CN103492409B - 制备抗真菌剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改进的制备米卡芬净的方法。

Description

制备抗真菌剂的方法

技术领域

本发明涉及一种制备米卡芬净（Micafungin）或其盐的改进方法。

背景技术

米卡芬净是具有抗真菌活性的棘白霉素，其可以用分子式（I）表示：

米卡芬净也称作纽莫康定A₀，1-[(4R,5R)-4,5-二羟-N2-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异恶唑基]苯甲酰基]-L-鸟氨酸]-4-[(4S)-4-羟基-4-[4-羟基-3-(磺酰氧基)苯基]-L-苏氨酸]。米卡芬净钠盐还称作FK-463。米卡芬净和米卡芬净钠盐的化学文摘社编号分别为235114-32-6和208538-73-2。

米卡芬净的抗真菌活性源自其抑制1,3-β-D-葡聚糖合酶，从而导致真菌细胞溶解。米卡芬净因此用于治疗各种感染；尤其是下列菌株引起的感染：例如曲霉菌、隐球菌、念珠菌、毛霉菌、放线菌、组织胞浆菌、皮肤癣菌、马拉色菌和镰刀菌。米卡芬净是已经批准的药物和的活性成分，它们用于治疗和预防由念珠菌引起的感染。

米卡芬净是纽莫康定系列中批准的第二种抗真菌剂，现在广泛用于危及生命的真菌感染的化学治疗。

授予藤泽制药工业株式会社的美国专利第6,107,458号公开了米卡 芬净及其制备方法。Ohigashi et al.等人在日本的“合成有机化学杂志”2006年12月的第64卷第12期上发表的一般性论文“米卡芬净的方法进展，一种新型脂肽类抗真菌剂”也公开了一种制备米卡芬净的方法。根据现有技术的方法，米卡芬净可以通过FR-901379获得，FR-901379是一种从名为Coleophoma empetri F-11899的真菌分离获得的天然产物。通过对FR-901379酶法脱酰，然后用4-[5-(4-戊氧基)苯基)异恶唑-3-基]苯甲酸酰化缩合，可以制得米卡芬净。

Fromtling等人以前也公开了一种制备米卡芬净的方法。根据Fromtling等人的方法，FR-901379脱酰所得的多肽核与一活性侧链再酰化，所述活性侧链为1-[4-[5-(4-戊氧基)苯基)异恶唑-3-基]苯甲酰基]苯并三唑3-氧化物。

在Hashimoto等人在The Journal of Antibiotics（抗生素杂志）2009年第62期第27-35页上的论文也公开了多种制备米卡芬净钠盐的方法。

美国第7199248号专利描述了一种改进的制备米卡芬净的方法。该方法还包括将隔离的米卡芬净侧链加到脱酰的米卡芬净多肽核的步骤，所述米卡芬净侧链为1-[4-[5-(4-戊氧基)苯基)异恶唑-3-基]苯甲酸基]-1H-1,2,3-苯并三唑。

Ohigashi等人在Organic Process Research&Development（有机过程的研究和开发杂志）2009年第9期第179-184页上的论文公开了一种优化的制备米卡芬净的工业方法，该方法还涉及分离活性的米卡芬净侧链。

在上述的现有技术的所有制备米卡芬净的方法中，共同的特点是，在与米卡芬净多肽核即FR-901379反应前需要分离活性的米卡芬净侧链。因此，所有现有技术的方法均通过分离形式的活性米卡芬净侧链进行。

本发明的一个目的在于提供一种改进的、工业上更高效的制备米卡芬净的方法。

发明内容

根据本发明的一个方面，本发明的目的通过下述方法来实现，该方 法涉及在一锅法中米卡芬净侧链的活化和将所述米卡芬净侧链连接到米卡芬净多肽核。即就是说，本发明的方法涉及米卡芬净多肽核的酰化而无须将活性的米卡芬净侧链从其所属的反应混合物中分离。另一方面，本发明涉及在一个反应混合物中活化米卡芬净侧链并将米卡芬净侧链连接到米卡芬净多肽核。因此，提供一种方法，其中分离活性的米卡芬净侧链是多余的。

