CN102827271A - 一种适用于对氨基偶氮苯的人工抗原合成方法 - Google Patents

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李灼坤
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王风艳
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Abstract

一种对氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明分别以对氨基苯丁酸和对氨基苯乙酸进行重氮化与苯胺进行反应，从而获得2个针对对氨基偶氮苯的衍生物1和2；同时以对氨基偶氮苯衍生物1为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联作为免疫原用来免疫兔子产生抗体；以对氨基偶氮苯衍生物2为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白OVA偶联作为包被原。用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了对氨基偶氮苯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，并且在应用于免疫分析中获得针对对氨基偶氮苯特异性非常好的抗体，可以满足国内对其研究的需要。

Description

一种适用于对氨基偶氮苯的人工抗原合成方法
技术领域
一种适用于对氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
对氨基偶氮苯，英文名：p-aminoazobenzene;Aniline Yellow，4-Aminoazobenzene；化学名也叫4-氨基偶氮苯，苯胺黄；CAS号：60-09-3；分子式是C12H11N3。偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物)是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。偶氮是国际环保要求的必检项目之一，检验方法有以下三种：薄层色谱法（TLC），气相色谱及质谱联用法（GC-MSD）及高效液相色谱法（HPLC）。标准规定被检产品中不得含有23种偶氮染料中间体，若检出其中一种即为不合格产品，其限量为30ppm。对氨基偶氮苯是这些有害芳香胺中的一种，在欧盟公布的偶氮染料标准中，对氨基偶氮苯属于禁用芳香胺中的MAK(Ⅲ)A2组中的一种。国外大部分现行相关标准法规都将对氨基偶氮苯列入禁用芳香胺行列。如德国《食品及日用消费品法》等，而国内在涉及纺织品、染料、皮革制品的标准都没有将其列入。由于检测技术的限制，常规的检验方法无法对其进行检测。近年来，国内外已经开展了对偶氮类免疫分析方法的研究，但国内外尚很少有针对对氨基偶氮苯的酶联免疫检测的报道，有必要制备能产生更好特异性抗体的对氨基偶氮苯人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于对氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于对氨基偶氮苯的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种适用于对氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，分别以对氨基苯丁酸和对氨基苯乙酸进行重氮化，重氮化产物分别与与苯胺进行反应，从而获得2个针对对氨基偶氮苯的衍生物1：对氨基偶氮苯丁酸，和对氨基偶氮苯的衍生物2：对氨基偶氮苯乙酸；同时以对氨基偶氮苯丁酸为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联作为免疫原用来免疫兔子产生抗体；以对氨基偶氮苯乙酸为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白OVA偶联作为包被原，用来建立酶联免疫检测方法。
（1）对氨基偶氮苯衍生物的制备
在冰浴下（-5℃-0℃）将底物对氨基苯丁酸（358 mg，2mmol）溶于稀盐酸中（1N，4 mL），然后加入亚硝酸钠（138 mg，2 mmol），搅拌15min后加入苯胺（186 mg，2 mmol），整个过程保持0℃以下0.5h，反应监测（LC/MS）原料消耗完全，将此反应溶液转至制备色谱纯化，制得对氨基偶氮苯衍生物1。
同理将底物换成对氨基苯乙酸，可制得对氨基偶氮苯衍生物2。
Figure 935696DEST_PATH_IMAGE001
（2）对氨基偶氮苯人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol对氨基偶氮苯衍生物1的N,N-二甲基甲酰胺DMF，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS室温避光反应3h，为A液；将0.0025mmol 牛血清蛋白BSA溶解到0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0.01M的PBS溶液透析2次和2L的去离子水透析2次，总计透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得对氨基偶氮苯人工抗原。
（3）对氨基偶氮苯包被原的制备
将步骤（2）中的对氨基偶氮苯衍生物1替换为对氨基偶氮苯衍生物2，其余操作均与步骤（2）相同，即得对氨基偶氮苯包被原。
（4）对氨基偶氮苯人工抗原的鉴定
