JP2014507153A - ＨＥ４ａの測定のための組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象の卵巣癌を評定するためのＨＥ／ＨＥ４ａマーカの使用を包含する。ＨＥ／ＨＥ４ａマーカを使用して卵巣癌の診断、悪性度分類およびステージ分類を実施し、卵巣がんと診断された対象の予後および処置有効性を決定する組成物および方法も、包含する。

Description

本発明は、卵巣癌の検出、診断、悪性度分類、ステージ分類、予後のため、ならびに卵巣癌が疑われる、および／または卵巣癌に罹患した対象の処置応答を予測およびモニタリングするための組成物および方法を包含する。患者から得られた試料中の全長ＨＥ４ａの存在を測定することにより、卵巣癌を検出するイムノアッセイ、結合剤、抗体、および方法も、開示する。

発明の背景
ＷＦＤＣ２（ＨＥ４／ＨＥ４ａ）遺伝子産物は、安定した４−ジスルフィド・コア蛋白質のファミリーの一員である。ＨＥ４は、ヒト精巣上体組織中で初めて観察された、分泌およびグリコシル化蛋白質であり（ヒト精巣上体蛋白質４；ＨＥ４）、卵巣癌をはじめとする特定の癌で過剰発現される。ＨＥ４／ＨＥ４ａ蛋白質および核酸の特徴づけは、例えば、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ， Ｈａｂｂｅｎ Ｉ， Ｉｖｅｌｌ Ｒ， Ｋｒｕｌｌ Ｎ （Ｍａｒ １９９２）． "Ａ ｍａｊｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ"． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４５ （２）： ３５０−７（非特許文献１）、Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｍ， Ｎｇ ＷＶ， Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ ＲＥ， Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ， Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｂ， Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ ＤＷ， Ｈａｓｓｅｌｌ Ｌ， Ｂａｌｄｗｉｎ ＲＬ， Ｋａｒｌａｎ ＢＹ， Ｈｏｏｄ Ｌ （Ｄｅｃ １９９９）． "Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｒａｙ ｏｆ ２１，５００ ｏｖａｒｉａｎ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ"． Ｇｅｎｅ ２３８ （２）： ３７５−８５（非特許文献２）、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ （１９９８）． "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．" Ｒｅｖ． Ｒｅｐｒｏｄ． ３ （２）： ８６−９５（非特許文献３）、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ， Ｏｓｔｅｒｈｏｆｆ Ｃ， Ｈａｂｂｅｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９０）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ．" Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ． １３ （２）： １５５−６７（非特許文献４）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ Ｉ， ｅｔ ａｌ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３ Ｊｕｌ １；６３（１３）：３６９５−７００（非特許文献５）に報告されている。癌細胞におけるＨＥ４／ＨＥ４ａの過剰発現から、この蛋白質およびその様々なアイソフォームが、癌を検出して癌を有する確率の高い患者を同定する有用なバイオマーカとなり得ることが示唆される。ＨＥ４／ＨＥ４ａなどの分子マーカの使用に関係する方法および組成物は、これまでに、米国特許第７２７０９６０号（特許文献１）、米国特許出願公開第２０１００３１１０９９号（特許文献２）、同第２００８００２０４７３号（特許文献３）、同第２００７０２８６８６５号（特許文献４）、同第２０１０００４７８１８号（特許文献５）、同第２００９０１０４６８４号（特許文献６）、および同第２００３０１０８９６５号（特許文献７）に報告されており、それらの各内容は、全体として本明細書に組み入れられている。

ＨＥ４／ＨＥ４ａ蛋白質は、選択的スプライシングによる異なるアイソフォーム、および異なるグリコシル化パターンからの異なるグリコフォームを有することが報告されている。先の事柄を考慮して、癌を診断するためにＨＥ４ａ、それらの変異体、スプライスアイソフォーム、およびグリコフォームなどのバイオマーカの過剰発現を検出し得る組成物および結合剤（例えば、抗体）が、当該技術分野で必要とされている。

米国特許第７２７０９６０号 米国特許出願公開第２０１００３１１０９９号 米国特許出願公開第２００８００２０４７３号 米国特許出願公開第２００７０２８６８６５号 米国特許出願公開第２０１０００４７８１８号 米国特許出願公開第２００９０１０４６８４号 米国特許出願公開第２００３０１０８９６５号

Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ， Ｈａｂｂｅｎ Ｉ， Ｉｖｅｌｌ Ｒ， Ｋｒｕｌｌ Ｎ （Ｍａｒ １９９２）． "Ａ ｍａｊｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ"． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４５ （２）： ３５０−７ Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｍ， Ｎｇ ＷＶ， Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ ＲＥ， Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ， Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｂ， Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ ＤＷ， Ｈａｓｓｅｌｌ Ｌ， Ｂａｌｄｗｉｎ ＲＬ， Ｋａｒｌａｎ ＢＹ， Ｈｏｏｄ Ｌ （Ｄｅｃ １９９９）． "Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｒａｙ ｏｆ ２１，５００ ｏｖａｒｉａｎ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ"． Ｇｅｎｅ ２３８ （２）： ３７５−８５ Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ （１９９８）． "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．" Ｒｅｖ． Ｒｅｐｒｏｄ． ３ （２）： ８６−９５ Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ， Ｏｓｔｅｒｈｏｆｆ Ｃ， Ｈａｂｂｅｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９０）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ．" Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ． １３ （２）： １５５−６７ Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ Ｉ， ｅｔ ａｌ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３ Ｊｕｌ １；６３（１３）：３６９５−７００

本発明は、対象における卵巣癌を診断する、および卵巣癌を有する確率の高い対象を同定する、組成物および方法を包含する。該組成物は、卵巣癌で過剰発現されるＨＥ４／ＨＥ４ａの可溶性形態および細胞表面形態に特異的に結合するモノクローナル抗体、それらの変異体およびフラグメントを含む。開示されたＨＥ４ａ抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体も、提供される。ＨＥ４／ＨＥ４ａモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も、開示される。開示された組成物は、卵巣癌を有する確率の高い対象を同定するための診断方法およびスクリーニング方法において使用を有する。詳細には診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイまたはダブルサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを含むことができる。開示されたＨＥ４ａモノクローナル抗体の１種以上を含む、本発明の方法を実践するためのキットも、提供される。ＨＥ４ａエピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および抗体の産生においてこれらのポリペプチドを使用する方法も、開示される。

ＨＥ４ａドメインおよびヒト／マウスＩｇＧを含む例示的ＨＥ４ａ融合蛋白質の実施形態を示す。 ＨＥ４ａの全長ＨＥ４ａ、ＨＥ４ａ−Ｖ４およびＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインへの、モノクローナル抗体の実施形態（１２Ａ２および１４Ｅ２抗体）の幾つかの結合特異性を示す。この実施例において、ＭＡｂｓ １２Ａ２および１４Ｅ２は、ＨＥ４ａ−Ｖ４変異体および全長ＨＥ４ａに結合したが、ＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインには結合しなかった。１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂが、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに結合したことが示される。 融合蛋白質への参照モノクローナル抗体（２Ｈ５および３Ｄ８抗体）の結合特異性を示す。この実施例において、参照ＭＡｂは、ＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインおよび全長ＨＥ４ａに結合するが、ＨＥ４ａ−Ｖ４ドメインには結合せず、それらがＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメイン内のエピトープを認識したことが示される。 Ｎ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣ ＨＥ４ａドメインを含むＨＥ４ａヌクレオチドおよびペプチド配列を示す。 Ｎ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣへの例示的モノクローナル抗体（１２Ａ２）の結合相互作用を示す。この実施例において、１２Ａ２の結合特異性は、ＭＡｂをＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣファージ ｐＶＩＩＩ融合蛋白質のみと反応させたファージＥＬＩＳＡ形式を利用して実証される。 １４Ｅ２ ＭＡｂと変性および還元ＨＥ４ａ−ｈＩｇ融合蛋白質との反応性を示す。変性および還元ＨＥ４ａ−ｈＩｇ融合蛋白質への結合は、１４Ｅ２ ＭＡｂがＨＥ４ａ蛋白質の線状エピトープを認識したことを示す。 捕捉ＭＡｂとして１４Ｅ２を用い、検出ＭＡｂとして３Ｄ８または１２Ａ２ＭＡＢを用いた、サンドイッチイムノアッセイの用量反応曲線を示す。１４Ｅ２ ＭＡｂと１２Ａ２ ＭＡｂとの組み合わせの結果から、それらが同時に結合し得ること、つまりＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインの独立したエピトープを検出し得ることが示される。 幾つかの例のサンドイッチイムノアッセイおよび２Ｈ５ ＭＡｂと組み合わせた１２Ａ２ ＭＡｂと１４Ｅ２ ＭＡｂとの結合を示す。この実施例において、ＭＡｂ １２Ａ２および１４Ｅ２は、全長ＨＥ４ａのみと反応するが、３Ｄ８および２Ｈ５のＭＡｂ組み合わせは、ＦＬ ＨＥ４ａおよびＨＥ４ａ−Ｖ２の両方の変異体と反応した。その結果から、１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂが、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメイン内で暴露されたエピトープを認識する証拠を更に裏づけている。 全長ＨＥ４ａ ＥＩＡの用量反応曲線を示す。このアッセイは、捕捉抗体としての２Ｈ５ ＭＡｂおよび検出ＭＡｂとしてのＨＲＰコンジュゲート１２Ａ２ ＭＡｂに基づいた。その手順を、実施例３に記載された通り実施した。 実施例３に記載された通りＦＬ ＨＥ４ａ ＥＩＡで測定された、健常な対象、良性婦人科疾患の患者および卵巣癌患者におけるＨＥ４ａレベルを示す。 卵巣癌の臨床経過をモニタリングするための例示的全長ＨＥ４ａイムノアッセイを示す（ＳＤ＝安定した疾患；Ｒ＝応答している；ＰＤ＝進行性疾患）。この実施例において、全長ＨＥ４ａが、卵巣癌と診断された患者の疾患の臨床経過を追跡するのに有用であることが、全長ＨＥ４ａから実証された。 ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的な例示的ＭＡｂを用いた良性および悪性卵巣組織のＩＨＣを示す。この実施例において、例示的１２Ａ２ ＭＡｂは、卵巣癌内の癌細胞に強く結合したが、良性腫瘍内の細胞には結合しなかった。Ａ：漿液性腺癌；Ｂ：漿液性腺癌；Ｃ：子宮内膜様卵巣癌；Ｄ：漿液性腺癌；Ｅ：線維腫；Ｆ：線維莢膜細胞腫。

詳細な説明
対象における卵巣癌を診断する、および卵巣癌を有する確率の高い対象を同定する、様々な組成物および方法が、提供される。組成物は、ＨＥ４／ＨＥ４ａ（卵巣癌細胞中で過剰発現することが示された蛋白質）に結合し得るモノクローナル抗体、を含む。該組成物は、卵巣癌で過剰発現されるＨＥ４／ＨＥ４ａの可溶性形態および細胞表面形態に特異的に結合するモノクローナル抗体、ならびにそれらの変異体およびフラグメントを含む。本開示のＨＥ４ａ抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体が、更に提供される。本開示のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も、開示される。より詳細にはＨＥ４ａのＮ−ＷＦＤＣドメインに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が、提供される。記載されたモノクローナル抗体を含むキットも、開示される。本発明は、ＨＥ４ａエピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および抗体の産生においてこれらのポリペプチドを使用する方法も包含する。該組成物は、対象における卵巣癌を診断するための「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡ法またはＩＨＣ、および卵巣癌を有する確率の高い対象を同定するためのスクリーニング方法に、特別な用途を見出す。

一態様において、本開示は、ＨＥ４ａに特異的に結合し得るモノクローナル抗体を提供する。一実施形態において、モノクローナル抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ａ２により産生される。別の実施形態において、モノクローナル抗体は、特許受託番号（１４Ｅ２ ＥＣＡＣＣＮｏ ）としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２により産生される。別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ

に示されたアミノ酸配列に結合する。

別の態様において、本発明は、配列番号ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体、および配列番号１９ ＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣ

に示されたアミノ酸配列に結合する追加のモノクローナル抗体を含む卵巣癌を診断するキットを提供する。第一のＨＥ４ａ抗体である固体担体上に固定された捕捉抗体と、検出可能な物質で標識された第二のＨＥ４ａ抗体であるタグ抗体と、を含み、前記第一または第二のＨＥ４ａ抗体が、特許受託番号（１４Ｅ２ ＥＣＡＣＣＮｏ ）としてＥＣＡＣＣに寄託され、および／または配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ

に示されたアミノ酸配列に結合するハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２により産生されたモノクローナル抗体である、患者における卵巣癌を診断するキットも、提供される。

本開示は、免疫反応を誘発する条件下、配列番号１、３および５に示されたアミノ酸配列（ＨＥ４ａ；ＨＥ４ａ Ｖ２；ＨＥ４ａ Ｖ４）およびそれらの変異体を含むポリペプチドで動物を免疫化すること；該動物から抗体を産生する細胞を単離すること；抗体を産生する細胞を不死化培養細胞と融合して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成すること；ハイブリドーマ細胞を培養すること；ならびにモノクローナル抗体を培養物から単離すること、を含む、ＨＥ４ａモノクローナル抗体を産生する方法も提供する。

本開示は、（ａ）ＨＥ４ａのＮ−ＷＦＤＣドメイン；（ｂ）配列番号１ ＨＥ４ａによりコードされたアミノ酸配列、に結合するＨＥ４ａ結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤は、抗ＨＥ４ａ抗体またはＨＥ４ａ抗原結合フラグメントである。更なる実施形態において、結合剤は、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ（配列番号１７）に選択的に結合する。更に別の実施形態において、結合剤は、ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントである。別の実施形態において、結合剤は、検出可能なマーカで標識されている。

本発明は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ａ２により産生されたモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する精製されたアミノ酸配列も包含する。

別の態様において、モノクローナル抗体のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する配列が、特許受託番号１４Ｅ２ ＥＣＡＣＣ Ｎｏ としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２により産生される、精製されたアミノ酸配列が提供される。

