CN103492582B - 用于测定HE4a的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明包括HE/HE4a标志物用于评估受试者的卵巢癌的用途。还包括使用HE/HE4a标志物进行卵巢癌的诊断、分级和分期、以及确定已经诊断出具有卵巢癌的受试者的预后和治疗有效性的组合物和方法。
Description
本发明包括用于疑似患有和/或罹患卵巢癌的受试者的检测、诊断、分级、分期、预后以及预测和监测所述受试者的治疗应答性的组合物和方法。也公开了通过确定全长HE4a在得自患者的样品中的存在来检测卵巢癌的免疫测定、结合剂和抗体和方法。
背景技术
WFDC2(HE4/HE4a)基因产物是稳定的4-二硫键核心蛋白家族的一个成员。HE4是一种首先在人附睾组织中观察到的分泌型糖基化蛋白(人附睾蛋白4;HE4),且在某些癌症(包括卵巢癌)中过表达。HE4/HE4a蛋白和核酸的表征已经被报道在,例如,KirchhoffC,HabbenI,IvellR,KrullN(Mar1992).“Amajorhumanepididymis-specificcDNAencodesaproteinwithsequencehomologytoextracellularproteinaseinhibitors”.BiolReprod45(2):350–7SchummerM,NgWV,BumgarnerRE,NelsonPS,SchummerB,BednarskiDW,HassellL,BaldwinRL,KarlanBY,HoodL(Dec1999).“Comparativehybridizationofanarrayof21,500ovariancDNAsforthediscoveryofgenesoverexpressedinovariancarcinomas”.Gene238(2):375–85;KirchhoffC(1998).“Molecularcharacterizationofepididymalproteins.”Rev.Reprod.3(2):86–95.;KirchhoffC,OsterhoffC,HabbenI,等人.(1990).“CloningandanalysisofmRNAsexpressedspecificallyinthehumanepididymis.”Int.J.Androl.13(2):155–67;I,等人;CancerRes.2003Jul1;63(13):3695-700。HE4/HE4a在癌细胞中的过表达提示,该蛋白和它的各种异形体可以作为用于检测癌症和用于鉴别具有增加的罹患癌症的可能性的患者的有用生物标志物。以前已经报道了与例如HE4/HE4a等分子标志物的应用有关的方法和组合物,包括US7270960、US20100311099、US20080020473、US20070286865、US20100047818、US20090104684和US20030108965,它们中的每一篇的内容整体并入本文中。
已经报道,由于选择性剪接以及不同糖基化模式所导致的不同糖型,HE4/HE4a蛋白具有不同的异形体。考虑到上述内容,本领域需要能够检测生物标志物例如HE4a、它们的变体、剪接异形体和糖型的过表达来诊断癌症的组合物和结合剂(例如抗体)。
发明内容
本发明包括用于诊断受试者的卵巢癌和用于鉴别具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受试者的组合物和方法。所述组合物包括特异性地结合在卵巢癌上过表达的HE4/HE4a的可溶性形式和细胞表面形式的单克隆抗体、它们的变体和片段。还提供了具有公开的HE4a抗体的结合特征的单克隆抗体。还公开了生产HE4/HE4a单克隆抗体的杂交瘤细胞系。公开的组合物可以用于诊断方法中以及用于鉴别具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受试者的筛选方法中。具体地,诊断方法可以包括免疫组织化学(IHC)测定或双夹心ELISA测定。还提供了试剂盒,其包括一种或多种公开的HE4a单克隆抗体,并用于实现本发明的方法。还公开了包含HE4a表位的氨基酸序列的多肽和在抗体的生产中使用这些多肽的方法。
附图说明
图1解释了包含HE4a结构域和人/小鼠IgG的一个示例性的HE4a融合蛋白实施方案。
图2解释了单克隆抗体实施方案(12A2和14E2抗体)对全长HE4a、HE4a的HE4a-V4和HE4a-V2结构域的一些结合特异性。在该实施例中,MAb12A2和14E2与HE4a-V4变体和与全长HE4a结合,但是不与HE4a-V2结构域结合。这表明,12A2和14E2MAb与HE4aN-WFDC结构域结合。
图3描绘了参照单克隆抗体(2H5和3D8抗体)对融合蛋白的结合特异性。在该实施例中,参照MAb与HE4a-V2结构域和与全长HE4a结合,但是不与HE4a-V4结构域结合,这表明,它们识别HE4aC-WFDC结构域中的表位。
图4显示了HE4a核苷酸(SEQIDNO:6)和肽(SEQIDNO:1)序列;包括N-WFDC和C-WFDCHE4a结构域。
图5解释了示例性的单克隆抗体(12A2)与N-WFDC和C-WFDC的结合相互作用。在该实施例中,使用噬菌体ELISA形式证实了12A2的结合特异性,其中所述MAb仅与HE4aN-WFDC噬菌体pVIII融合蛋白反应。
图6描绘了14E2MAb与变性的和还原的HE4a-hIg融合蛋白的反应性。与变性的和还原的HE4a-hIg融合蛋白的结合指示,14E2MAb会识别HE4a蛋白的线性表位。
图7显示了使用14E2作为捕获MAb和使用3D8或12A2MAB作为检测MAb的夹心免疫测定的剂量响应曲线。14E2和12A2MAb的组合的结果指示,它们能够同时结合,并从而检测HE4aN-WFDC结构域的独立表位。
图8解释了与2H5MAb组合的12A2和14E2MAb的一些实施例夹心免疫测定和结合。在该实施例中,MAb12A2和14E2仅与全长HE4a反应,而MAb组合3D8和2H5与FLHE4a和HE4a-V2变体二者反应。结果进一步证实:12A2和14E2MAb会识别在HE4aN-WFDC结构域中暴露的表位。
图9显示了全长HE4aEIA的剂量响应曲线。该测定是基于2H5MAb作为捕获抗体和HRP结合的12A2MAb作为检测MAb。如在实施例3中所述进行操作。
图10描绘了健康受试者、具有良性妇科疾病的患者和在FLHE4aEIA(如在实施例3中所述)中确定具有卵巢癌的患者的HE4a水平。
图11解释了用于监测卵巢癌的临床进程的一个示例性的全长HE4a免疫测定(SD=稳定疾病;R=应答;PD=进行性疾病)。在该实施例中,全长HE4a证实,全长HE4a可用于跟踪具有确诊的卵巢癌的患者的疾病的临床进程。
图12.解释了使用对HE4aN-WFDC结构域特异性的示例性MAb的良性和恶性卵巢组织的IHC。在该实施例中,示例性的12A2MAb强烈地结合卵巢癌中的癌细胞,但是没有结合良性肿瘤中的细胞。A:浆液性腺癌;B:浆液性腺癌;C:子宫内膜样卵巢癌;D:浆液性腺癌;E:纤维瘤;F:纤维卵泡膜细胞瘤。
具体实施方式
提供了用于诊断受试者的卵巢癌和用于鉴别具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受试者的不同组合物和方法。组合物包括能够结合HE4/HE4a(即已经证实在卵巢癌细胞中过表达的蛋白)的单克隆抗体。所述组合物包括特异性地结合在卵巢癌上过表达的HE4/HE4a的可溶性形式和细胞表面形式的单克隆抗体、它们的变体和片段。另外提供了具有本公开内容的HE4a抗体的结合特征的单克隆抗体。还提供了生产本公开内容的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。更具体地,提供了这样的杂交瘤细胞系:其生产结合HE4a的N-WFDC结构域的单克隆抗体。还公开了包含所述单克隆抗体的试剂盒。本发明还包括包含HE4a表位的氨基酸序列的多肽和在抗体生产中使用这些多肽的方法。所述组合物具体地用在诊断受试者的卵巢癌的“夹心”ELISA方法或IHC中和在鉴别具有增加的罹患卵巢癌的可能性的受试者的筛选方法中。
在一个方面,本公开内容提供了一种能够特异性地结合HE4a的单克隆抗体。在一个实施方案中,所述单克隆抗体由作为专利保藏物编号(PatentDepositNo.)10091401保藏在ECACC的杂交瘤细胞系12A2生产。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体由作为专利保藏物编号11022202保藏在ECACC的杂交瘤细胞系14E2生产。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体结合在SEQIDNO:17HE4aN-WFDC(EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
在另一个方面,本发明提供了一种用于诊断卵巢癌的试剂盒,其包括:结合在SEQIDNO:HE4aN-WFDC中所示的氨基酸序列的单克隆抗体和结合在SEQIDNO:19HE4aC-WFDC(KEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF)中所示的氨基酸序列的另一种单克隆抗体。还提供了用于诊断患者的卵巢癌的试剂盒,其包括:被固定化在固体支持物上的捕获抗体,其中所述捕获抗体是第一种HE4a抗体;和标签抗体,其中所述标签抗体是被可检测的物质标记的第二种HE4a抗体;其中所述第一种或所述第二种HE4a抗体是单克隆抗体,其中所述单克隆抗体由作为专利保藏物编号11022202保藏在ECACC的杂交瘤细胞系14E2生产,和/或结合在SEQIDNO:17HE4aN-WFDC(EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
本发明的公开内容也提供了一种用于生产HE4a单克隆抗体的方法,所述方法包括:在引起免疫应答的条件下用多肽免疫动物,其中所述多肽包含在SEQIDNO:1、3和5(HE4a;HE4aV2;HE4a-V4)中所示的氨基酸序列及其变体;从所述动物分离出抗体生产细胞;使所述抗体生产细胞与培养的永生化细胞融合以形成生产单克隆抗体的杂交瘤细胞;培养所述杂交瘤细胞;和从所述培养物中分离出单克隆抗体。
本公开内容也提供了HE4a结合剂,其结合:(a)HE4a的N-WFDC结构域;(b)由SEQIDNO:1HE4a编码的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述结合剂是抗-HE4a抗体或HE4a抗原结合片段。在另一个实施方案中,所述结合剂选择性地结合HE4aN-WFDC(SEQIDNO:17)。在另一个实施方案中,所述结合剂是多克隆的、单克隆的、双特异性的、嵌合的或人源化的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中,所述结合剂被可检测的标志物标记。
本发明还包括纯化的氨基酸序列,其与作为专利保藏物编号10091401保藏在ECACC的杂交瘤细胞系12A2所生产的单克隆抗体的氨基酸序列具有至少90%同一性。
在另一个方面,提供了纯化的氨基酸序列,其中与单克隆抗体的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列由作为专利保藏物编号14E2ECACCNo.11022202保藏在ECACC的杂交瘤细胞系14E2生产。
本公开内容也包括一种获得编码HE4a多肽的核酸序列的方法,所述方法包括:a)用包含正向引物和反向引物的引物集合,从样品扩增核酸,其中所述引物集合选自:SEQIDNO:21V4F和SEQIDNO:23_V4R,SEQIDNO:25V2F和SEQIDNO:27V2R;b)分离所述扩增的核酸。
本发明还包括一种分离的核酸分子,其编码结合SEQIDNO17HE4aN-WFDC的序列的结合蛋白,其中所述结合蛋白的氨基酸序列与由作为专利保藏物编号10091401保藏在ECACC的杂交瘤12A2或作为专利保藏物编号14E2ECACCNo.11022202保藏在ECACC的细胞系14E2生产的单克隆抗体的氨基酸序列具有至少90%同一性,和/或所述结合蛋白结合在SEQIDNO:17HE4aN-WFDC(EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND)中所示的氨基酸序列。
在另一个方面,提供了载体和宿主细胞,其包含编码结合蛋白的分离的核酸分子,所述结合蛋白结合SEQIDNO17HE4aN-WFDC的序列。
本公开内容也提供了一种分离的融合蛋白,其包含与Fc受体多肽连接的异源HE4a多肽,所述Fc受体多肽包含SEQIDNO:17HE4aN-WFDC的氨基酸序列。在一个实施方案中,通过使用由SEQIDNO:29W1F、SEQIDNO:31W1R、SEQIDNO:33W2F、SEQIDNO:35W2R编码的引物进行核酸扩增,得到分离的融合蛋白。在另一个实施方案中,所述融合蛋白包含作为剪接变体的异源HE4a抗原多肽。
