CN102391373A - 一种4-氨基偶氮苯完全抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以戊二醛作为连接臂合成的一种4-氨基偶氮苯完全抗原及制备方法。该方法具有重复性好，步骤少和反应条件温和的特点，为进一步建立4-氨基偶氮苯的免疫分析奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于小分子有机物的免疫化学生物技术领域，具体涉及一种4-氨基偶氮苯完全抗原及其制备方法。
背景技术
偶氮染料是指染料分子结构中含有偶氮基（-N=N-）的染料，这类染料具有色谱齐全、颜色鲜艳、色牢度较高、成本低等优点，被广泛应用在纺织品印染行业。但相关研究表明，部分偶氮染料与人体作用后能够产生多种芳香胺类物质，经人体的活化作用后会使细胞的DNA结构和功能发生改变，从而诱发细胞癌变或畸变等病变，对人体具有致癌性。因此，欧盟在2003年9月11日公布的第2002 /61号令中规定：凡是在还原条件下释放出致癌芳香胺的偶氮染料都禁止使用。
4-氨基偶氮苯（4-Aminoazobenzene，简称4-AAB）是目前国际上明令禁止使用的24种芳香胺中的一种。2009年，我国颁布了GB/T23344-2009《纺织品4-氨基偶氮苯的测定》标准。标准大部分内容参考了国外的相关标准。尽管新标准的颁布弥补了4-氨基偶氮苯检测方法的空白，但仍有一些不足，如标准中先还原后萃取的方法回收率低，依靠叔丁基甲醚的萃取效果不够理想。另外，常用的检测方法多是采用GC-MS、HPLC等色谱法分离检测。此类方法过程复杂、效率低，对色谱柱污染严重。所以建立简单、快速的4-氨基偶氮苯检测方法，具有重要的意义。
免疫分析是利用抗原和抗体的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物。免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。近年来免疫分析得到了环境科学、食品科学界得极大关注。因此研究建立4-氨基偶氮苯的免疫分析方法，将会提供其更为简单、有效的检测手段。
4-氨基偶氮苯的相对分子质量较小，为不能直接引发免疫反应的半抗原，必须和大分子的载体蛋白，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin, OVA）等偶联之后构成完全人工抗原，才能应用于免疫操作。因此，有必要制备4-氨基偶氮苯人工抗原，用于免疫检测。
申请公布号CN 101899109 A（申请号201010215515.5）的中国专利文献提供了一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，是以4-氨基偶氮苯为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联。其缺点是反应条件较为苛刻，要求在冰水浴中反应并且没有引入连接臂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种4-氨基偶氮苯完全抗原及其制备方法。该方法具有重复性好，步骤少和反应条件温和的特点，此外还引入了连接臂，为进一步提取免疫分析所需要的抗4-氨基偶氮苯抗体奠定了良好的基础。
本发明的方案是：一种4-氨基偶氮苯完全抗原，结构式如下：
所述4-氨基偶氮苯完全抗原的制备方法，步骤如下：
（1）将一定pH值的磷酸盐缓冲溶液和1,4-二氧六环按一定体积比混合，得到混合液备用；
（2）用占1/5体积的混合液溶解一定量的4-氨基偶氮苯；
（3）用占3/10体积的混合液稀释一定量的戊二醛溶液；
（4）将步骤（2）所述的4-氨基偶氮苯溶液逐滴滴加到步骤（3）所述的戊二醛溶液中，室温下搅拌反应一定的时间，得到中间产物
；
（5）在圆底烧瓶中，用占1/2体积的混合液溶解BSA，得到10mg/mL的BSA溶液，并将步骤（4）得到的中间产物溶液逐滴滴加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌反应一定的时间，得到4-氨基偶氮苯的完全抗原
溶液，透析，计算结合比。
前面所述的制备方法，优选的方案是，所述缓冲溶液具体为pH=6.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS），优选pH=7.4的PBS。
前面所述的制备方法，优选的方案是，将4-氨基偶氮苯溶液逐滴加入到戊二醛溶液中。中间产物也是逐滴加入到蛋白质溶液中。
前面所述的制备方法，优选的方案是，磷酸盐缓冲溶液与1,4-二氧六环的体积比为3-1:1，更优选2:1。
前面所述的制备方法，优选的方案是，4-氨基偶氮苯的用量与BSA的质量比优选0.39-0.79:1，更优选0.59:1。
前面所述的制备方法，优选的方案是，每克BSA所需25%的戊二醛溶液的用量优选0.6mL-1.4mL，更优选1mL。
前面所述的制备方法，优选的方案是，4-氨基偶氮苯与戊二醛搅拌反应的时间为10min-35min，更优选30min。
前面所述的制备方法，优选的方案是，蛋白质BSA与中间产物的反应时间为1.5h-4h，更优选2h。
所述4-氨基偶氮苯完全抗原的合成路线是：
本发明是以戊二醛作为连接臂与4-氨基偶氮苯的氨基反应得到中间体，中间体的醛基再与蛋白质的氨基反应，制备了4-氨基偶氮苯的完全抗原。
本发明的技术优势还体现在：
