、添加伏立诺他组的(+)-Terrein含量分别为：4.30g/L、3.00g/L、4.80g/L。添加伏立诺他时，促进效果较为明显，由此，以伏立诺他作为较优促进剂添加至发酵液中。
实施例2、单因素实验确定伏立诺他的最佳添加浓度和添加时间
上述实施例1确定伏立诺他作为较优促进剂，在此基础上研究其添加浓度和添加时间对(+)-Terrein产量的影响。
研究伏立诺他的最佳添加浓度，设置4个浓度梯度，分别为500μM，900μM，1300μM，1700μM。对土曲霉进行发酵，于培养的第2天分别添加终浓度为500μM，900μM，1300μM，1700μM的伏立诺他，第24天测量(+)-Terrein含量及菌体干重。结果如图2 所示，第2天添加900μM的伏立诺他时，(+)-Terrein产量为5.21g/L，较对照组的4.31g/L，提高了21%，由此以900μM作为伏立诺他的最佳添加浓度。
在此基础上，研究伏立诺他的最佳添加时间，对土曲霉进行发酵，于培养的第0，2，4，7，12天分别添加终浓度为900μM的伏立诺他，于第24天测量(+)-Terrein含量及菌体干重。结果如图3所示，于第4天添加900μM伏立诺他时，(+)-Terrein产量为5.58g/L，较对照组的4.31g/L，提高了39.8%。
由上，伏立诺他的最佳添加策略为：发酵第4天，添加900μM的伏立诺他。采用这种方法，(+)-Terrein产量较对照提高了39.8%。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种伏立诺他作为促进剂的用途，其特征在于，所述伏立诺他能够促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein，所述海绵共生土曲霉为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26 CGMCC NO.5208。
2.一种促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，包括如下步骤：在海绵共生土曲霉发酵的过程中添加伏立诺他，所述海绵共生土曲霉为土曲霉(Aspergillus terreus)PF26 CGMCC NO.5208。
3.如权利要求2所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵海绵共生土曲霉，向发酵液中添加伏立诺他，即可促进(+)-Terrein的合成。
4.如权利要求3所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述发酵使用的培养基的制备方法包括如下步骤：每1L纯水对应取如下质量的各组分：28.41g葡萄糖、23.18g麦芽糖、20.00g甘露醇、8.52g麦芽提取物、10.00g谷氨酸钠、10.00g氯化铵、3.90g硫酸钠，之后将所述组分溶于1L纯水中，即得。
5.如权利要求3所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述发酵采用摇瓶发酵，在发酵的第4天，添加伏立诺他。
6.如权利要求3所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述添加伏立诺他具体为，发酵液中伏立诺他的终浓度为900μM。
7.如权利要求3所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述添加伏立诺他具体为：称取适量的伏立诺他，溶解于DMSO中，使得伏立诺他的浓度为0.18M，之后采用无菌滤膜过滤，得到伏立诺他母液，之后添加于发酵液中。
8.如权利要求8所述的促进海绵共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述无菌滤膜的孔径为0.22μm。
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