本发明还包括一种筛选卵巢癌在受试者中的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的生物样品与至少一种对HE4a抗原多肽特异性的抗体接触,以确定所述生物样品中存在以可溶形式天然存在于该样品中、并具有可与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇的分子,所述接触在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇的结合的条件和时间下进行,然后检测卵巢癌的存在。在一个实施方案中,所述生物样品选自:血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、尿、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水液、胸膜液、心包液、腹膜液、腹水、培养基、条件培养基和洗出液。
本公开内容另外提供了一种筛选卵巢癌在受试者中的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的包含细胞的生物样品与至少一种对HE4a抗原多肽特异性的抗体接触,以确定所述生物样品中存在具有可与至少一种抗体反应的抗原决定簇的细胞表面分子,所述接触在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇的结合的条件和时间下进行,并从而检测卵巢癌的存在。在一个实施方案中,所述抗体被可检测地标记。在另一个实施方案中,所述抗体没有被可检测地标记,且其中所述抗体与抗原决定簇的结合的检测是间接的。
本发明还包括一种筛选卵巢癌在受试者中的存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的生物样品与至少一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的第一抗体接触,以确定分子在样品中的存在,所述接触在足以使所述第一抗体特异性地结合HE4a抗原多肽并由此形成免疫复合物的条件和时间下进行;除去所述样品的没有特异性地结合所述第一抗体的组分;和使所述免疫复合物与至少一种对HE4a抗原多肽特异性的第二抗体接触,其中所述第二抗体的抗原结合位点不会竞争性地抑制所述固定化的第一抗体的抗原结合位点,所述接触在足以检测所述第二抗体与HE4a抗原多肽的特异性结合的条件和时间下进行,并从而检测卵巢癌的存在。在一个实施方案中,所述固定化的第一抗体选自:12A2、14E2、2H5和3D8。在一个实施方案中,所述第二抗体选自:12A2、14E2、2H5和3D8。在另一个实施方案中,所述固定化的第一抗体是14E2。在另一个实施方案中,所述第二抗体是12A2。
还公开了一种诊断具有卵巢癌的受试者的方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与抗体接触,所述抗体具有结合HE4aN-WFDC的抗原结合域;和在显示器上检测所述复合物的存在,其中指示HE4a在所述试验样品中的存在的所述复合物的存在与卵巢癌的存在相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
本发明还包括一种诊断具有卵巢癌的受试者的方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成第一抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与第一抗体接触,所述第一抗体具有结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域;在足以形成第一抗体/抗原/第二抗体复合物的条件和时间下,将结合物加入所述第一抗体/抗原复合物中,其中所述结合物包含连接至产生信号的化合物的第二抗体,所述产生信号的化合物能够产生可检测信号;和在显示器上检测由所述产生信号的化合物产生的信号的存在,其中指示HE4a抗原在所述试验样品中的存在的所述信号的存在与卵巢癌的存在相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
本公开内容也包括具有卵巢癌的受试者的预后方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与抗体接触,所述抗体具有结合HE4aN-WFDC的抗原结合域;和在显示器上检测所述复合物的存在,其中指示HE4a抗原在所述试验样品中的存在的所述复合物的存在与卵巢癌的阶段相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
本发明还包括具有卵巢癌的受试者的预后方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成第一抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与第一抗体接触,所述第一抗体具有结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域;在足以形成第一抗体/抗原/第二抗体复合物的条件和时间下,将结合物加入所述第一抗体/抗原复合物中,其中所述结合物包含连接至产生信号的化合物的第二抗体,所述产生信号的化合物能够产生可检测信号;和在显示器上检测由所述产生信号的化合物产生的信号的存在,其中指示HE4a抗原在所述试验样品中的存在的所述信号的存在与卵巢癌的阶段相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
还公开了一种监测接受卵巢癌治疗的受试者的方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与抗体接触,所述抗体具有结合HE4aN-WFDC的抗原结合域;和在显示器上检测所述复合物的存在,其中指示HE4a抗原在所述试验样品中的存在的所述复合物的存在与对所述治疗的应答性相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
本公开内容另外提供了一种监测接受卵巢癌治疗的受试者的方法,所述方法包括:检测得自受试者的试验样品中的HE4a抗原;在足以形成第一抗体/抗原复合物的条件和时间下,使所述试验样品与第一抗体接触,所述第一抗体具有结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域;在足以形成第一抗体/抗原/第二抗体复合物的条件和时间下,将结合物加入所述第一抗体/抗原复合物中,其中所述结合物包含连接至产生信号的化合物的第二抗体,所述产生信号的化合物能够产生可检测信号;和在显示器上检测由所述产生信号的化合物产生的信号的存在,其中指示HE4a抗原在所述试验样品中的存在的所述信号的存在与对所述治疗的应答性相关联。在一个实施方案中,所述抗体包含结合HE4a的氨基酸N-WFDC的抗原结合域。在另一个实施方案中,所述抗体是由具有ECACC专利保藏物编号10091401的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
本发明也提供了一种用于检测卵巢癌在患者中的存在或不存在的方法,所述方法包括:使得自受试者的试验卵巢组织样品与抗体接触,所述抗体特异性地结合在SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13或15(HE4)任一个中所示的多肽;检测结合试验卵巢癌组织样品中的所述多肽的抗体的量;和将结合试验卵巢癌组织样品中的所述多肽的抗体的量与预定的截止值进行对比,其中当结合试验卵巢组织样品中的所述多肽的抗体的量高于预定的截止值时,所述试验卵巢癌组织样品是卵巢癌阳性的,由此检测卵巢癌在受试者中的存在或不存在。在一个实施方案中,使用免疫组织化学,确定结合试验卵巢癌组织样品中的所述多肽的抗体的量。
本文公开的方法涉及HE4/HE4a,即描述的“4-二硫键核心”蛋白家族的一个成员。“4-二硫键核心”蛋白家族包含功能多样的酸和热稳定的小分子的异质群组,且该异质群组包括人附睾4-二硫键核心蛋白或“HE4”(Kirchhoff等人,1991Biol.Reprod.45:350-357;Wang等人,1999Gene229:101;Schummer等人,1999Gene238:375)。HE4cDNA最早分离自人附睾(Kirchhoff等人,1991Biol.Reprod.45:350-357),HE4cDNA以后在从卵巢癌构建的cDNA文库中高频率地检测出(Wang等人,1999Gene229:101;Schummer等人,1999Gene238:375)。在Hellstrom等人,2003,Canc.Res.63:3695-3700中和在US7,270,960中公开了HE4a的修正序列。HE4a表现出的氨基酸序列与在更早的出版物中被称作HE4的分子的推论序列高度类似,但是不同。
在下面表1中详细报道了HE4蛋白的许多异形体。本领域技术人员会明白,本公开内容的HE4/HE4a单克隆抗体可以结合超过一种HE4异形体,只要每种异形体包括特定HE4/HE4a抗体的有关表位序列。
表1:HE4异形体
本文中使用的“受试者”表示作为治疗、观察或实验的对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物例如鱼、贝类、爬行动物和尤其是哺乳动物。“哺乳动物”包括,但不限于,小鼠;大鼠;兔;豚鼠;狗;猫;绵羊;山羊;牛;马;灵长类动物,例如猴、黑猩猩和猿类和人类。
本文公开的方法还包括这样的组合物和方法:其用于检测在受试者中天然地存在的HE4a的细胞表面形式和/或可溶形式,包括这样的多肽在具有某些癌症的受试者中的升高的水平。因此,本公开内容提供了有用的组合物和方法,其用于通过特异性检测这样的细胞表面和/或可溶性HE4a多肽而检测和诊断受试者的恶性病症(例如卵巢癌)。
还提供了用于测定全长HE4a抗原的免疫测定的设计和用于测定全长HE4a抗原的单克隆抗体的制备,以及所述免疫测定和单克隆抗体的下述用途:用于卵巢癌的血清学诊断,监测疾病的临床进程,和通过HE4a的组织分析来诊断卵巢癌。针对HE4aN-WFDC结构域特有的表位的新单克隆抗体的建立,和将这些抗体与针对HE4aC-WFDC结构域的抗体相组合,使得设计用于测定全长HE4a的特异性免疫测定成为可能。
根据本文公开的方法,可以在得自受试者的生物样品或生物来源中检测人HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。通过从受试者或生物来源获得血液样品、活检样本、组织外植体、器官培养物、生物流体或任何其它的组织或细胞制备物,可以提供生物样品。受试者或生物来源可以是人或非人的动物、原代细胞培养物或改造的培养物细胞系,包括、但不限于可以含有染色体整合的或附加型重组核酸序列的遗传工程改造的细胞系、永生化的或可永生化的细胞系、体细胞杂交细胞系、分化的或可分化的细胞系、转化的细胞系等。在本文公开的方法的某些实施方案中,受试者或生物来源可以疑似具有卵巢癌或处于具有卵巢癌的风险中。
在某些实施方案中,所述生物样品包括至少一个得自受试者或生物来源的细胞,在其它的实施方案中,生物样品是含有另一种肿瘤标志物的生物流体。生物流体典型为处于生理温度的液体,且可以包括在受试者或生物来源中存在、从其抽取、表达或以其它方式从其提取的天然存在的流体。某些生物流体源于特定的组织、器官或局部区域,且某些其它的生物流体可以更整体地或全身地存在于受试者或生物来源中。生物流体的非限制性例子包括 尿、脑脊液、唾液、浆膜液、血浆、淋巴液、分泌组织和器官的粘膜分泌液、阴道分泌物、乳汁、眼泪、以及腹水液,例如与非实体肿瘤有关的腹水液也是合适的。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体等。生物流体可以进一步包括与受试者或生物来源接触的液体溶液,例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等。在其它的实施方案中,生物样品是无细胞的液体溶液,例如血清、血浆或离心的尿液的上清液。
在某些其它实施方案中,生物样品含有完整的细胞,在某些其它优选实施方案中,生物样品包含含有核酸序列的细胞提取物,所述核酸序列编码HE4a抗原多肽或其片段或变体。在本文公开的方法的其它实施方案中,需要在测定以前对细胞进行物理或化学破碎或裂解,以给分析提供细胞内容物。