将酸性化合物例如米卡芬净侧链连接至一多肽核例如米卡芬净核可能导致多种不想要的副产品。尤其参考Ohigashi等人2006年的论文，其特别讨论了由于在米卡芬净核中的功能基团众多，需要抑制酰化反应时的副反应。Ohigashi等人2006年的论文还教导对于反应中的中间体需要优化的提纯条件。尽管现有技术这样教导，本发明的发明人出乎意料地发现，米卡芬净侧链可以活化并直接连接到米卡芬净核而无须分离活化的米卡芬净侧链的、单独的分离步骤，而且成功地接合且产生很少杂质。与现有技术的、以分离活性的米卡芬净侧链为前提的方法相比，本发明的方法有多个优点。例如，由于省略了分离步骤，一锅法在工业角度更高效、处理时间更短。而且，可以更好地利用活性米卡芬净侧链，由于一步式分离/提纯步骤导致更高的整体产率，不会有产品损失。

具体来说，本发明提供一锅法制备米卡芬净或其盐，包括以下步骤：

a）在一溶剂中混合分子式为（III）的化合物或其盐和一耦合添加剂，

所述耦合添加剂选自羟基苯并三唑和2-腈基-2-(肟基)乙酸乙酯组成的组；

b)在步骤a）所得的混合物中加入一耦合剂，其中所述耦合剂为碳化二亚胺；

c）在步骤b）所得的混合物中加入一赋形剂和分子式为（II）

的化合物或其盐。

根据本发明的一个实施例，所述耦合添加剂为1-羟基苯并三唑。

根据本发明的另一实施例，所述耦合添加剂为1-羟基-7-氮杂苯并三唑。

根据本发明的又一实施例，所述耦合添加剂为2-腈基(肟基)乙酸乙酯。

根据本发明的又一实施例，所述耦合剂为1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺(EDC)或其盐，优选EDC的盐酸盐。 

根据本发明的又一实施例，步骤a）中所用溶剂为DMF（二甲基甲酰胺）。

根据本发明的又一实施例，步骤c）中所用赋形剂为DIPEA（二异丙基乙基胺）。

根据本发明的又一实施例，在步骤b）所得混合物中加入分子式为II的化合物之前加入赋形剂。

根据本发明的又一实施例，在步骤b）所得混合物中加入分子式为II的化合物之后加入赋形剂。

根据本发明的又一实施例，在步骤c）所得的米卡芬净盐沉淀。

根据本发明的又一实施例，在步骤c）所得的米卡芬净盐通过使用一抗溶剂而沉淀。

根据本发明的又一实施例，在步骤c）所得的米卡芬净盐通过使用乙酸乙酯而沉淀。

根据本发明的又一实施例，在步骤c）所得的米卡芬净盐通过加入甲醇和丙酮淬灭反应后而沉淀。

附图说明

图1为一反应式，示出了实例1描述的反应，即米卡芬净侧链和1-羟基苯并三唑（HOBt）代表的耦合添加剂之间的单独的反应。

图2为一反应式，示出了实例2描述的反应，即米卡芬净多肽核和图1所示的反应产物之间单独的反应。

图3为一反应式，示出了实例3和4描述的反应，即米卡芬净侧链的活化和与米卡芬净多肽核的反应根据本发明的一锅法进行。

图4a为实例2公开的间隔方法的产物的色谱图。

图4b为实例3公开的一锅法的产物的色谱图。

图4c为实例4公开的一锅法的产物的色谱图。

具体实施方式

根据本发明，米卡芬净是指包括下列结构的任何化合物及其盐，

表述“其盐”是指可以用于制备和/或提纯米卡芬净的任何盐或者可以用作药物制剂的活性成分的、米卡芬净的任何药学上可接受的盐。就这点来说，米卡芬净盐的非限定性组包括钠盐、钾盐、二异丙基乙基胺（DIPEA）盐等。

根据本发明，米卡芬净是一锅法制备的，a）首先，混合米卡芬净侧链和一耦合添加剂；b）其次，在步骤a）的混合物中加入耦合剂；c） 在混合物中加入一赋形剂和上述的分子式为II的化合物，即米卡芬净多肽核。

酸性形式的米卡芬净侧链为名为4-[5-(4-戊氧基)苯基]异恶唑-3-基]苯甲酸的化合物。化学文摘社编号为179162-55-1，藤泽公司给其编号为FR-195752。该化合物在本文也称作米卡芬净侧链，其酸性形式可以由分子式III表示：