1、操作步骤简单；
2、反应条件温和，在室温下就可完成反应；
3、重现性好；
4、半抗原与大分子之间引入了含有五个碳的直链连接臂，符合3-6个碳原子的最佳连接臂范围，它可以使半抗原突出于载体的表面易为机体免疫系统识别并使其产生针对半抗原的抗体，为建立4-氨基偶氮苯的免疫分析奠定了良好的基础。
附图说明
图1 为所得完全抗原、4-氨基偶氮苯与BSA的紫外吸收光谱图。其中1、完全抗原的紫外吸收光谱；2、4-氨基偶氮苯的紫外吸收光谱；3、BSA的紫外吸收光谱。
图2 为所得完全抗原、4-氨基偶氮苯与BSA的红外光谱图。其中1、4-氨基偶氮苯的红外光谱；2、完全抗原的红外光谱；3、BSA的红外光谱。
图3 不同pH值磷酸盐缓冲溶液对结合比的影响。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1 4-氨基偶氮苯完全抗原的制备方法，步骤如下：
（1）将磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）和1,4-二氧六环按体积比1:1混合，得混合液备用；
（2）用占1/5体积的混合液溶解一定量的4-氨基偶氮苯（0.15mmol）；
（3）用占3/10体积的混合液稀释一定量25%的戊二醛溶液；
（4）将步骤（2）所述的4-氨基偶氮苯溶液逐滴滴加到步骤（3）所述的戊二醛溶液中，室温下搅拌反应30min后，得到中间产物
；
（5）在圆底烧瓶中，用占1/2体积的混合液溶解BSA，得到10mg/mL的BSA溶液，并将步骤（4）得到的中间产物溶液逐滴滴加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌反应2h，得到4-氨基偶氮苯的完全抗原
溶液，透析，计算结合比为9.63。
所得4-氨基偶氮苯完全抗原，结构式如下：
合成路线是：
实施例2
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比1.5:1混合后的溶液作溶剂，用2ml的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.77。
实施例3
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2.5:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.90。
实施例4
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比3:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.50。
实施例5
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2.2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将5mL 10mg/mL的BSA溶液逐滴加入到上述反应得到的溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.96。
实施例6
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将戊二醛溶液在室温搅拌下逐滴加入到4-氨基偶氮苯溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为8.29。
实施例7
pH=6.0的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将戊二醛溶液在室温搅拌下逐滴加入到4-氨基偶氮苯溶液中，反应30min后再将5mL 10mg/mL的BSA溶液逐滴加入到上述反应得到的溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为7.50。
实施例8
pH=6.0的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应35min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应4h，透析，测得结合比为10.05。
实施例9
pH=6.5的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为10.21。
实施例10
pH=7.0的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为10.68。
实施例11
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应1.5h，透析，测得结合比为10.81。
实施例12
pH=8.0的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为10.48。
实施例13
pH=8.5的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.01。
实施例14