本文中使用的样品中的“以可溶形式天然存在的分子”可以是可溶性的蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物;脂类、脂肪酸或类似物、或其衍生物;碳水化合物、糖或类似物、或其衍生物;核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相关的分子、或其衍生物等;或它们的任意组合,例如糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂质或任何其它的可溶性生物分子或本文提供的生物样品的无细胞组分。“以可溶形式天然存在的分子”进一步指在溶液中或存在于生物样品(包括本文提供的生物流体)中的分子,并且所述分子不与完整细胞的表面结合。例如,以可溶形式天然存在的分子可以包括,但是不一定限于:溶质;大分子复合物的组分;从细胞脱落、分泌或输出的物质;胶体;微粒或纳米粒子或其它细悬浮颗粒;等。
恶性病症(例如卵巢癌)在受试者的存在是指,在受试者中存在发育异常的、癌性的和/或转化的细胞,包括例如赘生的、肿瘤的、非接触性抑制的或致癌转化的细胞等。通过说明而不是限制,在本文公开的方法的背景下,恶性病症可以进一步指受试者中存在能够分泌、脱落、输出或释放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌细胞,以至于在得自受试者的生物样品中可以检测到升高的水平的这种多肽。例如,在某些实施方案中,这样的癌细胞是恶性上皮细胞例如癌细胞,且在某些实施方案中,这样的癌细胞是恶性间皮瘤细胞,它们是在例如内胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔中发现的鳞状上皮或间皮细胞的转化变体。
在一个实施方案中,卵巢肿瘤细胞(其存在会指示卵巢癌的存在)可以包括原发性和转移性卵巢癌细胞。将恶性肿瘤分类的标准是本领域众所周知的,得自原发性和转移性肿瘤的人卵巢癌细胞系的建立和表征也是本领域众所周知的。 恶性病症可以是间皮瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌或其它形式的癌症,包括各种癌(例如鳞状细胞癌和腺癌)中的任一种,也包括肉瘤和血液恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。这些以及其它恶性病症的分类对于熟悉本领域的人来说是已知的,且本公开内容提供了在这样的恶性病症中无需过多试验就确定HE4a多肽的存在的方法。
在本文包含的实施例中提供了参考值。这些值适合用于实践本文公开的方法。但是应当指出,本文公开的方法的使用并不限于那些参考值或数据。本领域技术人员可以根据他们的具体需要获得参考值。通过在患者因为疑似恶性的卵巢癌肿块而进行活组织检查操作时分析所述患者的HE4表达,可以获得这样的参考值。在实施例中提供了获得这类参考值的方法。另外,可以获得其它参考值,以聚焦于特定的患者类型。预见到,这样的类型可以包括年龄、遗传背景、癌症风险、医疗史、血型、物理特性例如体重,以及其它的类型。
本文提供的筛选恶性病症在受试者中的存在的方法可以使用对HE4a抗原多肽特性的抗体或对HE4a多肽特异性的抗体。对HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)特异性的抗体可容易地制备为单克隆抗体或多克隆抗血清,或可以使用本领域众所周知的方法生产为被设计成具有所需性能的遗传工程改造的免疫球蛋白(Ig)。例如,通过说明而不是限制,抗体可以包括重组IgG、具有免疫球蛋白衍生序列的嵌合融合蛋白或“人源化的”抗体(参见,例如,美国专利号5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5,530,101),它们都可以用于根据本文公开的方法检测人HE4a多肽。这样的抗体可以根据本文提供的方法制备,包括如下面所述述用HE4a多肽免疫接种。例如,公开了编码HE4a多肽的核酸序列,因此本领域技术人员可以常规地制备这些多肽用作免疫原。例如将在下面更详细地描述的单克隆抗体例如12A2、14E2、2H5和3D8,可用于实践根据在本文公开的方法的某些方法。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段例如F(ab')2和Fab片段、以及作为与HE4a多肽特异性结合的分子的任何天然存在或重组产生的结合配偶体。抗体,如果以大于或等于约104M-1优选地大于或等于约105M-1、更优选地大于或等于约106M-1和更优选地大于或等于约107M-1的Ka与HE4a多肽结合,则被定义为是“免疫特异性的”或特异性地结合。结合配偶体或抗体的亲和力可以使用常规技术容易地确定。其它蛋白作为HE4a多肽的结合配偶体的确定,可以使用许多已知的用于鉴定和获得与所述其它蛋白或多肽特异性相互作用的蛋白的方法中的任一种来进行,例如酵母双杂交筛选系统,如在例如US5,283,173和US5,468,614中描述的系统。本文公开的方法也包括使用HE4a多肽和基于HE4a多肽的氨基酸序列的肽来制备与HE4a多肽特异性结合的结合配偶体和抗体。
抗体一般可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种来制备。在一种这样的技术中,首先将含有HE4a多肽的免疫原(例如在其表面上具有HE4a多肽的细胞或分离的HE4a多肽)注射进适当的动物(例如,小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)中,优选根据预定的计划加入一次或多次增强免疫接种,然后定期从动物取血。然后可以通过例如使用与适当的固体支持物偶联的多肽的亲和色谱法,从这些抗血清中纯化出对HE4a多肽特异性的多克隆抗体。
通过本领域技术人员已知的任意技术,可以制备对HE4a多肽或其变体特异性的单克隆抗体。例如,这些方法可以包括:制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。例如,可以从得自上述免疫动物的脾细胞产生这种细胞系。然后例如通过融合骨髓瘤细胞融合配偶体(例如与所免疫动物同源的配偶体),使脾细胞永生化。例如,可以利用膜融合促进剂(例如聚乙二醇或非离子型去污剂)使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟,然后以低密度铺板在支持杂交细胞、但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。选择技术的一个例子使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择。经过足够时间,通常约1-2周,观察杂合体集落。选择单个集落,测试对该多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。本文公开的方法预见到产生特异性地结合HE4a多肽的单克隆抗体的杂交瘤。
可从生长杂交瘤集落的上清中分离单克隆抗体。另外,可以利用多种技术增加收率,例如将杂交瘤细胞系注射进合适脊椎动物宿主(例如小鼠或其它合适的宿主)的腹腔中。然后从腹水液或血液中收获单克隆抗体。通过常规技术,例如色谱法、凝胶过滤、沉淀或萃取,可以从抗体中去除污染物。例如,使用标准技术,通过固定化的蛋白G或蛋白A的色谱法,可以纯化抗体。
在某些实施方案中,可以使用抗体的抗原结合片段。此类片段包括Fab片段,后者可以使用标准技术(例如通过木瓜蛋白酶消化以产生Fab和Fc片段)制备。使用标准技术,通过亲和色谱法(例如在固定化的蛋白A柱子上),可以分离Fab和Fc片段。此类技术是本领域众所周知的,参见,例如,Weir,D.M.,HandbookofExperimentalImmunology,1986,BlackwellScientific,Boston。
在某些方面,提供了HE4融合蛋白。由于免疫球蛋白V区结构域(其由框架内连接至多种效应蛋白质编码序列的DNA序列编码)而具有预选抗原特异性结合亲和力的多功能融合蛋白是本领域已知的,例如如在EP-B1-0318554、US5,132,405、US5,091,513和US5,476,786中所公开。这种效应蛋白质包括可以用于通过本领域技术人员熟悉的多种技术中的任一种来检测融合蛋白结合的多肽结构域,所述技术包括、但不限于生物素模拟序列、利用可检测的标记部分直接共价修饰、非共价结合到特定标记的报告分子、酶学修饰可检测性底物或固定化(共价或非共价)于固相支持物上。
也可以通过诸如噬菌体展示等方法产生和选择用于本文公开的方法中的单链抗体(参见例如US5,223,409)。简而言之,在此方法中,可以将DNA序列插入丝状噬菌体(例如M13)的基因III或基因VIII基因中。已经开发了用于插入的具有多克隆位点的若干载体(McLafferty,M.A.,Kent,K.A.,Ladner,R.C.&Markland,W.Gene128,29-36(1993);ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science.1990Jul27;249(4967):386–390;SmithGP,ScottJK.Librariesofpeptidesandproteinsdisplayedonfilamentousphage.MethodsEnzymol.1993;217:228–257)。插入的DNA序列可以随机产生,或可以是用于结合HE4a多肽的已知结合结构域的变体。由插入序列编码的肽被展示于噬菌体的表面上。通过结合到固定化的HE4a多肽,例如使用本领域公知方法以及本文公开的核酸编码序列制备的重组多肽,选择表达HE4a多肽的结合结构域的噬菌体。利用通常包含10mMTris、1mMEDTA的不含盐或具有低盐浓度的洗液去除未结合的噬菌体。结合的噬菌体则利用例如含盐缓冲液洗脱。以逐步方式提高NaCl浓度,直至洗脱所有噬菌体。通常,高亲和力结合的噬菌体由高盐浓度释放。在细菌宿主中繁殖洗脱的噬菌体。可以进行其它选择轮回,以选择几种高亲和力结合的噬菌体。然后测定结合噬菌体中插入物的DNA序列。一旦已知结合肽的推断的氨基酸序列,便可以通过重组方法或合成方法制备充足的本文中用作对HE4a多肽特异性的抗体的肽。当将抗体生产成融合蛋白时,使用重组方法。为了使亲和力或结合最大化,也可以将所述肽制备为两种或多种相似或不相似的肽的串联阵列。
在本发明的公开内容中,提供了多种测定形式。为了检测可与HE4a多肽特异性抗体反应的抗原决定簇,检测试剂一般是如本文中所述或通过本领域已知的多种方法中的任一种制备的抗体。本领域普通技术人员已知使用抗体检测样品中的多肽的多种测定形式,包括、但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光测定法、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散及其它技术。参见,例如,Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988;Weir,D.M.,HandbookofExperimentalImmunology,1986,BlackwellScientific,Boston。例如,可以以蛋白质印迹形式进行该测定,其中将来自生物样品的蛋白质制备物进行凝胶电泳,转移到合适的膜并使其与抗体反应。然后如本领域公知及下文所述,可以使用合适的检测试剂检测抗体在膜上的存在。
在另一个实施方案中,所述测定包含使用固定化在固体支持物上的抗体结合目标HE4a多肽,并从样品的剩余物中移出它。然后可以使用可与独特HE4a多肽抗原决定簇反应的第二抗体,例如包含可检测报告部分的试剂,检测所结合的HE4a多肽。根据该实施方案的一个非限制性例子是,固定化的抗体和识别独特抗原决定簇的第二抗体可以是示例性的单克隆抗体2H5和3D8中的两种。可替换地,可以使用竞争性测定,其中HE4a多肽由可检测的报告部分标记,并在将固定化的抗体与样品一起温育之后,使其结合固定化的HE4a多肽特异性的抗体。样品组分的抑制标记的多肽与抗体结合的程度,会指示样品与固定化的抗体的反应性,并从而指示样品中的HE4a水平。
固体支持物可以是本领域普通技术人员已知的可以附着抗体的任何物质,例如微孔滴定板中的试验孔、硝酸纤维素滤膜或另一种合适的膜。可替换地,所述支持物可以是珠子或圆盘,例如玻璃、纤维玻璃、胶乳或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。使用专利和科学文献中详述的、本领域技术人员已知的多种技术,可以将抗体固定化在固体支持物上。
在某些实施方案中,用于检测样品中的HE4a抗原多肽的测定是双抗体夹心测定。该测定可以如下进行:首先使已经固定化在固体支持物(通常是微孔滴定板的孔)上的HE4a多肽特异性抗体(例如单克隆抗体,如2H5、3D8或4H4)接触生物样品,从而使得样品中天然存在的、具有可与抗体反应的抗原决定簇的可溶性分子结合固定化的抗体(例如,在室温温育30分钟一般足够),以形成抗原-抗体复合物或免疫复合物。然后从固定化的免疫复合物中除去样品的未结合组分。接着,加入对HE4a抗原多肽特异性的第二抗体,其中所述第二抗体的抗原结合位点不会竞争性地抑制固定化第一抗体的抗原结合位点与HE4a多肽(例如,与固定化在固体支持物上的单克隆抗体不相同的单克隆抗体,诸如2H5或3D8)的结合。可以如本文中所述可检测地标记第二抗体,以便可以直接检测它。可替换地,通过使用可检测地标记的第二(或”第二级”)抗-抗体,或通过使用本文中提供的特异性检测试剂,可以间接检测第二抗体。本文公开的方法不限于任何特定检测操作,熟悉免疫测定的人员会明白,众多试剂和构型可用于在双抗体夹心免疫测定中免疫学上检测特定抗原。