本開示は、ａ）試料からの核酸を、フォワードおよびリバースプライマーを含み、配列番号２１ Ｖ４Ｆと配列番号２３＿Ｖ４Ｒ、配列番号２５ Ｖ２Ｆと配列番号２７ Ｖ２Ｒからなる群より選択されるプライマーセットで増幅させること；ｂ）増幅された核酸を単離すること、を含む、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列を得る方法も包含する。

本発明は、配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣの配列に結合する結合蛋白質をコードする単離された核酸分子であって、該結合蛋白質のアミノ酸配列が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ１２Ａ２、または特許受託番号１４Ｅ２ ＥＣＡＣＣ番号としてＥＣＡＣＣに寄託され、および／もしくは配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ

により示されたアミノ酸配列に結合する細胞株１４Ｅ２、により産生されたモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、単離された核酸分子も包含する。

別の態様において、配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣの配列に結合する結合蛋白質をコードする単離された核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞が、提供される。

本開示は、配列番号１７ ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣのアミノ酸配列を含むＦｃ受容体ポリペプチドに連結した異種ＨＥ４ａポリペプチドを含む単離された融合蛋白質も提供する。一実施形態において、単離された融合蛋白質は、配列番号２９ Ｗ１Ｆ；配列番号３１ Ｗ１Ｒ；配列番号３３ Ｗ２Ｆ；配列番号３５ Ｗ２Ｒによりコードされるプライマーを用いて核酸増幅することにより得られる。別の実施形態において、融合蛋白質は、スプライス変異体である異種ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを含む。

本発明は、対象からの生物学的試料を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と、抗原決定基への該抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、該試料中で可溶性形態であり少なくとも１種の抗体と反応性がある抗原決定基を有する天然由来分子が、該生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにその後、卵巣癌の存在を検出すること、を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングする方法も包含する。一実施形態において、生物学的試料は、血液、血清、漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄ）、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌液、膣分泌液、腹水、肋膜液、心膜液、腹腔液、腹部液体（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、培地、コンディション培地および洗浄液からなる群より選択される。

本開示は、対象の細胞を含む生物学的試料を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と、抗原決定基への該抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、少なくとも１種の該抗体と反応性のある該抗原決定基を有する細胞表面分子が、該生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにこうして卵巣癌の存在を検出すること、を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングする方法を更に提供する。一実施形態において、抗体は、検出可能に標識されている。別の実施形態において、抗体は、検出可能に標識されておらず、抗原決定基への抗体の結合の検出は、間接的である。

本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の固定化第一抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的に結合させることにより免疫複合体を形成するのに十分な条件および時間で、対象からの生物学的試料を第一抗体と接触させて、試料中の分子の存在を測定すること；第一抗体に特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること；ならびにＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的で抗原結合部位が固定化第一抗体の抗原結合部位を拮抗阻害しない第二抗体の、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドへの特異的結合を検出するのに十分な条件および時間で、該免疫複合体を少なくとも１種の第二抗体と接触させ、こうして卵巣癌の存在を検出すること、を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングする方法も包含する。一実施形態において、固定化第一抗体は、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８からなる群より選択される。一実施形態において、第二抗体は、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８からなる群より選択される。別の実施形態において、固定化第一抗体は、１４Ｅ２である。更に別の実施形態において、第二抗体は、１２Ａ２である。

対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で、該検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と接触させること；および該複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａの存在を示す複合体の存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法も、開示される。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、

本発明は、対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；該検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること；検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること；ならびにシグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法も、包含する。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。

本開示は、対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；該検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること；ならびに該複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示す該複合体の存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後の方法も包含する。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。

本発明は、対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；該検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること；検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること；ならびにシグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後の方法も包含する。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。

対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；該検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること；ならびに該複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示す前記複合体の存在が処置の応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法も、開示される。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。

本開示は、対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること；該検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること；検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること；ならびにシグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が処置への応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法を更に提供する。一実施形態において、抗体は、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。

本発明は、対象から得られた検査卵巣組織試料を、配列番号ＨＥ４に示されたポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を検出すること；および検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を、所定のカットオフ値と比較すること、を含み、検査卵巣組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が、所定のカットオフ値を超えている場合には検査卵巣癌組織試料が卵巣癌について陽性となり、それにより対象における卵巣癌の有無を検出する、患者における卵巣癌の有無を検出する方法も提供する。一実施形態において、検査卵巣癌組織試料中ポリペプチドに結合する抗体の量は、免疫組織化学を利用して測定される。

本明細書に開示された方法は、記載された通り、蛋白質の「４−ジスルフィド・コア」ファミリーの一員であるＨＥ４／ＨＥ４ａに関係する。蛋白質の「４−ジスルフィド・コア」ファミリーは、機能が多岐にわたる小型の酸−および熱−安定性分子の異種群を含み、ヒト精巣上体４−ジスルフィド・コア蛋白質、または「ＨＥ４」を含む（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ４５：３５０−３５７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。ＨＥ４ ｃＤＮＡは、最初、ヒト精巣上体から単離され（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ４５：３５０−３５７）、後にＨＥ４ ｃＤＮＡは、卵巣癌から構成されたｃＤＮＡライブラリにおいて高頻度で検出された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。ＨＥ４ａの修正された配列が、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ６３：３６９５−３７００および米国特許第７，２７０，９６０号に開示された。ＨＥ４ａは、より初期の発行物でＨＥ４と呼ばれていた分子の推定配列と非常に類似しているが異なるアミノ酸配列を示す。

ＨＥ４蛋白質の複数のアイソフォームが、以下の表１に詳細に報告された。当業者は、各アイソフォームが、特定のＨＥ４／ＨＥ４ａ抗体の関連するエピトープ配列を含む限り、本開示のＨＥ４／ＨＥ４ａモノクローナル抗体が１を超えるＨＥ４アイソフォームに結合し得ることを、理解するであろう。

（表１）ＨＥ４アイソフォーム

本明細書で用いられる「対象」は、処置、観察または実験の目的となる動物を指す。「動物」は、冷血および温血の脊椎動物および無脊椎動物、例えば、魚、貝、爬虫類、特にホ乳類を含む。「ホ乳類」は、非限定的に、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類、例えばサル、チンパンジ、および類人猿、およびヒトを含む。

本明細書に開示された方法は、特定の癌を有する対象における高レベルのそのようなポリペプチドをはじめとし、対象における天然由来のＨＥ４ａの細胞表面および／または可溶性形態を検出する組成物および方法も包含する。本開示は、それ故、そのような細胞表面および／または可溶性のＨＥ４ａポリペプチドの特異的検出による対象における悪性状態（例えば、卵巣癌）の検出および診断に有用な組成物および方法を提供する。

全長ＨＥ４ａ抗原の測定のためのイムノアッセイの設計およびモノクローナル抗体の生成、卵巣癌の血清学的診断のための免疫学的アッセイおよびモノクローナル抗体の使用、ＨＥ４ａの組織分析による疾患の臨床経過のモニタリングおよび卵巣癌の診断も、提供される。ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的なエピトープに対する新規なモノクローナル抗体の作製、およびこれらの抗体とＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメインに対する抗体との組み合わせにより、全長ＨＥ４ａの測定に特異的なイムノアッセイを設計することが可能になる。

本明細書に開示された方法によれば、ヒトＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、対象または生物学的供給源からの生物学的試料中で検出することができる。生物学的試料は、対象もしくは生物学的供給源から、血液試料、生検標本、組織外植片、臓器培養物、生物学的液体または任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることにより提供することができる。対象または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物、非限定的に染色体に組み込まれた組換え核酸配列またはエピソームの組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株などの培養に適応させた細胞株、不死化または不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化または分化可能細胞株、形質転換された細胞株などであってもよい。本明細書に開示された方法の特定の実施形態において、対象または生物学的供給源は、卵巣癌を有する疑いがある、または卵巣癌を有するリスクの疑いがある可能性がある。

幾つかの実施形態において、生物学的試料は、対象または生物学的供給源からの少なくとも１種の細胞を含み、別の実施形態において、生物学的試料は、別の腫瘍マーカを含む生物学的液体である。生物学的液体は、典型的には生理学的温度の液体であり、対象または生物学的供給源中に存在する、それから採取、発現またはさもなければ抽出された、天然由来の液体を含み得る。特定の組織、臓器または局所領域から得られた特定の生物学的液体、および特定の他の生物学的液体は、対象または生物学的供給源中に全体または全身に位置し得る。生物学的液体の非限定的例としては、血液、血清および漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、漿液、血漿、リンパ、分泌組織および臓器の粘膜分泌液、膣分泌液、母乳、涙液が挙げられ、腹水、例えば非固形腫瘍に関連するものなども適している。追加の例としては、肋膜液、心膜液、腹腔液、腹部および他の体腔の液が挙げられる。生物学的液体としては、対象または生物学的供給源と接触した液性溶液、例えば細胞または臓器のコンディション培地をはじめとする細胞および臓器の培地、および洗浄液などを更に挙げることができる。別の実施形態において、生物学的試料は、無細胞液性溶液、例えば血清、血漿、または遠心分離された尿の上清である。

特定の他の実施形態において、生物学的試料は、インタクト細胞を含み、特定の他の好ましい実施形態において、生物学的試料は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体をコードする核酸配列を含む細胞抽出物を含む。本明細書に開示された方法の更に別の実施形態において、分析の細胞内容物を示すアッセイ実施の前に、細胞が物理的または化学的に破壊または溶解されることが望ましい。

本明細書で用いられる、試料中の「可溶性形態の天然由来分子」は、可溶性蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、またはその誘導体；脂質、脂肪酸など、またはそれらの誘導体；炭水化物、糖類など、またはその誘導体；核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンもしくは関連の分子、またはそれらの誘導体など；あるいはそれらの任意の組み合わせ、例えば糖蛋白質、糖脂質、リポ蛋白質、プロテオリピド、または本明細書に示された生物学的試料の可溶性もしくは無細胞成分である任意の他の生物学的分子であってもよい。「可溶性形態の天然由来分子」は、更に、本明細書に示された生物学的液体をはじめとする生物学的試料中に溶解または存在していて、インタクト細胞の表面に結合していない分子を指す。例えば可溶性形態の天然由来分子としては、限定する必要はないが、溶質；高分子複合体の成分；細胞から流出、分泌または排出された材料；コロイド；微粒子またはナノ粒子または他の微細な懸濁粒子などを挙げることができる。

対象における悪性状態（例えば、卵巣癌）の存在は、例えば新生物、腫瘍、非接触阻害細胞または発癌遺伝子により形質転換された細胞などをはじめとし、対象における形成異常、癌性および／または形質転換細胞の存在を指す。限定ではなく例示として、本明細書に開示された方法に関連して、悪性状態は、更に、高レベルのそのようなポリペプチドが対象からの生物学的試料中で検出可能となる手法で、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）を分泌、流出、排出または放出することが可能な癌細胞の、対象における存在を指すことができる。幾つかの実施形態において、例えばそのような癌細胞は、カルチノマ細胞などの悪性上皮細胞であり、幾つかの実施形態において、そのような癌細胞は、悪性中皮腫細胞であり、それらは例えば肋膜の裏層（ｌｉｎｉｎｇ ｐｌｅｕｒａｌ）、心膜、腹腔、腹部および他の体腔に見出される扁平上皮細胞または中皮細胞の形質転換された変異体である。

一実施形態において、卵巣癌の存在を表す卵巣腫瘍細胞は、原発性および転移性卵巣癌細胞を含むことができる。当該技術分野で周知の悪性を分類する基準は、原発性および転移性腫瘍からのヒト卵巣癌細胞株の作製および特徴づけである。他の実施形態において、本開示は、悪性状態が中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、または別の癌形態、例えば扁平上皮癌および腺癌などの様々な癌のいずれか、および例えば肉腫および血液悪性疾患（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）となり得ることも企図される。これらおよび他の悪性状態の分類は、当業者に公知であり、本開示は、過度の実験を実施せずにそのような悪性状態におけるＨＥ４ａポリペプチドの存在の測定をもたらす。

参照値は、本明細書に含まれる実施例に示されている。そのような値は、本明細書に開示された方法の実践に適している。しかし、本明細書に開示された方法の使用が、それらの参照値またはそのデータに限定されないことに留意しなければならない。当業者は、特定の要件のための参照値を得ることができる。そのような参照値は、患者が悪性の疑いがある卵巣癌の生検手順を受けて、患者におけるＨＥ４発現を分析することにより得ることができる。そのような参照値を得る方法は、実施例に示されている。加えて他の参照値は、患者の特定のカテゴリーに注目して得ることができる。そのようなカテゴリーは、年齢、遺伝的背景、癌のリスク、薬歴、血液型、物理的性質、例えば体重、および他のカテゴリーを含み得る。

本明細書に示された通り、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体またはＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体を用いることができる。ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）に特異的な抗体は、モノクローナル抗体としてもしくはポリクローナル抗血清として即座に産生されるか、または当該技術分野で周知の方法を用いて所望の特性を有するように設計された遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）として産生することができる。例えば限定ではなく例示として、抗体は、本明細書に開示された方法によるヒトＨＥ４ａポリペプチドの検出に用いられ得る、組換えＩｇＧ、免疫グロブリン誘導配列を有するキメラ融合蛋白質または「ヒト化」抗体（例えば、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，５８５，０８９号、同第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号）を含むことができる。そのような抗体は、以下に記載される通り、ＨＥ４ａポリペプチドでの免疫化など、本明細書に示された通り調製することができる。例えばＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列は開示されており、当業者は免疫原としての使用のために、これらのポリペプチドを日常的に調製することができる。例えば、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５、および３Ｄ８など、ならびに以下により詳細に記載されるモノクローナル抗体を用いて、本明細書に開示された方法により特定の方法を実践することができる。

