CN103497256B

CN103497256B - 制备恩拉霉素抗原的方法

Info

Publication number: CN103497256B
Application number: CN201310487971.9A
Authority: CN
Inventors: 余华; 严玉宝; 叶健强; 廖党金; 胡娟; 谢晶; 崔鹏博; 周岷江
Original assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; Sichuan Animal Science Academy
Current assignee: SICHUAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; Sichuan Animal Science Academy
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: CN103059143A; CN103497256A

Abstract

本发明涉及制备恩拉霉素抗原的方法，属于生物技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种偶联比率更高的制备恩拉霉素抗原的方法。本发明制备恩拉霉素抗原的方法包括如下步骤：a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解；b、于a步骤所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；c、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六环，混匀；d、c步骤混匀后的溶液于25～30℃反应3～5h，并加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液与1,4-二氧六环溶液的体积比为0.35～0.45:1，反应时的pH值控制在7.5～7.9；e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。

Description

制备恩拉霉素抗原的方法

技术领域

本发明涉及制备恩拉霉素抗原的方法，属于生物技术领域。

背景技术

恩拉霉素，又名安来霉素和持久霉素，该药于1966年日本武田药品研究所由土壤中分离出来的放线菌（Streptomyces fungicidiousNO.B5477）经发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十二种氨基酸结合而成的多肽类(Polypepide)抗生素，其主要成分是恩拉霉素A：C₁₀₇H₁₃₈N₂₆O₃₁C₁₂R=CH₃和恩拉霉素B：C₁₀₈H₁₄₀N₂₆O31C₁₂R=C₂H₅OH。该药因具有很强的抗G⁺菌的作用,用作饲料添加剂能促进畜禽生长和提高饲料效率，且长期使用不易产生耐药性,与其它抗生素亦无交叉耐药，化学性能稳定，无致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，残留极少，适口性好等优势，现已成为当前最具发展前景的兽用抗生素添加剂。

目前，免疫分析法因其较传统的微生物检测法、理化检测法具有简洁、快速、廉价、特异性强、灵敏度高等优点，已经被国内外广泛地应用于兽药残留的检测中，但至今国内外尚无有关恩拉霉素酶免疫检测技术报道，仅日本厚生省对该项残留物质有畜、水产性食品有常规检测技术报道。因此开发我国自主产权的Enramycin残留检测方法非常必要,要建立相关免疫学分析方法,制备出特异性强、效价高的Er抗体非常关键,必须将其与蛋白质载体等大分子载体偶联形成人工合成的完全抗原进而制备相应抗体，这也是建立免疫分析过程的前提和关键所在。

申请号为CN201010556432.2，发明名称为“一种恩拉霉素完全抗原的合成方法”的专利申请中公开了一种恩拉霉素完全抗原的合成方法，但是该方法制备的恩拉霉素抗原的偶联比率较低，恩拉霉素抗原的效价较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种偶联比率更高的制备恩拉霉素抗原的方法。

本发明制备恩拉霉素抗原的方法包括如下步骤：

a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液（即磷酸盐缓冲溶液，下同）使牛血清白蛋白溶解；

b、于a步骤所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素与牛血清白蛋白的质量比为1:1.2～1.5；

c、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六环，混匀；其中，所加入的1,4-二氧六环与PBS溶液的体积比为1:1.1～1.2；

d、c步骤混匀后的溶液于25～30℃反应3～5h，并加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液与1,4-二氧六环溶液的体积比为0.35～0.45:1，反应时的pH值控制在7.5～7.9（通过PBS溶液控制pH值）；

e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。

本发明的发明人经过实验研究分析，发现影响恩拉霉素抗原的偶联比率的因素较多，其中，恩拉霉素与牛血清白蛋白的质量比、1,4-二氧六环与PBS溶液的体积比、戊二醛溶液的加入量、反应时的pH值和反应温度为最主要的因素。按照上述方法制备的恩拉霉素抗原，其偶联比率较高，相比申请号为CN201010556432.2的方法，其偶联比率大幅提高，取得了意料不到的技术效果。