在使用上面描述的双抗体夹心测定的本文公开的方法的某些实施方案中,第一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的抗体是多克隆抗体,第二种对HE4a抗原多肽特异性的抗体是多克隆抗体。非竞争性的HE4a抗体的任何组合都可以与本文公开的方法一起使用。包括单克隆抗体、多克隆抗体和它们的组合。在本文公开的方法的某些其它实施方案中,第一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的抗体是单克隆抗体,第二种对HE4a抗原多肽特异性的抗体是多克隆抗体。在本文公开的方法的某些其它的实施方案中,第一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的抗体是多克隆抗体,第二种对HE4a抗原多肽特异性的抗体是单克隆抗体。在本文公开的方法的某些其它高度优选的实施方案中,第一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的抗体是单克隆抗体,第二种对HE4a抗原多肽特异性的抗体是单克隆抗体。例如,在这些实施方案中,应当指出,本文提供的单克隆抗体12A2、14E2、2H5和3D8会识别HE4a多肽上的独特的和非竞争性的抗原性决定簇(例如表位),因此这些单克隆抗体的任何成对组合都可以使用。具体地,某些组合可用于检测特定的全长HE4变体或剪接变体。在本文公开的方法的其它实施方案中,第一种固定化的对HE4a抗原多肽特异性的抗体和/或第二种对HE4a抗原多肽特异性的抗体可以是本领域中已知的和本文提到的任何种类的抗体,例如,作为说明而非限制,Fab片段、F(ab')2片段、免疫球蛋白V区融合蛋白或单链抗体。熟悉本领域的人员会明白,本文公开的方法包括在本文中公开和要求保护的方法中使用其它抗体形式、片段、衍生物等。
在某些实施方案中,第二抗体可以含有可检测的报告部分或标记,例如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。任何报告部分或标记可以与本文公开的方法一起使用,只要其信号与清洗后保留在支持物上的抗体的量直接相关或成比例即可。然后使用适合于特定的可检测的报告部分或标记的方法,确定仍然结合在固体支持物上的第二抗体的量。对于放射性基团来说,闪烁计数或放射自显影方法通常是适合的。使用多种偶联技术(作为例子,参见Scouten,W.H.(1987)Asurveyofenzymecouplingtechniques.Methodsin.Enzymology135,30–65),可以制备抗体-酶结合物。光谱方法可用于检测染料(包括,例如,酶反应的比色测量产物)、发光基团和荧光基团。可以使用与不同的报告基团(通常为放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素来检测生物素。一般可以通过加入底物(一般进行特定的时间段),然后对反应产物进行光谱、分光光度计测量或其它分析来检测酶报告基团。使用众所周知的技术,可以使用标准品或标准添加物来确定样品中抗原的水平。
在另一个实施方案中,本文公开的方法预见到使用本文提供的HE4a抗原多肽,通过检测得自生物来源或受试者的生物样品中免疫特异性的反应性抗体来筛选卵巢癌的存在。根据该实施方案,HE4a抗原多肽(或其片段或变体,包括本文提供的截短的HE4a抗原多肽)被可检测地标记,并与生物样品相接触,以检测样品中以可溶形式天然存在的抗体与HE4a抗原多肽的结合。例如,使用本文公开的序列,并配合众所周知的方法,例如在体外翻译过程中掺入易于检测的(例如放射性地标记的)氨基酸,或者通过使用其它可检测的报告部分例如在上面描述的那些,可以生物合成地标记HE4a抗原多肽。本领域技术人员会容易地理解,所述方法的该实施方案预见到,本文公开的某些HE4a多肽例如HE4a融合多肽,可以提供具有特定免疫原性的肽,并因此产生特异性的和可检测的抗体。例如,根据该理论,某些HE4a融合多肽可以代表能够引起强烈的免疫应答的“非自身”抗原,而缺少融合结构域的HE4a多肽可以被免疫系统视为更类似“自身”抗原,其不容易引发体液或细胞介导的免疫。
通过检测在得自受试者的生物样品中的超过一种肿瘤相关的标志物,可以进一步加强根据本文公开的方法筛选恶性病症的存在的方法。因此,公开的方法提供了筛选方法,所述筛选方法除了检测天然存在的组分与对HE4a抗原多肽特异性的抗体的反应性之外,还包括使用本领域中已知的确立方法和公开的那些方法来检测恶性病症的至少一种其它可溶性标志物。如上面所指出的,目前有许多可溶性的肿瘤相关抗原可以在容易获得的生物流体样品中检测到。
用于鉴别具有增加的罹患卵巢癌的可能性的患者的示例性筛选方法通常包括:检测患者身体样品中的多个生物标志物的表达,所述生物标志物在卵巢癌中选择性地过表达。所述生物标志物的过表达会指示所述患者具有卵巢癌的可能性增加。本公开内容的方法可以包括,例如,“两步”分析,其中进行第一个测定步骤以检测第一种生物标志物(例如,HE4/HE4a)或生物标志物集合的表达。如果第一种生物标志物或生物标志物集合被过表达,进行第二个测定步骤以检测第二种生物标志物或生物标志物集合的表达。第一种和第二种生物标志物或生物标志物集合的过表达会指示所述患者具有卵巢癌的可能性增加。
可替换地,使用标准的杂交和/或聚合酶链式反应(PCR)技术,可以检测编码HE4a多肽的核酸序列。本领域普通技术人员基于本文提供的HE4acDNA序列,可以设计适合的探针和引物。通常可以使用从生物来源获得的多种样品中的任一种来进行测定,所述生物来源例如真核细胞、细菌、病毒、从这类生物体制备的提取物以及在活生物体内发现的流体。
在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的。
从本文中公开的HE4a多肽的物理化学及免疫化学特性,并使用本文公开的编码HE4a的核酸序列,本领域普通技术人员按照公知方法也可以制备重组HE4a多肽,后者可用于产生及表征特异性抗体。可以在合适启动子控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达HE4a多肽。也可以使用来源于本文公开的HE4a多肽DNA编码区的RNA,利用无细胞翻译系统产生这类蛋白质。以前已经描述了与原核和真核宿主一起使用的合适克隆及表达载体,且是本领域技术人员众所周知的。在本发明优选实施方案中,在哺乳动物细胞中表达HE4a多肽。
本发明因而提供了编码HE4a抗原多肽的分离的核酸分子、或能够与这类HE4a多肽编码核酸杂交的核酸分子、或具有与其互补的序列的核酸分子。
变体优选地表现出与编码天然HE4a抗原多肽或其部分的多核苷酸序列的至少约70%同一性、更优选至少约80%至85%同一性、且最优选至少约90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。使用本领域普通技术人员众所周知的计算机算法,例如Align或theBLAST算法(AltschulS.F.(1991)Aminoacidsubstitutionmatricesfromaninformationtheoreticperspective.JournalofMolecularBiology219:555-565;HenikoffS,HenikoffJG.Aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks.ProcNatlAcadSciUSA.1992Nov15;89(22):10915-9,其可在NCBI网站(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)得到)进行序列对比,可以容易地测定同一性百分比。
某些变体与天然基因基本上同源。这类多核苷酸变体能够在中等严谨条件下与天然存在的编码天然HE4a抗原的DNA或RNA序列(或其互补序列)杂交。合适的中等严谨条件包括例如以下步骤或其等效步骤:在5×SSC、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中预洗涤;在50℃至65℃、5×SSC中杂交过夜;然后每次在包含0.1%SDS的2×、0.5×和0.2×SSC中在65℃洗涤两次各20分钟。另外的严谨性条件可以包括,例如,在0.1×SSC和0.1%SDS中在60℃洗涤15分钟,或等效条件。本领域普通技术人员容易理解,可以按常规方式改变参数,以产生按某种方式选择特定目标核酸的适当严谨性杂交条件,并且应当进一步理解,这样的条件可以随杂交中涉及的特定核酸序列而变化。
编码HE4a多肽或根据本发明所用的任何其它HE4a多肽的核酸可以包括、但不限于:仅仅HE4a多肽的编码序列;HE4a多肽的编码序列及另外的编码序列;HE4a多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)及非编码序列,诸如HE4a多肽的编码序列的内含子或5′和/或3′非编码序列,例如可以另外包括但不必限于一种或多种调节性核酸序列,其可以是受调节的或可调节的启动子、增强子、其它转录调节序列、抑制子结合序列、翻译调节序列或任何其它调节性核酸序列。因而,术语“编码HE4a多肽的核酸”涵盖只包括该多肽的编码序列的核酸以及包括另外的编码和/或非编码序列的核酸。
本发明另外涉及本文所述的核酸的变体,其编码HE4a多肽的片段、类似物和衍生物,例如具有SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13或15(HE4)任一个的推断的氨基酸序列的人HE4a多肽。编码HE4a的核酸的变体可以是所述核酸的天然存在的等位基因变体或剪接变体或非天然存在的变体。如本领域已知的,等位基因变体是可以具有一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加(其中任何一种不会实质上改变所编码的HE4a多肽的功能)中的至少一种的另一种核酸序列形式。通过编码HE4a多肽的核酸序列的突变,可以获得HE4a的变体和衍生物。通过多种常规方法中的任一种,可以完成天然氨基酸序列的改变。通过合成包含突变序列的寡核苷酸,其侧接限制性位点以便连接至天然序列的片段,可以在特定位点引入处突变。连接后,得到的重构序列编码具有所需氨基酸插入、置换或缺失的类似物。
可替换地,如本领域技术人员众所周知的,可以利用寡核苷酸指导的位点特异性的诱变操作来提供改变的基因,其中可以通过置换、缺失或插入来改变预定的密码子。
本发明也包括等效DNA构建体,其编码氨基酸残基或序列的各种添加或置换、或生物学活性非必需的末端或内部残基或序列的缺失。例如,可以改变编码生物学活性非必需的Cys残基的序列,使Cys残基缺失或置换为其它氨基酸,从而防止复性后形成错误的分子内二硫键。通过修饰邻近的二碱性氨基酸残基,可以制备其它等效物,以增强在具有KEX2蛋白酶活性的酵母系统中的表达。作为例子,EP212,914公开了使用位点特异性突变来失活蛋白质中的KEX2蛋白酶加工位点。通过缺失、添加或置换残基来改变Arg-Arg、Arg-Lys和Lys-Arg对,去除存在的这些邻近碱性残基,可以灭活KEX2蛋白酶加工位点。据认为Lys-Lys配对对于KEX2切割相当不敏感,将Arg-Lys或Lys-Arg转变为Lys-Lys是灭活KEX2位点的保守而又优选的方法。
利用多种方法可将合适的DNA序列插入多种公知的适于所选宿主细胞的载体中的任一种中。一般而言,利用本领域已知的方法,将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化的标准技术,涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应,以及各种分离技术,是本领域技术人员已知并常用的技术。
哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系(如GluzmanY.SV40-transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants.Cell.1981Jan;23(1):175-82所述)以及能够表达相容性载体的其它细胞系,例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。源自例如SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录性遗传元件。通过本领域技术人员熟悉的多种方法,包括、但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis,L.G.,Dibner,M.D.andBattey,J.F.:BasicMethodsin.MolecularBiology.Elsevier,NewYork,1986),可以将构建体引入宿主细胞中。