用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのフラグメント、例えばＦ（ａｂ'）_２およびＦａｂフラグメント、ならびに天然由来または組換えにより産生された結合パートナーを含み、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的に結合する分子である。抗体は、約１０^４Ｍ^−１以上、好ましくは約１０^５Ｍ^−１以上、より好ましくは約１０^６Ｍ^−１以上、およびより好ましくは約１０^７Ｍ^−１以上のＫ_ａでＨＥ４ａポリペプチドと結合する場合に、「免疫特異的」または特異的に結合すると定義される。結合パートナーまたは抗体のアフィニティーは、従来技術を用いて即座に測定することができる。ＨＥ４ａポリペプチドの結合パートナーとしての他の蛋白質の測定は、他の蛋白質またはポリペプチドと特異的に相互作用する蛋白質を同定および獲得するための複数の公知方法のいずれか、例えば米国特許第５，２８３，１７３号および同第５，４６８，６１４号に記載された酵母ツーハイブリッドスクリーニングシステムなどを用いて実施することができる。本明細書に開示された方法は、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的に結合する結合パートナーおよび抗体を調製するための、ＨＥ４ａポリペプチド、およびＨＥ４ａポリペプチドのアミノ酸配列に基づくペプチドも包含する。

抗体は、一般には、当業者に公知の様々な技術のいずれかにより調製することができる。そのような１つの技術において、最初、ＨＥ４ａポリペプチドを含む免疫原、例えば表面にＨＥ４ａポリペプチドを有する細胞または単離されたＨＥ４ａポリペプチドを有する細胞が、好ましくは１種以上のブースター免疫化を組み入れた所定の計画により、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に注射され、動物は定期的に採血される。その後、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば適切な固体担体に結合されたポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、そのような抗血清から精製することができる。

ＨＥ４ａポリペプチドまたはその変異体に特異的なモノクローナル抗体は、当業者に公知の任意技術により調製することができる。例えばこれらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生することが可能な不死細胞株の調製を含み得る。そのような細胞株を、例えば先に記載された通り免疫化された動物から得られた脾臓細胞から、産生することができる。その後、脾臓細胞は、例えば免疫化された動物と相乗作用のあるような骨髄腫細胞融合パートナーとの融合により、不死化される。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコールまたは非イオン性洗剤などの膜融合促進剤と数分間混和し、その後、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが骨髄細胞の増殖は支持しない選択培地に、低密度で播種することができる。選択技術の一例は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を利用する。十分な時間、通常は約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択して、ポリペプチドに対する結合活性について検査する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが、好ましい。ＨＥ４ａポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、本明細書に開示された方法により企図される。

モノクローナル抗体は、増殖したハイブリドーマコロニーの上清から単離することができる。加えて、ハイブリドーマ細胞株を適切な脊椎動物宿主、例えばマウスまたは他の適切な宿主の腹腔に注入するなど、様々な技術を用いて収率を高めることができる。その後、モノクローナル抗体を、腹水または血液から回収することができる。汚染物を、従来の技術、例えばクロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、および抽出により、抗体から除去することができる。例えば抗体は、標準の技術を用いた固定化プロテインＧまたはプロテインＡでのクロマトグラフィーにより、精製することができる。

特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントを、使用することができる。そのようなフラグメントにはＦａｂフラグメントなどがあり、それは、標準の技術を用いて（例えば、パパイン消化でＦａｂおよびＦｃフラグメントを得ることにより）調製することができる。ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントは、アフィニティークロマトグラフィーにより（例えば、固定化プロテインＡカラムで）標準の技術を用いて分離することができる。そのような技術は、当該技術分野で周知であり、例えばＷｅｉｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９８６， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｂｏｓｔｏｎを参照されたい。

特定の態様において、ＨＥ４融合蛋白質が、提供される。様々なエフェクター蛋白質をコードする配列にインフレームで結合されたＤＮＡ配列によりコードされた免疫グロブリンＶ領域ドメインのおかげで、予め選択された抗原への特異的結合アフィニティーを有する多機能融合蛋白質は、例えばＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４号、米国特許第５，１３２，４０５号、同第５，０９１，５１３号および同第５，４７６，７８６号に開示された通り、当該技術分野で公知である。そのようなエフェクター蛋白質は、非限定的にビオチン模倣配列、検出可能な標識部分での直接的な共有結合修飾、特異的標識されたレポーター分子への非共有結合、検出可能な基質の酵素修飾または固相担体への固定化（共有または非共有結合）をはじめとする、当業者に熟知された様々な技術のいずれかにより、融合蛋白質の結合を検出するのに用いられ得るポリペプチドドメインを含む。

本明細書に開示された方法において用いられる単鎖抗体は、ファージディスプレイなどの方法により生成および選択することもできる（例として、米国特許第５，２２３，４０９号参照）。簡潔に述べると、この方法において、ＤＮＡ配列を、フィラメントファージ、例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに挿入することができる。マルチクローニングサイトを有する複数のベクターが、挿入のために開発された（ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ， Ｍ． Ａ．， Ｋｅｎｔ， Ｋ． Ａ．， Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ． Ｃ． ＆ Ｍａｒｋｌａｎｄ， Ｗ． Ｇｅｎｅ １２８， ２９−３６ （１９９３）； Ｓｃｏｔｔ ＪＫ， Ｓｍｉｔｈ ＧＰ． Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９０ Ｊｕｌ ２７；２４９（４９６７）：３８６−３９０； Ｓｍｉｔｈ ＧＰ， Ｓｃｏｔｔ ＪＫ． Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９３； ２１７：２２８−２５７）。挿入されたＤＮＡ配列は、無秩序に生成させることができ、またはＨＥ４ａポリペプチドに結合するための公知結合ドメインの変異体であってもよい。挿入された配列によりコードされたペプチドは、バクテリオファージの表面に提示される。ＨＥ４ａポリペプチドのための結合ドメインを発現するバクテリオファージは、当該技術分野で周知の方法および本明細書に開示された核酸コード配列を用いて調製された固定化ＨＥ４ａポリペプチド、例えば組換えポリペプチドに結合することにより選択される。未結合のファージは、典型的には１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有し、塩を含まないか、または塩濃度の低い洗浄液により除去される。結合されたファージは、例えば塩含有緩衝液で溶出される。ＮａＣｌ濃度は、ファージが全て溶出されるまで、段階的に増加させる。典型的には高いアフィニティーで結合するファージ程、高い塩濃度により放出される。溶出されたファージは、細菌宿主内で増殖される。更に選択を実施して、高アフィニティーで結合する幾つかのファージについて選択することができる。その後、結合ファージ内の挿入物のＤＮＡ配列が決定される。結合ペプチドの予測されたアミノ酸配列が分かれば、本明細書においてＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体としての使用に十分なペプチドを、組換え手段または合成のいずれかにより作製することができる。組換え手段は、抗体が融合蛋白質として産生された場合に用いられる。該ペプチドは、アフィニティーまたは結合を最大にするために、２種以上の類似または非類似ペプチドのタンデムアレイとして生成させることもできる。

この開示において、様々なアッセイ形式が提供される。ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体と反応性のある抗原決定基を検出するために、検出試薬は、典型的には抗体であり、それは本明細書に記載された通り、または当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかにより調製することができる。非限定的に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈殿法、平衡透析法、免疫拡散法および他の技術をはじめとし、抗体を用いて試料中のポリペプチドを検出する、当業者に公知の様々なアッセイ形式が存在する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８； Ｗｅｉｒ， Ｄ． Ｍ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９８６， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｂｏｓｔｏｎを参照されたい。例えば該アッセイは、生物学的試料からの蛋白質調製物がゲル電気泳動に供されて、適切な膜に移し替えられ、抗体と反応させる、ウェスタンブロット形式で実施されてもよい。その後、膜上の抗体の存在を、当該技術分野で周知であり以下に記載される通り、適切な検出試薬を用いて検出することができる。

別の実施形態において、該アッセイは、標的ＨＥ４ａポリペプチドに結合してそれを試料の残りから除去するための、固体担体上で固定化された抗体の使用を含む。その後、結合されたＨＥ４ａポリペプチドは、別個のＨＥ４ａポリペプチド抗原決定基、例えば検出可能なレポーター部分を含む試薬と反応性のある第二抗体を用いて検出されてもよい。非限定的例として、この実施形態によれば、別個の抗原決定基を認識する固定化抗体および第二抗体は、例示的なモノクローナル抗体のうちの２種、２Ｈ５および３Ｄ８であってもよい。あるいはＨＥ４ａポリペプチドを検出可能なレポーター部分で標識し、固定化抗体と試料とのインキュベートの後、固定化ＨＥ４ａポリペプチド特異性抗体に結合させる、拮抗アッセイを用いてもよい。試料の成分が、標識されたポリペプチドの抗体への結合を阻害する度合いが、試料と固定化抗体との反応性を示し、結果として試料中のＨＥ４ａレベルを示す。

固体担体は、抗体が付着し得る、当業者に公知の任意材料、例えばマイクロタイタープレートの検査ウェル、ニトロセルロースフィルター、または別の適切な膜であってもよい。あるいは担体は、ビーズまたはディスク、例えばガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはプラスチック、例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニルであってもよい。抗体は、特許および科学文献に詳細に記載された当業者に公知の様々な技術を用いて、固体担体に固定されてもよい。

特定の実施形態において、試料中のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを検出するアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、最初、固体担体、一般にはマイクロタイタープレートのウェルに固定されているＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体（例えば、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８などのモノクローナル抗体）を、生物学的試料と接触させて、試料中の、抗体と反応性の抗原決定基を有する、天然由来可溶性分子が、固定化抗体に結合されて（例えば、室温では３０分のインキュベーション時間が、一般に十分である）、抗原−抗体複合体または免疫複合体を形成させることにより、実施されてもよい。試料の未結合成分は、その後、固定化免疫複合体から除去される。次に、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体が添加されるが、第二抗体の抗原結合部位は、固定化第一抗体の抗原結合部位が、ＨＥ４ａポリペプチドに結合するのを拮抗阻害しない（例えば、固体担体上の固定化モノクローナル抗体と同一でない２Ｈ５または３Ｄ８などのモノクローナル抗体）。第二抗体は、本明細書に示された通り検出可能に標識することができ、そのため直接検出することができる。あるいは第二抗体は、検出可能に標識された二次（または「第二段階の」）抗−抗体の使用により、または本明細書に示された特異的検出試薬を用いることにより間接的に検出することができる。イムノアッセイを熟知した者は二抗体サンドイッチイムノアッセイにより特定の抗原を免疫学的に検出するための数多くの試薬および構成が存在することを理解しているため、本明細書に開示された方法は、任意の特別な検出手順に限定されない。

先に記載された二抗体サンドイッチアッセイを用いる本明細書に開示された方法の特定の実施形態において、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第一の固定化抗体は、ポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体は、ポリクローナル抗体である。非拮抗ＨＥ４ａ抗体の任意の組み合わせを、本明細書に記載された方法と共に用いることができる。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびそれらの組み合わせをはじめとする。本明細書に開示された方法の特定の他の実施形態において、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第一の固定化抗体は、モノクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書に開示された方法の特定の他の実施形態において、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第一の固定化抗体は、ポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書に開示された方法の特定の他の非常に好ましい実施形態において、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第一の固定化抗体は、モノクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体は、モノクローナル抗体である。例えばこれらの実施形態において、本明細書に示されたモノクローナル抗体１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８は、ＨＥ４ａポリペプチド上で別個の非拮抗的抗原決定基（例えば、エピトープ）を認識するため、これらのモノクローナル抗体の任意の対による組み合わせを用い得ることに留意しなければならない。特に、特定の組み合わせは、特異的全長ＨＥ４変異体またはスプライス変異体を検出するのに有用である。本明細書に開示された方法の別の実施形態において、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第一の固定化抗体および／またはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体は、当該技術分野で公知であり本明細書で参照される抗体の種類のいずれか、例えば限定ではなく例示として、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント、免疫グロブリンＶ領域融合蛋白質または単鎖抗体であってもよい。当業者は、本明細書に開示された方法が、本明細書に開示および請求された方法における他の抗体形態、フラグメント、誘導体などの使用を包含することを理解するであろう。

特定の実施形態において、第二抗体は、酵素、染色剤、放射線核種、発光基、蛍光基またはビオチンなどの検出可能なレポーター部分または標識を含むことができる。任意のレポーター部分または標識は、そのようなシグナルが洗浄後の担体に残る抗体量に直接関連するまたは正比例する限り、本明細書に開示された方法と共に用いることができる。その後、固体担体に結合されたままの第二抗体の量が、特異的で検出可能なレポーター部分または標識に適した方法を用いて測定される。放射性基では、シンチレーションカウントまたはオートラジオグラフィー法が、一般に適切である。抗体−酵素コンジュゲートを、様々なカップリング技術を用いて調製することができる（例として、Ｓｃｏｕｔｅｎ， Ｗ． Ｈ． （１９８７） Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ． Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５， ３０−６５参照）。分光法を用いて、染色剤（例えば酵素反応での発色生成物）、発光基および蛍光基を検出することができる。ビオチンは、異なるレポーター基（一般には、放射性もしくは蛍光基、または酵素）に結合するアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出することができる。酵素のレポーター基は、一般に基質の添加（一般には特定の期間）と、その後の反応生成物の分光分析、分光光度分析または他の分析により検出することができる。標準物および標準的付加を用い、周知技術を利用して試料中の抗原レベルを測定することができる。