其中，上述的牛血清白蛋白的相对分子质量优选为67000。

进一步的，作为更优的技术方案，上述b步骤中所述的恩拉霉素与牛血清白蛋白的质量比优选为1:1.3。

进一步的，作为更优的技术方案，上述c步骤中的1,4-二氧六环与PBS溶液的体积比优选为1:1.15。

进一步的，作为更优的技术方案，上述c步骤混匀后的溶液于28℃反应4h，并加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液与1,4-二氧六环溶液的体积比为0.4:1，反应时的pH值控制在7.7。

本发明方法相比现有方法，大幅提高了恩拉霉素抗原的偶联比率，有利于更加精确的检测肉制品中恩拉霉素的残留含量，本发明具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例2制备的恩拉霉素抗原的紫外光谱鉴定结果图。

具体实施方式

本发明制备恩拉霉素抗原的方法包括如下步骤：

e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。

其中，上述的牛血清白蛋白的相对分子质量优选为67000。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例所用的主要试剂和主要仪器如下：

1、主要试剂

恩拉霉素(纯度≥98%）、牛血清白蛋白(BSA,相对分子质量:67000，上海博奥生物科技公司)、卵清蛋白(OVA,相对分子量:45000，上海基星生物科技公司)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)，均购于Sigma公司、透析袋(截留分子量:14000),（Sigma公司）、戊二醛（成都金山化学试剂公司）、1,4-二氧六环（成都科龙化工试剂厂），以上化学试剂均为分析纯。

2、主要仪器

UV2501-PC型紫外扫描仪(日本岛津Shimadzu公司)；BS124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；BS100S型分析天平北京赛多利斯有限公司；ULT1386-3-V38型低温冰箱(美国REVCO公司)；DCD-172K型常规冰箱(美国伊莱克斯公司)；Freeze6型冷冻干燥机(Labconco公司)；DF-101S型智能集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司)。

实施例1采用本发明方法制备恩拉霉素抗原

配制PBS溶液(pH7.6)：取磷酸二氢钾27.22g，加水使溶解成1000ml，取50ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml，再加水稀释至200ml，即得。

称取恩拉霉素20mg盛于100mL锥形瓶中，称取牛血清蛋白（BSA）24mg于5号试管中。向试管中加入PBS溶液约3mL，待牛血清蛋白（BSA）完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形瓶中，再用PBS溶液洗涤试管，将牛血清蛋白（BSA）完全移入锥形瓶，共用PBS溶液11mL。待恩拉霉素基本溶解后，向锥形瓶中加入1,4-二氧六环10mL，混匀。将磁力搅拌器放入反应器后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于25℃水浴，开启搅拌器，约5min后，保持搅拌状态，向反应器内逐滴加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液3.5mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h，反应时的pH值控制在7.6（通过PBS溶液控制pH值）；即得恩拉霉素完全抗原混合液。

配制A液：配制含碳酸钠(Na₂CO₃)10g/L及乙二胺四乙酸二钠（EDTA）1mol/L的碱性EDTA溶液，置于4℃下保存,以备处理透析袋

透析袋前处理：取20cm的透析袋，将其置于A溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷后用蒸馏水冲洗3min将其洗净，另取100cm长的棉线一根，用其一端将透析袋的一端扎紧，保证不会漏液，保存在4℃去离子水中备用；

透析：取15cm的三角漏斗一个，将其下部插于透析袋的未封口端，将恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口转移至透析袋内，转移完毕，利用棉线的另一端将透析袋封口。以一个小镊子作为梁将装好的透析袋悬于盛有适量蒸馏水的大烧杯中，保证烧杯内的水将透析袋内的液体完全浸没，将该装置于4℃冰箱内开始透析，透析72h，每天换水2次，最后使用冷冻干燥法将透析袋中的液体制成粉末，即得到恩拉霉素抗原：恩拉霉素-牛血清白蛋白。