本发明的HE4a多肽可以是未修饰多肽,或可以是经翻译后修饰的多肽,例如通过糖基化、磷酸化、脂肪酰化(包括糖基磷脂酰肌醇锚定修饰等)、磷脂酶切割(例如磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶c介导的水解等)、蛋白酶切割、去磷酸化或任何其它类型的蛋白质翻译后修饰,例如涉及共价化学键形成或断裂的修饰。
提及HE4a多肽、HE4a抗原多肽或HE4a融合蛋白时,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本保持与该多肽相同的生物学功能和/或活性的任何HE4a多肽。因此,类似物可以包括HE4a抗原多肽同工型,例如不同翻译后修饰的HE4a多肽或变体,如剪接变体。如本领域公知,“剪接变体”包括来自于RNA转录本不同细胞内加工的变体或其它形式的多肽。例如,如果两种不同的mRNA种类的差别仅在于,其中一种mRNA包含特定外显子对应的全部或部分序列,而其它种类没有,则其互为剪接变体。熟悉本领域的人员应当理解,在一般认为是剪接变体的mRNA种类之间可以存在其它结构关系。HE4a多肽另外包括蛋白原,可通过切割蛋白原部分而活化,产生活性HE4a多肽。
HE4a多肽或HE4a抗原多肽的片段、衍生物或类似物的生物学功能和/或活性包括但不必限于该多肽在本文公开的筛选受试者中存在恶性病症的方法中作为标志的用途。例如,通过检测受试者样品中以可溶性形式天然存在并具有与至少一种HE4a多肽特异性的抗体反应的抗原决定簇的分子,本领域技术人员可以监测HE4a多肽的生物学功能和/或活性。另外应当注意到,在某些实施方案中,本发明筛选方法涉及比较(i)疑似具有恶性病症的第一位受试者的第一份生物样品以及(ii)已知没有恶性病症的另一位受试者的另一份生物样品中以可溶性形式天然存在并具有与至少一种HE4a多肽特异性的抗体反应的抗原决定簇的可检测分子的相对数量、水平和/或数量。因此,在生物样品中存在相对数量的HE4a可以是HE4a多肽的生物学功能和/或活性,尽管这种生物学功能和/或活性不应当如此局限。
HE4a多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基由保守性或非保守性氨基酸残基置换(优选保守性氨基酸残基);(ii)其中另外的氨基酸与HE4a多肽融合,包括可以用于纯化HE4a多肽或蛋白原序列的另外氨基酸;或(iii)截短的HE4a多肽。相信这类片段、衍生物和类似物是在本领域技术人员根据本文中教导的范围之内。
截短的HE4a多肽可以是包含短于全长形式HE4a多肽的HE4a多肽分子。本发明提供的截短的分子可以包括截短的生物多聚物,在本发明优选实施方案中,所述截短的分子可以是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的核酸分子短于已知或所述核酸分子的全长核苷酸序列,其中该已知或所述核酸分子可以是天然存在、合成或重组的核酸分子,只要本领域技术人员认为它是全长分子即可。因此,例如对应于基因序列的截短的核酸分子包含短于全长的基因,其中该全长基因包含编码和非编码序列、启动子、增强子和其它调节序列、侧翼序列等、以及被认为是基因部分的其它功能性和非功能性序列。在另一例子中,对应于mRNA序列的截短的核酸分子包含短于全长的mRNA转录本(其可以包括各种翻译和非翻译区以及其它功能性和非功能性序列)。在其它优选实施方案中,截短的分子是包含短于特定蛋白质全长氨基酸序列的多肽。
本文中所用的“缺失”具有熟悉本领域人员所理解的常用含义,可以是指相对于对应的全长分子而言、缺少来自末端或非末端区的一个或多个序列部分的分子,例如本文中提供的截短的分子。作为线性生物多聚物例如核酸分子或多肽的截短的分子可以具有来自分子末端或非末端区的一个或多个缺失,这种缺失可以是缺失1-1500个连续核苷酸或氨基酸残基、优选1-500个连续核苷酸或氨基酸残基、更优选1-300个连续核苷酸或氨基酸残基。
如本领域已知,通过将该多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸置换与另一种多肽的序列作比较,来确定两种多肽之间的“相似性”。通过使用本领域普通技术人员公知的计算机算法(例如BLAST算法)进行序列比较,可容易地确定两种多肽或核酸序列之间的相似性、或甚而同一性百分比。其它有用的计算机算法的例子是在例如Align和FASTA等程序中使用的那些算法,所述Align和FASTA可以在例如InstitutdeGenetiqueHumaine,Montpellier,France的Genestream因特网网站(www2.igh.cnrs.fr/home.eng.html)获得。本发明多肽的片段或部分可以用于通过肽合成而产生相应的全长多肽;因此,片段可以用作产生全长多肽的中间体。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如,如果其是天然存在的,则指自然环境)中取出该物质。例如,存在于活动物中的天然存在的多肽或多核苷酸不是分离的,与自然系统中某些或全部共存物质分开的相同的多肽或多核苷酸则是分离的。这种多肽或多核苷酸可以是组合物的一部分,由于该组合物不是其自然环境的一部分,因而仍是分离的。
在分离供本发明方法使用的HE4a多肽的背景下,亲和技术是特别有用的,并可以包括利用与HE4a多肽特异性结合相互作用而进行分离的任何方法。例如,由于HE4a多肽可以包含共价结合的寡糖部分,亲和技术(例如在可使凝集素结合碳水化合物的条件下使HE4a多肽结合合适的固定化凝集素)可以是特别有用的亲和技术。其它有用的亲和技术包括用于分离HE4a多肽的免疫学技术,该技术依赖于抗原的抗体结合位点与复合物中存在的抗原决定簇之间的特异性结合相互作用。免疫学技术包括但不必限于免疫亲和色谱法、免疫沉淀、固相免疫吸附或其它免疫亲和方法。
如本文所述,本发明提供了包含与HE4a融合的多肽的融合蛋白。这种HE4a融合蛋白由具有在框架内融合另外编码序列的HE4a编码序列的核酸编码,以提供与另外功能性或非功能性多肽序列融合的HE4a多肽序列的表达,例如通过说明而不是限制,可以检测、分离和/或纯化HE4a融合蛋白。这种HE4a融合蛋白使得可以通过基于蛋白质-蛋白质亲和力、金属亲和力或电荷亲和力的多肽纯化、或通过特异性蛋白酶切割包含融合序列(可由蛋白酶切割的、以便从融合蛋白中分离HE4a多肽)的融合蛋白,从而检测、分离和/或纯化HE4a融合蛋白。
因而,HE4a融合蛋白可以包含亲和标签多肽序列,即添加给HE4a的多肽或肽,以便利通过与配体的特异性亲和相互作用来检测和分离HE4a。配体可以是亲和标签可以通过本文中提供的特异性结合相互作用与其相互作用的任何分子、受体、反受体(counterrecepter)、抗体等。这种肽包括例如聚-His或在下述文献中描述的抗原性鉴定肽:US5,011,912和T.P.Hopp,B.GallisandK.S.Prickett(1988)Ashortpolypeptidemarkersequenceusefulinproteinidentificationandpurification.Bio/Technology6:1204–1210,或XPRESSTM附加表位(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。在细菌宿主的情况下,所述亲和序列可以是六组氨酸标签(例如由pBAD/His(Invitrogen)或pQE-9载体供给),以提供与该标志物融合的成熟多肽的纯化,或者,例如,当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时,所述亲和序列可以是血凝素(HA)标签。HA标签对应于源自流感血凝素蛋白质的抗体确定的表位(WilsonIA,NimanHL,HoughtenRA,CherensonAR,ConnollyML,LernerRA.Thestructureofanantigenicdeterminantinaprotein.Cell.1984年7月;37(3):767-78)。
在特别实施方案中并如下文详述,HE4a融合蛋白可以另外包含添加给HE4a的免疫球蛋白恒定区多肽,以便利检测、分离和/或定位HE4a。所述免疫球蛋白恒定区多肽优选与HE4a多肽的C端融合。根据非限制性理论,在本文中提供的HE4a融合蛋白中包含免疫球蛋白(Ig)恒定区结构域,可以提供优点,例如,当用于特定宿主中时与特定Ig区的免疫原性/非免疫原性特性有关的优点(即“自身”相对于“非自身”),或便利融合蛋白的分离和/或检测的优点。熟悉本领域的人员会理解Ig融合蛋白的这些和其它优点。已经在下述文献中描述了融合蛋白的一般制备,所述融合蛋白包含与抗体衍生的多肽的不同部分(包括Fc结构域)融合的异源多肽:例如,AshkenaziA,MarstersSA,CaponDJ,ChamowSM,FigariIS,PennicaD,GoeddelDV,PalladinoMA,SmithDH.Protectionagainstendotoxicshockbyatumornecrosisfactorreceptorimmunoadhesin.ProcNatlAcadSciUSA.1991Dec1;88(23):10535-9和Byrn等人(ByrnRA,MordentiJ,LucasC,SmithD,MarstersSA,JohnsonJS,CossumP,ChamowSM,WurmFM,GregoryT,等人.BiologicalpropertiesofaCD4immunoadhesin.Nature.1990Apr12;344(6267):667-70。将编码HE4a:Fc融合蛋白的基因融合物插入合适的表达载体。在本发明的某些实施方案中,可使HE4a:Fc融合蛋白组装成更象抗体分子,由此在Fc多肽之间形成链间二硫键,产生二聚体HE4a融合蛋白。
由于包含免疫球蛋白V区结构域(由框架内连接至HE4a编码序列的DNA序列编码)的融合多肽而对预选抗原具有特异性结合亲和力的HE4a融合蛋白也在本发明范围内,包括本文中提供的其变体和片段。在例如EP0318554、US5,132,405、US5,091,513和US5,476,786中公开了用于构建具有免疫球蛋白V区融合多肽的融合蛋白的一般策略。
本发明的核酸也可以编码融合蛋白,所述融合蛋白包含与具有所需亲和特性的其它多肽(例如诸如谷胱甘肽-S-转移酶等酶)融合的HE4a多肽。作为另一个例子,HE4a融合蛋白也可以包含与金黄色葡萄球菌蛋白A多肽融合的HE4a多肽;在例如US5,100,788中一般地公开了蛋白A的编码核酸及其在构建具有免疫球蛋白恒定区亲和力的融合蛋白中的用途。用于构建HE4a融合蛋白的其它有用的亲和多肽可以包括抗生蛋白链菌素融合蛋白(如在例如WO89/03422、US5,489,528、US5,672,691、WO93/24631、US5,168,049、US5,272,254和别处所公开)和抗生物素蛋白融合蛋白(参见,例如,EP511,747)。如本文中及引用的参考文献所提供,HE4a多肽序列可以与融合多肽序列融合,所述融合多肽可以是全长的融合多肽,且可以可替换地是其变体或片段。
本发明也预见到含有多肽序列的HE4a融合蛋白,所述多肽序列指引融合蛋白到达细胞核、位于内质网(endoplasmicreticulum,ER)腔、通过经典的ER-高尔基体分泌途径从细胞分泌(参见,例如,vonHeijne,G.(1990)TheSignalPeptide.J.Membr.Biol.115,195-201)、掺入质膜、结合特定细胞质组分(包括跨膜细胞表面受体的细胞质结构域)、或通过本领域技术人员熟悉的多种已知细胞内蛋白质分选机制中的任一种导向到特定的亚细胞部位(参见例如,RothmanJE.Mechanismsofintracellularproteintransport.Nature.1994年11月3日;372(6501):55-63.,AdvaniRJ,BaeHR,BockJB,ChaoDS,DoungYC,PrekerisR,YooJS,SchellerRH.SevennovelmammalianSNAREproteinslocalizetodistinctmembranecompartments.JBiolChem.1998)。因此,用于将目的多肽靶向预定的细胞内、膜或细胞外定位的本发明的组合物及方法包括这些及相关实施方案。