米卡芬净多肽核由分子式II表示：

术语“米卡芬净多肽核”在本文也包括分子式为II的化合物的盐。例如上述化合物的钠盐，即FR-179642（参见Fromtling等人在1998年Drugs of the Future（未来药物杂志）第23卷第12期第1273-1278页上的文章）。

在米卡芬净中，米卡芬净侧链通过酰胺键连接到米卡芬净多肽核。现有技术公开了多种形成酰胺键的方法，即羧酸和胺反应，这种方法用于多肽的合成。在大多数情形，酰胺键的形成需要使用耦合剂和耦合添 加剂来活化羧酸，参见Madeleine M.Joullie和Kenneth M.Lassen在Arkivoc（有机化学档案杂志）的2010年第viii期第189-250页上的文章和Eric Valeur和Mark Bradley在Chem.Soc.Rev.（化学学会学报）的2009年第38期第606-631页上的文章。也有用一锅法通过形成酰基键来制备简单的多肽结构的例子，参见Pu等人在Organic Process Research&Development（有机化学研究与开发杂志）的2009年第13期第321-314页上的文章，其中在水性乙醇混合物中制备多肽。

但是，现有技术没有一锅法连接羧酸到复杂分子的胺基的教导，复杂分子例如是米卡芬净多肽核。

在本文中，术语“米卡芬净多肽核”或“米卡芬净核”是指由FR-901379的棕榈酰部分酶化脱酰所得的化合物，如上述分子式II所表征。藤泽对米卡芬净多肽核编号为FR-179642，对米卡芬净多肽核的钠盐编号为FR-133303。化学文摘社给该化合物的注册编号为168110-44-9。在本文中，米卡芬净多肽核包括该化合物及其盐，例如钠盐FR-133303。

根据本发明的一锅法的第一步是混合米卡芬净侧链和一耦合添加剂。混合后，在混合物中加入一耦合剂，导致米卡芬净侧链活化和与反应添加剂反应。

在此所用的术语“耦合添加剂”是指能够增强活化的米卡芬净侧链的反应活性和促进到米卡芬净多肽核的伯胺的连接的任何化合物。使用耦合添加剂的好处在于其能够减少副产物的形成。

有大量的耦合添加剂（参见Valeur和Bradley在Chem.Soc.Rev.（化学学会学报）的2009年第38期第606-631页上的文章）。术语“羟基苯并三氮唑”包括羟基苯并三氮唑、羟基杂氮苯并三氮唑和它们的取代衍生物。例如1-羟基苯并三氮唑、1-羟基-7-杂氮苯并三氮唑、6-氯-1-羟基杂氮苯并三氮唑等。

根据本发明的方法，可以使用1-羟基苯并三氮唑（HOBt）和2-腈基-2-肟基乙酸乙酯（品牌Oxyma化学文摘社编号3849-21-6，在此称作Oxyma）。使用所述耦合添加剂导致低杂质和理想的米卡芬净的高产率。

本发明所用的术语“耦合剂”是指能够在耦合添加剂存在下活化米 卡芬净侧链的羧酸并从而促使它与米卡芬净多肽核结构上的胺基反应的任何化合物。

根据本发明，可以使用的耦合剂包括碳化二亚胺的衍生物，由下述分子式表示：Ra-N=C=N-Rb，其中Ra和Rb可以相同也可以不同，Ra和Rb中每一个代表脂肪族、杂脂肪族、碳环或杂环基团，所有所述基团可以取代。根据本发明的一个方面，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺(EDC)可以用作耦合剂。根据本发明的一个优选方面，EDC的盐酸盐可以用作耦合剂。

现有技术已知碳化二亚胺可以用作耦合剂，参见Valeur和Bradley于2008年6月在Chem.Soc.Rev.（化学学会学报）上的文章。米卡芬净侧链上的带负电的氧原子会理想地作为亲核试剂，攻击二亚胺基团的中央碳原子。下面用Oxyma作为耦合添加剂、EDC作为耦合剂来描述本发明的方法，见反应式1。

一锅法反应的适当溶剂包括极性非质子型有机溶剂。适当的溶剂的非限定性列表包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲亚砜(DMSO)等以及它们的混合物。