別の実施形態において、本明細書に開示された方法は、生物学的供給源または対象からの生物学的試料中の免疫特異的に反応性の抗体の検出により卵巣癌の存在についてスクリーニングするための、本明細書に示されたＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの使用を企図する。この実施形態によれば、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（または本明細書に示されたトランケート型ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをはじめとするそのフラグメントまたは変異体）は、検出可能に標識され、生物学的試料と接触させて、試料中の可溶性形態の天然由来抗体のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドへの結合を検出する。例えばＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、即座に検出可能な（例えば、放射性標識された）アミノ酸のインビトロ翻訳の間に取り込みなどの周知方法と協調的に本明細書に開示された配列を用いることにより、または先に記載されたような他の検出可能なレポーター部分を使用することにより、生合成的に標識することができる。本明細書に開示されたＨＥ４ａ融合ポリペプチドなどの特定のＨＥ４ａポリペプチドが、特に免疫原性であるペプチドを提供することができ、そのため特異的で検出可能な抗体を生じ得ることを、該方法のこの実施形態が企図することを、当業者は即座に理解するであろう。例えばこの理論によれば、特定のＨＥ４ａ融合ポリペプチドは、貪欲な免疫反応を誘発する「非自己」抗原を表すことができ、融合ドメインを欠くＨＥ４ａポリペプチドは、体液または細胞を介した免疫作用を容易に誘発しない、より類似した「自己」抗原として免疫系により認められ得る。

本明細書に開示された方法による悪性状態の存在についてのスクリーニング方法は、対象からの生物学的試料中の１種を超える腫瘍関連マーカを検出することにより更に向上させることができる。したがって開示された方法は、天然由来成分とＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体との反応性を検出することに加えて、当該技術分野で公知の確立された方法および開示された方法を利用して悪性状態の少なくとも１種の追加的可溶性マーカを検出することも包含する。先に述べられた通り、現在は、即座に得られる生物学的液体の試料中で検出可能である可溶性腫瘍関連抗原が複数存在する。

卵巣癌を有する確率の高い患者を同定する例示的スクリーニング方法は、一般に、卵巣癌中で選択的に過剰発現される複数のバイオマーカの発現を、患者の身体試料中で検出することを含む。バイオマーカの過剰発現は、患者が卵巣癌を有する確率が高いことを示す。本開示の方法は、例えば第一のアッセイステップが、第一のバイオマーカ（例えば、ＨＥ４／ＨＥ４ａ）またはバイオマーカパネルの発現を検出するために実施される、「２ステップ」分析を含み得る。第一のバイオマーカまたはバイオマーカパネルが、過剰発現されると、第二のアッセイステップが実施されて、第二のバイオマーカまたはバイオマーカパネルの発現を検出する。第一および第二のバイオマーカまたはバイオマーカパネルの過剰発現が、患者が卵巣癌を有する可能性が高いことを示す。

あるいは、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列は、標準のハイブリダイゼーションおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて検出することができる。適切なプローブおよびプライマーは、本明細書に示されたＨＥ４ａ ｃＤＮＡ配列に基づき、当業者により設計することができる。アッセイは、一般に、生物学的供給源、例えば真核生物細胞、細菌、ウイルス、そのような生物体から調製された抽出物および生存する生物体内に見出された液体、から得られた様々な試料のいずれかを用いて実施することができる。

実施例で用いられる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知である。

本明細書で開示されたＨＥ４ａポリペプチドの物理化学的および免疫化学的特性から、そして本明細書に開示されたＨＥ４ａをコードする核酸配列を用いて、当業者は、周知の方法により特異的抗体を産生し、特徴づけるために用いられ得る組換えＨＥ４ａポリペプチドを調製することもできる。ＨＥ４ａポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下でホ乳類細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系を用いて、本明細書に開示されたＨＥ４ａポリペプチドＤＮＡコード領域から得られたＲＮＡを用いてそのような蛋白質を産生することもできる。原核生物および真核生物宿主と共に使用される適切なクローニングおよび発現ベクターは、過去に記載されており、当業者に周知である。本発明の好ましい実施形態において、ＨＥ４ａポリペプチドは、ホ乳類細胞中で発現される。

それゆえ本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする単離された核酸分子、またはそのようなＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズし得る核酸分子、またはそれに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。

変異体は、ネイディブＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示す。％同一性は、配列を当業者に周知のコンピュータアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． （１９９１） Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１９： ５５５−５６５； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ， Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９２ Ｎｏｖ １５；８９（２２）：１０９１５−９，ＮＣＢＩのウェブサイト （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）から入手可能）を用いて比較することにより即座に測定することができる。

特定の変異体は、ネイティブの遺伝子に対して実質的に相同性である。そのようなポリヌクレオチド変異体は、ネイティブＨＥ４ａ抗原をコードする天然由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（または相補配列）に対して中等度にストリンジェントな（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズすることが可能である。適切な、中等度にストリンジェントな条件には、例えば、以下のステップまたはそれらの均等なステップが含まれる：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備洗浄して；５×ＳＳＣと共に５０℃〜６５℃で一晩ハイブリダイズし；その後、それぞれ２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣを含有する０．１％ＳＤＳを用いて６５℃で２０分間の洗浄を２回。追加的ストリンジェンシーでは、条件は例えば、６０℃の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５分間の洗浄、または均等な条件が含まれてもよい。当業者は、該当する特定の核酸に場合により選択的となる適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を設定するために、日常的事柄として変動され得るパラメータを、即座に理解し、更に、そのような条件がハイブリダイゼーションに関与する特定の核酸配列の関数となり得ることを理解するであろう。

ＨＥ４ａポリペプチド、または本発明により用いられる任意の他のＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸は、非限定的に、ＨＥ４ａポリペプチドのコード配列のみ；ＨＥ４ａポリペプチドのコード配列および追加的コード配列；ＨＥ４ａポリペプチドのコード配列（場合により追加的コード配列）および非コード配列、例えばＨＥ４ａポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'を含むことができ、それらは例えば、限定する必要はないが、調節されたまたは調節可能なプロモーター、エンハンサー、他の転写調節配列、レプレッサー結合配列、翻訳調節配列、または任意の他の調節核酸配列となり得る１種以上の調節核酸配列を更に含むことができる。つまり用語「ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸」は、ポリペプチドのコード配列のみを含む核酸、ならびに追加的コードおよび／または非コード配列（複数可）を含む核酸を包含する。

本発明は、更に、ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号ＨＥ４の推定されたアミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチド、のフラグメント、類似体および誘導体をコードする本明細書に記載された核酸の変異体に関する。ＨＥ４ａをコードする核酸の変異体は、核酸の天然由来対立遺伝子もしくはスプライス変異体、または非天然由来変異体であってもよい。当該技術分野で公知の通り、対立遺伝子変異体は、コードされたＨＥ４ａポリペプチドの機能を実質的に変化させない、１種以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加のうちの少なくとも１つを有し得る核酸配列の代替形態である。ＨＥ４ａの変異体および誘導体は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得てもよい。ネイティブアミノ酸配列の改変は、複数の従来法のいずれかにより実行されてもよい。突然変異は、制限部位がフランクされてネイディブ配列のフラグメントがライゲートされた、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションの後、得られた制限配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。

あるいは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）手順を用いて、当業者に周知の通り、所定のコドンが置換、欠失または挿入により改変されている場合がある、改変された遺伝子を提供することができる。

生物学的活性に必要とならないアミノ酸残基もしくは配列の様々な付加もしくは置換、または末端もしくは内部残基もしくは配列の欠失をコードする均等なＤＮＡ構築物も、本発明により包含される。例えば、生物学的活性にとって肝要とならないＣｙｓ残基をコードする配列は、Ｃｙｓ残基を欠失または他のアミノ酸と交換させるよう改変させて、復元の際に間違った分子内ジスルフィド架橋が形成するのを防止することができる。他の均等物は、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増進することにより、調製することができる。例として、欧州特許第２１２，９１４号には、部位特異的突然変異を利用して、蛋白質中のＫＥＸ２プロテアーゼ処理部位を不活性化することが開示される。ＫＥＸ２プロテアーゼ処理部位は、残基を欠失、付加または置換してＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の出現を排除することにより不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対は、ＫＥＸ２切断を著しく受け難く、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇからＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的で好ましいアプローチを表す。

適切なＤＮＡ配列（複数可）が、様々な手順により選択された宿主細胞に適した複数の周知ベクターのいずれかに挿入されてもよい。一般的にはＤＮＡ配列は、当該技術分野で公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のためのクローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製の標準技術、および様々な分離技術は、公知であり、当業者に一般的に用いられる。

ホ乳類発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ Ｙ． ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＳＶ４０ ｍｕｔａｎｔｓ． Ｃｅｌｌ． １９８１ Ｊａｎ；２３（１）：１７５−８２により記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現し得る他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。ホ乳類発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写末端配列、ならびに５'フランキング非転写配列も含む。例えばＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位から得られる、ＤＮＡ配列を用いて、必要とされるに非転写遺伝要素を提供してもよい。宿主細胞への該構築物の導入は、非限定的に例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、または電気穿孔をはじめとする、当業者に熟知されている様々な方法により実行することができる（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．Ｇ．， Ｄｉｂｎｅｒ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｂａｔｔｅｙ， Ｊ．Ｆ．： Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８６）。

本発明のＨＥ４ａポリペプチドは、非修飾ポリペプチドであってもよく、あるいは例えばグリコシル化、リン酸化、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー修飾などを含む脂肪アシル化、ホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼｃを介した加水分解などのホスホリパーゼ切断、プロテアーゼ切断、脱リン酸化、または任意の他のタイプの蛋白質翻訳後修飾、例えば共有化学結合の形成もしくは切断を含む修飾により、翻訳後修飾されているポリペプチドであってもよい。

ＨＥ４ａポリペプチド、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合蛋白質を参照する場合の用語「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」は、そのようなポリペプチドと同じ生物学的機能および／または活性を本質的に保持する任意のＨＥ４ａポリペプチドを指す。つまり類似体は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドアイソフォーム、例えば分化により翻訳後修飾されたＨＥ４ａポリペプチドまたはスプライス変異体などの変異体を含んでいてもよい。当該技術分野で周知の通り、「スプライス変異体」は、ＲＮＡ転写産物の異なる細胞内プロセシングから生じるポリペプチドの変異体または別の形態を含む。例えば２種の異なるｍＲＮＡ種は、互いに、１つのｍＲＮＡ種内の特定のエクソンに対応する配列の全てまたは一部を含むこと、および他の種のものが存在しないことのみが異なる、お互いのスプライス変異体となり得る。当業者に理解される通り、他の構造的関連性は、一般にスプライス変異体とみなされるｍＲＮＡ種間に存在し得る。ＨＥ４ａポリペプチドは、プロ蛋白質を更に含み、プロ蛋白質部分を切断して、活性ＨＥ４ａポリペプチドを産生することにより活性化され得る。

ＨＥ４ａポリペプチドまたはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドのフラグメント、誘導体および類似体の生物学的機能および／または活性は、非限定的に、本明細書に開示された通り、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法におけるマーカとしてのそのようなポリペプチドの使用を含む。例えば、可溶性形態であり、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と反応性のある抗原決定基を有する、天然由来分子を、対象からの試料中で検出することにより、当業者は、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性をモニタリングしてもよい。更に、特定の実施形態において本発明のスクリーニング方法が、可溶性形態であり、（ｉ）悪性状態を有する疑いのある第一の対象からの第一の生物学的試料、および（ｉｉ）悪性状態を有さないことが知られている第二の対象からの第二の生物学的試料、のそれぞれのＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と反応性のある抗原決定基を有する、天然由来の検出可能な分子の相対量、レベルおよび／または総量を比較することに向けられる。したがって生物学的試料中のＨＥ４ａポリペプチドの相対量的な存在は、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性であってもよいが、そのような機能および／または活性は、そのように限定されてはならない。

ＨＥ４ａポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくは類似体は、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が、保存もしくは非保存のアミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されたもの；（ｉｉ）ＨＥ４ａポリペプチドの精製に用いられ得るアミノ酸またはプロ蛋白質配列をはじめとする、追加のアミノ酸がＨＥ４ａポリペプチドに融合されているもの；または（ｉｉｉ）トランケート型ＨＥ４ａポリペプチドであってもよい。そのようなフラグメント、誘導体および類似体は、本明細書内の技術の当業者の範囲内と思われる。

トランケート型ＨＥ４ａポリペプチドは、全長未満のＨＥ４ａポリペプチドを含む任意のＨＥ４ａポリペプチド分子であってもよい。本発明により提供されたトランケート型分子は、トランケート型生体ポリマーを包含してもよく、本発明の好ましい実施形態において、そのようなトランケート型分子は、トランケート型核酸分子またはトランケート型ポリペプチドであってもよい。トランケート型核酸分子は、公知または記載された核酸分子の全長未満のヌクレオチド配列を有し、そのような公知または記載された核酸分子は、当業者がそれを完全長分子とみなす限り、天然由来、合成または組換え核酸分子であってもよい。つまり例えば遺伝子配列に対応するトランケート型核酸分子は、完全長未満の遺伝子を含み、該遺伝子は、コードおよび非コード配列、プロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列、フランキング配列など、ならびに遺伝子の一部として認識される他の機能的および非機能的配列を含む。別の例において、ｍＲＮＡ配列に対応するトランケート型核酸分子は、全長未満のｍＲＮＡ転写産物を含み、それは様々な翻訳および非翻訳領域、ならびに他の機能的および非機能的配列を含んでいてもよい。別の好ましい実施形態において、トランケート型分子は、特定の蛋白質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

本明細書で用いられる「欠失」は、当業者に理解される共通の意味を有し、例えば本明細書に示されたトランケート型分子の場合と同様に、対応する全長分子に関して末端または非末端領域の配列の部分を１つ以上欠く分子を指すことができる。核酸分子またはポリペプチドなどの直鎖状生体ポリマーであるトランケート型分子は、分子のいずれかの末端の欠失または分子の非末端領域の欠失の１つ以上を有していてもよく、そのような欠失は、１〜１５００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基、好ましくは１〜５００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基、より好ましくは１〜３００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。