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制对氨基偶氮苯浓度为0，10，20，30 μg·mL-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知对氨基偶氮苯的最大吸收波长为400nm，在400nm处测吸光值，每个浓度做平行样．摩尔吸光系数计算为：ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5min，每个浓度做平行样．在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。
偶联比测定：配制150 μg·mL-1牛血清蛋白的20%乙醇溶液，将偶联产物用20%乙醇稀释到150 μg·mL-1，在400nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：
Figure 662956DEST_PATH_IMAGE002
。
其中ε为摩尔吸光系数（L·mol-1），66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度（μg·mL-1）。
本发明的有益效果：本发明合成了对氨基偶氮苯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1 对氨基偶氮苯人工抗原的紫外扫描图。
图2利用间接ELISA方法测得的对氨基偶氮苯的标准抑制曲线。
具体实施方式
（1）对氨基偶氮苯衍生物的制备
在冰浴下（-5℃- 0℃）将底物对氨基苯丁酸（358 mg，2mmol）溶于稀盐酸中（1N，4 mL），然后加入亚硝酸钠（138 mg，2 mmol），搅拌15min后加入苯胺（186 mg，2 mmol），整个过程保持0℃以下0.5h，反应监测（LC/MS）原料消耗完全，将此反应溶液转至制备色谱纯化，制得对氨基偶氮苯衍生物1。
同理将底物换成对氨基苯乙酸，可制得对氨基偶氮苯衍生物2。
（2）对氨基偶氮苯人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol对氨基偶氮苯衍生物的N,N-二甲基甲酰胺DMF/水溶液，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS室温避光反应3h，为A液。将0.0025mmol 牛血清蛋白BSA溶解到0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液。然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得对氨基偶氮苯人工抗原。
（3）对氨基偶氮苯包被原的制备
将步骤（2）中的对氨基偶氮苯衍生物1替换为对氨基偶氮苯衍生物2，其余操作均与步骤（2）相同，即得对氨基偶氮苯包被原。
（4）对氨基偶氮苯人工抗原的鉴定
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制对氨基偶氮苯浓度为0，10，20，30 μg·mL-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知对氨基偶氮苯的最大吸收波长为400nm，在400nm处测吸光值，每个浓度做平行样．摩尔吸光系数计算为：ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样．在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。
偶联比测定：配制150 μg·mL-1牛血清蛋白的20%乙醇溶液，将偶联产物用20%乙醇稀释到150 μg·mL-1，在400nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r为：
Figure 505010DEST_PATH_IMAGE002
。
其中ε为摩尔吸光系数（L·mol-1），66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度（μg·mL-1）。
表1不同兔子抗血清的抗血清效价
Figure 2012103699108100002DEST_PATH_IMAGE003

Claims (1)

1.一种适用于对氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，其特征在于分别以对氨基苯丁酸和对氨基苯乙酸进行重氮化，重氮化产物分别与苯胺进行反应，从而获得2个针对对氨基偶氮苯的衍生物1：对氨基偶氮苯丁酸，对氨基偶氮苯的衍生物2：对氨基偶氮苯乙酸；同时以对氨基偶氮苯丁酸为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联作为免疫原用来免疫兔子产生抗体；以对氨基偶氮苯乙酸为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白OVA偶联作为包被原，用来建立酶联免疫检测方法；
（1）对氨基偶氮苯人工抗原的制备
取0.5mL的含有0.1mmol对氨基偶氮苯衍生物1的N,N-二甲基甲酰胺DMF，加入0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺NHS室温避光反应3h，为A液；将0.0025mmol 牛血清蛋白BSA溶解到0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0.01M的PBS溶液透析2次和2L的去离子水透析2次，总计透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得对氨基偶氮苯人工抗原；
（2）对氨基偶氮苯包被原的制备
将步骤（1）中的对氨基偶氮苯衍生物1替换为对氨基偶氮苯衍生物2，其余操作均与步骤（1）相同，即得对氨基偶氮苯包被原。
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