一锅法反应的适当的赋形剂包括能够加质子到米卡芬净多肽核的胺基的有机和无机赋形剂。适当的赋形剂的非限定性列表包括DIPEA、NaHCO₃、Na₂CO₃等。

活化米卡芬净侧链的适当温度为0℃至40℃，优选20℃至30℃。

连接米卡芬净侧链到米卡芬净多肽核的适当温度为-5℃至10℃，优选0℃。还优选在加入赋形剂前达到所述温度。

所述一锅法的适当的总反应时间为约4小时到20小时。优选地，2-4小时用于米卡芬净侧链的活化，90分钟至2-4小时用于将活化的米卡芬净连接到米卡芬净多肽核。

重要的是，在混合耦合添加剂和米卡芬净侧链后才加入耦合剂。

下面的反应式1示出了在本发明的一锅法中米卡芬净侧链的活化和所述活化的米卡芬净侧链与米卡芬净多肽核的反应。

反应式1：

在连接米卡芬净侧链到米卡芬净多肽核后，产物可以沉淀为米卡芬净盐。就这点来说，术语“米卡芬净盐”可以是米卡芬净的任何药学上可接受的盐或者可以用于进一步纯化米卡芬净的盐。在后一情形中，米卡芬净盐可以例如是N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)盐。米卡芬净的任何药学上可接受的盐可以利用根据本发明制备的米卡芬净产品进一步制备。米卡芬净的药学上可接受的有用的盐可以选自钠盐和钾盐组成的组。

可选地，根据本发明制备的米卡芬净还可以利用本领域技术人员公 知的方法进一步提纯。根据本发明的一个实施例，本发明步骤c）的产品转化为米卡芬净的DIPEA盐，随后转化为一种米卡芬净的药学上可接受的盐，例如米卡芬净的钠盐，随后再用色谱纯化。

根据本发明制备的米卡芬净可以用于制备可以治疗和预防哺乳动物的感染疾病的药物组合物，所述哺乳动物包括人类和动物。所述药物组合物可以采用现有技术公知的标准技术来制备。所述药物组合物可能会经过传统的药学操作，例如消毒。

例如，可以制备单位剂型的药物组合物，其包括单独的、给定量的纯化的米卡芬净或者与其他活性成分的组合以及药学上可接受的辅料。术语“药学上可接受的辅料”是指一种或多种组成材料，其适于实现或增强包括在药物组合物内的米卡芬净到需要该药物组合物的患者的递送。“药学上可接受的辅料”还可以包括佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。乳糖是米卡芬净的适当的稳定剂的实例，尤其对于冻干形式的米卡芬净。本领域技术人员可以理解，有多种用于制备含抗真菌化合物（例如米卡芬净）的药物组合物的药学上可接受的辅料。根据本发明的组合物可以制为能够进行肠胃外给药，例如静脉注射。

可以对需要根据本发明的组合物的患者给药适当剂量的米卡芬净。人类或者哺乳动物的适当的日剂量可能有很多变化范围，取决于患者的条件和其他因素。本领域技术人员可以利用常规方法确定日剂量，所述常规方法通常用于利用给药来治疗和预防感染。

本领域技术人员会从下列实例中理解本发明的更多的优点。下面的实验和结果应当理解为非限定性的实例。

实例1：制备活化的米卡芬净侧链

FR-195752(10.0g(克))和HOBt(羟基苯并三唑，5.2g)(含12%的水)悬浮在DMF(142ml(毫升))中并搅拌5分钟。在悬浮液中加入EDCHCl(盐酸EDC，6.6g)。反应混合物在25℃搅拌4小时。反应混合物倒入426ml乙腈并在25℃搅拌18小时。过滤白色悬浮体并滤干2小时。所得产物12.6g(95%)，HPLC(高效液相色谱)测试纯度：98.0%。

实例2.将活化的米卡芬净侧链连接至米卡芬净多肽核

将FR-179642(10.0g)悬浮在无水DMF(200ml)中并在25℃搅拌10分钟。混合物冷却至0℃。加入米卡芬净侧链(4.50g)和实例1所述的活化酸，随后加入DIPEA(2.25ml)。5分钟后所有材料溶解，在0℃搅拌混合物90分钟。加入甲醇(50ml)和丙酮(100m)的混合物，升温至10℃。在该温度搅拌混合物60分钟。在2.5小时期间慢慢加入乙酸乙酯（1000ml）。所得悬浮液搅拌15小时，用带有细的毛玻璃烧结的滤盘的1000ml奥德里奇玻璃压滤器压滤收集产物。滤饼用乙酸乙酯(1500ml)洗涤并滤干15分钟。在真空橱在25℃进一步干燥3小时，得到12.8g(86%)白色固体。