当該技術分野で公知の通り、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれへの保守的アミノ酸置換を、第二のポリペプチドの配列を比較することにより測定される。２つのポリペプチドまたはヌクレオチド配列間の類似性、または％同一性であっても、ＢＬＡＳＴアルゴリズムなどの当業者に周知のコンピュータアルゴリズムを用いて配列を比較することにより即座に測定することができる。他の有用なコンピュータアルゴリズムの例は、ＡｌｉｇｎおよびＦＡＳＴＡなどのプログラムで用いられるものがあり、例えばＧｅｎｅｓｔｒｅａｍ ｉｎｔｅｒｎｅｔ ｗｅｂｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｈｕｍａｉｎｅ， Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ （ｗｗｗ２．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｈｏｍｅ．ｅｎｇ．ｈｔｍｌ）にアクセスしてもよい。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを製造するために用いられてもよく、それゆえフラグメントは、全長ポリペプチドを製造するための中間体として用いられてもよい。

用語「単離された」は、その材料が本来の環境（例えば、それが天然由来であれば、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生存する動物の体内に存在する天然由来ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されていないが、自然系に共存する材料の一部または全てから分離された同じポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離されている。そのようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、組成物の一部となり得、そのような組成物が自然環境の一部ではない場合でも単離することができる。

アフィニティー技術は、本発明の方法による使用のためにＨＥ４ａポリペプチドを単離する状況において特に有用となり、ＨＥ４ａポリペプチドとの特異的結合相互作用を発揮して分離を実行する任意の方法を含むことができる。例えばＨＥ４ａポリペプチドは、共有結合的に付着されたオリゴ糖部分を含み得るため、レクチンによる炭水化物の結合を可能にする条件下での適切な固定化レクチンへのＨＥ４ａポリペプチドの結合などのアフィニティー技術は、特に有用なアフィニティー技術となり得る。他の有用なアフィニティー技術は、ＨＥ４ａポリペプチドを単離するための免疫学的技術を包含し、その技術は、抗原の抗体結合部位と、複合体中に存在する抗原決定基との特異的結合相互作用に依存する。免疫学的技術としては、限定する必要はないが、免疫アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈殿、固相免疫吸着または他の免疫アフィニティー法が挙げられる。

本明細書に記載された通り、本発明は、ＨＥ４ａに融合されたポリペプチドを含む融合蛋白質を提供する。そのようなＨＥ４ａ融合蛋白質は、追加のコード配列にインフレームで融合されたＨＥ４ａコード配列を有する核酸によりコードされていて、限定ではなく例として、ＨＥ４ａ融合蛋白質の検出、単離および／または精製を可能にする追加の機能的または非機能的ポリペプチド配列に融合されたＨＥ４ａポリペプチド配列の発現を提供する。そのようなＨＥ４ａ融合蛋白質は、蛋白質間アフィニティー、金属アフィニティーもしくは電荷アフィニティーを基にしたポリペプチド精製による、またはプロテアーゼにより切断可能な融合配列を含む融合蛋白質の特異的プロテアーゼ切断によるＨＥ４ａ融合蛋白質の検出、単離および／または精製を可能にして、ＨＥ４ａポリペプチドを融合蛋白質から分離可能にしてもよい。

つまりＨＥ４ａ融合蛋白質は、ＨＥ４ａに付加されたポリペプチドまたはペプチドを指すアフィニティータグポリペプチド配列を含むことで、リガンドとの特異的アフィニティー相互作用を介したＨＥ４ａの検出および単離を容易にしてもよい。リガンドは、本明細書に示された特異的結合相互作用を通してアフィニティータグが相互作用し得る、任意の分子、受容体、対抗受容体、抗体などであってもよい。そのようなペプチドとしては、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号およびＴ．Ｐ． Ｈｏｐｐ， Ｂ． Ｇａｌｌｉｓ ａｎｄ Ｋ．Ｓ． Ｐｒｉｃｋｅｔｔ （１９８８） Ａ ｓｈｏｒｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｒｋｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４−１２１０に記載されたポリ−Ｈｉｓもしくは抗原同定ペプチド、またはＸＰＲＥＳＳ（商標）エプトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。アフィニティー配列は、細菌宿主の場合にマーカに縮合された成熟ポリペプチドの精製をもたらす、例えばｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはｐＱＥ−９ベクターにより供給される、ヘキサ−ヒスチジンタグであってもよく、または例えばアフィニティー配列は、ホ乳類宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が用いられる場合にはヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質から得られた、抗体に認識されるエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ ＩＡ， Ｎｉｍａｎ ＨＬ， Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ＲＡ， Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ ＡＲ， Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ＭＬ， Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ． １９８４ Ｊｕｌ；３７（３）：７６７−７８）。

ＨＥ４ａ融合蛋白質は、特別な実施形態において、そして以下により詳細に記載される通り、ＨＥ４ａに付加された免疫グロブリン定常領域ポリペプチドを更に含むことで、ＨＥ４ａの検出、単離および／または位置決定を容易にする。免疫グロブリン定常領域ポリペプチドは、好ましくはＨＥ４ａポリペプチドのＣ末端に融合される。非限定的理論によれば、本明細書に示されたＨＥ４ａ融合蛋白質への免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域ドメインの含有は、利点、例えば特定の宿主（即ち、「自己」対「非自己」）において用いられる場合には特定のＩｇ領域の免疫原性／非免疫原性に関連する利点、または融合蛋白質の単離および／もしくは検出を容易にする利点を提供し得る。Ｉｇ融合蛋白質のこれらおよび他の利点は、当業者により理解されよう。抗体から得られたポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された異種ペプチドを含む融合蛋白質の一般的調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ａ， Ｍａｒｓｔｅｒｓ ＳＡ， Ｃａｐｏｎ ＤＪ， Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ， Ｆｉｇａｒｉ ＩＳ， Ｐｅｎｎｉｃａ Ｄ， Ｇｏｅｄｄｅｌ ＤＶ， Ｐａｌｌａｄｉｎｏ ＭＡ， Ｓｍｉｔｈ ＤＨ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ ｂｙ ａ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９１ Ｄｅｃ １；８８（２３）：１０５３５−９、およびＢｙｒｎ ｅｔ ａｌ． （Ｂｙｒｎ ＲＡ， Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ， Ｌｕｃａｓ Ｃ， Ｓｍｉｔｈ Ｄ， Ｍａｒｓｔｅｒｓ ＳＡ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＳ， Ｃｏｓｓｕｍ Ｐ，Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ， Ｗｕｒｍ ＦＭ， Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ＣＤ４ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９０ Ａｐｒ １２；３４４（６２６７）：６６７−７０に記載される。ＨＥ４ａ；Ｆｃ融合蛋白質をコードする遺伝子融合物が、適切な発現ベクターに挿入される。本発明の特定の実施形態において、ＨＥ４ａ；Ｆｃ融合蛋白質が、同じ方法で抗体分子を組み立てて、そこで鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチドを形成し、二量体ＨＥ４ａ融合蛋白質を生成してもよい。

ＨＥ４ａをコードする配列にインフレームに結合したＤＮＡ配列によりコードされた免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドのおかげで、予め選択された抗原への特異的結合アフィニティーを有するＨＥ４ａ融合蛋白質も、本明細書に示された変異体およびそのフラグメントを含め、本発明の範囲内である。免疫グロブリンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合蛋白質の構築のための一般的方策は、例えば、欧州特許第０３１８５５４号； 米国特許第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；および同第５，４７６，７８６号に開示される。

本発明の核酸は、所望のアフィニティー特性を有する他のポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの酵素に融合したＨＥ４ａポリペプチドを含む融合蛋白質もコードし得る。別の実施例として、ＨＥ４ａ融合蛋白質は、スタフィロコッカス・アウレウスプロテインＡポリペプチドに融合したＨＥ４ａポリペプチドも含んでいてもよく；プロテインＡをコードする核酸、および免疫グロブリン定常領域へのアフィニティーを有する融合蛋白質を構築する際のそれらの使用は、例えば米国特許第５，１００，７８８号に概ね開示される。ＨＥ４ａ融合蛋白質の構築のための他の有用なアフィニティーポリペプチドは、例えば国際公開第８９／０３４２２号パンフレット；米国特許第５，４８９，５２８号； 同第５，６７２，６９１号；国際公開第９３／２４６３１号パンフレット； 米国特許第５，１６８，０４９号；同第５，２７２，２５４号およびその他に開示されたストレプトアビジン融合蛋白質、ならびにアビジン融合蛋白質（例えば、欧州特許第５１１，７４７号参照）を含んでいてもよい。本明細書および引用された参考資料に示される通り、ＨＥ４ａポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチドであってもよく、あるいはその変異体またはフラグメントであってもよい、融合ポリペプチド配列に融合されていてもよい。

本発明は、融合蛋白質を細胞核に向かわせるポリペプチド配列を含むことで、小胞体（ＥＲ）の内腔に常在するか、古典的なＥＲ−ゴルジ分泌経路（例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ． （１９９０） Ｔｈｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ． １１５， １９５−２０１参照）を介して細胞から分泌されるか、原形質膜に取り込まれるか、膜貫通型細胞表面受容体の細胞質ドメインを含む特異的細胞質成分と会合するか、または当業者に熟知された様々な公知細胞内蛋白質分類メカニズムのいずれかにより特定の細胞小器官位置に向かわせる、ＨＥ４ａ融合蛋白質も企図する（例として、Ｒｏｔｈｍａｎ ＪＥ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９４ Ｎｏｖ ３；３７２（６５０１）：５５−６３．， Ａｄｖａｎｉ ＲＪ， Ｂａｅ ＨＲ， Ｂｏｃｋ ＪＢ， Ｃｈａｏ ＤＳ， Ｄｏｕｎｇ ＹＣ， Ｐｒｅｋｅｒｉｓ Ｒ， Ｙｏｏ ＪＳ， Ｓｃｈｅｌｌｅｒ ＲＨ． Ｓｅｖｅｎ ｎｏｖｅｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＳＮＡＲＥ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｌｏｃａｌｉｚｅ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９８参照）。したがって、これらおよび関連の実施形態は、該当するポリペプチドを、所定の細胞内、膜または細胞外位置決定に案内する本発明の組成物および方法により包含される。

本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび構築物にも関し、詳細には先に示された本発明によるＨＥ４ａポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組換え発現構築物」；本発明のベクターおよび／または構築物で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え技術による、本発明のＨＥ４ａポリペプチドおよび融合蛋白質、またはそれらのフラグメントもしくは変異体の製造にも関する。ＨＥ４ａ蛋白質は、適切なプロモーターの制御下、ホ乳類細胞、酵母、細菌または他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系を、本発明のＤＮＡ構築物から得られたＲＮＡを用いてそのような蛋白質を製造するのに用いることもできる。

一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカ、例えばＥ．コリのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレビシエＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子から得られたプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、オペロンをコードする解糖酵素、とりわけ３−ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−ファクター、酸ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質などから得ることができる。その非相同的構造配列は、適切な時期に、翻訳開始および終結配列を含んで組み立てられる。場合により非相同配列は、所望の特徴、例えば発現された組換え産物の安定化または簡便な精製、を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードすることができる。

細菌使用に有用な発現構築物は、発現ベクターに、機能的プロモーターを有する作動可能なリーディングフェーズ（ｏｐｅｒａｂｌｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）における適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に所望の蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより、構築される。該構築物が１つ以上の表現型の選択マーカおよび複製起点を含むことで、ベクター構築物を確実に維持し、所望により、宿主内で増幅させることができる。形質転換に適した原核生物宿主としては、Ｅ．コリ、バシラス・サブチリス、サルモネラ・ティフィムリウム、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびスタフィロコッカス属内の種々の種が挙げられるが、選択の問題として他の種を用いてもよい。宿主内で複製可能および生存可能である限り、いずれかの他のプラスミドまたはベクターが用いられてもよい。

代表的であるが非限定的な例として、細菌使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、選択マーカおよび細菌の複製起点を含むことができる。そのような商業的ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」区分が、適切なプロモーターおよび発現させられるべき構造配列と組み合わせられる。

適切な宿主菌株の形質転換および適切な細胞密度への宿主菌株の増殖の後、選択されたプロモーターが、本明細書に示された調節されたプロモーターであるならば、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘発）により誘発され、細胞を更なる期間、培養させる。細胞は、典型的には、遠心分離により回収され、物理的または化学的手段により破壊され、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。蛋白質の発現において用いられる微生物細胞は、冷凍−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用をはじめとする任意の従来法によって破壊することができ、そのような方法は、当業者に周知である。

つまり、例えば本明細書に示された本発明の核酸は、ＨＥ４ａポリペプチドを発現するための組換え発現構築物として、様々な発現ベクター構築物の任意の１つに含まれてもよい。そのようなベクターおよび構築物としては、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルスおよび仮性狂犬病が挙げられる。しかし、宿主において複製可能および生存可能である限り、任意の他のベクターを組換え発現構築物の調製に用いてもよい。

適切なＤＮＡ配列（複数可）は、様々な手順によりベクター内に挿入され得る。一般的にＤＮＡ配列は、当該技術分野で公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のためのクローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製の標準技術、ならびに様々な分離技術は、公知であり、当業者に一般的に用いられる。複数の公知の標準技術のうちの任意の１つ以上を、用いることができる。

発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成に向かわせる少なくとも１種の適切な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは調節されたプロモーター）と作動可能に連結される。そのような発現制御配列の代表的な例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０のプロモーター、Ｅ．コリ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλ Ｐ_Ｌプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することで知られる他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、選択マーカを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターが、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の命名された細菌プロモーターとしては、ｌａｃ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λ Ｐ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルに十分含まれ、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された少なくとも１種のプロモーターまたは調節されたプロモーターを含む特定の特に好ましい組換え発現構築物の調製が、本明細書に記載される。

先に述べられた通り、特定の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。例えばレトロウイルスプラスミドベクターを得ることができるレトロウイルスとしては、非限定的に、モロニーマウス白血病ウイルス；脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられる。

該ウイルスベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターとしては、非限定的に、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０ （１９８９）に記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、非限定的にヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターをはじめとする真核生物細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）が挙げられる。利用され得る別のウイルスプロモーターとしては、非限定的に、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明白となり、先に記載された調節されたプロモーターまたはプロモーターのいずれかの１つであってもよい。

該レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、非限定的に、全体が本明細書に参考として組み入れられた、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）に記載の、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられる。該ベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、非限定的に、電気穿孔、リポソームの使用、およびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。１つの代替法において、該レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム内に封入するか、または脂質に結合させ、その後、宿主に投与してもよい。

該プロデューサー細胞株は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合蛋白質をコードする核酸配列（複数可）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。その後、そのようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、真核生物細胞を形質導入することができる。形質導入された真核生物細胞は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合蛋白質をコードする核酸配列（複数可）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、非限定的に、胚幹細胞、胚癌細胞に加え、造幹血細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞および様々な他の培養に適した細胞株が挙げられる。

ウイルスベクターを用いて組換えＨＥ４ａ発現構築物を調製する本発明の実施形態の別の例として、１つの好ましい実施形態において、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合蛋白質の発現に向かわせる組換えウイルス構築物により形質導入された宿主細胞は、ウイルス出芽の間にウイルス粒子により取り込まれる宿主細胞膜の部分から得られる、発現されたＨＥ４ａポリペプチドまたは融合蛋白質を含むウイルス粒子を産生することができる。別の好ましい実施形態において、ＨＥ４ａをコードする核酸配列は、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ３９， Ｃ． Ｄ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．， １９９５； Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ， "Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，" Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ １６ ｉｎ： Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９２， ｐ１６−３２ ｔｏ １６４８に記載された通り、バキュロウイルスシャトルベクターにクローニングされ、その後、バキュロウイルスで組換えて、例えばＳｆ９宿主細胞を感染するのに用いられる組換えバキュロウイルス発現構築物を生成させる。

別の態様において、本発明は、先に記載された組換えＨＥ４ａ発現構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、例えばクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物であってもよい、本発明のベクターおよび／または発現構築物で遺伝子操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）されている。該ベクターまたは構築物は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。操作された宿主細胞は、適宜、プロモーターを活性化させる、形質転換物を選択する、または特定の遺伝子、例えばＨＥ４ａポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合蛋白質をコードする遺伝子を増幅させる、改変された従来の栄養培地で培養することができる。発現のために選択される特定の宿主細胞の培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、当業者により即座に明白となろう。

宿主細胞は、高等な真核生物細胞、例えばホ乳類細胞、もしくは下等な真核生物細胞、例えば酵母細胞であってもよく、または宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞であってもよい。本発明による適切な宿主の代表的例としては、非限定的に、Ｅ．コリ、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ５２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｊ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または２９３細胞などの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞、またはインビトロ増殖に既に適用された、もしくはデノボで樹立された任意の適切な細胞が挙げられる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示があれば当業者の範囲内であると思われる。

様々なホ乳類細胞培養系を用いて、組換え蛋白質を発現することもできる。それゆえ本発明は、一部として、ＨＥ４ａをコードする核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１種のプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養することにより、組換えＨＥ４ａポリペプチドを産生する方法に向けられる。特定の実施形態において、プロモーターは、本明細書に示された調節されたプロモーター、例えばテトラサイクリンで抑制可能なプロモーターであってもよい。特定の実施形態において、組換え発現構築物は、本明細書に示された組換えウイルス発現構築物である。ホ乳類発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ Ｙ． ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＳＶ４０ ｍｕｔａｎｔｓ． Ｃｅｌｌ． １９８１ Ｊａｎ；２３（１）：１７５−８２に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合可能なベクターを発現し得る他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。ホ乳類発現ベクターは、例えばＭＲＡ発現構築物の調製に関して本明細書に記載された通り、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライス部位およびポリアデニル化部位から得られるＤＮＡ配列を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を提供してもよい。宿主細胞への構築物の導入は、非限定的に、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、または電気穿孔法をはじめとする、当業者に熟知された様々な方法により実行することができる（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．Ｇ．， Ｄｉｂｎｅｒ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｂａｔｔｅｙ， Ｊ．Ｆ．： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ内のＢａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８６）。

発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）、またはそれらから得られた融合蛋白質は、インタクト宿主細胞；細胞膜、細胞内小胞体もしくは他の細胞内オルガネラなどのインタクトオルガネラ；あるいは非限定的に細胞ホモジネートもしくは溶解物、単層および多層膜小胞、または他の調製物をはじめとする破壊された細胞調製物の形態の免疫原として有用となり得る。あるいは発現された組換え抗原ポリペプチドまたは融合蛋白質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィーをはじめとするアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。蛋白質リフォールディングステップは、必要に応じて、成熟蛋白質の構成を完成させる際に用いることができる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終的な精製ステップに用いることができる。発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）または融合蛋白質は、当業者により即座に実践され得る日常的な抗体スクリーニング用の複数のアッセイ構成のいずれかにおいて、標的抗原としても有用となり得る。

つまり、本発明の方法において用いられる特異的抗体の産生のための免疫原であるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、天然で精製された生成物もしくは化学合成手順の生成物であってもよく、または原核細胞宿主、もしくは好ましくは真核細胞宿主から組換え技術により生成されてもよい。組換え生成手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、当該技術分野で公知であり本明細書に示された通り、グリコシル化またはさもなければ翻訳後修飾されてもよい。

本開示の主題を、ここに、以下の実施例を参照しながら記載する。これらの実施例は、例示を目的として示されているに過ぎず、その主題はこれらの実施例に限定されず、むしろ本明細書に示された教示の結果として示された全ての変形例を包含する。

本明細書に記載された実験の前に、免疫細胞化学（ＩＨＣ）アッセイ形式を利用して対象からの試料中のＨＥ４ａのＮ−ＷＦＤＣドメインを最適に測定し得るプロトコルは発表されていなかった。本開示の態様および実施形態は、全長ＨＥ４／ＨＥ４ａの存在を評定するために同時にまたは組み合わせて用いられる場合に、１２Ａ２および１４Ｅ２モノクローナル抗体が、意外で予測されなかった用途および効能を有する、という意外な発見に由来する。

本明細書に記載された実験において、予測されなかった高度な／増強された効能を可能にする複数の因子が、発見された。例えば、２Ｈ５／３Ｄ８との特定の組み合わせにおける１２Ａ２／１４Ｅ２抗体を用いることにより、より特異的な全長ＨＥ４認識および結合プロファイルが得られ得ることが、発見された。加えて、検査卵巣癌試料（全長ＨＥ４試料を含む）中のＨＥ４の分析の間に、ＩＨＣをはじめとする例示的診断における２Ｈ５または３Ｄ８と組み合わせた１２Ａ２もしくは１４Ｅ２抗体、得られた対応する臨床データおよび／または疾患の相関性を利用することで、ＨＥ４プロファイルの評定において意外な程低いバックグランドおよび／または驚く程改善された分解能が示されることも発見された。

例として、ＨＥ４モノクローナルＡｂの生成における免疫化のための組換えＨＥ４融合蛋白質が、開発された。

実施例１

組換え全長ＨＥ４ａｈＩｇ／ｍＩｇ、ＨＥ４ａ−Ｖ４ＨＩｇ／ｍＩｇおよびＨＥ４ａ−Ｖ２−ｈＩｇ／ｍＩｇ融合蛋白質の生成：融合構築物の構築のための高処理能力ＨＥ４ａ ｃＤＮＡクローンからのＨＥ４ａ（ＷＦＤＣ２）ｃＤＮＡの増幅

ＨＥ４ａ（ＷＤＦＣ２）遺伝子を、ＩｇＧをコードする遺伝子と組み合わせて融合蛋白質を構築し、マウスを免疫化してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得た。マウスを、マウスＩｇテイルを有する融合蛋白質に対して免疫化して、ハイブリドーマを、ヒトＩｇテイルを有する融合蛋白質に対してスクリーニングした。次に、二重抗原決定基（サンドイッチ）（ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）ＥＬＩＳＡを開発した。

最初はＫｉｒｃｈｏｆｆらにより発表され（１５， ２２）、ＧｅｎＢａｎｋ （アクセション番号Ｘ６３ １８７）に寄託されたＨＥ４ａのｍＲＮＡ配列は、ＨＥ４ａをコードするｃＤＮＡをクローニングするオリゴヌクレオチドプライマーの設計のための原理を提供した。ＨＥ４ａ ｃＤＮＡをクローニングするために、ＴＲＩｚｏｌ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを卵巣腫瘍、正常な精巣上体、ならびに４００７およびＯＶＣＡＲ３（２４）をはじめとする複数の卵巣腫瘍細胞株から調製した。ＲＮＡ １〜３μｇ、ランダムヘキサマー、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用い、製造業者の指導に従い、ｃＤＮＡを調製した。標準条件を利用して、ランダムプライムされたｃＤＮＡから、ＨＥ４ａ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。全長ＨＥ４ａの予測サイズのＰＣＲ産物を得て、その後、クローニングした。配列解析により、Ｋｉｒｃｈｏｆｆらの配列およびＧｅｎＢａｎｋ（アクセション番号ＡＹ２１２８８８）に寄託されたＨＥ４ａの正しい配列と比較した差から同定する配列分析を利用して、融合蛋白質を構築した。全長ＨＥ４ａ遺伝子を含む、配列を検証されたｃＤＮＡフラグメントをｐＳＰＯＲＴにクローニングして、このプラスミドＤＮＡを融合クローンの構築のためのＰＣＲ鋳型として用いた。

ヒトまたはマウスＩｇＧ Ｆｃドメインに融合された完全なＨＥ４ａ遺伝子産物を取り込んだ融合蛋白質を構築した。クローニングのための適切な制限部位をコードし、最終的な構築物の蛋白質ドメインの必要なインフレーム融合を作製したプライマーを設計した。５'プライマー（配列番号ＸＸ：５'−ＧＴＴＧＴＴＡＡＧＣ ＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴ ＧＣＣＴＧＣＴＴＧＴ ＣＧＣＣＴＡＧＧＣ−３'）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、最初のＡＴＧに隣接する発現を改善するコザック配列、およびＨＥ４ａ配列に基づくＨＥ４ａリーダーペプチドの部分を含んだ。３'プライマー（配列番号ＸＸ：５'−ＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＡＡＴＴＧＧ ＧＡＧＴＧＡＣＡＣＡ ＧＧＡＣＡＣ−３'）は、終止コドンの直前でトランケートされたＨＥ４ａコード配列の３'末端を有する、ヒト／マウスＩｇテイルｃＤＮＡへの融合のためのインフレームのＢａｍＨＩ部位を含んだ。ＰＣＲ増幅反応は、鋳型としてＨＥ４ａ／ｐＳＰＯＲＴプラスミド １００ｎｇを用いて、製造業者の使用説明書に従い（ＥｘＴａｑ；Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｉｎｃ．， Ｏｔｓｕ， Ｓｈｉｇａ， Ｊａｐａｎ）実施し、増幅（９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３０秒間）を３０サイクル実施した。全長ＨＥ４ａの予測サイズ（４００ｂｐ）のＰＣＲ産物を得て、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲフラグメントを制限消化し、ＱＩＡＥｘ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ（ｍＩｇＧ２ａ）およびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）を有する融合物中で、先に記載されたｐＣＤＮＡ ３の誘導体であるホ乳類発現ベクターｐＤ１８にライゲートした。図１は、ＦＬ ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ２ａおよびＦＬ ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１ ｃＤＮＡ構築物がＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてｐＤ１８のマルチクローニング部位に挿入された方法を概略的に示す。

ライゲーション産物を、ＤＨ５α細菌細胞に形質転換して、形質転換物を、ＦＬ ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ２ａおよびＦＬ ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１融合遺伝子挿入物の存在についてスクリーニングして、配列解析により検証した。加えて蛋白質発現を、これらの単離物からのプラスミドＤＮＡを用いて確認し、記載された通りＤＥＡＥ−デキストラン技術によりＣＯＳ７細胞を一過性トランスフェクトさせた。培養上清を７２時間後に回収して、蛋白質アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いた免疫沈降によりスクリーニングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法およびウェスタンブロットを減らした。ウェスタンブロットは、１：５０００のヤギ抗ヒトＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｃａｌｔａｇ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）を用いてプローブし、その後、高度の化学ルミネッセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を発生させた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃテイル（ｐＤ１８−ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧプラスミド）を融合されている配列検証されたＨＥ４ａ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｎｇｌｅら（Ｂｉｎｇｌｅ Ｌ．， Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｖ．， Ｂｉｎｇｌｅ Ｃ． Ｄ． Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ＨＥ４ （ＷＦＤＣ２）， ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ ｙｉｅｌｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２１： ２７６８−２７７３， ２００２）の発行物に記載されたＨＥ４ａスプライスバリアントＨＥ４ａ−Ｖ４およびＨＥ４ａ−Ｖ２の増幅およびクローニングのための鋳型として用いた。ＨＥ４ａ−Ｖ４およびＨＥ４ａ−Ｖ２スプライスバリアントを、先の全長ＨＥ４ａについて記載された通り、マウスおよびヒトＩｇＧ Ｆｃで融合してクローニングした。層福に用いられたヌクレオチドプライマーを、以下に列挙する。