本发明也涉及包括本发明核酸的载体和构建体,特别涉及包括上文提供的编码本发明HE4a多肽的任何核酸的“重组表达构建体”;涉及利用本发明载体和/或构建体遗传工程改造的宿主细胞,并涉及利用重组技术产生本发明的HE4a多肽和融合蛋白、或其片段或变体。HE4a蛋白可以在合适启动子控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。也可以使用源自本发明DNA构建体的RNA,利用无细胞翻译系统产生这类蛋白质。通常,重组表达载体应包括复制起点以及允许转化宿主细胞的选择标记,例如大肠杆菌(E.coli)的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因,以及源自高表达基因的启动子,以指导下游结构序列的转录。这样的启动子可源自编码糖酵解酶例如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热激蛋白等的操纵子。在适当的阶段,将异源结构序列与翻译起始和终止序列一起组装。任选地,异源序列可编码包括N端鉴定肽的融合蛋白,所述N端鉴定肽可带来所需特征,例如所表达的重组产物的稳定或简化的纯化。
通过在表达载体中插入编码所需蛋白质的结构DNA序列连同位于功能性启动子有效阅读相位的合适的翻译起始和终止信号,构建供细菌使用的有用表达构建体。所述构建体可以包含一种或多种表型选择标记及复制起点,以确保在宿主内维持该载体构建体,如若需要则提供扩增。供转化的合适原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各个种,尽管也可以利用其它宿主以供选择。可以使用任意其它质粒或载体,只要它们可在宿主中复制并存活。
作为代表性的但非限制性的例子,供细菌使用的有用表达载体可以包含选择标记以及细菌复制起点,后者源自包含众所周知的克隆载体pBR322的遗传元件的商购可得的质粒(ATCC37017)。这种商品化载体包括例如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(PromegaBiotec,Madison,Wis.,USA)。这些pBR322“主链”部分与合适的启动子以及待表达的结构性序列相连。
转化合适的宿主株并培养宿主株至适当细胞密度以后,所选启动子如果是本文中提供的调节型启动子,则利用适当方法诱导(例如变温或化学诱导),并再培养细胞一段时间。一般通过离心收集细胞,利用物理或化学方法破坏,保留所得粗提物供进一步纯化。通过任何常规方法,包括冻融循环、声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂,可以破坏用于蛋白质表达的微生物细胞;这样的方法为本领域技术人员所公知。
因而,例如,本文中提供的本发明核酸可以被包括于多种表达载体构建体的任一种中,用作表达HE4a多肽的重组表达构建体。这类载体及构建体包括染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列,例如SV40的衍生物;细菌质粒;噬菌体DNA;杆状病毒;酵母质粒;来源于质粒和噬菌体DNA、病毒DNA的组合的载体,例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病。然而,任何其它载体,只要可在宿主中复制并存活,均可以用来制备重组表达构建体。
可以通过多种方法将合适的DNA序列插入载体中。一般而言,利用本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点中。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化的标准技术,涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应,以及各种分离技术,是本领域技术人员已知并常用的技术。可以利用许多已知的标准技术中的任意一种或多种。
表达载体中的DNA序列可操作地连接到至少一个合适的表达控制序列(例如启动子或调节型启动子),以指导mRNA合成。这种表达控制序列的代表性例子包括LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子和以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中的基因的表达的其它启动子。使用CAT(氯霉素转移酶)载体或带有选择标记的其它载体,可以从任何所需基因中选择启动子区域。两种合适的载体为pKK232-8和pCM7。特别提及的细菌启动子包括lac、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒LTR和小鼠金属硫蛋白-I。合适的载体和启动子的选择属于本领域的普通技能水平内,本文中描述了某些特别优选的重组表达构建体的制备,所述构建体包含至少一个可操作地连接至编码HE4a多肽的核酸的启动子或调节型启动子。
如上面所指出的,在某些实施方案中,所述载体可以是病毒载体,例如逆转录病毒载体。例如,可以从其中得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括、但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。
病毒载体包括一种或多种启动子。可以利用的合适启动子包括、但不限于逆转录病毒LTR;SV40启动子;以及在Miller,等人,Biotechniques7:980-990(1989)所述的人巨细胞病毒(CMV)启动子,或任何其它启动子(例如,细胞启动子诸如真核细胞启动子,包括、但不限于组蛋白、polIII和β-肌动蛋白启动子)。可以使用的其它病毒启动子包括、但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。本领域技术人员从本文中含有的教导显而易见合适启动子的选择,并可以从调节型启动子或上述启动子中选择。
利用逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系,以形成生产细胞系。可以转染的包装细胞的例子包括、但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和在Miller,HumanGeneTherapy,1:5-14(1990)(其通过引用整体并入本文)中所述的DAN细胞系。通过本领域已知的任何方法,载体可以转导包装细胞。所述方法包括、但不限于电穿孔、使用脂质体以及磷酸钙沉淀。在一个替代方案中,可以将逆转录病毒质粒载体包囊进脂质体中、或与脂质偶联,然后施用给宿主。生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒,其包括编码HE4a多肽或融合蛋白的核酸序列。然后可以利用这种逆转录病毒载体颗粒在体外或在体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码HE4a多肽或融合蛋白的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括、但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、支气管上皮细胞和各种其它适于培养的细胞系。
作为本发明的一个实施方案(其中使用病毒载体制备重组HE4a表达构建体)的另一个例子,在一个优选实施方案中,被指导HE4a多肽或融合蛋白表达的重组病毒构建体转导的宿主细胞,可以产生包含所表达的HE4a多肽或融合蛋白的病毒颗粒,所述HE4a多肽或融合蛋白源自病毒出芽期间被病毒颗粒整合的宿主细胞膜部分。在另一个优选实施方案中,将编码HE4a的核酸序列克隆进杆状病毒穿梭载体中,所述载体然后与杆状病毒重组,以产生用于感染例如Sf9宿主细胞的重组杆状病毒表达构建体,如在下述文献中所述:BaculovirusExpressionProtocols,MethodsinMolecularBiology第39卷,C.D.Richardson,Editor,HumanPress,Totowa,N.J.,1995;Piwnica-Worms,“ExpressionofProteinsinInsectCellsUsingBaculoviralVectors,”第16章第II部分,见:ShortProtocolsinMolecularBiology,第2版,Ausubel等人编,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,1992,第16-32页至1648页。
在另一个方面,本发明涉及包含上述重组HE4a表达构建体的宿主细胞。利用本发明的载体和/或表达构建体(其可以是例如克隆载体、穿梭载体或表达构建体)遗传工程改造(转导、转化或转染)宿主细胞。所述载体或构建体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可以在已改变为适于活化启动子、选择转化体或扩增特定基因(例如编码HE4a多肽或HE4a融合蛋白的基因)的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。选择用来表达的特定宿主细胞的培养条件例如温度、pH等,对于普通技术人员而言显而易见。
宿主细胞可以是高等真核细胞例如哺乳动物细胞、或低等真核细胞例如酵母细胞,或宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞。本发明合适的宿主细胞的代表性例子包括但不必限于细菌细胞,例如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门菌;真菌细胞,例如酵母;昆虫细胞,例如果蝇S2(DrosophilaS2)和灰翅夜蛾属Sj9;动物细胞,例如CHO、COS或293细胞;腺病毒;植物细胞,或已经适于体外增殖或为此重新建立的任何合适细胞。相信合适宿主的选择属于本领域技术人员根据本文中教导的范围之内。
也可以利用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。本发明因而部分涉及生产重组HE4a多肽的方法,所述方法包括:培养包含重组表达构建体的宿主细胞,所述构建体包含至少一个可操作地连接至编码HE4a的核酸序列的启动子。在某些实施方案中,所述启动子可以是本文中提供的调节型启动子,例如四环素可阻抑型启动子。在某些实施方案中,所述重组表达构建体是本文中提供的重组病毒表达构建体。哺乳动物表达系统的例子包括GluzmanY.SV40-transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants.Cell.1981Jan;23(1):175-82所述的猴肾成纤维细胞的COS-7系,以及能够表达相容性载体的其它细胞系,例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列,例如本文中关于制备MRA表达构建体所述。源自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录性遗传元件。通过本领域技术人员熟悉的多种方法,包括、但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis,L.G.,Dibner,M.D.andBattey,J.F.:BasicMethodsin.MolecularBiology.Elsevier,NewYork,1986),可以将构建体引入宿主细胞中。
所表达的重组HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或从其衍生的融合蛋白可以以下述形式用作免疫原:完整宿主细胞;完整细胞器例如细胞膜、细胞内囊泡或其它细胞器;或破裂的细胞制备物,包括、但不限于细胞匀浆物或裂解物、单层和多层膜囊泡或其它制备物。可替换地,通过诸如以下方法,包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法(包括免疫亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法),可以从重组细胞培养物中回收并纯化所表达的重组抗原多肽或融合蛋白。在完成成熟蛋白质的构型中,必要时可以使用蛋白质重折叠步骤。最后,可以利用高效液相色谱法(HPLC)进行最后的纯化步骤。所表达的重组HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或融合蛋白也可以在本领域普通技术人员可容易地进行的用于常规抗体筛选的许多测定构型的任一种中用作靶抗原。
作为产生用于本发明方法中的特异性抗体的免疫原,HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)可以因而是天然地纯化的产物、或化学合成操作的产物、或利用重组技术从原核或优选真核宿主产生。如本领域已知及本文中所提供,根据用于重组生产操作的宿主,本发明的多肽可以经糖基化或翻译后修饰。
现在参考下述实施例来描述本公开内容的主题。提供这些实施例仅仅用于说明的目的,且所述主题不限于这些实施例,而是包括作为本文提供的教导的结果而显见的所有变体。
实施例