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL上述混合液溶解0.10mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释30μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应10min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.46。
实施例15
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL上述混合液溶解0.10mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应20min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应3h，透析，测得结合比为9.73。
实施例16
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL上述混合液溶解0.10mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释70μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应4h，透析，测得结合比为10.12。
实施例17
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL上述混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释30μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应20min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应4h，透析，测得结合比为9.75。
实施例18
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.15mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释70μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应10min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应3h，透析，测得结合比为10.29。
实施例19
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.20mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释 30μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应30min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应3h，透析，测得结合比为9.54。
实施例20
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.20mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释50μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应10min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应4h，透析，测得结合比为9.55。
实施例21
pH=7.4的PBS与1,4-二氧六环按体积比2:1混合后的溶液作溶剂，用2mL的混合液溶解0.20mmol的4-氨基偶氮苯，用3mL的混合液稀释70μL 25%的戊二醛溶液，并将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应20min后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到5mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温搅拌下反应2h，透析，测得结合比为9.58。
氨基偶氮苯完全抗原制备条件的优化：
（1）混合溶液中磷酸盐缓冲溶液（PBS）与1,4-二氧六环的体积比的优化，由实施例1-4,11的制备结果可知最佳的体积比为2:1。在实施例1中少量的蛋白质不溶，而实施例4中有大量的4-氨基偶氮苯不溶，溶解性影响了实施例1-4的结合比。
（2）由实施例5-7,11可知，溶液之间最佳的滴加顺序为将4-氨基偶氮苯溶液在室温搅拌下逐滴加入到戊二醛溶液中，反应后再将上述反应得到的溶液逐滴加入到BSA溶液中。实施例6的滴加顺序容易使戊二醛的两个醛基都和4-氨基偶氮苯的氨基反应，失去了戊二醛的连接作用。
（3）磷酸盐缓冲溶液pH的优化，由实施例8-13可知，磷酸盐缓冲溶液最佳的pH为7.4。
（4）利用正交试验的方法对4-氨基偶氮苯、戊二醛的用量和两次反应的时间进行了进一步的优化：
表1正交实验因素水平表
| 因素水平 | A小分子（mmol） | B戊二醛（μL） | C反应时间1（min） | D反应时间2（h） |
| 1 | 0.10 | 30 | 10 | 2 |
| 2 | 0.15 | 50 | 20 | 3 |
| 3 | 0.20 | 70 | 30 | 4 |