实例3.活化并将米卡芬净侧链连接到米卡芬净多肽核

在25℃将FR-195752(394mg)和羟基苯并三唑的水合物（197mg）悬浮在DMF(15ml)。加入EDC HCl(盐酸EDC，166mg)，混合物在25℃搅拌4小时。混合物冷却至0℃，加入DIPEA(0.223ml)，随后加入FR-179642(1.00g)。在0℃搅拌混合物90分钟。加入甲醇(2.5ml)和丙酮(5m)的混合物，混合物升温至10℃并搅拌60分钟。在30分钟期间慢慢加入乙酸乙酯（100ml）。所得悬浮液在10℃搅拌16小时。过滤收集固体产物，用乙酸乙酯(150ml)洗涤并在过滤器干燥15分钟。在真空橱在25℃进一步干燥2小时，得到1.47g(98%)白色固体。HPLC纯度：96.6%。

实例4.活化并将米卡芬净侧链连接到米卡芬净多肽核

在25℃将FR-195752(2.06g)和Oxyma（834mg（毫克））悬浮在DMF(60ml)中。加入EDC HCl(盐酸EDC，1.07g)，混合物在25℃搅拌2小时。反应混合物变为亮黄色溶液。所述黄色溶液冷却至0℃，加入DIPEA(1.1ml)，随后加入FR-179642(5.00g)。在0℃搅拌混合物90分钟。加入甲醇(15ml)和丙酮(30m)的混合物，混合物升温至10℃并搅拌60分钟。在30分钟期间慢慢加入乙酸乙酯（300ml），所得悬浮 液在10℃搅拌20小时。过滤收集固体产物，用乙酸乙酯(100ml)洗涤并在过滤器干燥15分钟。在真空橱在25℃进一步干燥2小时，得到6.68g(90%产率)灰白色固体。

实例5.实例2-4的色谱比较 

用HPLC反相色谱仪分析实例2-4所得的粗产品的HPLC色谱图。表1示出了三种不同工艺（见图4a-4c）的HPLC色谱图比较的结果。实例2为间断法，实例3和4为分别利用HOBt和Oxyma作为耦合添加剂的一锅法。Oxyma没有出现在粗产品的色谱图中。在反应混合物中，Oxyma出现在8.5分钟处。

表1：从实例2-4分离的粗产品的HPLC色谱图

注：RRT为色谱分析中的相对保留时间。

由于使用较少溶剂和避免了活化酸的分离，实例3和4更高效且反应时间短。在一锅法中，重量产率明显高，实例3和4的产率分别为98%和95%，而现有技术的方法仅为82%。从实例可以看出，根据本发明的一锅法允许生产像现有技术的间断法的纯度的米卡芬净，而产率更高，如图4a-c所示，粗产物的纯度基本相同。

Claims (11)

1.一种一锅法制备米卡芬净或其盐的方法，包括以下步骤：

a)在一溶剂中混合分子式为(III)的化合物或其盐和一耦合添加剂，

所述耦合添加剂选自1-羟基苯并三唑和2-腈基-2-(肟基)乙酸乙酯组成的组；

b)在步骤a)所得的混合物中加入一耦合剂，其中所述耦合剂为碳化二亚胺；

c)在步骤b)所得的混合物中加入一赋形剂和分子式为(II)

的化合物或其盐。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述耦合剂为1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺(EDC)或其盐。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述耦合剂为EDC的盐酸盐。

4.根据权利要求1-3之一的方法，其特征在于，步骤a)中所用溶剂为DMF。

5.根据权利要求1-4之一的方法，其特征在于，步骤c)中所用赋形剂为DIPEA。

6.根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，在步骤b)所得混合物中加入分子式为(II)的化合物之前加入赋形剂。

7.根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，在步骤b)所得混合物中在加入分子式为(II)的化合物之后加入赋形剂。

8.根据权利要求1-7之一的方法，其特征在于，在步骤c)所得的米卡芬净盐沉淀。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于，在步骤c)所得的米卡芬净盐通过使用一抗溶剂而沉淀。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述抗溶剂为乙酸乙酯。

11.根据权利要求8的方法，其特征在于，在步骤c)所得的米卡芬净盐通过加入甲醇和丙酮淬灭反应后而沉淀。