实施例2采用本发明方法制备恩拉霉素抗原

配制PBS溶液(pH7.8)：

甲液：取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml；

乙液：取磷酸二氢钠2.76g，加水溶解，并稀释至100ml；

取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀，即得。

称取恩拉霉素20mg盛于100mL锥形瓶中，称取牛血清蛋白（BSA）26mg于5号试管中。向试管中加入PBS溶液约3mL，待牛血清蛋白（BSA）完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形瓶中，再用PBS溶液洗涤试管，将牛血清蛋白（BSA）完全移入锥形瓶，共用PBS溶液11.5mL。待恩拉霉素基本溶解后，向锥形瓶中加入1,4-二氧六环10mL，混匀。将磁力搅拌器放入反应器后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于28℃水浴，开启搅拌器，约5min后，保持搅拌状态，向反应器内逐滴加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液4mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h，反应时的pH值控制在7.8（通过PBS溶液控制pH值）；即得恩拉霉素完全抗原混合液。

按实施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。

实施例3采用本发明方法制备恩拉霉素抗原

配制PBS溶液(pH7.8～8.0)：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。

称取恩拉霉素20mg盛于100mL锥形瓶中，称取牛血清蛋白（BSA）30mg于5号试管中。向试管中加入PBS溶液约3mL，待牛血清蛋白（BSA）完全溶解后转移到有恩拉霉素的锥形瓶中，再用PBS溶液洗涤试管，将牛血清蛋白（BSA）完全移入锥形瓶，共用PBS溶液12mL。待恩拉霉素基本溶解后，向锥形瓶中加入1,4-二氧六环10mL，混匀。将磁力搅拌器放入反应器后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧瓶置于30℃水浴，开启搅拌器，约5min后，保持搅拌状态，向反应器内逐滴加入体积浓度为0.25%的戊二醛溶液5mL，滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4h，反应时的pH值控制在7.9（通过PBS溶液控制pH值）；即得恩拉霉素完全抗原混合液。

按实施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。

试验例1恩拉霉素抗原的紫外光谱鉴定

采用UV2501-PC型紫外扫描仪对恩拉霉素、BSA和实施例1-3制备的恩拉霉素抗原进行紫外全波段扫描，波长范围在200nm-400nm之间。结果得出，恩拉霉素标准品紫外最大吸收波长为279nm，BSA紫外最大吸收波长为278nm。当恩拉霉素与BSA偶联形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波长偏移至恩拉霉素和BSA特征峰之间，提示实施例1-3均偶联成功且得到了恩拉霉素与BSA偶联的免疫抗原Er-BSA，其中，实施例2制备的恩拉霉素抗原的紫外光谱鉴定结果如图1所示。

试验例2偶联比率测定

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸光系数ε：配制恩拉霉素浓度为0，10，20，30μg·mL^-1，pH=7.2的PBS溶液，通过紫外扫描可知恩拉霉素的最大吸收波长为278nm，在278nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε=吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε=9264L·mL^-1。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清蛋白的pH=7.2的PBS溶液，将偶联产物完全抗原用pH=7.2的PBS稀释到150μg·mL^-1，在278nm处测吸光值，以pH=7.2的PBS为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为Al，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：[(A1-A2)/ε]/(150×l0^-3/67000)。

其中ε为摩尔吸光系数(L·mol^-1)，67000为牛血清蛋白的分子量，150×l0^-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL^-1)。

经测定，实施例1、2、3制备的恩拉霉素抗原的偶联比率r分别为：25.60，30.15，26.01。

另外，采用申请号为CN201010556432.2，发明名称为“一种恩拉霉素完全抗原的合成方法”的专利申请中公开的方法制备恩拉霉素抗原，并采用上述方法测定其偶联比率，其偶联比率约为22。