在本文所述的实验之前,没有使用免疫细胞化学(IHC)测定形式来最佳地测量得自受试者的样品中的HE4a的N-WFDC结构域的公开方案。本发明的公开内容的方面和实施方案源自下述意外发现:当并行地或联合地用于评估全长HE4/HE4a的存在时,12A2和14E2单克隆抗体具有惊人的且意外的实用性和效力。
在本文所述的实验中,发现几个因素会实现意外的提高的/增强的效力。例如,发现,通过在某些组合中与2H5/3D8一起使用12A2/14E2抗体,可以得到更特异性的全长HE4识别和结合特性。另外,还发现,在分析试验卵巢癌样品(包括全长HE4样品)中的HE4的过程中,在一个示例性的诊断测定(包括IHC)中,联合使用12A2或14E2抗体与2H5或3D8,得到的对应临床数据和/或疾病关联表现出意外的降低的背景,和/或令人惊讶地提高了评估HE4特性的分辨率。
作为例子,开发了在HE4单克隆Ab的生产中用于免疫接种的重组HE4融合蛋白。
实施例1
重组全长HE4ahIg/mIg、HE4a-V4HIg/mIg和HE4a-V2-hIg/mIg融合蛋白的生产:从高通量HE4acDNA克隆扩增HE4a(WFDC2)cDNA用于构建融合构建体。
将HE4a(WDFC2)基因与编码IgG的基因相组合以构建融合蛋白,用于免疫小鼠和得到单克隆抗体(MAb)。用具有小鼠Ig尾巴的融合蛋白免疫小鼠,并针对具有人Ig尾巴的融合蛋白筛选杂交瘤。随后,开发了双重决定簇(夹心)ELISA。
HE4a的mRNA序列最初由Kirchoff等人(15,22)公开,并保藏在GenBank(登记号X63187),该序列提供了用于克隆编码HE4a的cDNA的寡核苷酸引物设计的基础。为了克隆HE4acDNA,使用TRIzol(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD),根据生产商的说明书,从卵巢肿瘤、正常附睾和从几个卵巢肿瘤细胞系(包括4007和OVCAR3(24))制备RNA。使用1–3μgRNA、随机六聚体和SuperscriptII逆转录酶(LifeTechnologies,Inc.),根据生产商的说明书,制备cDNA。使用标准条件,从随机引发的cDNA来PCR扩增HE4acDNA。得到了具有全长HE4a的预期大小的PCR产物,然后克隆。序列分析鉴别出相对于Kirchoff等人的序列的差异,并使用HE4a的校正序列(保藏在GenBank(登记号AY212888))来构建融合蛋白。将含有全长HE4a基因的验证过序列的cDNA片段克隆进pSPORT中,并将该质粒DNA用作PCR模板,用于构建融合克隆。
构建了包含与人或小鼠IgGFc结构域融合的完整HE4a基因产物的融合蛋白。将引物设计为编码用于克隆的合适限制位点,并产生最终构建体所需的蛋白质结构域的框架内融合体。5’引物(SEQIDNO:25′-GTTGTTAAGCTTGCCGCCATGCCTGCTTGTCGCCTAGGC-3’)包括HindIII位点、提高相邻第一个ATG表达的Kozak序列以及基于HE4a序列的HE4a前导肽的一部分。3’引物(SEQIDNO:45′-GTTGTTGGATCCGAAATTGGGAGTGACACAGGACAC-3′)包括用于融合至人/小鼠-Ig尾巴cDNA的框架内BamHI位点,HE4a编码序列的3’末端恰好在终止密码子前截短。使用100ngHE4a/pSPORT质粒作为模板和30个扩增循环(在94℃保持1min、在55℃保持1min和在72℃保持30s),根据生产商的说明书(ExTaq;TakaraBio,Inc.,Otsu,Shiga,日本),进行PCR扩增反应。得到具有全长HE4a的预期大小(400bp)的PCR产物,然后使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进行纯化。将纯化的PCR片段进行限制酶切消化,使用QIAExII凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化,并与小鼠IgG2aFc(mIgG2a)和人IgG1Fc(hIgG1)一起融合地连接进哺乳动物表达载体pD18(如前所述的pCDNA3的衍生物)中。图1示意地显示了如何将FLHE4a-mIgG2a和FLHE4a-hIgG1cDNA构建体作为HindIII-XbaI片段插入pD18的多克隆位点中。
将连接产物转化进DH5α细菌细胞中,并针对FLHE4a-mIgG2a和FLHE4a-hIgG1融合基因插入物的存在来筛选转化体,并通过序列分析进行验证。另外,通过描述的DEAE-葡聚糖技术,使用得自这些分离物的质粒DNA瞬时转染COS7细胞,从而证实了蛋白表达。在72h后收获培养物上清液,并通过使用蛋白琼脂糖(Repligen,Cambridge,MA)的免疫沉淀、还原SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法进行筛选。使用1:5000的山羊抗人IgG辣根过氧化物酶结合物(Caltag,Burlingame,CA)探测蛋白质印迹,随后进行增强的化学发光显影(Amersham,LittleChalfont,英国)。使用具有与人IgG1Fc尾巴融合的经过序列验证的HE4a基因的质粒DNA(pD18-HE4a-hIgG质粒)作为模板,用于扩增和克隆在Bingle等人的出版物(BingleL.,SingletonV.,BingleC.D.TheputativeovariantumourmarkergeneHE4(WFDC2),isexpressedinnormaltissuesandundergoescomplexalternativesplicingtoyieldmultipleproteinisoforms.Oncogene,21:2768-2773,2002)中描述的HE4a剪接变体HE4a-V4和HE4a-V2。如上面关于全长HE4a所述,将HE4a-V4和HE4a-V2剪接变体与小鼠和人IgGFc融合地克隆。在下面列出了用于扩增的核苷酸引物。
对于HE4a-V4:
正向引物SEQIDNO:21:5′-GTTGTTACCGGTGCAGCAGAGAAGACTGGCGTGTGCCCC-3′
反向引物SEQIDNO:23:5′-AATCTCCCAGAGCCTCCGTGTCTTTAGGTGCCAGTGGAACAGTGCATTGGGCAGAGAGCA-3′
对于HE4a-V2:
正向引物SEQIDNO:255′-GTTGTTACCGGTGCAAAGGAGGGTTCCTGCCCCCAG-3′
反向引物:SEQIDNO:275′-GTTGTTGGATCCGAAATTGGGAGTGACACAGGA-3′
HE4aIg融合蛋白的生产
建立了全长HE4a-mIgG2a和HE4a-hIgG1cDNA构建体和对应的含有HE4a-V4和HE4a-V2剪接变体的构建体的稳定细胞系。使用CHO-DG44细胞构建表达高水平目标融合蛋白的稳定系。如下产生稳定的CHO系:进行质粒构建体的高拷贝电穿孔,并通过在含有重组胰岛素(LifeTechnologies,Inc.)、丙酮酸钠(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)、L-谷氨酰胺(InvitrogenCorp.)、2X非必需氨基酸(InvitrogenCorp.)和100nM甲氨蝶呤(Sigma,St.Louis,MO)的Excell302CHO培养基(JRHBiosciences,Denver,PA)中进行有限稀释来选择甲氨蝶呤抗性的克隆。然后利用IgG夹心ELISA,测定抗性克隆的培养物上清液,以筛选高产系。从大规模培养物中收获用过的上清液,通过蛋白A亲和色谱法纯化IgG融合蛋白,此后通过蛋白质印迹法来检测融合蛋白(数据未显示)。HE4a-hIgG1融合蛋白在还原凝胶或蛋白质印迹上迁移至Mw48,000的表观分子量,大于基于预测的氨基酸序列所预见到的Mr36,000,这提示,所述分子被糖基化。使用稳定的转染子来生产足够免疫接种BALB/c小鼠的蛋白。
作为例子,开发了对HE4aN-WFDC结构域特异性的杂交瘤和单克隆抗体。
实施例2
对HE4aN-WFDC结构域特异性的杂交瘤和单克隆抗体的建立
每2周用HE4a-V4mIgG免疫BALB/c小鼠,共5次,并用FLHE4a免疫第六次。在最后一次免疫接种后3天,处死小鼠,并如前面关于间皮素所述制备杂交瘤。在HE4a-V4hIgG上筛选杂交瘤上清液,并基于它们与HE4a-V4hIgG的反应性而选择杂交瘤12A2和14E2。根据标准规程,将杂交瘤克隆2次,并使用选择的克隆来生产HE4aN-WFDCMAb。如下生产单克隆抗体:通过在滚瓶内的DMEM、5%胎牛血清中接种104个细胞/mL并允许生长10-14天,在体外培养杂交瘤克隆。然后通过蛋白A亲和色谱法,根据生产商的推荐,从培养基中纯化单克隆抗体。
实施例3.mAb对ME4aN-WFDC结构域的结合特异性的表征
3.1与hIgGHE4a融合蛋白的反应性
然后在ELISA中试验了12A2和14E2MAb对FLHE4a、HE4a-V4和HE4a-V2hIgG融合蛋白的特异性。通过在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(C-3041;Sigma)中温育MAb(10μg/mL),将12A2和14E2MAb包被在微孔滴定板的孔中。除去上清液以后,用200μl/孔的GSC封闭缓冲液(GeneticSystems,Seattle)在室温封闭孔2小时。此后用含有0.1%吐温的PBS进行4次200μl/孔的洗涤。
然后与100μl/孔的FLHE4a、HE4a-V4和HE4aV2一起温育MAb包被的孔2h。然后通过与HRP结合的抗-hIgG1一起温育并测定OD450nm,检测结合的HIgGHE4a融合蛋白。
12A2和14E2MAb与全长HE4a和HE-V4反应,这表明,它们对HE4aN-WFDC结构域是特异性的,图2。
还使用相同方法,试验了作为参照MAb的3D8和2H5MAb的特异性,图3。
3.2与作为噬菌体融合蛋白展示的HE4a结构域的反应性
通过在噬菌体ELISA中试验与HE4aN-WFDC结构域和HE4aC-WFDC结构域(表达为与噬菌体外壳蛋白pVIII的融合蛋白)的反应性,进一步证实了12A2和14E2MAb对HE4aN-WFDC结构域的特异性。
将从分离自OvCar-3细胞的mRNA制备的cDNA用作模板,用于PCR扩增编码C-和N-端WFDC区域的基因部分,用于克隆进噬菌体展示载体f88-4中。构建在表2中列出的PCR引物对,用于分别扩增氨基酸残基31-75(N-WFDC)和76-124(C-WFDC)的编码区。在5’-末端中,是为了与pVIII信号肽和pVIII成熟外壳蛋白融合地克隆而插入的HindIII和PstI的限制位点。
表2.用于扩增HE4aN-和C-WFDC的PCR引物
引物 | SEQ ID NO: | 序列 | WFDC |
W1F | 29 | 5-TGCTAAGCTTTGCCGAGAAGACTGGCGTGTGCCC–3’ | N-WFDC |
W1R | 31 | 5’-CCTTCTGCAGGATCATTGGGCAGAGAGCAG–3’ | N-WFDC |
W2F | 33 | 5’-TGCTAAGCTTTGCCAAGGAGGGTTCCTGCCCCCA–3’ | C-WFDC |
W2R | 35 | 5’-CCTTCTGCAGGGAAATTGGGAGTGACACAGGA–3’ | C-WFDC |
在含有含有各1μM的正向和反向引物、75mMTris-HCl(pH8.8,在25℃),20mM(NH4)2SO4,0.1%(v/v)吐温20,2mMMgCl2,0.02u/μlTaq-聚合酶(Abgene,Surrey,UK)和各0.1mM的脱氧核苷酸的反应混合物中,以25μl的终体积,利用重复30次的下述温度循环,从0.5μlcDNA单独扩增WFDC区域:在95℃、50℃和72℃温育30秒。
将经过HindIII和PstI消化的PCR产物和f88-4连接到一起,并转染进大肠杆菌JM109中,此后在含有四环素的LB平板上选择克隆。在大肠杆菌JM109中扩增每种构建体的2个克隆,并制备双链DNA用于DNA测序。使用Big染料终止子v1.1循环测序试剂盒和f88-4载体特异性的引物,进行DNA测序。将测序反应物送至CyberGeneAB(Huddinge,瑞典)进行分析。使用自由软件Chromas1.45版(TechnelysiumPtyLtd.,澳大利亚),分析序列原始数据。核苷酸测序验证了前导肽和成熟噬菌体外壳蛋白pVIII一起的框架内插入。HE4a插入物表现出与HE4a序列(登录号AY212888)的同一性,图4。
噬菌体ELISA
将经过序列验证的噬菌体克隆扩增、纯化、用PEG/NaCl浓缩,并在含1%BSA的PBS中稀释,用作噬菌体ELISA测定中的抗原。在用山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)包被的孔(100μl/孔)中,固定化MAb3D8和2H5(在含1%BSA的PBS中稀释至1μg/ml)和MAb12A2(在100μl克隆培养基中)。密封平板,并在室温保存过夜。将用HE4aMAb包被的孔洗涤3次,并以100μl/孔的体积加入噬菌体颗粒。在温育2小时后,洗涤孔,并加入兔抗-M13抗体(自制)。温育和洗涤后,加入HRP标记的猪抗兔抗体(Dako)。在最后一次洗涤后,加入TMB底物,并在温育5分钟后在620nm测量平板,图5。