ＨＥ４ａ−Ｖ４について：

フォワードプライマー配列番号３：

リバースプライマー配列番号４：

ＨＥ４ａ−Ｖ２について

フォワードプライマー配列番号５：

リバースプライマー配列番号６：

ＨＥ４ａＩｇ−融合蛋白質の生成

全長ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ２ａおよびＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１ ｃＤＮＡ構築物ならびにＨＥ４ａ−Ｖ４およびＨＥ４ａ−Ｖ２スプライスバリアントでの対応する構築物の安定した細胞株を作製した。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を用いて、該当する融合蛋白質を高レベルで発現する安定した細胞株を構築した。安定したＣＨＯ細胞株を、プラスミド構築物の高コピー電気穿孔、ならびに組換えインスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、２×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、および１００ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含むＥｘｃｅｌｌ ３０２ ＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｅｎｖｅｒ， ＰＡ）での限定希釈によるメトトレキサート耐性クローンの選択により作製した。その後、耐性クローンからの培養上清を、ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイして、高産生株についてスクリーニングした。使用済みの上清を大規模培養物から回収して、ＩｇＧ融合蛋白質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その後、融合蛋白質をウェスタンブロットにより確認した（データは示さない）。ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１融合蛋白質は、還元型ゲルおよびウェスタンブロットでは見かけ上の分子量Ｍｗ４８，０００、予測されたアミノ酸配列に基づく予想ではＭｒ３６，０００超、に移動し、分子がグリコシル化されたことが示唆された。安定したトランスフェクタントを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化に十分な蛋白質を産生した。

例として、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的なハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を開発した。

実施例２

ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的なハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の作製

ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１週間に２回の割合で、ＨＥ４ａ−Ｖ４ ｍＩｇＧで５回、そして６回目はＦＬ ＨＥ４ａで免疫化した。最後の免疫化の３日後にマウスを殺処分し、ハイブリドーマを、メソテリンについて過去に記載された通り生成した。ハイブリドーマ上清をＨＥ４ａ−Ｖ４ ｈＩｇＧについてスクリーニングして、ハイブリドーマ１２Ａ２および１４Ｅ２を、それらとＨＥ４ａ−Ｖ４ ｈＩｇＧとの反応性に基づいて選択した。ハイブリドーマを標準の手順により２回クローニングして、選択されたクローンをＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ ＭＡｂの産生に用いた。ローラーボトル内のＤＭＥＭ ５％ウシ胎仔血清中に１０^４細胞／ｍＬで播種して１０〜１４日間増殖させることによる、ハイブリドーマクローンのインビトロ培養により、モノクローナル抗体を産生した。その後、モノクローナル抗体を、製造業者の推奨に従ったプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から精製した。

実施例３．ＭＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに対するＭＡｂの結合特異性の特徴づけ

３．１ ｈＩｇＧ ＨＥ４ａ融合蛋白質との反応性

その後、１２Ａ２および１４Ｅ２ＭＡｂの特異性を、ＦＬ ＨＥ４ａ、ＨＥ４ａ−Ｖ４ およびＨＥ４ａ−Ｖ２ ｈＩｇＧ融合蛋白質でのＥＬＩＳＡで検査した。１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂを、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（Ｃ−３０４１；Ｓｉｇｍａ）中でのＭＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）のインキュベーションによりマイクロタイタープレートのウェルにコーティングした。上清を除去した後、ウェルを２００μｌ／ウェル ＧＳＣブロッキンス緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅａｔｔｌｅ）で室温で２時間ブロッキングした。この後、これを０．１％Ｔｗｅｅｎを含む２００μｌ／ウェル ＰＢＳで４回洗浄した。

その後、ＭＡｂをコートしたウェルを１００μｌ／ウェルのＦＬ ＨＥ４ａ、ＨＥ４ａ−Ｖ４ およびＨＥ４ａ−Ｖ２と共に２時間インキュベートした。その後、結合されたｈＩｇＧ ＨＥ４ａ融合蛋白質を、ＨＲＰコンジュゲートされた抗ｈＩｇＧ１と共にインキュベートしてＯＤ４５０ｎｍで測定することにより検出した。

１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂを、完全長ＨＥ４ａおよびＨＥ−Ｖ４と反応させたところ、それらがＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的であることが示された（図２）。

３Ｄ８および２Ｈ５ ＭＡｂの特異性も、同じ方法論を用いて参照ＭＡｂとして検査した（図３）。

３．２ ファージ融合蛋白質として提示されたＨＥ４ａドメインとの反応性

ファージＥＬＩＳＡにおいて、ファージコート蛋白質ｐＶＩＩＩを有する融合蛋白質として発現されたＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインおよびＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメインへの反応性を検査することにより、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメイン対しての１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂの特異性を更に確認した。

ＯｖＣａｒ−３細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡは、ファージ提示ベクターｆ８８−４中でのクローニングのためのＣ−およびＮ−末端ＷＦＤＣ領域をコードする遺伝子部分のＰＣＲ増幅の鋳型として働いた。表２に列挙されたＰＣＲプライマー対を、それぞれアミノ酸残基３１−７５（Ｎ−ＷＦＤＣ）および７６−１２４（Ｃ−ＷＦＤＣ）のコード領域の増幅用に構築した。５'末端では、ｐＶＩＩＩシグナルペプチドおよびｐＶＩＩＩ成熟コート蛋白質を融合するクローニングのために挿入されたＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの制限部位が存在した。

（表２）ＨＥ４ａ Ｎ−およびＣ−ＷＦＤＣの増幅に用いられたＰＣＲプライマー

ＷＦＤＣ領域を別々に、最終的な容量２５μｌ中に、１μＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２μ／μｌ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Ａｂｇｅｎｅ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ）、および０．１ｍＭ 各デオキシヌクレオチドを含む反応混合物中で、０．５μｌ ｃＤＮＡから次の温度サイクルを３０回繰り返して増幅させた；９５℃、５０℃および７２℃で３０秒インキュベート。

ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化されたＰＣＲ産物およびｆ８８−４を一緒にライゲートして、Ｅ．コリ ＪＭ１０９にトランスフェクトし、その後、クローンをＬＢプレート上でテトラサイクリンを用いて選択した。各構築物の２つのクローンを、Ｅ．コリ ＪＭ１０９中で増幅させて、二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ配列決定のために調製した。ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｇｄｙｅターミネータｖ１．１サイクルシーケンスキットおよびｆ８８−４ベクター特異性プライマーを用いて実施した。配列決定反応は、分析のためにＣｙｂｅｒＧｅｎｅ ＡＢ（Ｈｕｄｄｉｎｇｅ， Ｓｗｅｄｅｎ）に送付した。配列の生データを、無料ソフトウエアＣｈｒｏｍａｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４５（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて解析した。ヌクレオチド配列決定により、リーダーペプチドおよび成熟ファージコート蛋白質ｐＶＩＩＩのインフレームでの挿入を検証した。ＨＥ４ａ挿入物により、ＨＥ４ａ配列（アクセション番号ＡＹ２１２８８８）に対する同一性を実証した（図４）。

ファージＥＬＩＳＡ

配列を検証されたファージクローンを増幅、精製してＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて濃縮し、ファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原として使用するためにＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１μｇ／ｍｌに希釈されたＭＡｂ ３Ｄ８および２Ｈ５ならびに１００μｌクローン培地中のＭＡｂ１２Ａ２を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でコートされたウェルで固定化した（１００μｌ／ウェル）。プレートを密閉して、室温で一晩貯蔵した。ＨＥ４ａ ＭＡｂでコートされたウェルを３回洗浄し、容量１００μｌ／ウェルのファージ粒子を添加した。２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄して、ウサギ抗Ｍ１３抗体（所内で作製）を添加した。インキュベーションおよび洗浄後に、ＨＲＰ標識されたブタ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ）を添加した。最終的な洗浄の後、ＴＭＢ基質を添加して、プレートを５分間インキュベートした後６２０ｎｍで測定した（図５）。

ファージ蛋白質ｐＶＩＩＩを有する融合蛋白質として提示されたＮ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣドメインを用いたファージＥＬＩＳＡ試験、ならびにＨＥ４ａ−Ｖ２、ＨＥ４ａ−Ｖ４およびＦＬ ＨＥ４ａ ｈＩｇＧ１融合蛋白質への反応性から、１２Ａ２および１４Ｅ２ＭＡｂがＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的であることが確認された。

３．３ １２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂにより認識されたエピトープの特徴づけ

１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂにより認識されたエピトープのタイプ、即ち線状またはコンホメーション依存性のエピトープを、変性および還元されたＨＥ４ａ抗原に対する抗体の反応性を検査することにより測定した。未希釈および５倍希釈の、全長ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１を産生する安定した細胞株の使用済み培地を、７０℃で変性させて、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。蛋白質を、標準技術によりＰＶＤＦ膜上にブロットした。膜を一次ＨＥ４ａ抗体と共にインキュベートした後、結合した抗体をＨＲＰブタ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）によりトレースした。ＨＲＰ抗体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標）ＥＣＬ（商標）検出システムを用いて化学ルミネッセンスにより検出した。

ＭＡｂ １２Ａ２では、変性および還元されたＨＥ４ａ抗原への反応性が実証されなかったことから（データは示さない）、その抗体がコンホメーション依存性エピトープを認識することが示された。その一方で、ＭＡｂ １４Ｅ２では、グリコシル化ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１融合分子の予測サイズであるおよそ４８ｋＤａのバンドへの特異的染色が実証された。より高濃度の抗原のレーンでは、そのサイズの約２倍のバンドが観察された。このバンドは、抗原の二量体を表し、Ｆｃ部分中のジスルフィド結合が完全に破壊されていなかった可能性が最も高い。ウェスタンブロットデータから、ＭＡｂ １４Ｅ２が線状エピトープを認識することが示される（図６）。

３．４ 作製されたＨＥ４ Ｎ−ＷＦＤＣ特異性抗体の独立したエピトープ

１２Ａ２ ＭＡｂと１４Ｅ２ ＭＡｂとの、変性および還元されたＨＥ４ａ抗原への反応性の差から、２種の抗体がＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメイン内の２種の独立したエピトープを認識することが示される。

１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂによるＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメイン中の独立したエピトープの認識を、サンドイッチイムノアッセイにおいて１２Ａ２および１４Ｅ２ ＭＡｂを組み合わせることにより更に確認した。ＭＡｂ １４Ｅ２を、検出抗体としてのＨＲＰ標識されたＭＡｂ １２Ａ２と組み合わせて、捕捉ＭＡｂとして用い、ＨＥ４ａ抗原での用量反応曲線を決定した。濃縮されたハイブリドーマ培地中のＭＡｂ １４Ｅ２を、ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）をコートされたマイクロウェル中で捕捉した。洗浄後に、ＨＥ４ａ ＥＩＡキット（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）からの２５μｌのＨＥ４ａ抗原（０〜９００ｐＭ）を添加し、その後、ＨＲＰ標識された１２Ａ２ ＭＡｂを添加した。対照実験として、ＨＥ４ａ ＥＩＡ中で用いられた１４Ｅ２ ＭＡｂ固相およびＨＲＰ標識されたトレーサＭＡｂ ３Ｄ８を用いて並行試験を実施した。ＭＡｂ ３Ｄ８は、Ｃ−末端ＷＡＰ領域を標的とすることで知られ、それゆえＭＡｂ １４Ｅ２とサンドイッチＥＩＡ対を形成するはずである。インキュベーションおよび洗浄ステップの後、ＴＭＢ基質を添加して、３０分間のインキュベーションステップの後、吸収を６２０ｎｍで分析した。ＭＡｂ ３Ｄ８および１２Ａ２の両者とも、ＭＡｂ １４Ｅ２との用量反応曲線を実証した（図７）。

還元ＨＥ４ａ抗原との異なる反応性に加え、１２Ａ２ ＭＡｂおよび１４Ｅ２ ＭＡｂのサンドイッチイムノアッセイの正の用量反応曲線から、ＭＡｂ １４Ｅ２およびＭＡｂ １２Ａ２がＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的な独立したエピトープを認識することが示された。

全長ＨＥ４ａに特異的なイムノアッセイも、開発した。

実施例４

全長ＨＥ４ａに特異的なイムノアッセイの確立

全長ＨＥ４ａ（ＦＬ ＨＥ４ａ）に特異的なアッセイを、Ｎ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣドメインに特異的な抗体を用いることにより設計した。

本発明の一態様において、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的な抗体を、ＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメインに特異的な抗体と組み合わせることで、全長ＨＥ４ａに特異的なイムノアッセイの設計を可能にしたが、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣドメイン、ＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメイン、ＨＥ４ａ−Ｖ４変異体またはＨＥ４ａ−Ｖ２変異体のいずれかを検出することはできなかった。

最初の実験において、本発明による１２Ａ２ ＭＡｂおよび１４Ｅ２ ＭＡｂならびにＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメインに反応性の３Ｄ８ ＭＡｂ（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ； Ｔｈｅ ＨＥ４ （ＷＦＤＣ２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｊｕｌｙ １， ２００３ ６３； ３６９５）を、検出抗体としてのＨＥ４ａ Ｃ−ＷＦＤＣドメインに対して反応性の２Ｈ５ ＭＡｂを用いたサンドイッチアッセイにおいて、捕捉抗体として用いた。サンドイッチアッセイにおいて、異なる捕捉ＭＡｂを実施例２の記載と類似の手順を用いて、マイクロタイターウェルで免疫化し、ＦＬ ＨＥ４ａ、ＨＥ４ａ−Ｖ４ およびＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインのｈＩｇＦｃ融合蛋白質と共にインキュベートした。その後、ビオチン化２Ｈ５ ＭＡｂと共にインキュベートした後、ストレプトアビジンＨＲＰと共にインキュベートして、ＯＰＤ ＨＲＰ基質とのインキュベーション後にＯＤ４５０ｎｍを測定することにより、結合されたＨＥ４ａ蛋白質を検出した。サンドイッチアッセイから、１２Ａ２ ＭＡｂまたは１４Ｅ２ ＭＡｂと２Ｈ５ＭＡｂとの組み合わせがＦＬ ＨＥ４ａ融合蛋白質のみを検出するが、３Ｄ８ ＭＡｂと２Ｈ５ ＭＡｂとの組み合わせがＦＬ ＨＥ４ａおよびＨＥ４ａ Ｖ２変異体の両方を検出することが実証された（図８）。