从上述结果可以看出，本发明方法制备的恩拉霉素抗原的偶联比率均高于现有方法，尤其是实施例2的方法制备的恩拉霉素抗原最好。

试验例3采用本发明恩拉霉素抗原制备抗体

1、试验材料与试验方法

1.1试验材料

新西兰大白兔；

恩拉霉素人工抗原(Er-BSA，分别由上述实施例1、2、3制备得到)；

弗氏完全佐剂（FCA，Sigma公司）；

弗氏不完全佐剂（FICA，Sigma公司）；

酶标二抗(山羊抗兔IgG-HRP,华美生物工程公司进口分装)；

96孔酶标板(COSTAR)；

三甲基联苯胺(TMB，AMRESCO公司)，其余化学试剂均为分析纯。

1.2试剂的配制与用品准备

1.2.1配制试剂

0.85％生理盐水溶液:0.85gNaCL溶于100mL去离子水；

萘氏试剂溶液:11.50gHgI和8.00gKI溶于50mL蒸馏水中,搅拌溶解后,再加入50mL20%NaOH；

饱和硫酸铵溶液:425g硫酸铵加入500mL去离子水中，然后边加热边搅拌至基本溶解，趁热过滤，待其冷却到室温后用氨水调pH到7.0；

包被缓冲液(CBS,0.05M pH9.6)：0.159g碳酸钠和0.293g碳酸氢钠溶解于离子水中，定容到100mL：

稀释缓冲液(PBS,0.01M pH7.4)：800gNaCL,0.20gKCL,0.20gKH₂P04,3.58g,Na₂C03·12H₂0，溶于800mL去离子水中，用NaCL或HCL调pH7.2～7.4，定容到1000mL；

磷酸盐洗涤缓冲液:将PBS缓冲液中添加0.05％Tween-20；

TMB底物储存液：10mgTMB溶于2mLDMSO中，在4℃冰箱中避光保存；

柠檬酸缓冲液(pH5.0)：2.3328g柠檬酸,9.2006gNa₂C03·12H₂O,定容到500mL；

底物缓冲液:将柠檬酸缓冲液(pH5.0)500mL中加入0.5mLTween-20；

样品稀释液；1.0LPBS加1.0mLTween-20和1g明胶；

终止液：2mol/LH₂SO₄；

封闭液：明胶1.0g加入包被缓冲液（CBS)100mL；

1.2.2主要仪器

酶标仪（Bio－Tek ELX800型）;

各种规格移液枪(Eppendorf);

BS100S型分析天平(北京赛多利斯公司);

DF-101S型恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器公司);

漩涡振荡仪;

恒温水浴锅;

ULT1386-3-V38型低温冰箱(美国REVCO公司);

DCD-172K型常规冰箱(美国伊莱克斯公司);

培养箱（浙江科通仪器公司）;

RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;

KQ-600型超声波清洗器;

1.3试验方法

1.3.1免疫方案

选10只健康的2月龄雄性实验用清洁级新西兰大白兔，体重为2.0～2.50kg/只,用兔子分笼饲养，自由饮食；在免疫前采集阴性血清备用,免疫程序见表1。

表1实验动物免疫方案程序

注：70天免疫结束后采血。

将人工抗原解冻，在无菌状态下以适量生理盐水稀释后，滴加到等体积的佐剂（FCA或FICA）中，混合乳化后成油包水(W/O)状态，使免疫的最终浓度为1mg/mL(以载体蛋白含量计算），据表1设计方案分别采用实施例1、2、3制备的恩拉霉素抗原进行相关免疫程序和采血检测。免疫前采耳缘静脉血1mL，4℃放置4h后3000rpm*10min离心取血清，将血清与甘油(1:1)等体积混和，保存于-20℃冰箱,用于空白对照,在70d免疫结束后采用心脏直接采血法采血,20～30mL/只；按上述方法分离血清，分装和保存。