使用N-WFDC和C-WFDC结构域(其展示为与噬菌体蛋白pVIII的融合蛋白)的噬菌体ELISA研究和与HE4a-V2、HE4a-V4和FLHE4ahIgG1融合蛋白的反应性证实,12A2和14E2MAb对HE4aN-WFDC结构域是特异性的。
3.3被12A2和14E2MAb识别的表位的表征
通过试验抗体与变性的和还原的HE4a抗原的反应性,确定了被12A2和14E2MAb识别的表位的类型,即线性的或构象依赖性的表位。将得自生产全长HE4a-hIgG1的稳定细胞系的用过的培养基(未稀释和稀释5次)在70℃变性,并在还原条件下用SDS-PAGE分离。根据标准技术,将蛋白质印迹在PVDF膜上。与第一HE4a抗体一起温育膜以后,通过HRP猪抗小鼠抗体(Dako)跟踪结合的抗体。使用AmershamTMECLTM检测系统,通过化学发光来检测HRP抗体。
MAb12A2没有表现出与变性的和还原的HE4a抗原的反应性(数据未显示),这指示,所述抗体识别构象依赖性的表位。另一方面,MAb14E2表现出在大约48kDa(这是糖基化的HE4a-hIgG1融合分子的预期大小)的带的特异性染色。在具有更高抗原浓度的泳道中,观察到约2倍大小的带。该带最可能代表抗原的二聚体,其中在Fc部分中的二硫键尚未完全断裂。蛋白质印迹数据指示,MAb14E2识别线性表位,图6。
3.4建立的HE4N-WFDC特异性抗体的独立表位
12A2和14E2MAb与变性的和还原的HE4a抗原的反应性的差异指示,2种抗体识别HE4aN-WFDC结构域的2个独立表位。
通过在夹心免疫测定中组合12A2和14E2MAb,进一步证实了12A2和14E2MAb对HE4aN-WFDC结构域中的独立表位的识别。使用MAb14E2作为捕获MAb,联合使用HRP标记的MAb12A2作为检测抗体,并用HE4a抗原测定剂量响应曲线。将浓缩的杂交瘤培养基中的MAb14E2捕获在用山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoResearchLab)包被的微孔中。洗涤后,加入25μl得自HE4aEIA试剂盒(FujirebioDiagnosticsInc)的HE4a抗原(0–900pM),并在此后加入HRP-标记的12A2MAb。作为对照实验,用在HE4aEIA中使用的14E2MAb固相和HRP标记的示踪剂MAb3D8进行平行运行,。已知MAb3D8靶向C-端WAP区域,因此将与MAb14E2形成夹心EIA对。在温育和洗涤步骤以后,加入TMB底物,并在温育步骤后30分钟在620nm分析吸光度。MAb3D8和12A2都表现出与MAb14E2的剂量响应曲线,图7。
12A2MAb和14E2MAb的夹心免疫测定的正剂量响应曲线以及它们与还原的HE4a抗原的不同反应性,证实了MAb14E2和MAb12A2会识别对HE4aN-WFDC结构域特异性的独立表位。
还开发了对全长HE4a特异性的免疫测定。
实施例4
对全长HE4a特异性的免疫测定的建立
使用对N-WFDC和C-WFDC结构域特异性的抗体,设计了对全长HE4a(FLHE4a)特异性的测定。
在本发明的一个方面,将对HE4aN-WFDC结构域特异性的抗体与对HE4aC-WFDC结构域特异性的抗体相组合,以允许设计对全长HE4a特异性的免疫测定,同时不会检测HE4aN-WFDC、HE4aC-WFDC结构域或HE4a-V4或HE4a-V2变体。
在一个初期实验中,在夹心测定中,使用根据本发明的12A2MAb和14E2MAb和可与HE4aC-WFDC结构域反应的3D8MAb(Hellstrom等人;TheHE4(WFDC2)ProteinIsaBiomarkerforOvarianCarcinoma;CancerRes2003年7月1日63;3695)作为捕获抗体,使用可与HE4aC-WFDC结构域反应的2H5MAb作为检测抗体。在所述夹心测定中,使用与在实施例2中所述类似的操作,将不同的捕获MAb固定化在微量滴定孔中,并与FLHE4a、HE4a-V4和HE4a-V2结构域的hIgFc融合蛋白一起温育。然后如下检测结合的HE4a蛋白:与生物素化的2H5MAb一起温育,随后与抗生蛋白链菌素HRP一起温育,并在与OPDHRP底物一起温育后测定OD450nm。所述夹心测定证实,12A2MAb或14E2MAb与2H5MAb的组合仅检测到FLHE4a融合蛋白,而3D8MAb和2H5MAb的组合检测到FLHE4a和HE4a.V2变体,图8。
在对FLHE4a特异性的免疫测定的优选设计构型中,使用2H5MAb作为捕获抗体,并使用12A2MAb作为检测抗体。使用标准规程,用生物素-NHRS己酸酯(SigmaChemicalCo,US)将2H5MAb生物素化,并用作捕获抗体。根据Nakone操作的改进,用HRP结合12A2MAb。将生物素化的2H5MAb和HRP结合的12A2MAb用于根据下述方案的一步EIA中。
测定操作:
在抗生蛋白链菌素包被的微孔滴定板(KaivogenOy,Turku,芬兰)中,加入25μLFLHE4a-hIgG重组抗原(0–1000pM,在pH7.2的PBS、60g/LBSA中)+100μL1μg/mL的生物素2H5MAb和1μg/mL的HRP12A2MAb(在测定缓冲液中)。
2.在摇动下温育1h±10min
3.用5mMTris缓冲液、0.05%吐温40(pH7.75)洗涤6次。
4.加入100μLTMB,Neogen,US.
5.温育30min±5min
6.在ELISA读数器中测定OD620nm。
使用在PBS、60g/LBSA中稀释的HE4a–hIgG进行测定的剂量响应曲线的一个例子显示在图9中。测定的灵敏度是<5pM,这显著低于在健康受试者中发现的浓度。因而,该测定适合用于在健康受试者中和在具有已知或疑似卵巢癌的个体中测定FLHE4a。
该研究的目的是,通过评价它们在示例性测定形式中估测全长HE4的存在的能力而评估新12A2MAb的适合性。
实施例5
使用对全长HE4a特异性的免疫测定来诊断卵巢癌
在本公开内容的一个方面,使用抗体来设计用于卵巢癌的血清学诊断的免疫测定。使用针对FLHE4a的免疫测定(其使用如在实施例3中所述的2H5MAb与12A2MAb的组合)来确定得自健康个体、具有良性妇科疾病的患者和具有卵巢癌的患者的血清样品中的全长HE4a的浓度。
与具有良性妇科疾病的患者或健康受试者相比,在具有卵巢癌的患者中的FLHE4a水平明显更高(p<0.001),表3,图10。
表3.在健康受试者、具有良性妇科疾病的个体和具有卵巢癌的患者中的HE4a水平
该研究的目的是,通过评价它们在确定和监测卵巢癌进程中的能力,评估新12A2MAb/全长HE4测定形式的适合性。
实施例6
通过测定FLHE4a来监测卵巢癌疾病的进程
在本发明的另一个方面,使用根据实施例3的用于测定FLHE4a的免疫测定来跟踪具有确诊的卵巢癌的患者中的疾病的临床进程。
在图11中显示了3位卵巢癌患者在所述疾病的临床进程中的FLHE4a水平。FLHE4a水平跟随疾病的临床进程,且适合反映卵巢癌的治疗效果以及复发性疾病的检测。
作为例子,该研究的目的是,评估新的12A2MAb/全长HE4测定形式用于测定组织样品中的HE4的适合性。
实施例7
通过测定组织切片中的HE4a来诊断卵巢癌
在本发明的另一个方面,通过了一种用于诊断卵巢癌的方法,所述方法包括:将对HE4a的N-WFDC结构域特异性的抗体与得自疑似具有卵巢癌的患者的组织或细胞一起温育,和测定所述抗体与所述组织或细胞的结合。
根据生产商的说明书,将组织阵列载玻片(SuperBioChips)脱石蜡。对于抗原提取,在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中将载玻片微波处理10min。通过在3%H2O2中温育5min,淬灭内源性过氧化物酶。在优选的构型中,将组织切片与12A2MAb一起在室温温育1h。对于结合的12A2MAb的显影,根据生产商的说明书使用EnVision+System-HRP(DakoAS,丹麦)。在苏木精(DakoCytomation)中将载玻片复染色,固定,并通过显微术进行分析。针对HE4aN-WFDC,将不同的卵巢癌切片染色(图12A-D),而得自非癌性组织的组织是阴性的(图12E-F)。
在本文中参考的或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站和其它文件和材料都是本发明所属领域技术人员技能水平的表示,且每篇这样的参考的文件和材料特此通过引用并入,其程度如同它已经单独地通过引用整体并入或在本文中整体进行阐述。申请人保留将任何这种专利、出版物、科学文章、网站、电子信息和其它参考资料或文献的任何和所有信息物理地并入本说明书中的权利。
已经采用的术语和表达被用作说明书的术语而非限制性的,并且使用这些术语和表达时不是意在排除所示和所述特征的任何等价物或其部分,但是需要认识到在要求保护的本发明范围内可进行各种修饰。因此,应该理解,尽管优选实施方案和任选特征已经具体地公开了本发明,本领域技术人员可以对本文公开的概念做出修改和变化,并且这样的修改和变化被认为是所附权利要求定义的本发明范围内。
本文已经概括地和一般地描述了本发明。落入一般公开范围内的每种较窄的物类和亚组也形成本发明的一部分。这包括总的发明说明书具有从种类中排除任何主题的附带条件或消极限制,而无论所排除的材料是否在本文中明确地述及。
其它实施方案在以下权利要求范围内。此外,在通过马库什群组的方式描述本发明的特征和方面的情况下,本领域技术人员会认识到,本发明也因此通过马库什群组的任意单个成员或成员的亚组来描述。
Claims (14)
1.一种抗体,其特异性地结合SEQIDNO:17所示的HE4a多肽的N-WFDC结构域,其中所述抗体任选地用可检测的标记物标记,以及其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体,或单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体的抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是由作为专利保藏物编号10091401保藏在ECACC的杂交瘤细胞系12A2生产的单克隆抗体。
3.一种融合蛋白,其包含SEQIDNO:17所示的HE4a多肽的N-WFDC结构域或者SEQIDNO:19所示的HE4a多肽的C-WFDC结构域以及选自以下的异源多肽:亲和标签多肽序列,免疫球蛋白恒定区多肽,或者将融合蛋白靶向预定的细胞内、细胞膜或细胞外定位的多肽。
4.一种核酸分子,其编码权利要求3的融合蛋白。
5.一种表达载体构建物,其包含权利要求4的核酸分子。
6.一种分离的宿主细胞,其包含权利要求5的表达载体构建物。
7.一种试剂盒,其包含权利要求1或2的抗体,权利要求3的融合蛋白,权利要求4的核酸分子,权利要求5的表达载体构建物,或者权利要求6的分离的宿主细胞。
8.权利要求7的试剂盒,其中所述试剂盒包含权利要求1的抗体,还包含特异性结合SEQIDNO:19所示的HE4a多肽的C-WFDC结构域的第二抗体,所述第二抗体任选地被可检测地标记。
9.权利要求7的试剂盒,其中所述试剂盒包括特异性结合HE4a蛋白的N-WFDC结构域中的不同表位的两种抗体;或者特异性结合HE4a蛋白的N-WFDC结构域中的表位的一种抗体以及特异性结合HE4a蛋白的C-WFDC结构域中的表位的一种抗体。
10.至少两种对HE4a抗原多肽特异性的抗体在制备试剂盒中的应用,所述试剂盒用于筛选卵巢癌在受试者中的存在或者诊断受试者患有卵巢癌,其中所述两种抗体特异性结合:SEQIDNO:17所示的HE4a抗原多肽的N-WFDC结构域中的不同表位;或者SEQIDNO:17所示的HE4a多肽的N-WFDC结构域中的一个表位,以及SEQIDNO:19所示的HE4a抗原多肽的C-WFDC结构域中的一个表位,
其中所述抗体用于与得自受试者的生物样品接触,以确定所述生物样品中存在HE4a多肽;以及
其中生物样品含有被至少一种抗体特异性结合的分子表明卵巢癌的存在或者诊断受试者患有卵巢癌。
11.根据权利要求10所述的应用,其中所述分子以可溶形式天然存在,并且所述生物样品包括血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、尿、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、器官条件培养基或洗出液。
12.根据权利要求10所述的应用,其中至少一种抗体被固定在固体支持物上。
13.根据权利要求12所述的应用,其中所述抗体被用于双抗体夹心测定中。
14.根据权利要求10所述的应用,其中受试者正在进行卵巢癌的治疗,并且所述试剂盒用于监测疾病的进程。
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