表2 L9（34）正交实验设计及结果
根据以上正交实验的结果可得出结论：在选取的四个因素中最主要的因素为A即加入4-氨基偶氮苯的量，最次要的因素为D即蛋白质和4-氨基偶氮苯同戊二醛反应产物的结合时间。最优的组合为A2B2C3D1即加入4-氨基偶氮苯的量为0.15mmol，加入戊二醛的量为50μL，4-氨基偶氮苯同戊二醛的反应时间为30min，蛋白质和4-氨基偶氮苯同戊二醛的反应产物的结合反应时间为2h。
4-氨基偶氮苯完全抗原的制备结果：4-氨基偶氮苯完全抗原的鉴定：经透析前后产物的颜色变化和紫外光谱分析来初步证明偶联的效果并利用光路叠加原理来确定4-氨基偶氮苯和蛋白质BSA的结合比，经真空冷冻干燥后进行红外扫描来进一步证明4-氨基偶氮苯和BSA的偶联效果。具体是：
（1）由于4-氨基偶氮苯有颜色，戊二醛和蛋白质溶液均为无色，所以可以根据反应前后溶液的颜色来判断偶联是否成功。4-氨基偶氮苯本身的颜色为黄色，反应得到的完全抗原经透析处理后仍有颜色并且变为橘红色。这可以初步的说明4-氨基偶氮苯同载体蛋白质结合成功。
（2）由说明书附图1可以看出，完全抗原的紫外吸收兼具4-氨基偶氮苯和BSA的紫外吸收特性，由戊二醛合成的完全抗原使蛋白质在279nm处的最大吸收峰向短波方向移动至266nm处，4-氨基偶氮苯的最大吸收由原来的386nm向长波方向移动至411nm处，符合上述颜色的变化。三种物质在550nm-800nm均无明显吸收。此外在相同浓度下，完全抗原和标准蛋白质的紫外光谱相比，吸光度明显增加。这是因为在4-氨基偶氮苯的氨基处增加了一个与苯环共轭的氮碳双键，使得4-氨基偶氮苯的吸收峰向长波长方向移动，并且导致ε（消光系数）增加即A的值增加。据此可以进一步判断4-氨基偶氮苯与载体牛血清白蛋白（BSA）的偶联成功。
（3）由说明书附图2可以看出，BSA和完全抗原两种物质在3500～3200 cm-1和 1 660～1300 cm-1区域有相似的红外吸收；4-氨基偶氮苯和完全抗原两种物质在1140cm-1～490cm-1区域有相似的红外吸收。完全抗原与BSA相比，红外光谱产生偏移,BSA约在3420cm-1和1648cm-1处的峰分别偏移至3418cm-1和1654cm-1处，应该是4-氨基偶氮苯与 BSA偶联后导致峰位的偏移。红外光谱更进一步证明了两种物质的偶联成功。
（4）透析袋前处理：剪取15cm的透析袋，在2% NaHCO3和0.1mol/L EDTA（pH=8.0）的混合溶液中煮沸10min，然后用蒸馏水彻底清洗，再放入0.1mol/L EDTA（pH=8.0）的溶液中煮沸10min，冷却后存放于4℃溶液中备用，必须确保透析袋始终浸没在溶液中，使用前用去离子水冲洗干净。
结合比的测定：根据物质的吸光度可以叠加，与BSA浓度相同的完全抗原吸光度的增加来自于小分子4-氨基偶氮苯的贡献，将此贡献值与制备的4-氨基偶氮苯浓度-吸光度标准曲线来确定4-氨基偶氮苯的浓度，再由结合比=小分子摩尔数/BSA摩尔数，得出结合比。
取上述所得完全抗原溶液适量转移至透析袋中，用0.01mol/L的PBS溶液4℃透析48h，每4h更换一次透析液，将透析好的完全抗原溶液转移至小试剂瓶中，4℃保存备用。利用光路叠加原理测得完全抗原溶液的结合比，最优条件下得到的完全抗原的结合比为10.81。
Claims (8)
1.一种4-氨基偶氮苯完全抗原，其特征是，结构式如下：
2.根据权利要求1所述4-氨基偶氮苯完全抗原的制备方法，其特征是，步骤如下：
（1）将磷酸盐缓冲溶液和1,4-二氧六环按比例混合，得混合液备用；
（2）取1/5的混合液溶解4-氨基偶氮苯；
（3）取3/10的混合液稀释戊二醛溶液；
（4）将步骤（2）所述4-氨基偶氮苯溶液逐滴滴加到步骤（3）所述戊二醛溶液中，室温下搅拌反应一定的时间，得到中间产物；
（5）在反应容器中，取剩余的混合液溶解BSA，并将步骤（4）得到的中间产物溶液逐滴滴加入到反应容器中，室温下搅拌反应一定的时间，得到4-氨基偶氮苯完全抗原溶液，透析，计算结合比。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述缓冲溶液具体为pH=6.0-8.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS），优选pH=7.4的PBS。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，磷酸盐缓冲溶液与1,4-二氧六环的体积比为3-1:1，优选2:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，4-氨基偶氮苯的用量与BSA的质量比优选0.39-0.79:1，更优选0.59:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，每克BSA所需25%的戊二醛溶液的用量0.6mL-1.4mL，优选1mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，4-氨基偶氮苯与戊二醛搅拌反应的时间为10min-35min，优选30min。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，BSA与中间产物的反应时间为1.5h-4h，优选2h。
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