1.3.2EL1SA方法的建立

1.3.2.1抗原抗体最佳工作浓度的测定

分别从每只家兔的耳缘静脉采血lmL，室温静置l h，4℃冰箱2～3h，3000g/min15min离心分离血清。采用方阵滴定法确定抗原、抗体的最适工作浓度，具体步骤如下：

a、包被：用包被液将包被抗原稀释成一系列浓度加至酶标板，100uL/孔，37℃孵育2h，然后4℃过夜；

b、洗涤：用洗涤液洗3遍，200uL/孔，每次间隔lmin，在吸水纸上拍干；

c、封闭：加入封闭液150uL/孔，37℃孵育1h后,4℃过夜，洗涤同b；

d、加样：加入事先系列稀释好的抗体，100uL/孔，37℃孵育lh；

e、洗涤：用洗液洗5遍，200uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

f、加酶：加入HRP—羊抗兔lgG(1:20000倍稀释)100uL/孔，37℃孵育lh；洗板同(e)；

g、显色：加入100uL/孔TMB底物使用液/孔，37℃显色10min；

h、终止：加入2moL/mlH₂SO₄50uL/孔，用酶标仪读取各孔OD₄₅₀；

判定标准:阳性血清OD₄₅₀在1.0左右抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。

阳性血清与阴性血清的P/N比值≥2.0倍的血清稀释倍数为血清效价。

1.3.2.2间接竞争ELISA方法的建立

a、包被：用包被液将包被抗原稀释成一定浓度加至酶标板100uL/孔，37℃孵育2h，然后4℃过夜；

b、洗涤：用洗涤液洗3遍，200uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

c、封闭：加入封闭液150uL/孔，37℃孵育lh后拍干；

d、加样：加入系列稀释的Er标准品50uL/孔，再加入适当稀释的抗体50uL/孔，37℃孵育lh；

e、洗涤：用洗涤液洗3遍，250uL/孔，每次间隔1min，在吸水纸上拍干；

f、加二抗:加入HRP—羊抗兔IgG(l：20000倍稀释)100uL/孔，37℃孵育lh；洗板同(e)；

g、显色：分别加入100uL底物溶液/孔，37℃显色10min；

1.3.2.3饱和硫酸铵法纯化多抗血清

多抗血清的纯化采用饱和硫酸铵法，将最后一次免疫后的兔子取血后获得的血清一部分与等量灭菌甘油混合后于1.5mL离心管中分装保存；一部分纯化提取lgG后再与等量灭菌甘油混合分装保存。该法具体操作步骤如下：

取血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50％饱和(NH4)2SO4]，然后于4℃，3小时以上，使其充分沉淀，再离心(3000rpm)20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。再逐滴加饱和硫酸铵Ｘ/2ml，置4℃，3小时以上［此时(NH4)2SO4的饱和度为33％)］。重复上述第二步过程2次。将末次离心后所得沉淀物以0.02MPH7.4PBS溶解至Xml装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色，透析结束。纯化后血清一部分与甘油1:1等体积混合，其余直接冷冻干燥后保存于-20℃。

2.结果分析

2.1Er抗血清效价的测定

采用间接ELISA方法，测得抗Er抗血清的最高效价大于1:320000，结果表明用戊二醛法制备免疫抗原来免疫家兔，能够产生特异性抗体。在进行了4次免疫后，试验家兔均产生了针对Er的抗体。其中，实施例2制备的恩拉霉素抗原免疫家兔所产生特异性抗体的效价最高，实施例3、1制备的恩拉霉素抗原免疫家兔所产生特异性抗体的效价次之。上述结果表明，本发明方法制备的恩拉霉素抗原的偶联比率的提高有助于提高恩拉霉素抗原免疫家兔所产生特异性抗体的效价，为采用间接酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测肉制品中恩拉霉素残留提供了必要保证。

Claims

1.制备恩拉霉素抗原的方法，其特征在于包括如下步骤：

a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解，其中，所述的牛血清白蛋白的相对分子质量为67000；

b、于a步骤所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素与牛血清白蛋白的质量比为1:1.3；

c、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六环，混匀；其中，所加入的1,4-二氧六环与PBS溶液的体积比为1:1.15；

d、c步骤混匀后的溶液于28℃反应4h，并加入体积浓度为0.25％的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液与1,4-二氧六环溶液的体积比为0.4:1，反应时的pH值控制在7.8；

e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。