ＦＬ ＨＥ４ａに特異的なイムノアッセイの設計のための好ましい構成において、２Ｈ５ ＭＡｂを捕捉抗体として用い、１２Ａ２ ＭＡｂを検出抗体として用いた。２Ｈ５ ＭＡｂを、標準的手順を利用してビオチン−ＮＨＲＳカプロン酸エステル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， ＵＳ）でビオチン化して、捕捉抗体として用いた。１２Ａ２ ＭＡｂは、ナコーネ（Ｎａｋｏｎｅ）法の変形によりＨＲＰとコンジュゲートさせた。ビオチン化された２Ｈ５ ＭＡｂおよびＨＲＰコンジュゲートされた１２Ａ２ ＭＡｂを、以下のプロトコルによるワンステップＥＩＡにおいて使用した。

アッセイ手順：

ＦＬ ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１０００ｐＭ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ，ｐＨ７．２）２５μｌ＋アッセイ緩衝液中の１μｇ／ｍｌ ビオチン２Ｈ５ ＭＡｂおよび１μｇ／ｍｌ ＨＲＰ １２Ａ２ ＭＡｂの１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（Ｋａｉｖｏｇｅｎ Ｏｙ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）に入れる。

２．振とうしながら１時間±１０分間インキュベートする。

３．５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ４０、ｐＨ７．７５で６回洗浄する。

４．１００μｌ ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， ＵＳ）を添加する。

５．３０分間±５分間インキュベートする。

６．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。

ＰＢＳ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡで希釈されたＨＥ４ａ−ｈＩｇＧを用いた用量反応曲線の例を、図９に示す。アッセイの感度は、＜５ｐＭであり、健常な対象に見出される感度よりも有意に低かった。つまりそのアッセイは、卵巣癌であることが分かっている、または卵巣癌の疑いのある健常対象および個体におけるＦＬ ＨＥ４ａの測定に適している。

本試験の目的は、例示的アッセイ形式で全長ＨＥ４の存在を評定する能力を評価することにより、新しい１２Ａ２ ＭＡｂの適切性を評定することである。

実施例５

全長ＨＥ４ａに特異的なイムノアッセイを用いた卵巣癌の診断

本開示の一態様において、抗体を用いて、卵巣癌の血清診断のイムノアッセイを設計した。実施例３に記載された１２Ａ２ ＭＡｂと組み合わせた２Ｈ５ ＭＡｂを用いたＦＬ ＨＥ４ａのイムノアッセイを、健常な個体、良性婦人科疾患の患者、および卵巣癌患者の血清試料中の全長ＨＥ４ａの濃度を測定するために用いた。

ＦＬ ＨＥ４ａのレベルは、卵巣癌患者では、良性婦人科疾患患者または健常対象に比較して有意に高かった（ｐ＜０．００１）（表３、図１０）。

（表３）健常な個体、良性婦人科疾患の患者、および卵巣癌患者のＨＥ４ａレベル

この試験の目的は、卵巣癌を測定してその経過をモニタリングする能力を評価することにより、新しい１２Ａ２ ＭＡｂ／全長ＨＥ４アッセイ形式の適切性を評定することである。

実施例６

ＦＬ ＨＥ４ａの測定による卵巣癌の疾患経過のモニタリング

本発明の別の態様において、実施例３によるＦＬ ＨＥ４ａを測定するためのイムノアッセイを利用して、卵巣がんと診断された患者の疾患の臨床経過を追跡した。

卵巣癌患者３名のＦＬ ＨＥ４ａレベルを、疾患の臨床経過と対応させて図１１に示す。ＦＬ ＨＥ４ａレベルは、疾患の臨床経過に従っており、卵巣癌の治療効果および再発疾患の検出を拡充する（ｆｕｌｌ）のに適している。

例として、本試験の目的は、ＨＥ４ａ組織試料を測定する際の新しい１２Ａ２ ＭＡｂ／全長ＨＥ４アッセイ形式の適切性を評定することである。

実施例７

組織切片における、ＨＥ４ａの測定による卵巣癌の診断

本発明の追加的態様において、ＨＥ４ａのＮ−ＷＦＤＣドメインに特異的な抗体を、卵巣癌が疑われる患者から得られた組織または細胞と共にインキュベートし、組織または細胞への抗体の結合を測定することにより、卵巣癌の診断方法を提供する。

組織アレイスライド（Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）を、製造業者の使用説明書に従って脱パラフィンを行った。抗原賦活化では、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中でスライドに１０分間マイクロ波を照射した。３％Ｈ_２Ｏ_２で５分間インキュベートすることにより、内在性ペルオキシダーゼをクエンチした。好ましい構成において、組織切片を１２Ａ２ ＭＡｂと共に室温で１時間インキュベートした。結合１２Ａ２ ＭＡｂの視覚化のために、Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ ＡＳ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。スライドは、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で対比染色し、顕微鏡測定により分析した。異なる卵巣癌切片（図１２Ａ〜Ｄ）を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣについて染色し、非癌性組織から得た組織は、陰性であった（図１２Ｅ〜Ｆ）。

特許、発行物、科学文献、ウェブサイト、および他の文書、ならびに本明細書で参照または記述される材料は全て、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示しており、そのような参照された文書および材料はそれぞれ、その全体が個別に参照により組み入れられている場合、または全体として本明細書に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。出願人は、任意のそのような特許、発行物、科学文献、ウェブサイト、電子的に入手した情報、および他の参照された材料または文書からのあらゆる材料を、本明細書に物理的に組み入れる権利を有する。

用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられており、限定としてではなく、図示および記載された特色の任意の均等物またはその一部を除外するような用語および表現の使用を意図するものではなく、様々な改良が請求された本発明の範囲内で可能であると認識される。つまり、本発明は好ましい実施形態および任意の特色により具体的に開示されており、本明細書に開示された概念の改良および変更は、当業者に依存されてもよく、そのような改良および変更は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲内とみなされる。

本発明を、広範に、そして包括的に記載した。包括的開示に含まれるより狭い分類および亜属の群も、本発明の一部を形成する。これは、本発明の包括的記述を、任意の目的物をその属から除外する条件または否定的限定付きで含み、除外された材料が本明細書に具体的に列挙されているかにかかわらない。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群に関して記載されていれば、本発明がそれによりマーカッシュ群の任意の個々の構成物または構成物の亜群に関しても記載されることを、当業者は認識するであろう。

配列表

Claims (57)

1. （ａ）特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ａ２により産生されたモノクローナル抗体、
   （ｂ）特許受託番号１４Ｅ２ＥＣＡＣＣ番号＿としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２により産生されたモノクローナル抗体、
   （ｃ）配列番号ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体、
   （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記フラグメントがＨＥ４ａに特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体、
   からなる群より選択される、ＨＥ４ａに特異的に結合し得るモノクローナル抗体。
2. 特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ａ２。
3. 特許受託番号１４Ｅ２ＥＣＡＣＣ番号＿としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２。
4. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞株。
5. 請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含む卵巣癌を診断するキット。
6. 配列番号１７に示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体と、配列番号１９に示されたアミノ酸配列に結合する追加のモノクローナル抗体と、を含む卵巣癌を診断するキット。
7. ａ）固体担体上に固定された、第一のＨＥ４ａ抗体である捕捉抗体と、
   ｂ）検出可能な物質で標識された第二のＨＥ４ａ抗体である、タグ抗体と、
   を含み、前記第一または第二のＨＥ４ａ抗体が、請求項１に記載のモノクローナル抗体である、患者における卵巣癌を診断するキット。
8. （ａ）免疫反応を誘発する条件下、配列番号１、３または５に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫化すること、
   （ｂ）前記動物から抗体を産生する細胞を単離すること、
   （ｃ）抗体を産生する細胞を不死化培養細胞と融合して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成すること、
   （ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を請求項１に従って培養すること、ならびに
   （ｅ）モノクローナル抗体を培養物から単離すること、
   を含む、ＨＥ４ａモノクローナル抗体を産生する方法。
9. （ａ）配列番号１のＮ−ＷＦＤＣドメイン、
   （ｂ）配列番号１７によりコードされたアミノ酸配列、
   （ｃ）ＨＥ４ａによりコードされたアミノ酸配列、または
   （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの変異体もしくはフラグメント、
   に結合するＨＥ４ａ結合剤。
10. 抗ＨＥ４ａ抗体またはＨＥ４ａ抗原結合フラグメントである、請求項９に記載の結合剤。
11. ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣ（配列番号１７）に選択的に結合する、請求項１０に記載の結合剤。
12. ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントである、請求項９に記載の結合剤。
13. ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、または抗原結合フラグメントである、請求項１０に記載の結合剤。
14. ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、または抗原結合フラグメントである、請求項１１に記載の結合剤。
15. 検出可能なマーカで標識されている、請求項１０に記載の結合剤。
16. 請求項１のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、精製されたアミノ酸配列。
17. ａ）フォワードおよびリバースプライマーを含み、配列番号２１（Ｖ４Ｆ）と配列番号２３（Ｖ４Ｒ）、配列番号２５（Ｖ２Ｆ）と配列番号２７（Ｖ２Ｒ）からなる群より選択されるプライマーセットで、試料から核酸を増幅させること；ｂ）増幅された核酸を単離すること、を含む、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列を得る方法。
18. 配列番号１７であるＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣの配列に結合する結合蛋白質をコードする単離された核酸分子であって、前記結合蛋白質の可変性重鎖のアミノ酸配列が、請求項１に記載のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、単離された核酸分子。
19. 請求項１８に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
20. 請求項１９に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
21. ａ）調節要素に作動可能に連結された請求項１８に記載の核酸分子を含むベクターを構築するステップ、
    ｂ）得られたベクターを宿主細胞に形質転換するステップ、
    ｃ）前記結合蛋白質を産生するのに十分な時間および条件で、前記宿主細胞を培養するステップ、
    を含む、Ｎ−ＷＦＤＣに結合し得る結合剤を生成する方法。
22. 請求項２１に記載の方法により生成された、単離された結合剤。
23. 配列番号１７であるＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣのアミノ酸配列を含むＦｃ受容体ポリペプチドに連結された異種ＨＥ４ａポリペプチドを含む単離された融合蛋白質。
24. ポリペプチドが、配列番号２９（Ｗ１Ｆ）、配列番号３１（Ｗ１Ｒ）、配列番号３３（Ｗ２Ｆ）、配列番号３５（Ｗ２Ｒ）によりコードされるプライマーを用いて核酸増幅することにより得られる、請求項２２に記載の単離された融合蛋白質。
25. ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドが、スプライス変異体である、請求項２３に記載の融合蛋白質。
26. 対象からの生物学的試料を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と、抗原決定基への前記抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、前記試料中で可溶性形態であり少なくとも１種の抗体と反応性がある抗原決定基を有する天然由来分子が前記生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにその後、悪性状態の存在を検出すること、を含む、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法。
27. 生物学的試料が、血液、血清、漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄ）、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌液、膣分泌液、腹水、肋膜液、心膜液、腹腔液、腹部液体（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、培地、コンディション培地および洗浄液からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 対象の細胞を含む生物学的試料を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の抗体と、抗原決定基への前記抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、少なくとも１種の前記抗体と反応性のある前記抗原決定基を有する細胞表面分子が、前記生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにこうして悪性状態の存在を検出すること、を含む、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法。
29. 少なくとも１種の抗体が検出可能に標識されている、請求項２６に記載の方法。
30. 少なくとも１種の抗体が検出可能に標識されている、請求項２８に記載の方法。
31. 少なくとも１種の抗体が検出可能に標識されておらず、抗原決定基に対する抗体の結合の検出が間接的である、請求項２６に記載の方法。
32. 少なくとも１種の抗体が検出可能に標識されておらず、抗原決定基に対する抗体の結合の検出が間接的である、請求項２８に記載の方法。
33. ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１種の固定化第一抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的に結合させることにより免疫複合体を形成するのに十分な条件および時間で、対象からの生物学的試料を第一抗体と接触させて、試料中の分子の存在を測定すること；第一抗体に特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること；ならびにＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的で抗原結合部位が固定化第一抗体の抗原結合部位を拮抗阻害しない第二抗体の、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドへの特異的結合を検出するのに十分な条件および時間で、前記免疫複合体を少なくとも１種の第二抗体と接触させ、こうして卵巣癌の存在を検出すること、を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングする方法。
34. 固定化第一抗体が、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
35. 第二抗体が、１２Ａ２、１４Ｅ２、２Ｈ５および３Ｄ８からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
36. 固定化第一抗体が１４Ｅ２である、請求項３３に記載の方法。
37. 第二抗体が１２Ａ２である、請求項３３に記載の方法。
38. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で、前記検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と接触させること、および
    ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａの存在を示す複合体の存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法。
39. 抗体が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、請求項３８に記載の方法。
41. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）前記検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
    ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
    ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法。
42. 抗体の少なくとも１種が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項４２に記載の方法。
44. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）前記検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、ならびに
    ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示す前記複合体の存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後判定の方法。
45. 抗体が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項４４に記載の方法。
46. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、請求項４４に記載の方法。
47. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）前記検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
    ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
    ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後判定の方法。
48. 少なくとも１つの抗体が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項４７に記載の方法。
49. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項４７に記載の方法。
50. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）前記検査試料を、ＨＥ４ａ Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、ならびに
    ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示す前記複合体の存在が処置の応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法。
51. 抗体が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
52. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
53. ａ）対象の検査試料中のＨＥ４ａ抗原を検出すること、
    ｂ）前記検査試料を、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
    ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
    ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
    を含み、検査試料中のＨＥ４ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が処置への応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法。
54. 抗体の少なくとも１種が、ＨＥ４ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項５３に記載の方法。
55. 抗体が、特許受託番号１００９１４０１としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項５３に記載の方法。
56. 対象から得られた検査卵巣組織試料を、配列番号ＨＥ４に示されたポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を検出すること；および検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を、所定のカットオフ値と比較すること、を含み、検査卵巣組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が所定のカットオフ値を超えている場合には検査卵巣癌組織試料が卵巣癌について陽性となり、それにより対象における卵巣癌の有無を検出する、患者における子宮頸癌の有無を検出する方法。
57. 検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が、免疫組織化学を利用して測定される、請求項５６に記載の方法。

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